nitrozatif etkileri ve “caffeic acid phenethyl ester”in koruyucu rolü
Mukadder ÇALIKOĞLU1, Ali ÜNLÜ2, Nehir SUCU3, Savaş AKTAŞ4, Lülüfer TAMER2, İlker ÇALIKOĞLU5
1 Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi, Göğüs Hastalıkları Anabilim Dalı, 2 Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi, Biyokimya Anabilim Dalı,
3 Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi, Kardiyovasküler Cerrahi Anabilim Dalı, 4 Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi, Histoloji Anabilim Dalı,
5 Mersin Devlet Hastanesi, Biyokimya Kliniği, Mersin.
ÖZET
İskemi-reperfüzyon (İR), mikrovasküler fonksiyonların bozulması sonucu lokal ve sistemik inflamatuvar yanıt ile yaygın hasar oluşturabilen bir süreçtir. En sık etkilenen uzak organlar akciğerler ve kardiyovasküler sistemdir. Çalışmamızda İR bağımlı, endotelyal ve mikrovasküler fonksiyonlardaki bozulmayla oluşabilen akciğer hasarında nitrozatif markerların et- kisini inceledik. Antioksidan özellikleri ileri sürülen “Caffeic Acid Phenethyl Ester (CAPE)”in İR sürecinde nitrik oksitle iliş- kili hasarı önlemedeki rolünü araştırdık. Yirmiiki yetişkin erkek Wistar rat, yedi kontrol, yedi İR ve sekiz İR + CAPE olmak üzere üç gruba ayrıldılar. İR ve CAPE + İR grubundaki ratlarda sağ bacak torakanter majör düzeyinde 8 saat İR oluşturul- du ve CAPE + İR grubundakilere reperfüzyondan önce 10 µM CAPE verildi. Reperfüzyon sonunda kan, bronkoalveoler la- vaj (BAL) ve akciğer dokusu elde edildi. Serumda nitrit ve nitrat düzeyleri, BAL miyeloperoksidaz (MPO) aktivitesi, akci- ğer dokusunda 3-nitrotirozin (3-NT) seviyeleri ve akciğerde lökosit infiltrasyonu araştırıldı. İR ve kontrol grubu karşılaştırıl- dığında nitrat, MPO ve lökosit infiltrasyonunda artış gözlemlenirken, nitrit ve 3-NT düzeylerinde önemli değişikliğe rastla- nılmadı. CAPE kullanımı ile nitrat düzeyleri (p< 0.0001), MPO aktivitesi (p< 0.0001) ve peribronşiyal/perivasküler lökosit düzeylerini anlamlı ölçüde azaltırken (χ2= 27.163, p= 0.0001), doku 3-NT seviyelerinde önemli bir değişikliğe yol açmadı.
Sonuç olarak, periferik İR sistemik inflamatuvar yanıt ve endotelyal fonksiyon bozukluğuna yol açarak uzak organları et- kileyebilir ve bu zararlı etkilerin CAPE ile önlenebileceği söylenebilir.
Anahtar Kelimeler: “Caffeic acid phenetyl ester”, iskemi-reperfüzyon, akciğer.
SUMMARY
The nitrosative effect of peripheral ischemia-reperfusion on lung and preventive of caffeic acid phenethyl ester
Calikoglu M, Unlu A, Sucu N, Aktas S, Tamer L, Calikoglu I
Pulmonary Disease, Faculty of Medicine, Mersin University, Mersin, Turkey.
Ischemia-reperfusion (IR) is characterized by microvascular disfunction and this involves both direct effected organ and re- mote organ by systemic inflamatory respons. These remote effects of IR are most frequently observed in the lung and car-
Yazışma Adresi (Address for Correspondence):
Dr. Mukadder ÇALIKOĞLU, Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi, Göğüs Hastalıkları Anabilim Dalı, 33079, MERSİN - TURKEY
İskemi-reperfüzyon (İR); mikrovasküler fonksi- yonların bozulması ile hem direkt etkilenen or- ganda, hem de sistemik inflamatuvar yanıtı ha- rekete geçirerek uzak organlardaki arteriyoller- de bozulmuş endotel bağımlı dilatasyon, kapiller yatakta artmış sıvı filtrasyonu ve lökosit tıkaçla- rı, postkapiller venüllerde plazma proteinleri ve lökosit ekstravazasyonu ve mikrosirkülasyonun her kademesinde artmış oksijen radikali üretimi ile hasar oluşturabilen bir süreçtir (1,2).
