T.C. NAMIK KEMAL ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJELERİ KOORDİNASYON BİRİMİ (NKÜBAP)
BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ SONUÇ RAPORU
NKUBAP.10.GA.17.117 nolu proje
KIVIRCIK MELEZİ KUZULARDA LEPTİN, KALPASTATİN VE İNSÜLİN BENZERİ BÜYÜME HORMONU 1 GEN POLİMORFİZMLERİNİN ARAŞTIRILMASI
Yürütücü: Yrd. Doç. Dr. Selçuk KAPLAN Araştırmacı: Uzm. Sertaç ATALAY
2017
I ÖNSÖZ
Hayvansal proteinler insanların temel besin ihtiyaçlarının karşılanmasında önemli bir yere sahiptir. Bu bakımdan başta et, süt ve yumurta gibi hayvansal proteince zengin gıdalar insanların temel diyet gereksiniminin karşılanmasında olmazsa olmaz hayvansal ürünlerdir. Bu amaçla insanoğlu, hayvansal protein ihtiyacını karşılamak amacıyla evciltme döneminden başlayarak koyun, sığır ve tavuk gibi çiftlik hayvanlarını yetiştirmektedir.
Son yıllarda hızla artan Dünya nüfusunun temel besin ihtiyaçlarının nasıl karşılanacağı önemli bir bilimsel soru olarak öne çıkmaktadır. Bu artış beraberinde önemli bir hayvansal protein talebi getirmektedir. Bu talebin karşılanmasında çiftlik hayvanları yetiştiriciliği kritik bir rol oynamaktadır. Bununla birlikte, nüfusa bağlı hızla artan hayvansal protein talebinin karşılanmasında geleneksel yetiştirme ve ıslah yöntemlerinin kullanılması yeterli olmamaktadır.
Günümüzde hayvansal protein ihtiyaçlarının karşılanmasına yönelik olarak yürütülen hayvancılık programları değerlendirildiğinde hayvan sayısını arttırmak yerine hayvan başına verimi arttırmaya yönelik programların giderek yaygınlaştığı görülmektedir. Söz konusu programlarda, birim hayvan başına verimi arttırmaya yönelik melezleme yöntemlerinin sıklıkla kullanıldığı görülmektedir.
Melezlemede temel amaç melezlemede kullanılan hayvanlardan daha üstün ve gelişmiş özelliklere sahip bireylerin elde edilmesidir. Bu amaçla Türkiye de bulunan yerli koyun ırkları üzerinde yapılan melezleme çalışmaları 1950'li yıllara dayanmaktadır. Bununla birlikte, yerli koyun ırkları içersinde Kıvırcık ırkı koyunlar melezlemeye en çok tabi tutulan koyun ırkları arasında bulunmaktadır. Kıvırcık koyunları kombine verimli hayvanlar olup etinin lezzetli oluşuyla bilinmektedir.
Kıvırcık ırkı koyunlar, hayvan başına verimlerinin arttırılması ve geliştirilmesi amacıyla başta Merinos olmak üzere birçok koyun ırkıyla melezlemeye tutulmuştur.
Bu melezlemelerde istenilen hedefe ne ölçüde ulaşıldığı ya da melezleme sonrasında hayvanlarda genetik olarak ne gibi farklılıkların oluştuğu ise önemli bir araştırma konusudur.
Bu çalışmanın amacı, Kıvırcık melezi kuzularda, çiftlik hayvanlarında büyüme, et kalitesi ve karkas özellikleri ilgili önemli markerler arasında bulunan kalpastatin, leptin ve insülin benzeri büyüme hormonu 1 genlerine ait polimorfizmlerin araştırılmasıdır. Böylece yerli melez hayvanlarımız üzerinde yapılan genetik araştırmalara katkıda bulunulması hedeflenmektedir.
Bu proje Namık Kemal Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimi (NKÜBAP) tarafından NKUBAP.10.GA.17.117 numarası ile desteklenerek Namık Kemal Üniversitesi Veteriner Fakültesi bünyesinde bulunan Genetik laboratuvarlarında yürütülmüştür. Projeye maddi destek sağlayan Namık Kemal Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimi'ne ve doku örneklerini sağlayan İpsala Lider Et Mezbaha işletmesine teşekkür ederim.
Yrd. Doç. Dr. Selçuk KAPLAN
II ÖZET
Kıvırcık Melezi Kuzularda Leptin, Kalpastatin ve İnsülin Benzeri Büyüme Hormonu 1 Gen Polimorfizmlerinin Araştırılması
Büyüme, et kalitesi ve karkas özellikleri üzerine yem, bakım ve besleme gibi çevresel faktörlerin önemli etkileri bulunmaktadır. Bununla birlikte kantitatif özellikler arasında bulunan büyüme, et kalitesi ve karkas özellikleri, her biri küçük etkiye sahip çok sayıda genin kontrolü altında bulunmaktadır. Leptin (LEP), Calpastatin (CAST) and Insulin-Like Growth Hormone 1 (IGF1) genleri çiftlik hayvanlarında büyüme, et kalitesi ve karkas özellikleri ile ilgili önemli markerler olup söz konusu özelliklerle ilgili uygulanan marker destekli seleksiyon programlarında kullanılmaktadır. Bu araştırmada, Kıvırcık melezi kuzularda LEP, CAST ve IGF genleriyle ilgili polimorfizmlerin belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla söz konusu genlerle ilgili genetik varyasyonun belirlenmesinde PCR-RFLP metodu kullanılmıştır. Araştırma sonuçlarına göre, IGFI geni A ve B allel frekansları 0.915 ve 0.085, LEP geni A ve G 0.055 ve 0.945 ve CAST geni M ve N allel frekansları 0.90 ve 0.10 olarak bulunmuş olup populasyonun söz konusu genlerle ilgili Hardy-Weinberg dengesinde olduğu belirlenmiştir (P>0.05).
Anahtar Kelimeler: Koyun, Kalpastatin, Leptin, Igf1, PCR-RFLP, Polimorfizm
III ABSTRACT
Investigation of Leptin, Calpastatin and Insulin-Like Growth Hormone 1 Gene Polymorphisms in Kıvırcık Crossbred Ewes
Environmental factors such as feed, management and nutrition have important effects on growth, meat quality and carcass characteristics. However, the growth, meat quality and carcass characteristics are among the quantitative traits. And these traits are under the control of a large number of genes that have small effect. Leptin (LEP), Calpastatin (CAST) and Insulin-Like Growth Hormone 1 (IGF1) gene are important markers for growth, meat quality and carcass characteristics of farm animals. Therefore, these genes are using marker-assisted selection programs of farm animals. In this study, it was aimed to determine polymorphisms related to CAST, LEP and IGF1 gene in Kıvırcık crossbred ewes. For this purpose, the PCR- RFLP method was used to determine the genetic variation related to these genes.
According to the results of the research, IGFI allele frequencies A and B were found with 0.915 and 0.085, LEP allele frequencies A and G were found with 0.055 and 0.945 and CAST allele frequencies M and G were found with 0.90 and 0.10, respectively. There was no deviation from Hardy-Weinberg equilibrium of population (P>0.05) relative to these genes.
Keywords: Sheep, Calpastatin, Leptin, Igf1, PCR-RFLP, Polymorphism
IV
İÇİNDEKİLER
ÖNSÖZ ………... I
ÖZET ………... II
ABSTRACT ………... III
İÇİNDEKİLER………... IV
ŞEKİLLER DİZİNİ………... V
ÇİZELGELER DİZİNİ………... VI
1.GİRİŞ………... 1
2. GENEL BİLGİLER………... 3
3. MATERYAL ve YÖNTEM………... 4
4. BULGULAR ve TARTIŞMA………... 10
5. SONUÇ………... 14
6. KAYNAKLAR………... 16
V
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 1. LEP/BcnI genotipleri... 10 Şekil 2. CAST/MspI genotipleri... 12 Şekil 3. IGF1/BfoI genotipleri... 13
VI
TABLOLAR DİZİNİ
Tablo1.Çalışmada kullanılan primerler... 7
Tablo 2. CAST geni genotipleri... 9
Tablo 3. LEP geni genotipleri... 9
Tablo 4. IGF1 geni genotipleri... 10
Tablo 5. LEP/BcnI allel ve genotip frekansları... 11
Tablo 6. CAST/MspI allel ve genotip frekansları... 12
Tablo 7. IGF1/BfoI allel ve genotip frekansları... 14
1 GİRİŞ
Koyun varlığı bakımından ülkemiz dünyada ilk 10’da yer almasına rağmen üretimde istenilen verimliliğe ulaşılamamıştır. Üretimde ortaya çıkan olumsuzlukların temel sebebi çoğunluğu düşük verimli yerli ırkların varlığı ve sürdürülebilir üretim sisteminin uygulamaya konulamamasıdır. Bu bakımdan ülkemiz koyunculuğu, kaliteli karkas ve ekonomik et üretimi gibi ticari kuzu üretimini olanaklı kılan temel faktörleri sağlamaktan çok uzak bir noktada bulunmaktadır. Son 30 yıl içinde besi koyunculuğunda ıslah çalışmaları sonucunda birim hayvan başına verimlilik ve nitelikli damızlık üretimi ve muhafazası konusunda çok sayıda çalışma yapılmış ve kimi önemli sonuçlar elde edilmiştir. Bu çalışmalar kapsamında geleneksel olarak, fenotipik seleksiyona dayalı ıslah çalışmaları yapılmış olup sonuç itibariyle bazı özelliklerde fenotipik performansa dayalı önemli ilerlemeler elde edilmesine rağmen, multifaktöriyel kalıtım gösteren kantitatif karakterlerde istenilen başarı çoğu zaman yakalanamamıştır.
