TIBBİ LABORATUVAR TEKNİKLERİ
SAĞLIK HİZMETLERİ MESLEK YÜKSEKOKULU
TLT116-TIBBİ MİKROBİYOLOJİ - I Öğr. Gör. Nüket ÇALIŞKAN nuket.caliskan@omu.edu.tr
Besiyerine Ekim Yöntemleri
Hafta-5
TLT116-TIBBİ MİKROBİYOLOJİ – I UYGULAMA
2
MİKROBİYOLOJİK ÖRNEK ALMA VE KÜLTÜR YAPMA(KÜLTİVASYON)
• Kültür tanımı:
üzerinde veya içinde
mikroorganizma üretilmiş besiyerlerine kültür adı verilir.
• Kültür tipleri:
• Sıvı kültür
• Katı kültür
• Saf kültür
• Karışık kültür
KÜLTÜR YAPMA (KÜLTİVASYON)
• Mikroorganizmaların bulundukları ortamdan belirli tekniklerle alınarak uygun besleyici ortama (besiyerine) aktarılması ve burada gelişmelerinin sağlanması aşamalarını içerir.
• Kültüre ait bilgiler hazırlık aşamasında örnek besiyerine aktarılmadan besiyerinin hazırlandığı petri kutusu, tüp, balon veya erlenmayer üzerine yazılmalıdır.
KÜLTÜRE AİT BİLGİLER
• İnkübasyonun başlatıldığı tarih ve gerekli ise saat
• Ekimi yapılan örneğin adı veya kodu
• Örneğin dilüsyon oranı (dilüsyon yapılmışsa)
• Gerekirse besiyerinin adı
• Gerekirse inkübasyon sıcaklığı ve süresi
KÜLTÜR ELDE ETME AŞAMALARI
Örnek alma ve alınan örneğin inokülasyona hazırlanması (aseptik koşullarda)
Dilüsyon hazırlama ve İnokülasyon (Ekim, Aşılama)
İnkübasyon
KÜLTÜR
AKTARMA TEKNİKLERİ VE KULLANILAN ALETLER
• İnokülasyon; incelenecek veya geliştirilecek olan kültür mikroorganizmasının uygun besiyerine transferidir.
• İnokulasyon işlemindeöze, iğne öze, pipet, eküvyon (yüzeylerden örnek alınırken) kullanılan aletlerdir.
• İnkübasyon:Kültür elde etmedeki en son aşamadır.
Ekim yapılmış besiyeri içeren kabın uygun bir inkübatörde belirli sıcaklık derecesinde ve belirli süre tutulması işlemidir. İnkübasyon için genellikle etüv ya da su banyosu gibi inkübatörlerden faydalanılır.
AKTARMA TEKNİKLERİ VE KULLANILAN ALETLER
• Ekim yapılarak bir besiyerinde üretilmiş (kültürü yapılmış) mikroorganizmaların çeşitli amaçlar için (çoğaltma, saf kültürlerini elde etmek, üreme ve biyokimyasal özelliklerini incelemek vb.) besiyerinden özeler kullanarak yeni besiyerine aktarma işlemine pasaj denir.
Besiyerine Ekim Yöntemleri
• Sıvı besiyerinde hazırlanan kültürlerde:
✓ Mikroorganizmalar uygun koşullarda sıvı besiyerinde, katı besiyerine göre daha hızlı ürer.
• Bakterinin üremesi tüpte bulanıklık oluşması ile anlaşılır.
• Bulanıklık homojen, üst yüzeyde zar veya dipte çöküntü oluşturacak şekilde olabilir.
• Katı besiyerinde ise bakteriler tabaka halinde veya tek tek koloni oluşturacak şekilde üreyebilirler.
✓ Katı besiyerine ekilen mikroorganizmalar, düştüğü alanda bölünüp çoğalarak koloniler oluşturur. Koloniler, birçok hücrenin üst üste, yan yana gelmesiyle oluşan bir hücre yığınıdır.
PETRİ KUTUSUNDAKİ AGARLI BESİYERİNE İNOKULASYON
• Tek Koloni Ekimi (Sürme)
• Yayma
• Dökme tekniklerinden birisi kullanılarak inokülasyon yapılabilir.
Tek Koloni Ekimi (Sürme Yöntemi)
• Tek koloni ekiminde amaç, plak yüzeyine ekimi yapılacak mikroorganizma kolonilerini diğer bakteri kolonilerinden ayrı üretmektir.