Bir serbest radikal olan nitrik oksit (NO) fizyolo- jik ve birçok patolojik durumda kan akımının düzenlenmesinde önemli rol oynar. İskemi, da- mar endotelinde hem inflamatuvar hücre infilt- rasyonu hem de indüklenebilen nitrik oksit sen- tazın (NOS) aktivitesini arttırır. Böylece, iskemi sırasında NO seviyeleri artarken, reperfüzyon süresince kan akımının yeniden başlamasıyla, büyük miktarlarda moleküler oksijen dokulara taşınır ve reperfüzyon hasarından sorumlu oldu- ğu düşünülen çok miktardaki serbest oksijen ra- dikali ve süperoksit (O2-) ortaya çıkar (3,4). İs- kemi sırasında oluşan NO, ya bu radikalin stabil son ürünleri olan nitrit ve nitrata dönüşür, ya da süperoksit (O2-) radikali ile reaksiyona girerek peroksinitrit (ONOO-) oluşturur (5,6). Peroksi- nitrit proteinlerdeki tirozin rezidülerinin 3-pozis- yonundaki hidroksil grubuna bir nitro grubu ek- leyerek, stabil bir son ürün olan 3-nitrotirozin (3-NT)’i oluşturur (7). Ayrıca NO, nötrofil akti- vasyonunun bir göstergesi olan miyeloperoksi- daz enzimi ile reaksiyona girmek suretiyle de proteinlerdeki tirozinin nitrasyonuna yol açabilir
(8). 3-NT protein nitrasyonunun indirekt ve sta- bil ürünü olup, nitrozatif stresi göstermede yay- gın olarak kullanılmaktadır (9,10).
Propiller, güçlü antimikrobiyal, antiinflamatuvar, antioksidan ve antineoplastik aktiviteleri olan ve bal arıları tarafından toplanan ürünlerdir. Propil- lerin aktif bir komponenti olan “Caffeic Acid Phenethyl Ester (CAPE)” bu biyolojik aktivitele- rin tümünden sorumlu olabilir ve 10 µmol kon- santrasyonda kullanıldığında insan nötrofillerin- de reaktif oksijen türlerini tam olarak bloke etti- ği gösterilmiştir (11-15). Yine son yıllarda yapıl- mış çalışmalarda CAPE’nin antioksidan özelliği ve İR’den direkt etkilenen organ ve dokularda reaktif oksijen ve nitrojen türlerine bağlı olarak gelişen İR hasarını önlediği gösterilmiştir (13,14, 16-19).
Bu çalışmada amacımız, deneysel olarak oluştu- rulan periferik İR’nin uzak hedef organ olan ak- ciğerdeki etkilerini belirlemektir.
MATERYAL ve METOD
Bu çalışmada 200-250 g ağırlığında, 22 yetişkin erkek Wistar rat kullanıldı. Hayvanlar, yedi kont- rol, yedi İR ve sekiz İR + CAPE olmak üzere üç gruba ayrıldılar. 100 mg/kg intramusküler (IM) ketaminle uyutulduktan sonra sağ bacak tora- kanter majör proksimali düzeyine bir turnike ko- yularak dört saat süresince iskemi oluşturuldu.
Sonrasında turnikeler alınarak dört saat reper- füzyon oluşturuldu. İR + CAPE grubundaki ratla- ra daha önceki çalışmalarda önerilen doz olan diovascular system. In this study we aim to determine lung damage which induced IR, and endothelial and microvascu- lar disfunction using nitrosavive markers. Previous studies suggest that caffeic acid phenethyl ester (CAPE) has some an- tioxidant effects. Therefore, we also investigated whether it has a role associated with nitric oxide during IR condition.
Twenty-two adult male Wistar rats were divided into three groups: control (n= 7), IR (n= 7), and CAPE + IR (n= 8). 8 h IR period was performed on right hindlimb in the IR and the CAPE with IR group. In the CAPE with IR group, animals rece- ived CAPE 10 µM 1 h before the reperfusion. At the end of the reperfusion period, blood, bronchoalveolar lavage (BAL) and lung tissue were obtained, and were used for biochemical and histopathological examination. There was a significantly ele- vation in serum nitrate, BAL MPO, and leukocyte infiltration in the lung in the IR group compared to the CAPE + IR group.