Son yıllarda genetik biliminde, yenilenen teknolojiler ve kullanılan moleküler tekniklerde yaşanan hızlı ilerlemelere bağlı olarak çok önemli gelişmeler sağlanmıştır.
Genetikte yaşanan bu gelişmelere müteakip son yıllarda çiftlik hayvanlarının genetik ıslahına yönelik yapılan araştırmalarda önemli artış olduğu görülmektedir. Bu araştırmaların önemli bir kısmını, çiftlik hayvanı yetiştiriciliğinde büyüme, süt verimi, et kalitesi, hastalıklara direnç gibi ekonomik olarak önemli kantitatif özellikleri kontrol eden genlerin araştırılması ve bu genlerin sahip oldukları çeşitliliklerin belirlenmesi oluşturmaktadır. Üstelik söz konusu özelliklerle ilgili bazı gen bölgeleri türler arasında ortak olup birbiri için referans bilgilere sahip olabilmektedir. Bu bakımdan bu özellikler üzerinde etkisi olan yeni genlerin belirlenmesi yada daha önce belirlenen genlerle ilgili yeni genetik verilerin elde edilmesi ıslah programları için büyük önem taşımaktadır. Bu kapsamda çiftlik hayvanlarında yürütülen ıslah programlarında hayvanlardan elde edilen fenotipik ve genotipik verilerin birlikte değerlendirilip kullanılması ıslah çalışmalarına büyük hız kazandırmaktadır. Bu çalışmalar sonucunda çiftlik hayvanlarının genomlarının aydınlatılması, üretimde verimliliğin arttırılması, genetik çeşitliliğin korunması ve ırkların güvenliği açısından büyük önem taşımaktadır. Bununla birlikte yapılan genetik araştırmalar değerlendirildiğinde, koyunlarda yapılan araştırmaların çiftlik hayvanı türleri içerinde özellikle sığırlarla karşılaştırıldığında oldukça az ve sınırlı olduğu değerlendirilmektedir. Bu durum aslında koyunların yeni genetik çalışmalar yapılması için önemli bir potansiyele sahip olduğunu göstermektedir. Günümüzde, bir çok hayvan türünün ıslahında markere dayalı seleksiyon yönteminden faydalanılmaktadır. Koyunlarda ise önemli verim özellikleriyle ilgili yeteri kadar marker ve kantitatif özellik lokusu belirlenmediği için seleksiyonda yaygın olarak klasik ıslah yöntemleri uygulanmaktadır. Bu durum doğal olarak ıslahta istenilen hedeflere varılmasını zorlaştırmaktadır. Koyun ıslahında yaşanan bu sıkıntıların aşılması için koyunlarda genetik araştırmaların arttırılması büyük önem arz etmektedir.
Bu projenin kapsamında çalışılacak olan kalpastatin (CAST), leptin (LEP) ve insülin benzeri büyüme hormonu 1 (IGF1) genleri birden fazla özelliği aynı anda etkileme potansiyeline sahip pleotropik (pleiotropic) etkili genlerdir. Bu nedenle söz konusu genlerle ilgili çiftlik hayvanlarında çok sayıda çalışma bulunmaktadır. Bununla birlikte oldukça polimorfik bir yapıya sahip bu genlerle ilgili daha aydınlatılması gereken birçok nokta bulunmaktadır. Bu bakımdan bu projenin konusunu Kıvırcık melezi kuzularda, çiftlik hayvanlarında büyüme, et kalitesi ve karkas özellikleri ilgili
2
önemli markerler arasında bulunan CAT, LEP ve IGF1 genlerine ait polimorfizmlerin araştırılması oluşturmaktadır.
GENEL BİLGİLER
Islah kelimesi düzeltme ve iyileştirme anlamına gelmektedir. Bu bakımdan hayvan ıslahı bir populasyonda bulunan hayvanlara ait özelliklerin istenen istikamette iyileştirilmesi anlamına gelmektedir. Hayvan ıslahında istenilen hedefe kısa sürede ulaşılmasında genetik ilerleme hızı büyük önem taşımaktadır. Klasik hayvan ıslahında saf yetiştirme ve seleksiyondan yaralanılmaktadır. Bununla birlikte saf yetiştirme ve seleksiyonla elde edilecek genetik ilerleme oldukça sınırlı olmaktadır.
Bu durum Türkiye de bulunan yerli koyun ırklarında dünden bugüne yapılan melezleme çalışmalarının temelini oluşturmaktadır. Melezleme en klasik tabirle farklı ırktaki hayvanların çiftleştirilmesidir. Bu çiftleştirmenin sonunda ebeveynlerinden üstün fenotipik değere sahip hayvanların elde edilmesi beklenmektedir. Söz konusu üstün fenotipin ortaya çıkmasında genotipin ve çevrenin ortak etkileri vardır. Bu etkiler arasında çevre etkilerinin kontrolü nispeten daha kolay olmaktadır. Bununla birlikte genotipik farklılıklardan meydana gelen etkilerin sürekli takip edilmesi gerekmektedir. Genotipik farklılıkların ortaya çıkmasından sorumlu olan kantitatif karakter lokuslarının (QTL) üzerinde çok sayıda genin ortak etkileri bulunmaktadır.
Bu etkilerin ortaya çıkarılması söz konusu genlere ait yolakların aydınlatılmasına bağlıdır. Genlere ait yolakların aydınlatılmasında ise gen polimorfizmlerinden yararlanılmaktadır. Bu bakımdan özelikle son yıllarda çiftlik hayvanlarında ekonomik öneme sahip kantitatif özellikleri etkileyen genlere ait polimorfizmleri araştıran çalışmalarda hızlı bir artış görülmektedir. Bununla birlikte, genetik araştırmalar sonucu söz konusu genlerle ilgili elde edilen bilgilerin hala oldukça sınırlı olduğu ve yeni bilgilere ihtiyaç duyulduğu görülmektedir.
Türkiye sahip olduğu doğal ve ekonomik koşulları, tarımsal yapısı, gelenekleri ile koyun yetiştiriciliğinin yaygın olarak yapılmasına elverişlidir ve koyun eti ülkemizde hemen her yerde yaygın olarak tüketilmektedir. Ülkemizde, koyun yetiştiriciliği için çoğu etmenin mevcut olmasına rağmen kırmızı et üretimi son derece yetersizdir.
Küçükbaş hayvancılıkta et üretim miktarı karkas ağırlığı ve hayvan sayısı ile doğru orantılı olarak değişim göstermektedir. Bu nedenle koyun varlığındaki sayısal artışın yanında karkas ağırlığındaki artış da önem kazanmaktadır. Bu nedenle besi koyunculuğunda ıslah çalışmalarının hedeflerinden biride karkas ağırlığının arttırılmasıdır.
Kıvırcık ırkı koyunlar Türkiye de özellikle Marmara bölgesinde (Tekirdağ, Edirne, Kırklareli, İstanbul, İzmit, Bursa, Çanakkale, Balıkesir ve Sakarya ilerinde Ege bölgesinde İzmir, Aydın ve Manisa illerinde yetiştiriciliği yapılan yerli koyun ırkımızdır.