• Ekim örneğindeki hastalık yapıcı
mikroorganizmanın örnekte bulunan diğer
Tek Koloni Ekimi (Sürme Yöntemi)
• Ekim örneği, plak besiyerinin yüzeyine öze (ekim yapmak için kullanılan alet) ile tek koloni (seyreltme ekimi) ekim tekniği uygulanarak ekilir.
• Tek koloni ekiminde besiyerinin ilk ekim bölgeleri birbirine yakın şekilde çok sayıda bakteri içerirken son ekim alanlarında birbirlerine uzak çok az sayıda bakteri bulunur.
Tek Koloni Ekimi (Sürme Yöntemi)
Kolonilerin;
• Büyüklüğü,
• Biçimi,
• Yapısı,
• Rengi,
• Kokusu,
• Hemolitik aktivitesi (alyuvarları hemoliz etme) bakteri türlerinin ayırt edilmesinde önemli özelliklerdir
Tek Koloni Ekimi (Sürme Yöntemi)
• Laboratuvara ilk defa gelmiş idrar, BOS gibi sıvı örnekler, gaita, balgam vb. katı örnekler ve bunların sıvı kültürlerinden plak yüzeyine tek koloni ekimleri yapılır.
• Laboratuvara gelen mikrobiyolojik örneklerin alındıkları eküvyonlarla (Örnek almak amacıyla kullanılan çubuk) veya gaita, idrar, balgam vb.
gönderildikleri steril kaplarından, eküvyon, öze, steril cam pipet, otomatik pipet vb. uygun ekim araçları kullanılarak aşağıdaki yöntemlerle plak besiyeri yüzeyine ekimleri yapılır.
Yayma Tekniği
• petri kutusundaki besiyeri yüzeyine pastör
pipeti ya da 0.1 mL örnek aktarılır. Örnek
Drigalski özesi kullanılarak kurutulmuş agar
yüzeyine uygun şekilde yayılır.
Yayma Tekniği
Yayma tekniği ile ekim aşağıdaki şekillerde gerçekleştirilir.
✓ Öze ile yaygın ekim
✓ Eküvyonla yaygın ekim
✓ Ekim örneğinin otomatik pipetle besiyerine nakletme ve ekimi
✓ Drigalski spatülü (yayma yöntemi ile sayımda kullanılan cam ya da metalden yapılmış kıvrık çubuk.)kullanarak plak besiyeri yüzeyine yaygın ekim yapma
Yayma Tekniği
• Antibiyogram testinde ve idrardaki bakterilerin sayılmasında kullanılan ekim yöntemdir.
• Plak yüzeyine yaygın ekimde amaç ekim örneğinde bulunabilecek mikroorganizmaların plak besiyerinin tüm yüzeyinde yaygın bir şekilde üremelerini sağlamaktır.
Yayma Tekniği
• İdrar kültürlerinden yapılan yaygın ekimler sonunda üreyen mikroorganizmaların koloni sayımına dayalı (ekim örneğinin 1 ml’de bulunan) canlı bakteri sayımları da yapılır.
• Bu amaçla bakteri sayımı yapılacak ekim örneğinden ölçülü öze, otomatik pipet ya da pipet kullanılarak genelde 0.1 ml örnek besiyerine aktarılarak ekim yapılır.
• Antibiyotik duyarlılık testlerinde Mc Farland bulanıklık standartlarına göre ayarlanmış içinde belirli sayıda bakteri bulunan besiyerinden eküvyonla ekim örneği alınır, yine eküvyonla besiyeri yüzeyine yaygın ekim yapılır.
Dökme plak yöntemi (Plak Besiyeri İçine Ekim )
• Sıvı kültürlerden veya sıvı örnekten (seri dilüsyonlar yapılmış) steril pipetle 1mL alınarak steril boş petri kutusuna aktarılır.
Üzerine daha önceden sterilize edilmiş ve 44- 48°C’ye ayarlanmış su banyosunda tutulan katı besiyerinden petri kutusuna 15-20 mL dökülür. Besiyeri içerisinde örneğin homojen dağılması sağlanır.