But, serum nitrite and lung 3-NT levels were not different between these groups. While nitrate (p< 0.0001), MPO (p< 0.0001) and leukocyte infiltration (χ2= 27.163, p= 0.0001), reduce by using CAPE before reperfusion, tissue 3-NT levels did not chan- ge. In conclusion, peripheral IR leads to systemic inflammatory responses and endothelial disfunction-induced NO produc- tion, and these harmful effects may reduced by CAPE.
Key Words: Caffeic acid phenethyl esther, ischemia reperfusion, lung.
10 µM CAPE reperfüzyondan bir saat önce intra- peritoneal olarak uygulandı (16,17). Aynı mik- tarda salin solüsyonu aynı yolla İR grubundaki ratlara uygulandı. Reperfüzyon dört saat sürdü- rüldü ve bitiminde biyokimyasal incelemeler için çıkan aortadan 5 mL kan alındı.
Reperfüzyon sürecinin sonunda, yarı steril şart- larda İR ve IR + CAPE grubundaki ratlara midsit- renotomi yapıldı. Sol ana bronş klemplendikten sonra trakeadan sağ akciğere 0.07 mol-1 etilen diamin tetraasetik asit içeren 2 mL salin solüs- yonu üç kez enjekte edildi ve geri çekildi. Böyle- likle toplam 3-4 mL bronkoalveoler lavaj (BAL) sıvısı elde edildi. Bu işlemin bitiminden sonra sol akciğer çıkarıldı ve histopatolojik inceleme için
%10’luk formaldehid içinde fikse edildi.
Nitrit ve nitrat ölçümü: Kısa yarı ömrü ve radi- kal yapısı sebebiyle NO’nun direkt olarak sap- tanması zor olduğundan plazmada stabil son ürünleri olarak nitrit ve nitratın ölçümü kullanıl- maktadır (20). Nitrit ve nitrat düzeyleri spektro- fotometrik metod ile saptandı (Roche, Mannhe- im, Germany). Nitrat redüktaz enzimi varlığında nitratın nitrite indirgenmesine ve oluşan nitritin sulfanilamid ve N-etilendiamine dihidroklorid ile reaksiyona girerek oluşan kromojenin 550 nm’de ölçümü prensibine dayanır. NO’nun se- rumdaki direkt göstergeleri olarak kabul edilen nitrit + nitrat değerleri ölçüldü (20).
Doku 3-NT ölçümü: Akciğer doku örnekleri ilk olarak 6 N HCl içinde 100°C’de 24 saat inkübas- yon ile hidrolize edildi. Daha sonra örnekler filtre edilerek HPLC sistemi (HP 1050 DAD) kullanıla- rak analiz edildi. Analitik kolon 5 µm por ölçülü spherisorb ODS-2 ters faz kolonu idi. Sitrat-ase- tat tamponu izokratik şartlar altında mobil faz olarak dakikada 1 mL gidecek şekilde kullanıldı.
3-NT pikleri UV dedektörde 274 nm dalga bo- yunda ölçüldü. 3-NT pikleri retansiyon süresine göre belirlendi. Çıkan 3-NT pikleri ekzojen 3-NT eklenerek piklerin büyütülmesi ile doğrulandı (21). 3-NT nmol/mg protein olarak verildi.
BAL miyeloperoksidaz (MPO) ölçümü: MPO nötrofillerin azurofil granülleri içerisinde bulunur ve lökosit sekestrasyonunun saptanmasında ba- sit, kantitatif bir yöntem olarak kullanılmaktadır.
MPO aktivite ölçümü o-dianozidin redüksiyonu-
nu ve redükte o-dianozidinin absorbansının 410 nm’de ölçümüne dayanmaktadır (22).
Histopatolojik değerlendirme: Akciğer dokusu
%10 formalin ile fiske edildikten sonra ışık mik- roskobik inceleme için rutin hazırlıklar yapıldı.
Parçalar (4 µm) mikrotom ile kesildi ve hema- toksilin-eozin ile boyandı. Hazırlanan preparat- larda inflamatuvar değişiklikleri değerlendirmek üzere lökosit sayımı yapıldı. Mikroskobik değer- lendirme için Olympus B X 50 ışık mikroskobu kullanıldı ve fotoğraflar Olympus PM10SP sis- tem ile çekildi.