Kıvırcık ırkı Türkiye koyun popülasyonunun yaklaşık olarak % 6-7' sini oluşturmaktadır. Kıvırcık koyunu et, süt ve yapağı verim yönü iyi olan kombine bir ırktır. Kıvırcık koyununun sürü içgüdüsü ve adaptasyon yeteneği yüksektir. Çevre koşullarına oldukça dayanıklı kanaatkar bir hayvan olan kıvırcık koyununun eti oldukça yumuşak ve lezzetlidir (Anonim, 2017a; Kaymakçı ve ark. 2001).
Canlı ağırlık artışı, karkas özellikleri, et kalitesi gibi ekonomik olarak önemli birçok özellik, her biri küçük etkiye sahip çok sayıda genin kontrolü altındadır. Bu gibi özelliklerden sorumlu lokuslara kantitatif özellik lokusu (QTL) denilmektedir. Kantitatif özellikli lokus (QTL) üzerine yapılan araştırmaların temel amacı marker destekli seleksiyon (MAS) programlarında kullanılabilecek genler veya markerlerin belirlenmesidir. DNA markerleri, bir tür içerisindeki farklı bireylerde dizi polimorfizmi
3
gösteren DNA bölgeleridir ve varyasyonun belirlenmesinde günümüzde en sık kullanılan yöntemdir. Çiftlik hayvanlarında ekonomik özellikler ile ilişkili bir çok kantitatif özellik lokusu tespit edilmiştir, bunlardan biride koyunlarda beşinci kromozom üzerinde bulunan CAST genidir (Palmer ve ark. 1998). Kalpastatin kalpainlerin endojen inhibitörüdür. Bununla birlikte, kalsiyum iyonlarının varlığında aktif bir kalpain-calpastatin kompleksinin oluşması, hücresel fonksiyon üzerinde önemli bir etkiye sahiptir. Sinaptik iletişim, salgılama, hücre farklılaşması, kas proteinlerinin metabolizması gibi önemli yaşam süreçlerinin düzenlenmesini de sağlamaktadır (Sato ve Kawashima 2001, Goll ve ark. 2003).Postmortem süreçte CAST geni kalpain aktivitesi üzerinden et gevrekliğini düzenlemektedir (Kawasaki ve Kawashima 1996). Cast geninin ayrıca sığırlarda et kalite parametreleri ile ilişkili olduğu bildirilmektedir (Schenkel ve ark. 2006).
Koyunlardaki CAST geni (Gene ID: 443364) 5. kromozom üzerinde bulunmaktadır. 29 ekzondan oluşur ve toplam 89.553 bp büyüklüğündedir. Ekson 1C ve 1D arasındaki ilk intronda yer alan bir gen polimorfizmi, restriksiyon endonükleaz (MspI) kullanılarak PCR-RFLP yöntemi ile belirlenebilmektedir (Palmer ve ark. 1998).
Farklı koyun ırklarındaki Cast/MspI polimorfizmi incelemeleri, CAST genotipleri ile koyun büyüme ve canlı ağırlık özellikleri arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki olduğunu göstermiştir (Riaz ve ark. 2012, Sunilkumar ve ark. 2014).
Yılmaz ve ark. 2014 yaptıkları çalışmada Kıvırcık ırkı kuzularda karkas kalite karakteristikleri ile CAST geninin ilişkisini araştırmışlardır. Kıvırcık kuzularda CAST lokusunun M allelinin en yaygın allel olduğu tespit etmişlerdir. MM, MN ve NN genotipleri için genotip frekansları sırasıyla %72.91, %22.66 ve %4.43 olarak bulmuşlardır. Bu tek nokta mutasyonunun bel gözü kasına ait yağ kalınlığı ve deri- yağ kalınlığı değerleri ve günlük canlı ağırlık artışı ile ilişkili olduğu bildirilmektedir (Yilmaz ve ark. 2014).
Avanus, 2015, yerli koyun ırklarında CAST genine ait genetik çeşitliliği PCR- RFLP yöntemi ile araştırmıştır. Çalışmada 6 farklı yerli koyun ırkı; Kıvırcık, İmroz, Karayaka, Hemsin, Morkaraman ve Karagül kullanmıştır. Araştırmacı, genetik analizler ile M (336 bç ve 286 bç) ve N (622 bç) olmak üzere iki alleli tespit etmiştir.
Allel frekanslarında ise en yüksek M allel frekansı İmroz (%96), N allel frekansı ise Kıvırcık ırkında belirlemiştir. MN, MM ve NN genotip frekansları en yüksek olarak sırasıyla Kıvırcık (%60), İmroz (%92.6) ve Morkaraman (%7.1) ırklarında belirlemiştir.
Çalışmada, Kıvırcık, İmroz, Karayaka ve Karagül ırklarında NN genotipi belirlenememiştir. Heterozigotluk değeri Kıvırcık ırkında en yüksek (%60) iken, İmroz ırkında en düşük (%7.4) olarak bildirilmektedir.
Riaz ve ark. (2012) koyunlarda ve keçilerde Cast/MspI polimorfizmini araştırmışlardır. Keçilerde Cast/MspI polimorfizmi yönünden varyasyon tespit edilememişken koyunlarda farklı genotipleri tespit etmişlerdir. İstatistik analizleri sonucunda ortalama canlı ağırlık kazancı ile Cast/MspI polimorfizmi arasında ilişki olduğunu rapor etmişlerdir. MN genotipine sahip hayvanların diğer genotiplere göre önemli derecede yüksek canlı ağırlık kazancına sahip oldukları tespit edilmiştir. Cast geninindeki bu tek nükleotid polimorfizminin büyüme oranı ile ilgili olarak marker olarak kullanılabileceğini önermişlerdir.
Leptin sığırlarda enerji metabolizması, büyüme ve üreme regülasyonunda görev alan bir protein olduğu için kantitatif özellik lokusu çalışmaları için önemli bir aday gendir (Choudhary ve ark. 2005). Leptin ağırlıklı olarak yağ dokusu tarafından üretilirken daha düşük miktarlarda mide, iskelet kası ve plasenta tarafından üretilmektedir. Leptin hormonu depolanan enerji düzeyindeki değişiklikleri sinyal olarak beyne ileterek gıda alımı ve enerji harcamaları arasındaki dengeyi sağlar ve
4
vücut ağırlığını düzenler (Zhou ve ark. 2009). Plazmadaki leptin seviyesi koyunlarda ve sığırlarda vücut yağ kütlesi ve enerji dengesi ile doğrusal olarak ilişki içindedir.
LEP geni 4. kromozom üzerinde bulunur ve 3 eksondan oluşmaktadır. LEP geni varyasyonlarının hayvanlarda karkas ağırlığı üzerine etkisinin incelendiği bir çok araştırma yapılmıştır. Shojaei ve ark, (2010) LEP geninin 3.ekson bölgesinde 275 bç’lik bir bölgeyi çoğaltarak tek zincir konformasyon analizi (SSCP) metodu ile varyasyon analizi yapmışlardır. Koyun LEP geninin bu bölgesinde 10 genotip tespit etmiş ve bu genotiplerin koyunların büyüme özelliklerini önemli derecede etkilediklerini tespit etmişlerdir. Leptin geninin koyun seleksiyonunda seçici bir kriter olarak kullanılabileceğini önermişlerdir.
Jonas ve ark. (2016), koyunlarda LEP ve LEP reseptörü genlerindeki polimorfimzlerin dolaşımdaki leptin miktarı ve enerji döngüsü ile ilişkisini araştırmışlardır. Leptin geninde tespit edilen 2 tekli nükleotit polimorfizminin (SNP) dolaşımdaki leptin konsantrasyonu ile ilişkili olduğunu, bir SNP’nin ise süt üretimi ile ilişkili olduğunu bulmuşlardır.
Boucher ve ark. (2006) Dorset ve Suffolk ırkı kuzularda LEP geni polimorfizmleri ile büyüme, karkas kompozisyonu, longissimus kas yapısı ve metabolik özellikler ile ilişkisini araştırmışlardır. Suffolk ırkında A103G polimorfizmi ile kas kalınlığı, bel gözü kası alanı, kesim kuvveti ve longissimus kas yapısı arasında ilişki bulmuşlardır.
Dorset ırkında ise A103G polimorfizminin Longissimus kasında artan sitrat sentetaz aktivitesi ve deri altı yağ miktarı ile ilişkili olduğu belirlenmiştir.