Dökme plak yöntemi (Plak Besiyeri İçine Ekim )
• Plak besiyeri içine ekim, bakterilerin besiyeri
içinde oluşturdukları koloni morfolojilerini
görmek ve uygun O2 koşullarında üremesini
sağlamak amacıyla ekim örneğinin daha
önceden seyreltilerek katı besiyeri içine
Tüpte Ekim Yöntemleri
• Tüpte Yatık (Yatık Jeloza) Besiyerine Ekim
• Tüpte Dikey Besiyerine Ekim
• Dik Jeloz Besiyerine Çalkalama Kültürü Ekimi
Tüpte Yatık (Yatık Jeloza) Besiyerine Ekim
• Kültürü yapılmış mikroorganizmanın belirlenen uygun kolonisinden iğne öze ile örnek alınarak besiyeri içine ve yüzeyine yapılan ekimdir.
• Amacı bakterinin;
✓ Saf kültürünü elde etmek,
✓ Pigment oluşumunu sağlamak,
✓ Karbonhidratlı besiyerlerinde gaz oluşturmasını sağlamak,
✓ Bakterilerin yayılarak üremesiyle hareketlerini incelemek vb. çalışmaları yapmak amacıyla uygulanan bir ekim yöntemidir.
Tüpte Dikey Besiyerine Ekim (Batırma Ekim)
• Yüksek tabaka halinde dik olarak katılaştırılmış besiyerinde bir iğne ile derin kısımlara tek bir noktadan batırarak ekim yapılır.
• Bakterilerin hareketlerini, karbonhidratlar üzerindeki etkilerini, bakterilerin gaz oluşturma vb. özelliklerini araştırmak amacıyla yapılır. Ayrıca fakültatif anaerop bazı bakterilerin uygun dik besiyerine ekimleri yapılarak üreyen bakterilerin uygun koşul ve ortamlar sağlanarak uzun süre saklanmasında da kullanılır.
Dik Jeloz Besiyerine Çalkalama Kültürü Ekimi
• Bakterilerin oksijene karşı duyarlılıklarını
belirlemek amacıyla yapılan ekim yöntemidir.
SAF KÜLTÜR
✓Bakterilerin kültür karakterlerinin incelenebilmesi için diğer mikroorganizmalarla karışık olmadan saf olarak üretilmesi gerekir.
✓Steril olmayan bir klinik örnekten yapılan kültürler sonucunda karışık kültür elde edilir.
✓Bir karışık kültürden izole edilen farklı bakterilerin ayrı ayrı tanımlanabilmesi için saf kültür olarak üretilmeleri gerekir.
Tek tip mikroorganizmadan oluşan topluluğa saf kültür denir. Değişik ortamlarda saf veya karışık halde bulunan mikroorganizmları katı besiyeri yüzeylerine veya sıvı besiyerine ekmede değişik yöntemler kullanılır. Genelde bu ekimler öze ile yapılır.
Çizgi ekim yöntemleri
Herhangi bir kültürün saflığını test etmek için o kültürden katı besiyerine özeyle çizgi ekim yapılır. İnkübasyon sonucunda benzer görünümde koloniler oluşuyorsa kültür muhtemelen saf demektir. Fakat, farklı tipte koloniler meydana gelmişse karışık demektir.
Ayrıca bu kolonilerden yapılan boyama ve mikroskobik inceleme sonucunda benzer şekilli mikroorganizmalar görülürse saflık test edilmiş olur. Aksi durumda kültür saf değildir.
SAF KÜLTÜR ELDESİ
• Tıbbi mikrobiyoloji laboratuvarında hastadan alınan inceleme örneklerinde hastalık etkenlerinin identifikasyonunun (tanımı) yapılması gerekmektedir.
• Mikrobiyoloji laboratuvarlarında başvurulan identifikasyon yöntemlerinden biri de etkenin uygun katı besiyerine ekim yapılarak kültür elde edilmesidir.
• Uygun katı besiyerlerinde kültürleri yapılmış mikroorganizmaların koloni özelliklerinden yararlanılarak diğer mikroorganizmalardan izolasyonları (ayırma işlemi) yapılır.
SAF KÜLTÜR ELDESİ
• Kültür yöntemiyle mikroorganizmanın izolasyonunda uygun besiyeri seçimi önemlidir.