Lökosit infiltrasyon düzeyini ifade etmek için her bir preparat 10 alana bölünerek değerlendirildi ve her alanda 400 hücre sayılarak lökosit yo- ğunluğu skorlandı.
Skor 0: Ekstravasküler lökosit yok; 1: < 10 löko- sit; 2: 10-45 lökosit; 3: > 45 lökosit olarak ifade edildi. İstatistik analiz: Veriler ortalama değer ± standart hata olarak sunuldu (23). Gruplar arası farklılıklar ANOVA test ile analiz edildi. Anlamlı- lık p< 0.05 olarak tanımlandı.
Histopatolojik verilerin değerlendirilmesinde χ2 ve Z-approximation testleri kullanıldı. p< 0.05 istatistiksel anlamlı kabul edildi.
BULGULAR
IR uygulaması sonucunda serum nitrat düzeyi önemli derecede artarken (p< 0.01) nitrit düzey- lerinde belirgin bir değişiklik gözlemlenmedi. Ar- tan sistemik nitrat düzeylerine karşılık, akciğerde lokal 3-NT düzeylerinde herhangi bir değişiklik saptanmadı. BAL MPO seviyesi İR grubunda be- lirgin yüksek bulunup, CAPE uygulanan grupta anlamlı düşüş gösterdi. Benzer şekilde, reperfüz- yon öncesi CAPE uygulanması ile serum nitrat seviyelerinin de kontrol grubuna yakın düzeylere indiği gözlendi. Serum nitrit ve akciğer dokusun- da 3-NT düzeylerinde İR sürecinde anlamlı bir değişiklik gözlenmedi ve CAPE kullanımının her- hangi bir etkisine rastlanılmadı. Gruplara ait bi- yokimyasal veriler Tablo 1’de izlenmektedir.
Histopatolojik değerlendirme: Akciğer dokuları- nın ışık mikroskopi ile değerlendirilmesi sonu- cunda gruplar arasında peribronşiyal ve perivas- küler lökosit infiltrasyonu bakımından anlamlı fark saptandı (χ2= 27.163, p= 0.0001).
İR grubunda yedi ratın 6 (%85.7)’sı skor 3 dere- cesinde lökosit infiltrasyonuna sahipken, bu skor CAPE ile tedavi edilen gruptaki ratlardan sadece birinde saptandı (p= 0.002). Benzer şe- kilde CAPE grubunda sekiz ratın 3 (%37.5)’ünde skor 1 lökosit infiltrasyonu varken, İR grubunda bu skora hiç rastlanmadı (p= 0.03). Sonuçta ak-
ciğerdeki lökosit infiltrasyonu kontrol grubunda skor 0, IR grubunda skor 2 ve 3, CAPE grubun- da ise skor 1 ve 2’de yoğunlaşmıştı. Veriler Tab- lo 2’de izlenmektedir.
Resim 1, 2 ve 3’te kontrol, İR ve CAPE + İR gruplarının akciğerlerinde peribronşiyal ve peri- vasküler lökosit infiltrasyonu sunulmuştur.
Tablo 1. Gruplardaki nitrit, nitrat, 3-NT düzeyleri ve miyeloperoksidaz aktivitesi.
Serum Serum BAL Doku
Nitrit Nitrat Miyeloperoksidaz aktivitesi 3-NT
(µmol/L) (µmol/L) (U mg-1protein h-1) (nmol/mg protein)
Kontrol (n= 7) 9.4 ± 3.44 43 ± 12.5 0.11 ± 0.05** 5.3 ± 4.3
İR (n= 7) 11.4 ± 4.16 90.5 ± 6.5* 1.69 ± 0.67*** 6.4 ± 3.8
CAPE + İR (n= 8) 13 ± 7.1 50 ± 28.6 0.34 ± 0.27 6.2 ± 2.6
* p< 0.01, kontrol ile CAPE + İR grubu arasındaki fark,
** p< 0.0001, kontrol ile İR grubu arasındaki fark,
*** p< 0.0001, İR ile CAPE + İR grubu arasındaki fark.
Tablo 2. Gruplar arasındaki lökosit infiltrasyon skorları.