Hajihosseinlo ve ark. (2012), leptin polimorfizmleri ile doğum ağırlığı, sütten kesim ağırlığı, 6 aylık ağırlık, 9 aylık ağırlık ve doğum ile sütten kesim arasında ortalama günlük canlı ağırlık kazancı arasındaki ilişkiyi araştırmışlardır. Vücut ağırlıkları ile leptin geni polimorfizmlerinin ilişkili olduğunu rapor etmişlerdir.
Omurgalılarda, büyüme ekseninde yer alan IGF1, fizyolojik ve metabolik süreçlerde önemli rol oynamaktadır (De la Rosa Reyna ve ark. 2010). IGF1, birçok biyolojik etkinin aracıdır; glikoz emilimini arttırır, miyogenezisi uyarır, apoptozu inhibe eder, hücre döngüsü genlerinin aktivasyonuna katılır, lipidlerin sentezini arttırır, granüler hücrelerde progesteron üretimini uyarır ve hücre çoğalmasında DNA, RNA ve protein sentezine etki eder. IGF1 ayrıca üreme, fetüs gelişimi ve büyümeyi içeren fizyolojik süreçlerin tümünde önemli rol oynamaktadır (He ve ark. 2012).
Sığır IGF1 geninin regulatör bölgesindeki bir SNP’nin gen transkripsiyonunu etkilediği dolayısıyla büyüme özellikleri üzerinde etkiye sahip olduğu gösterilmiştir (Ge ve ark. 2001). IGF1 geninin regülatör bölgesinde bulunan bazı polimorfizmlerin ise süt koyunlarında, laktasyon sırasındaki süt verimini etkilediği Scata ve ark. (2010) tarafından rapor edilmiştir. He ve ark.(2012) ise IGF1 geninin regülatör bölgesindeki SNP’lerin kuzulama üzerine etkilerini rapor etmişlerdir.
MATERYAL VE YÖNTEM
Hayvan Materyali ve Verilerin Toplanması:
Çalışma için Lider Et İpsala tesisinde kesimi yapılan 100 Kıvırcık melezi kuzunun boyun bölgesinden kas doku örnekleri alınmıştır. Alınan kuzu örnekleri Türk Vet hayvan kayıt sisteminde Kıvırcık melezi olarak görünmekle birlikte üreticiyle yapılan görüşmede kesilen hayvanların melez tipi olarak Kıvırcık x Merinos melezi kuzular olduğu ifade edilmiştir. Alınan örnekler çalışma yapılıncaya kadar Namık Kemal Üniversitesi, Veterinerlik Fakültesi, Genetik Laboratuvarında -20 °C’de muhafaza edilmiştir. Genetik analizlerde LEP, CAST ve IGF1 genleri üzerindeki
5
SNP’ler polimeraz zincir reaksiyonu restriksiyon fragment uzunluk polimorfizmi (PCR- RFLP) metodu ile tespit edilmiştir. Örneklerin genotiplendirilmesinden sonra gen ve genotip frekansları belirlenmiştir.
Moleküler Genetik Analizler:
DNA İzolasyonu
DNA izolasyonu ticari DNA izolasyon kitiyle (GeneMATRIX Tissue, Bacterial DNA Purification Kit) üretici firmanın prosedürüne göre yapılmış olup izolasyon aşamaları maddeler halinde açıklanmaktadır. DNA izolasyonu sonrasında örnekler jelde yürütülerek kontrol edilmiştir
1-.2 µl’lik tüplere spin kolonlar yerleştirilip üzerine 40 µl Buffer T konulup oda sıcaklığında inkubasyona bırakılmıştır
2- 25 mg'lık koyun doku kesitleri 2 µl’lik tüplere konulmuştur
3- Örnekler üzerine 2 µl RNase A ve 20 µl Proteinase K konulup vorteks aracılığı ile karıştırılmıştır
4- Örneklerin üzerine 350 µl Buffer Lyse T konulmuştur 5- Örnekler 56 °C’de 3 saat inkübasyona bırakılmıştır
6- Örneklerin üzerine 350 µl Buffer SOL T ilave edilip vorteks aracılığı ile karıştırılmıştır
7- Örnekler 70 °C’de 10 dakika inkübasyona bırakılmıştır
8- Örneklerin üzerine 350 µl %96’lık etanol eklenip aracılığı ile karıştırılmıştır 9-.Örnekler vorteks aracılığı ile karıştırılmıştır
9- Örnekler 1 dakika 12000 rpm de santrifüje edilmiştir
10- İnkübasyona bırakılmış spin kolonlu tüplerin üzerine kolleksiyon tüpünden 600 µl çözelti konulmuştur
11- Örnekler 1 dakika 12000 rpm de santrifüje edilmiştir 12- Spin kolon çıkarılıp altta kalan çözelti dökülmüştür
13- Spin kolon tekrar tüpe yerleştirilip üzerine kolleksiyon tüpünde kalan çözelti ilave edilmiştir
14- Örnekler 2 dakika 12000 rpm de santrifüje edilmiştir 15- Spin kolon çıkarılıp altta kalan çözelti dökülmüştür
6
16- Spin kolon tekrar tüpe yerleştirilip üzerine 500 µl Wash TX1 çözeltisi konulmuştur
17- Örnekler 1 dakika 12000 rpm de santrifüje edilmiştir 18- Spin kolon çıkarılıp altta kalan çözelti dökülmüştür
19- Spin kolon tekrar tüpe yerleştirilip üzerine 500 µl Wash TX2 çözeltisi konulmuştur
20- Örnekler 2 dakika 12000 rpm de santrifüje edilmiştir
21- Spin kolon yeni bir kolleksiyon tüpüne alınıp üzerine 100 µl önceden 70
°C’de ısıtılmış Elüsyon Buffer konulmuştur
22- Örnekler oda sıcaklığında 3 dakika inkübasyona bırakılmıştır 23- Örnekler 1 dakika 12000 rpm de santrifüje edilmiştir
24- Spin kolan atılıp kolleksiyon tüpünde toplanan DNA çalışma yapılıncaya kadar -20 °C’de saklanmıştır.
Genomik DNA miktarının hesaplanması
İzole edilen DNA’nın miktarı ve saflığı spektrofotometre cihazı ile ölçülmüştür.
DNA’nın ışığı absorbe etme miktarına Optik Density (OD) denilmektedir. 1 OD yoğunlukta 50µg/ml DNA olduğu kabul edilmektedir. DNA’da bulunan bütün bazlar 260 nm’de ultraviyole ışığını absorbe etmektedirler. Bu nedenle spektrofotometre ile DNA miktarının hesaplanması 260 nm dalga boyunda yapılmaktadır. 260 nm’de elde edilen değerler örnekte bulunan nükleik asit konsantrasyonunun miktarının belirlenmesini sağlamaktadır. Bununla birlikte ayrıca spektrofotometre cihazında elde edilen DNA’da bulunan nükleik asitlerin saflığını belirlemek için 260 nm ve 280 nm’deki OD’ler (OD260/OD280) ölçülmektedir. OD260/OD280 değerlerinin 1.8-2.0 arasında olması istenmektedir (Seğmen 2005, Arıca ve ark. 2006).
Çalışmada 100µl steril 1X TBE tampon çözeltisinde çözülen DNA’ların konsantrasyonları 260 ve 280 nm dalga boylarında (OD260/OD280) spektrofotometre ile okunmuş ve konsantrasyonları steril saf su ile 50 ng/µl olacak şekilde eşitlenmiştir.
Bu örnekler eşit miktarlarda % 1’lik agaroz jelinde (1X TBE tamponunda) yürütülerek konsantrasyonlarının eşitliği gözle de gözlenmiş ve DNA’ların parçalanmamış olduğu belirlenmiştir.
Çalışmada Kullanılan Primerler
Çalışmada LEP, CAST ve IGF1 genleri için kullanılan primerler Tablo 1'de gösterilmektedir.
7 Tablo 1. Çalışmada kullanılan primerler
GEN Primerler (5’-3’) Uzunluk Kaynak
LEP F: TGTTGTCCCCTTCCTCCTG
R: CCCACATAGGCTCTCTTCTGC 463 bç Bakhtiar ve ark. 2017
CAST F: TGGGGCCCAATGACGCCATCGATG
R: GGTGGAGCAGCACTTCTGATCACC 622 bç Palmer ve ark. 1998
IGF1 F: TGAGGGGAGCCAATTACAAAGC
R: CCGGGCATGAAGACACACACAT 294 bç He ve ark. 2012
Polimeraz Zincir Reaksiyonu
Tüm PCR uygulamaları Phire Tissue Direct Pcr Master Mix (ThermoFisher LSG-F170L) ile üretici talimatlarına uygun olarak yapılmıştır. Tüm polimorfizmler için PCR reaksiyonları toplam 50 µl hacimde gerçekleştirilmiştir. PCR reaksiyonu 25 µl Phire Tissue Direct Pcr Master Mix, 0,3-0,5 mm doku örneği, 5 µM primer ve hacmin geri kalanı ddH2O olacak şekilde hazırlanmıştır. IGF1, LEP ve CAST genleriyle ilgili PCR koşulları aşağıda gösterilmektedir.