• Ekimi yapılacak örneğin hastadan alındığı bölge ve etken hakkındaki tahminler ekim
SAF KÜLTÜR ELDESİ
• Boğaz kültürleri: Kanlı agar, çikolatalı agar
• Gaita: EMB, SS agar
• Balgam: Kanlı agar, çikolatalı agar, EMB,
sabouraud agar
Saf Kültür Elde Edilmesi
Bakterilerin üreme ve koloni yapısının, morfolojik özelliklerinin, biyokimyasal etkilerinin, antijen
yapılarının tanınması ve antibiyotiklere duyarlılık deneylerinin yapılması için saf kültür
olarak üretilmeleri gereklidir.
• Saf kültürün tanımlanması için:
– Morfoloji, – Besin ihtiyacı,
– Kültür ve biyokimyasal özellikleri, – Antijenik yapıları,
– Patojenitesi göz önüne alınır.
1. Petri kutusunda azaltma yöntemi:
– Petri 4 bölgeye ayrılır, öze ile alınan örnekten 1.
alandan başlayarak 4. bölgeye kadar ekim yapılır.
– Bir gece etüvde inkübe edildikten sonra 1. bölgede en fazla 4. bölgede en az bakteri kolonisi elde edilir.
– Tek kolonilerden ekim yapıldığında o bakterinin saf kültürü elde edilir.
2. Örnek özel bir işlemden geçirildikten sonra ekim yapılır
1. Sporlu bakterileri üretmek için örnek 800C’de 10 dak veya etil alkolde 1 saat bekletilir.
2. Tüberküloz bakterisini üretmek için örnek %4 NaOH ile 30 dak muamele edilir. Bu sürede aside dirençli olmayan diğer bakteriler ölürler.
3. Özel Besiyerleri Kullanılır
1. Fazla tuz içeren (Chapman) besiyeri………..Stafilokoklar 2. Alkali besiyerleri………… Vibrio cholerae
3. Antibiyotikli besiyeri……Antibiyotiğe dirençli bakteriler
Katı Besiyerinde Bakteri Koloni Özellikleri
• Bakteri kolonileri her bakteri için özeldir.
Prensip olarak belirli bir cins bakteri, aynı birleşimdeki besiyeri ve aynı ortam koşullarında her zaman aynı morfolojik özellikte koloniler oluşturur.
• Bakteri kolonilerinin büyüklüğü, biçimi, rengi, kokusu, hemolitik aktivitesi bakteri türlerinin ayırt edici özelliklerindendir.
S (smooth) koloni:
• Yuvarlak, düzgün kenarlı, düzgün yüzeyli, hafif
kabarık, nemli ve homojen kolonilerdir. Klinik
önemi olan bakterilerin çoğu S-koloni
oluşturur.
R (rough) koloni:
• Düzgün olmayan, yüzeyleri buruşuk veya tanecikli, kenarları girintili çıkıntılı, yassı, basık görünümlüdür. Bacillus antracis, Mycobacterium tuberculosis’in kolonileri R şeklindedir.
• S ve M koloni oluşturan bakterilerin kültürleri uzun süre bekletilir veya uygun olmayan besiyerlerinde üretilirlerse R- koloni tarzında üreme gösterirler.
M (mucoid) koloni:
• Polisakkarit kapsüllü bakterilerin oluşturduğu koloni tipidir. Bu bakteriler, uygun zenginleştirilmiş besiyerinde üretildiklerinde, sümüksü görünümlü, yapışkan, parlak koloniler oluşturur.
• Koloniye öze ile dokunulup çekildiğinde koloni iplik gibi uzar.
L tipi koloni:
• Yüzeyleri kabarık, granüllü, besiyeri içine doğru mıh gibi uzantı yapan, bu kolonilerin görünümü aynı zamanda “sahanda yumurta” görünümü olarak da tarif edilir.
• Bakterilerin L formları ve Mycoplasma türleri L-koloni oluşturur. Bu bakterilerin kolonileri büyüteçle görülebilecek kadar küçüktür.
Kültürler Nasıl Saklanır?
• Yeni bir besiyerine ekim yapılır (pasaj yapmak).
• Madeni yağ veya sıvı parafinle kültürler kapatılır.
• Liyofilize edilir.
– Kültürler hızla dondurulup, vakum altında kurutulurlar.
– Bu yöntemle çok uzun süre saklanabilirler.
• Soğukta saklanır.
– Aşılar, serumlar, bakteri kültürleri +40C’de,
– Virus içeren örnekler -200C ve hatta -700C’de saklanırlar.