Lökosit infiltrasyon skoru
Grup 0 1 2 3 Toplam
Kontrol 5 (%71.4)* 2 (%28.6) 7 (%100)
İR 1 (%14.3)** 6 (%85.7)*** 7 (%100)
CAPE + İR 3 (%37.5)**** 4 (%50) 1 (%12.5) 8 (%100)
χ2= 27.163, p= 0.0001, İR: İskemi-reperfüzyon, CAPE: “Caffeic Acid Phenethyl Ester”
* Kontrol- İR grubu arasındaki fark (p= 0.005) ve kontrol-CAPE + İR grubu arasındaki fark (p= 0.01),
** IR-CAPE + İR grubu arasındaki fark (p= 0.029),
*** Kontrol-İR grubu arasındaki fark (p= 0.001) ve İR-CAPE + İR grubu arasındaki fark (0.002),
**** İR-CAPE + İR grubu arasındaki fark (0.03),
Diğer skorlar bakımından gruplar arasında anlamlı fark bulunmadı (p> 0.05).
Resim 1. Kontrol grubunda terminal ve respiratuar bronşiyoller, alveoler duktus yapıları (hematoksilin &
eozin x 40).
Resim 2. İR grubunda peribronşiyal ve perivasküler lökosit infiltrasyonu, terminal bronşiyoller ve alveoler yapılar (hematoksilin & eozin x 100)
TARTIŞMA
İR sürecinin, reaktif oksijen radikallerinin artışı ve güçlü kemotaktik özellikleri olan birçok infla- matuvar mediatörün salınması ile karakterize bir doku hasarına neden olduğu bilinmektedir (2,24,25). Bu sürecinin uzak organlar üzerinde- ki etkileri en sık akciğerler ve kardiyovasküler sistemde görülmektedir (2).
Bu çalışmada bacakta oluşturulan İR sırasında endojen NO üretiminin bir göstergesi olan serum nitrat düzeylerinin; lökosit infiltrasyon ve akti- vasyonunun bir ifadesi olarak da BAL’da MPO aktivitesinin anlamlı artış gösterdiğini saptadık.
Bir serbest radikal olan nitrik oksit (NO), nitrik oksit sentazın (NOSs) L-arjinin ile etkileşimi so- nucu oluşur, birçok fizyolojik ve patolojik du- rumda kan akımının düzenlenmesinde önemli rol oynar. İnflamatuvar ve hipoksik bir süreçle sonlanan İR, endotelyal NOS’nin yapısal ve özel- likle de indüklenebilir izoformlarının ekspresyo- nuna ve dolayısıyla NO artışına neden olabilir (26,27). NO artışındaki bir diğer muhtemel me- kanizma nötrofillerin aktivasyonu ve etkilenen dokuya sekestrasyonudur (28). Bugüne kadar İR hasarı konusunda yapılan yoğun çalışmalara karşın, İR sürecinden NO’nun ne yönde etkilen- diği açık değildir.
Koltuksuz ve arkadaşları tarafından bir testiste oluşturulan İR’nin, sadece o testiste ve iskemi sı- rasında NO’yu arttırdığını, reperfüzyon sırasında ise azalttığını, ancak karşı testisi etkilemediğini gözlemlemişlerdir (16). Biz bacakta oluşturulan
İR sonucu serumda NO artışını gözledik ve bu- nun hipoksik ve inflamatuvar süreç olan İR sıra- sındaki NOS ekspresyonunun artışı ile ilgili ola- bileceğini düşünmekteyiz. Ancak nitrozatif stre- sin bir göstergesi olan 3-NT düzeyleri için akci- ğer dokusunda anlamlı bir değişiklik bulmadık.
Nötrofil aktivasyonunun kantitatif bir ifadesi olan MPO’nun birçok patolojik süreçte reaktif oksijen radikallerinin aşırı üretimine neden olduğu bilin- mektedir (29). Çalışmamızda BAL’da MPO akti- vitesini artmış bulduk ama bu artışın da akciğer dokusunda 3-NT düzeylerini etkilemediğini göz- ledik. Bunun nedeni periferik İR sırasında BAL- MPO artışına rağmen akciğer dokusunda yeterli NO sentezinin olmaması ve MPO aracılıklı tirozin nitrasyonunun gerçekleşmemesi olabilir.
Bu durum, İR’den direkt etkilenen dokuda üreti- lerek sistemik dolaşıma salınan NO’nun uzak or- ganda protein nitrasyonuna yol açacak düzeyde olmaması veya hipoksiden direkt olarak etkilen- meyen uzak organda NOS ekspresyonunun ye- terli düzeyde olmadığını düşündürmektedir.