IGF1 (PCR)
98 °C‘de 5 dk başlangıç denatürasyonu 40 döngü
98 °C‘de 5 sn 55 °C‘de 5 sn 72°C‘de 20 sn 72 C‘de 1 dakika LEPTİN (PCR)
98 °C‘de 5 dk başlangıç denatürasyonu 40 döngü
98 °C‘de 5 sn 63 °C‘de 5 sn 72°C‘de 20 sn 72 C‘de 1 dakika CAST (PCR)
98 °C‘de 5 dk başlangıç denatürasyonu 40 döngü
98 °C‘de 5 sn 63 °C‘de 5 sn 72°C‘de 20 sn 72 C‘de 1 dakika
8 Agaroz Jelin Hazırlanması ve dökülmesi
PCR işlemlerinin tamamlanmasından sonra çoğaltılan DNA örneklerinin elektroforetik ayrımı için agaroz jel Prona Agarose (Nu Micropor) kullanılmıştır. PCR ürünleri %2’lik agaroz jelinde yürütülmüştür. Jelin hazırlanması sırasında agaroz, erlen mayerde 1X TBE tampon çözeltisi içinde yüksek sıcaklıkta 300–305°C’de bir mikrodalga fırın içinde 2–3 dk kaynatılarak eritilmiştir. Kaynama esnasında yaklaşık 10–20 s’de bir çözelti sallamak suretiyle şeffaf bir görünüm kazanıncaya kadar karıştırılmıştır. Eriyen jel tepsi içine dökülmeden önce DNA örneklerinin yükleneceği kuyucukların oluşması için çok dişli bir tarak tepsi üzerindeki yuvasına yerleştirilmiştir.
Daha sonra soğutulan eriyik jel kalıbında ve tarakların bulunduğu bölgelerde hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edilerek tepsiye dökülmüştür. Jel donduktan sonra taraklar dikkatli bir şekilde çıkarılarak elektroforez tankının içine yerleştirilmiştir. Daha sonra jelin üst kısmını kapatacak kadar hazırlanan TBE elektrolit çözeltisinden dökülmüştür.
PCR ürünlerinin jel kuyularına yüklenmesi
PCR cihazı ile çoğaltılan DNA örneklerinin jelde yürütülebilmesi, takibi ve elektrolit çözeltisi ile karışmasının önlenmesi amacıyla Loading Dye (Yükleme boyası) adı verilen yükleme çözeltisi hazırlanmıştır. Elektroforez uygulanacak olan her bir PCR ürününden 5µl alınıp yeni tüplerde hazır bulunan her biri 2 µl 6X yükleme çözeltisi ile mikro pipet ucu yardımıyla karıştırılmıştır. Daha sonra karışım jelde hazır bulunan kuyucuklara yüklenmiştir.
Jele yüklenen PCR ürünlerinin jelde yürütülmesi
Jel kuyucuklarına yüklenen PCR ürünlerini elektrik akımı olan ortamda birbirlerinden ayırmak için yatay elektroforez cihazında 120V’da 1-3 saat (ara sıra) kontrol edilerek yürütülmüştür. Kontrolün sebebi, jelin bitiş noktasına kadar PCR ürünlerinin yürümesini engellemektir.
Jelin boyanması ve bantların elde edilmesi
Elektroforez işlemi tamamlandıktan sonra PCR ürünlerinin görüntülenebilmesi için jel elektroforezden çıkarılmıştır. DNA’ların UV ışığı altında gözlemlenebilmesi için jel 0.5µg/ml Ethidium Bromür çözeltisinin içinde 15–25 dk bekletilerek ethidium bromürün jele nüfus etmesi sağlanmıştır. Daha sonra, jel çözelti içerisinden alınarak, RFLP bantlarına ilişkin fotoğraflar jel dokümantasyon sisteminde transilüminatör yardımı ile 254 nm dalga boyundaki UV ışığı altında elde edilmiş ve veriler elektronik ortamda saklanmıştır.
Enzim Kesimi ve Genotiplendirme
Örneklerin genotiplendirilmesi PCR-RFLP (Polimeraz Zincir Reaksiyonu- Restriksiyon Parça Uzunluk Polimorfizmi) metodu ile yapılmıştır. PCR-RFLP metodu, restriksiyon endonükleaz enzimleri ile kesim işlemine tabi tutulan, mutant ve doğal tipteki DNA fragmentinden farklı büyüklüklerde bantlar elde edilmesi esasına dayanmaktadır. Restriksiyon endonükleaz enzimleri yüksek hassasiyette sekans spesifik olarak DNA çift zincirini kesmektedir. DNA sekansındaki tek nükleotid
9
değişimleri, restriksiyon enzimleri için farklı kesim bölgeleri oluşturmaktadır. Enzim ile kesilen amplifiye edilmiş DNA fragmentleri, agaroz jel elektroforezinde koşturularak molekül ağırlıklarına göre ayrılabilmektedir.
Agaroz jel elektroforezi çoğaltılan DNA fragmentlerinin büyüklüklerine göre ayrılmasını sağlamaktadır. Elektrik akımı altında DNA fragmentleri eksiden (-) artıya (+) doğru hareket etmektedir. Bu ayrım metodu, molekül ağırlığı büyük fragmentlerin küçük fragmentlere göre daha yavaş hareket etmesi esasına dayanmaktadır. PCR rekasiyonu sonucunda elde edilen ürünler % 2 ’lik agaroz jelde yürütülüp, UV görüntüleme cihazı ile jel görüntüleri alınmıştır. PCR ürünleri UV ışığı altında görüntülendikten sonra CAST, LEP ve IGF1 genleri için restriksiyon endonükleaz enzimleri ile kesim gerçekleştirilmiştir.
Restriksiyon endonükleaz enzimi olarak, MspI (CAST), BcnI (LEP) ve BfoI (IGF1) enzimleri kullanılmıştır (Palmer ve ark. 1998; Bakhtiar ve ark. 2017; He ve ark.
2012). Restriksiyon endonükleaz enzimleri, üreticinin talimatlarına uygun olarak, enzim ile birlikte gelen saklama ve reaksiyon tamponları ile kullanılmıştır. Kesim reaksiyonlarında LEP geni 10 μl PCR ürünü 2 μl (20 U) BcnI (ER0061, ThermoFisher) enzimiyle at 37°C'de 3 saat inkübasyona bırakılmıştır. IGF1 geni 10 μl PCR ürünü 2 μl (20 U) Fast Digest BfoI (FD2184, ThermoFisher) enzimiyle 37°C'de 15 dakika inkübasyona bırakılmıştır. CAST geni 10 μl PCR ürünü 2 μl (20 U) MspI (Fermentas - Kat.No: ER0541) enzimiyle at 37°C'de 5 saat inkübasyona bırakılmıştır.
Kesim sonrasında elde edilen ürünler yine % 2’ lik agaroz jelde yürütülüp, UV görüntüleme cihazı ile jel görüntüleri alınıp genotipleme yapılmıştır. CAST, IGF1 ve LEP genleri için genotipleme Tablo 2,3,4’ te gösterilmektedir.
Tablo 2. CAST geni genotipleri
Ürün (bç) AA BB AB
622 ___ ___
374 ___ ___
248 ___ ___
Tablo 3. LEP geni genotipleri
Ürün (bç) AA BB AB
463 ___ ___
270 ___ ___
193 ___ ___
10 Tablo 4. IGF1 geni genotipleri
Ürün (bç) AA BB AB
294 ___ ___
194 ___ ___
100 ___ ___
İstatistik Analizler:
Hardy-Weinberg kuralına göre allel genlerin ve genotiplerin frekansları belirlenmiştir. Değerlendirmeler Popgene32 1.31 versiyon programı kullanılarak yapılmıştır (Yeh ve ark., 1997).
BULGULAR VE TARTIŞMA
Leptin Geni Polimorfizminin Belirlenmesi
Bu çalışmada, Kıvırcık melezi kuzularda LEP geni ekzon 3 bölgesinde LEP (170.G>A) tek nükleotid değişimine ilişkin bir polimorfizm olup olmadığı araştırılmıştır.
100 Kıvırcık melezi kuzuda ilgili gen bölgesi çoğaltılmış örnekler istatistiki değerlendirmeye alınmıştır.
Leptin Geni Polimorfizm Sonuçları
Kıvırcık melezi kuzularda ekzon 3 bölgesinde LEP (170 G>A) tek nükleotid polimorfizmiyle ilgili GG, GA ve AA olmak üzere 3 genotip belirlenmiştir (Şekil 1).
Şekil 1. LEP/BcnI genotipleri
Çalışmada GG, GA ve AA genotip frekansları sırasıyla 0.90, 0.09 ve 0.01 olarak belirlenmiş olup A ve G allelleri için allel frekansları sırasıyla 0.055 ve 0.945 olarak bulunmuştur. Yapılan analiz sonucunda Kıvırcık melezi kuzu populasyonunun LEP/BcnI genotipleri bakımından Hardy-Weinberg dengesinde olduğu belirlenmiştir
11
(P>0.05). Kıvırcık melezi kuzularda ekzon 3 bölgesinde LEP (170 G>A) tek nükleotid polimorfizmiyle ilgili allel ve genotip frekansları Tablo 5'te verilmektedir.
Tablo 5. LEP/BcnI allel ve genotip frekansları
LEP S
Genotipler Genotip Frekansları Allel Frekansları (χ²)1
GG GA AA GG GA AA G A 2.10ÖD
Gözlenen 100 90 9 1 0,90 0,09 0.01
0.9450 0.0550 Beklenen 100 89.2764 10.4472 0.2764 0.89 0.10 0.0027
1 χ 20.05;1 ; 3,84Hardy-Weingberg dengesi, ÖD; önemli değil (P > 0.05)
Bu çalışmada, Kıvırcık melezi populasyonunda Lep/BcnI (ekzon 3) bölgesinde G alleli homozigot olarak bulunmuştur. Aynı gen bölgesinde yapılan çalışmalarda benzer olarak, Jonas ve ark. (2016) İvesi x Merinos melezlerinde A ve G allel frekanslarını sırasıyla 0.08 ve 0.92 olarak bildirmektedir. Herri koyunlarında A ve G allel frekansları sırasıyla 0.086 ve 0.914 olarak bulunmuştur (Mahmoud ve ark., 2014). Sanjabi koçlarında yapılan bir diğer çalışmada A ve G allel frekansları sırasıyla 0.086 ve 0.914 olarak belirlenmiştir (Bakhtiar ve ark., 2017). Literatür bildirişlerinin araştırma sonuçlarıyla uyumlu olduğu görülmektedir.
LEP geniyle ilgili koyun ırklarında belirlenmiş farklı polimorfik bölgeler bulunmaktadır. Cauveri ve ark.(2014) Nilagiri koyunlarında LEP ekzon 3 (16973 G>A, 17476 C>T) polimorfizmlerini çalışmışlardır. Araştırmacılar allel frekanslarını 0.87 (C) ve 0.13 (T) olarak rapor etmektedir. Bir başka çalışmada Malpura koyunlarında LEP ekzon 3 T387G lokusu polimorfik bulunmuş olup G ve T allel frekansları 0.82 ve 0.18 olarak bulunmuştur (Meena ve ark., 2017). Mahmoud ve ark.(2014) Herri koyunlarında LEP geniyle ilgili farklı polimorfik bölgelerin varlığını araştırmışlardır.
İlgili çalışmada 248 (CTG/CCG-transisyon), 286 (GTG/TTG- transversiyon) ve 332 (CGG/CAG- transisyon) lokasyonlarındaki polimorfik bölgelerin birbirine benzer olmadığını; bununla birlikte 213 (ACC/GCC transisyon) ve 216 (CCA/CCG transisyon) olmak üzere birbirine benzer iki polimorfik bölgenin olduğunu bildirmektedir.
CAST Geni Polimorfizminin Belirlenmesi
Bu çalışmada, Kıvırcık melezi kuzularda CAST/MspI polimorfizminin olup olmadığı araştırılmıştır. Bu amaçla, 100 Kıvırcık melezi kuzuda ilgili gen bölgesi çoğaltılmış örnekler istatistiki değerlendirmeye alınmıştır.
Kalpastatin Geni Polimorfizm Sonuçları
Kıvırcık melezi kuzularda CAST/MspI polimorfizmiyle ilgili MM, MN ve NN olmak üzere 3 genotip belirlenmiştir (Şekil 2).
12 Şekil 2. CAST/MspI genotipleri
Çalışmada MM, MN ve NN genotip frekansları sırasıyla 0.82, 0.16 ve 0.02 olarak belirlenmiş olup M ve N allelleri için allel frekansları sırasıyla 0.90 and 0.10 olarak bulunmuştur. Yapılan analiz sonucunda Kıvırcık melezi kuzu populasyonunun CAST/MspI genotipleri bakımından Hardy-Weinberg dengesinde olduğu belirlenmiştir (P>0.05). Kıvırcık melezi kuzularda CAST/MspI polimorfizmiyle ilgili allel ve genotip frekansları Tablo 6'da verilmektedir.
Tablo 6. CAST/MspI allel ve genotip frekansları
CAST S
Genotipler Genotip Frekansları Allel
Frekansları (χ²)1
MM MN NN MM MN NN M N 1.39öd
Gözlenen 100 82 16 2 0.82 0.16 0.2
0.90 0.10 Beklenen 100 80.9548 18.0905 0.9548 0.80 0.18 0.0095
1χ20.05;1; 3.84Hardy-Weingberg dengesi, ÖD; önemli değil (P>0.05)
Kıvırcık melezi populasyonunda CAST/MspI polimorfizmiyle ilgili yapılan çalışmada M alleli homozigot olarak bulunmuştur. Bu sonuç, kıvırcık koyunlarında CAST/MspI polimorfizmiyle ilgili yapılan diğer çalışmalarla M (0.85) (Yılmaz ve ark., 2014) ve M (0.70) (Avanus 2015) uyumludur. Bununla birlikte, farklı koyun ırkı popülasyonlarında CAST/MspI polimorfizmi ile ilgili birçok çalışma bulunmaktadır.
Literatür bildirişlerine göre bu çalışmada belirlenen M allel frekansı (0.90); Lori koyunları 0.63 (Asadi ve ark., 2014), Sakız koyunları 0.34 (Yılmaz ve ark., 2014), Najdi koyunları 0.66 (Saleha 2015), (0.72) Sanjabi, (0.63) Afshari, (0.69) Ghezel, (0.48) Arkhamerino ve (0.33) Mehraban koyunları (Tohidi 2013), Polonya Merinos koyunları 0.76 (Szkudlarek-Kowalczyk ve ark., 2011), Bandur koyunları 0.74 (Sunilkumar ve ark., 2014), İvesi (0.50), Güney Karaman (0.52) ve Akkaraman koyunu (0.52) (Balcıoğlu ve ark., 2014), Karakul 0.73 (Avanus 2015) koyunlarında bildirilen M allel frekanslarından yüksektir. Buna karşın, İmroz koyunu 0.98 (Yılmaz ve ark., 2014), Berrichon du Cher (0.92) ve Ile de France (0.95) (Szkudlarek- Kowalczyk ve ark., 2011), Gökçeada 0.95 (Yılmaz ve ark., 2014), Shumen 0.92
13
(Georgieva ve ark., 2015) koyunlarında bildirilen M allel frekansı bu çalışmada belirlenen M allel frekansından (0.90) yüksektir.
IGF1 Geni Polimorfizminin Belirlenmesi
Bu çalışmada, Kıvırcık melezi kuzularda IGF1 geni 5ᶦ regulatör bölgesinde tek nükleotid değişimine ilişkin bir polimorfizm olup olmadığı araştırılmıştır. 100 Kıvırcık melezi kuzuda ilgili gen bölgesi çoğaltılmış örnekler istatistiki değerlendirmeye alınmıştır.
IGF1 Geni Polimorfizm Sonuçları
Kıvırcık melezi kuzularda IGF1 geni 5ᶦ regulatör bölgesinde tek nükleotid polimorfizmiyle ilgili AA, AB ve BB olmak üzere 3 genotip belirlenmiştir (Şekil 3).