NOS’nin olmaması peroksinitrit oluşturmak üze- re serbest oksijen radikalleri ile reaksiyona gire- cek NO üretiminin oluşmaması ile sonlanır. Böy- lelikle peroksinitrit aracılıklı nitrozatif hasar ge- lişmemiş olabilir.
Aslında mikrosirkülasyonda NO’nun koruyucu rolünün olduğu bilinmektedir. Ancak, aşırı mik- tarda üretilen NO, hipoksik ortamda artmış olan reaktif oksijen ürünleri ile birleşip zararlı özellik kazanabilir; yüksek miktarda NO ve peroksinitrit oluşumunu azaltarak İR bağımlı hasarın önlene- bileceği ileri sürülmektedir (30). İR hasarının di- rekt etkilenen dokularda CAPE tarafından azaltıl- dığını gösteren çalışmalar vardır (11,13-15,23).
Bu çalışmada da reperfüzyon öncesi CAPE uy- gulaması ile serum NO düzeyleri ve BAL MPO aktivitesinde anlamlı azalma gözledik. Ayrıca ak- ciğer dokusunun histopatolojik incelemesi de CAPE’nin perivasküler ve peribronşiyal lökosit infiltrasyonunu azalttığını gösterdi. Uzak organda MPO aktivitesi ve lökosit infiltrasyonunun azaltıl- ması reaktif oksijen radikallerinin üretiminin azal- ması ile paraleldir. Bu çalışmada her ne kadar akciğer dokusunda zararlı oksijen radikalleri ile birleşecek yeterli NO’nun olmadığı düşünülse de, serumda artan NO ile reaksiyona giren bu radi- kallerin hücre zarlarında lipid peroksidasyonuna Resim 3. CAPE + IR grubunda terminal ve respiratu-
ar bronşiyoller, alveoler duktus yapıları (hematoksilin
& eozin x 40)
veya hücrelerin çeşitli enzim aktivitelerinde ve enerji metabolizmalarında bozulmalara neden olabileceği düşünülebilir. Bu zararlı etkileri önle- mek amacıyla CAPE’nin antioksidan özelliğinden yararlanmak faydalı olabilir.
KAYNAKLAR
1. Welbourn CRB, Goldman G, Peterson IS. Pathophysi- ology of ischemia-reperfusion injury: Central role of the neutrophil. Br J Surg 1991; 78: 651-5.
2. Carden DL, Granger DN. Pathophysiology of ischemia-re- perfusion injury. J Pathol 2000; 190: 255-66.
3. Bulkley GB. Free radical mediated reperfusion injury: A selective review. Br J Cancer Suppl 1987; 8: 66.
4. Love S. Oxidative stress in brain ischemia. Brain Pathol 1999; 9: 119-31.
5. Cardillo C, Kilcoyne CM, Cannon RO, et al. Xanthine oxi- dase inhibition with oxypurinol improves endothelial va- sodilator function in hypercholesterollemic but not in hypertensive patients. Hypertention 1997; 30: 57-63.
6. Beckman JS, Beckman TW, Chen J, et al. Apperent hydroxyl radical production by peroxynitrite: Implicati- on for endothelial injury from nitric oxide and superoxi- de. Proc Natl Acad Sci 1990; 87: 1620-4.
7. Ischiropoulos H, Zhu L, Chen J, et al. Peroxynitrite-medi- ated tyrosine nitration catalyzed by superoxide dismuta- se. Arch Biochem Biohys 1992; 298: 438-45.
8. Beckman J, Koppenol W. Nitric oxide, superoxide, and peroxynitrite: The good, the bad, and the ugly. Am J Physiol 1996; 271: 1424-37.
9. Van Der Vliet A, Eiserich JP, Shigenaga MK, Cross CE. Re- active nitrogen species and tyrosine nitration in the respi- ratory tract. Am J Respir Crit Care Med 1999; 160: 1-9.
10. Eiserich JP, Hristova M, Cross CE, et al. Formation of nit- ric oxide-derived inflammatory oxidants by myeloperoxi- dase in neutrophils. Nature 1998; 391: 393-7.