Şekil 3. IGF1/BfoI genotipleri
Çalışmada IGF1/BfoI polimorfizmi için genotip frekansları sırasıyla 0.85 (AA), 0.13 (AB) ve 0.02 (BB) olarak belirlenmiş olup A ve B allelleri için allel frekansları sırasıyla 0.055 ve 0.945 olarak bulunmuştur. Yapılan analiz sonucunda Kıvırcık melezi kuzu populasyonunun IGF1/BfoI genotipleri bakımından Hardy-Weinberg dengesinde olduğu belirlenmiştir (P>0.05). Kıvırcık melezi kuzularda IGF1 geni 5ᶦ regulatör bölgesinde tek nükleotid polimorfizmiyle ilgili allel ve genotip frekansları Tablo 7 'de verilmektedir.
14
Tablo 7. IGF1/BfoI allel ve genotip frekansları
IGF1 S
Genotipler Genotip Frekansları Allel Frekansları (χ²)1
AA AB BB AA AB BB A B 3.00ÖD
Gözlenen 100 85 13 2 0.85 0.13 0.12
0.9150 0.0850
Beklenen 100 83.6834 15.6332 0.6834 0.83 0.15 0.0068
1χ20.05;1; 3.84Hardy-Weingberg dengesi, ÖD; önemli değil (P>0.05)
5ᶦ regulatör bölgesi IGF1 geninin polimorfik bölgeleri arasında yer almaktadır.
Bu bölgede yapılan çalışmalarda, He ve ark.(2012) C1511G ve A1513G olarak isimlendirilen iki polimorfizm belirlemişlerdir. İlgili çalışmada A ve B allel frekansları Tail Han koyunlarında (0.809-0.191), Hu koyunlarında (0.638-0.362), Texel koyunlarında (0.969-0.031) ve Dorset koyunlarında (1.000-0.000) olarak belirlenmiştir. Trukhachev ve ark.(2016) Rusya Sovyet Merinos koyunlarında IGF1 geninin 5ᶦ regulatör bölgesinde allel frekanslarını 0.87 (C) ve 0.13 (T) olarak bildirmektedir. IGF1 geninin 5ᶦ regulatör bölgesinde yapılan çalışmalarda Small Tail Han, Texel ve Rusya Sovyet Merinos koyunlarında bildirilen allel frekansları araştırma sonuçlarıyla uyumlu görülmektedir. Bununla birlikte, koyunlarda IGF1 geninin farklı bölgeleriyle ilgili yapılan çalışmalar bulunmaktadır. Makoei koyunlarında IGF1 (Ekson 1) bölgesinde yürütülen çalışmada allel frekansları 0.73 (A) ve 0.27 (G) olarak bulunmuştur (Moradian ve ark., 2013). Polish Lowland koyunlarında IGF1 (Ekson 3) bölgesinde yapılan çalışmada herhangi bir polimorfizme raslanılmadığı bildirilmektedir (Niznikowski ve ark., 2014). Kazemi ve ark. (2011) Zel koyunlarında IGF1 geninin promotor bölgesinde polimorfizm belirlemişlerdir. İlgili çalışmada allel frekansları 0.71 (A) ve 0.29 (B) olarak verilmektedir. Pomeranian Coarsewool koyunlarında IGF1 (Ekson 3) bölgesinde yürütülen çalışmada allel frekansları 0.205 (C) ve 0.795 (T) olarak bildirilmektedir (Proskura ve Szewczuk, 2014). Bir diğer çalışmada, IGF1 geninin 5′ flanking bölgesinde A ve B alleli için allel frekansları sırasıyla 0.92 and 0.8 olarak belirlenmiştir (Grochowska ve ark., 2011).
SONUÇ
Türkiye sahip olduğu doğal ve ekonomik koşulları, tarımsal yapısı, gelenekleri ile koyun yetiştiriciliğinin yaygın olarak yapılmasına elverişlidir ve koyun eti ülkemizde hemen her yerde yaygın olarak tüketilmektedir. Bununla birlikte, yapılan istatistiklere göre Türkiye'nin koyun varlığının yıllar itibariyle azaldığı görülmektedir. Bu durum doğal olarak kesilen hayvan sayısını ve üretilen et miktarını olumsuz yönde etkilemektedir. Hayvan ıslahının en önemli amaçlarından biri ekonomik üretim yapmaktır. Bu bakımdan populasyonu oluşturan hayvanların genetik kapasitesinin yükseltilip birim hayvan başına düşen verimi arttırmaya yönelik yapılan seleksiyon çalışmaları hayvan ıslahının temelini oluşturmaktadır.
Genetik biliminde son yıllarda önemli ilerlemeler sağlanmıştır. Bu ilerlemeler sayesinde çiftlik hayvanlarında geleneksel seleksiyon yöntemleri günümüzde genomik seleksiyonla desteklenerek ıslah hedeflerine daha kısa sürede varılması mümkün olmaktadır. Büyüme, et kalitesi ve karkas özellikleri çiftlik hayvanı
15
yetiştiriciliğinde ekonomik olarak üzerinde durulan önemli özellikler arasında bulunmaktadır. Bu amaçla son yıllarda çiftlik hayvanlarında ekonomik olarak üzerinde durulan verim özelliklerini etkileyen genlerin belirlenmesine yönelik çalışmaların hızla arttığı görülmektedir.
Büyüme, et kalitesi ve karkas özellikleri kantitatif özellikler olup binlerce genin ortak etkisiyle şekillenmektedir. Bu özelliklerle ilgili kantitatif özellik lokuslarının (QTL) ve markerlerin belirlenmesi markere dayalı seleksiyon çalışmalarını hızlandırmaktadır. Bu bakımdan verim özelliklerini etkileyen gen, polimorfizm ve kantitatif özellik lokusları arasındaki genetik yolakların aydınlatılması oldukça önemlidir. Bu amaçla bu çalışmada kıvırcık melezi kuzularda çiftlik hayvanı yetiştiriciliğinde ekonomik öneme sahip kantitatif özelliklerle ilişkili LEP, CAST ve IGF1 genleriyle ilgili araştırma yapılmıştır. Araştırma sonuçları söz konusu genlerle ilgili polimorfizmlerin kıvırcık melezi kuzularda bulunduğunu göstermektedir. Bu genlerle ilgili elde edilen verilerin arttırılması için daha fazla çalışma yapılması gerektiği değerlendirilmektedir. Bu bakımdan söz konusu genlerle gelecekte farklı koyun ırklarında yapılacak çalışmaların amaca yönelik önemli katkılar sağlayacağı düşünülmektedir.
16 KAYNAKLAR
ANONİM,2017a.YerliKoyunIrkları.www.tarim.gov.tr/HAYGEM/Belgeler/Hayvancı lık/Küçükbaş (Erişim Tarihi: 12.05.2017)
ARICA, Ş. Ç., AKÇAPINAR, H., BUDAK., F. A., ÜNAL, N., ATASOY, F. 2006.
Bafra (SakızхKarayaka, G1) Koyunlarının RAPD-PCR Yöntemi ile Moleküler Genetik Analizi. TÜBİTAK, Proje No: TBAG-1964 (100T111).
ASADİ N, NANEKARANİ S. KHERDERZADEH S. 2014. Genotypic frequency of calpastatin gene in lori sheep by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) method. African Journal of Biotechnology 13.
AVANUS, K. 2015. Genetic Variability of CAST Gene in Native Sheep Breeds of Turkey. Kafkas Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi 216: 789-794.
BAKHTİAR R, ABDOLMOHAMMADİ A, HAJARİAN H, NİKOUSEFAT Z KALANTAR-NEYESTANAKİ D 2017. Identification of g. 170G> A and g. 332G> A mutations in exon 3 of leptin gene (Bcnl and Cail) and their association with semen quality and testicular dimensions in Sanjabi rams. Animal reproduction science 179:49-56.
BALCIOĞLU MS, KARSLI T, ŞAHİN E, ULUTAŞ Z. AKSOY Y. 2014. Türkiye’de Yetiştirilen Bazı Yerli Koyun Irklarında Kalpastatin (CAST) Geni Polimorfizminin PCR- RFLP Yöntemiyle Belirlenmesi. Tarım Bilimleri Dergisi 20, 427-33.
BOUCHER, D., PALIN M., CASTONGUAY F., GARIÉPY C. POTHIER F. 2006.
Detection of polymorphisms in the ovine leptin (LEP) gene: Association of a single nucleotide polymorphism with muscle growth and meat quality traits. Canadian journal of animal science 861: 31-36.
CAUVERİ D, SİVASELVAM S KARTHİCKEYAN S, TİRUMURUGAAN K KUMANAN K 2014 Allelic polymorphism of exon 3 of leptin gene in Nilagiri sheep identified by sequencing and PCR-RFLP.
CHOUDHARY, V., P. KUMAR, T. K. BHATTACHARYA, B. BHUSHAN and A.
SHARMA 2005. DNA polymorphism of leptin gene in Bos indicus and Bos taurus cattle. Genetics and Molecular Biology 284: 740-742.
DE LA ROSA REYNA, X., H. MONTOYA, V. CASTRELLÓN, A. RINCÓN, M.
BRACAMONTE and W. VERA 2010. Polymorphisms in the IGF1 gene and their effect on growth traits in Mexican beef cattle. Genet Mol Res 92: 875-883.
GE, W., DAVIS M., HINES H., IRVIN K. SIMMEN R. 2001. Association of a genetic marker with blood serum insulin-like growth factor-I concentration and growth traits in Angus cattle. Journal of Animal Science 797: 1757-1762.
GEORGİEVA S, HRİSTOVA D, DİMİTROVA I, STANCHEVA N. BOZHİLOVA- SAKOVA M. 2015. Molecular analysis of ovine calpastatin (CAST) and myostatin (MSTN) genes in Synthetic Population Bulgarian Milk sheep using PCR-RFLP.
Journal of BioScience Biotechnology 4.
GOLL, D. E., V. F. THOMPSON, H. LI, WEI W. CONG J. 2003. The calpain system. Physiological reviews 833: 731-801.
GROCHOWSKA E, BORYS B, JANİSZEWSKİ P, KNAPİK J MROCZKOWSKİ S 2017. Effect of the IGF-I gene polymorphism on growth, body size, carcass and meat quality traits in Coloured Polish Merino sheep. Archiv fuer Tierzucht 60:161.
HAJIHOSSEINLO, A., HASHEMI A. SADEGHS. I 2012. Association between polymorphism in exon 3 of leptin gene and growth traits in the Makooei sheep of Iran.
Livestock Research for Rural Development 249: 543-546.
HE, J., B. ZHANG, M. CHU, P. WANG, T. FENG, G. CAO, R. DI, L. D FANG,.
HUANG TANG Q. 2012. Polymorphism of insulin-like growth factor 1 gene and its
17
association with litter size in Small Tail Han sheep. Molecular biology reports 3910:
9801-9807.
JONAS, E., G. MARTIN, P. CELI, L. LI, M. SOATTIN, P. THOMSON H.
RAADSMA 2016. Association of polymorphisms in leptin and leptin receptor genes with circulating leptin concentrations, production and efficiency traits in sheep. Small Ruminant Research 136: 78-86.
KAYMAKCI, M., OĞUZ, I., UN, C., BİLGEN, G., TAKSIN, T. 2001. Basic characteristics of some Turkish indigenous sheep breeds. Pakistan J Biol Sci, 4, 916- 9.
KAWASAKI, H. KAWASHIMA S. 1996. Regulation of the calpain-calpastatin system by membranes (review). Molecular membrane biology 134: 217-224.
KAZEMİ SM, AMİRİNİA C, EMRANİ H GHARAHVEYSİ S 2011. Study and Identification of Insulin-Like Growth Factor-I Gene Polymorphisms in Zel Sheep Population. American Journal of Animal and Veterinary Sciences.
MAHMOUD A, SALEH A, ABOU-TARBOUSH F, SHAFEY T ABOUHEIF M 2014. Nucleotide sequence polymorphism within exon 3 region of leptin and prolactin genes in Herri sheep. Research Journal of Biotechnology Vol 9:10.
MEENA A, BHATT R, SAHOO A KUMAR S 2017. Polymorphism of the exon 3 of leptin gene in Malpura sheep. Indian J Anim Res 51:469-473.
MORADIAN C, ESMAILNIA G HAJIHOSSEINLO A 2013. Polymorphism of IGF- 1 gene in Makoei Sheep using PCR-SSCP. Eur J Exp Biol 3:490-494.
NIZNIKOWSKi R, CZUB G, KAMINSKi J, NIERADKO M, SWIATEK M, GLOWACZ K SLEZAK M 2014. Polymorphism of insulin-like growth factor (IGF-1) gene in Polish Lowland sheep from Podlaskie voivodship. Annals of Warsaw University of Life Sciences-SGGW Animal Science 53.
PALMER, B., N. ROBERTS, J. HICKFORD and R. BICKERSTAFFE 1998.
Rapid communication: PCR-RFLP for MspI and NcoI in the ovine calpastatin gene. J.
Anim. Sci 765: 1499-1500.
PROSKURA WS and SZEWCZUK M 2014.The polymorphism in the IGF1R gene is associated with body weight and average daily weight gain in Pomeranian Coarsewool ewes. Pak Vet J 34:514-517
RIAZ, M. N., A. GHAFFAR and M. F. U. KHAN 2012. Calpastatin (CAST) gene polymorphism and its association with average daily weight gain in Balkhi and Kajli sheep and Beetal goat breeds. Pakistan Journal of Zoology 442.
SATO, K. and S. KAWASHIMA 2001. Calpain function in the modulation of signal transduction molecules. Biological chemistry 3825: 743-752.
SALEHA Y. ALAKİLLİ M 2015. Analysis of Polymorphism of Caplstatin and Callipyge Genes in Saudi Sheep Breeds Using PCR-RFLP Technique Int. J. Pharm.
Sci. Rev. Res 30, 340-4.
SCATÀ, M. C., G. CATILLO, G. ANNICCHIARICO, G. DE MATTEIS, F.
NAPOLITANO, F. SIGNORELLI and B. MOIOLI 2010. Investigation on lactation persistency and IGF-I gene polymorphisms in dairy sheep. Small Ruminant Research 891: 7-11.
SCHENKEL, F., S. MILLER, Z. JIANG, I. MANDELL, X. YE, H. LI and J.
WILTON 2006. Association of a single nucleotide polymorphism in the calpastatin gene with carcass and meat quality traits of beef cattle. Journal of Animal Science 842: 291-299.
SEĞMEN H. 2005. İdyopatik Jeneralize Epilepsilerde Genetiğin Yeri ve SCN1A Geninde D188V Mutasyonu. Nöroloji Uzmanlık Tezi, İstanbul.
18
SHOJAEI, M., M. M. ABADI, M. A. FOZI, O. DAYANI and A. KHEZRI (2010).
Association of growth trait and Leptin gene polymorphism in Kermani sheep. Journal of Cell and Molecular Research, Citeseer.
SUNILKUMAR, M., C. NAGARAJA, M. JAYASHANKAR, N. FAIROZE and B.
VEEREGOWDA 2014. Molecular studies on meat quality gene in Bandur sheep.
Journal of Cell and Tissue Research 141: 4049.
SZKUDLAREK-KOWALCZYK M, WIŚNIEWSKA E. MROCZKOWSKI S. 2011.
Polymorphisms of calpastatin gene in sheep. Journal of Central European Agriculture 12, 0.
TOHIDI R. 2013. Molecular Analysis of Ovine Calpastatin Gene in Six Iranian Sheep Breeds Using PCR-RFLP. Journal of Animal Production Advances 3, 271-7.
TRUKHACHEV V, SKRİPKİN V, KVOCHKO A, KULİCHENKO A, KOVALEV D, PİSARENKO S, VOLYNKİNA A, SELİONOVA M, AYBAZOV M SHUMAENKO S, 2016. Polymorphısms of The Igf1 Gene in Russian Sheep Breeds And Their Influence on Some Meat Productıon Parameters. Slovenian Veterinary Research 53.
YILMAZ, O., I. CEMAL, O. KARACA and N. ATA 2014. Association of Calpastatin (CAST) gene polymorphism with weaning weight and ultrasonic measurements of loin eye muscle in Kıvırcık lambs. Journal of the Faculty of VeterinaryMedicine, Kafkas University 20: 675-680.
YILMAZ O, SEZENLER T, ATA N, YAMAN Y, CEMAL I. KARACA O. 2014.
Polymorphism of the ovine calpastatin gene in some Turkish sheep breeds. Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences 38, 354-7.
YEH F, YANG R BOYLE T 1997. POPGENE Version 1.32. Ag. For Molecular Biology and Biotechnology Centre, University of Alberta and Center for International Forestry Research
ZHOU, H., J. G. HICKFORD and H. GONG 2009. Identification of allelic polymorphism in the ovine leptin gene. Molecular biotechnology 411: 22-25.