11. Hepsen IP, Bayramlar H, Gültek A, et al. Caffeic acid phe- nethyl ester to inhibit posterior capsule opacification in rabbits. J Cataract Refract Surg 1997; 23: 1572.
12. Hepsen IF, Er H, Cekic O. Topically applied water extract of propels to suppress cornean neovascularization in rab- bits. Ophthalmic Res 1999; 31: 426-31.
13. Ilhan A, Koltuksuz U, Ozen S, et al. The effects of caffeic acid phenethyl ester on spinal cord ischemia/reperfusi- on injury in rabbits. Eur J Cardiothorac Surg 1999; 16:
458-63.
14. Koltuksuz U, Özen S, Uz E, et al. Caffeic acid phenethyl ester prevents intestinal reperfusion injury in rats. J Pe- diatr Surg 1999; 34: 1458-62.
15. Sud’ina GF, Mirzoeva OK, Puskareva MA, et al. Caffeic acid phenethyl ester as a lipoxygenase inhibitor with an- tioxidant properties. FEBS Lett 1993; 329: 21.
16. Koltuksuz U, Irmak MK, Karaman A, et al. Testicular nit- ric oxide levels after unilateral testicular torsion/detorsi- on in rats pretreated with caffeic acid phenethyl ester.
Urol Res 2000; 28: 360-3.
17. Ozyurt H, Irmak ÖK, Akyol O, Sogut S. Caffeic acid phe- nethyl ester changes the indices of oxidative stress in se- rum of rats with renal ischemia-reperfusion injury. Cell Biochem Funct 2001; 19: 259-63.
18. Irmak MK, Koltuksuz U, Kutlu ON, et al. The effect of caf- feic acid phenethyl ester on ischemia-reperfusion injury in comparison with alpha-tocopherol in rat kidneys. Urol Res 2001; 29: 190-3.
19. Chen YJ, Shiao MS, Wang SY. The antioxidant caffeic acid phenethyl ester induces apoptosis associated with selective scavenging of hydrogen peroxide in human le- ukemic HL-60 cells. Anticancer Drugs 2001; 12: 143-9.
20. Moshage H, Kok B, Huizenge JR, Jansen PLM. Nitrite and nitrate determination in plasma: A critical evaluati- on. Clin Chem 1995; 41: 892-6.
21. Kamisaki Y, Wada K, Nakamoto K, et al. Sensitive deter- mination of nitrotyrosine in human plasma by isocratic high-performance liquid chromotagrophy. J Chromatogr B Biomed Appl 1996; 685: 343-7.
22. Golowich SP, Kaplan SD. Methods in enzymology. Vol 2.
New York: Academic Press Inc, 1955: 769.
23. Çalıkoğlu M, Tamer L, Sucu N, et al. The effects of the caf- feic acid phenethyl ester on tissue damage in lung after hindlimb ischemia-reperfusion. Pharmacol Res 2003; 48:
397-403.
24. Sucu N, Unlu A, Tamer L, et al. Effects of trimetazidine on tissue damage in kidney after hindlimb ischemia-reper- fusion. Pharmacological Research 2002; 46: 345-9.
25. Seekamp A, Ward PA. Ischemia-reperfusion injury.
Agents Actions Suppl 1993; 41: 137-52.
26. Demers P, Elkouri S, Sirois MG, Cartier R. Effects of acu- te rejection on L-arginine/iNOS pathway in canine heart transplantation. Can J Cardiol 2003; 19: 419-25.
27. Pararajasingam R, Weight SC, Bell PR, et al. Endogeno- us renal nitric oxide metabolism following experimental infrarenal aortic cross-clamp-induced ischemia-reperfu- sion injury. Br J Surg 1999; 86: 795.
28. Adams LB, Hibbs JB, Taintor RR, et al. Microstatic effect of murine-activated macrophages for Toxoplasma gondii:
Role of synthesis of inorganic nitrogen oxides from L-ar- ginie. J Immunol 1990; 144: 2725.
29. Hoy A, Tregouet D, Leininger-Muller B, et al. Serum mye- loperoxidase concentration in a healthy population: Bi- ological variations, familial resemblance and new gene- tic polymorphisms. Eur J Hum Genet 2001; 9: 780-6.
30. Morisue A, Wakabayashi G, Shimazu M, et al. The role of nitric oxide after a short period of liver ischemia-reperfu- sion. J Surg Res 2003; 109: 101-9.
