DOKTORA TEZİ
Ahmet UMAY
KRONİK LENFOSİTİK LÖSEMİDE (KLL)
METİLENTETRAHİDROFOLAT REDÜKTAZ (MTHFR) ENZİMİNİN GEN POLİMORFİZMLERİNİN ARAŞTIRILMASI
KİMYA ANABİLİM DALI
ADANA 2016
KRONİK LENFOSİTİK LÖSEMİDE (KLL)
METİLENTETRAHİDROFOLAT REDÜKTAZ (MTHFR) ENZİMİNİN GEN POLİMORFİZMLERİNİN ARAŞTIRILMASI
Ahmet UMAY
DOKTORA TEZİ
KİMYA ANABİLİM DALI
Bu Tez 17/02/2016 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/Oyçokluğu ile Kabul Edilmiştir.
………... ..……….. ……...
Prof. Dr. Ramazan BİLGİN Prof. Dr. S. Seyhan TÜKEL Prof. Dr. Mustafa CANLI
DANIŞMAN ÜYE ÜYE
...………... ...………...
Prof. Dr. Lülüfer TAMER Yrd. Doç. Dr. Yener TEKELİ
ÜYE ÜYE
Bu Tez Enstitümüz Kimya Anabilim Dalında hazırlanmıştır.
Kod No:
Prof. Dr. Mustafa GÖK Enstitü Müdürü
Bu Çalışma Ç. Ü. Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir.
Proje No: FEF2013D17
Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.
KRONİK LENFOSİTİK LÖSEMİDE (KLL)
METİLENTETRAHİDROFOLAT REDÜKTAZ (MTHFR) ENZİMİNİN GEN POLİMORFİZMLERİNİN ARAŞTIRILMASI
Ahmet UMAY
ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
KİMYA ANABİLİM DALI
Danışman : Prof. Dr. Ramazan BİLGİN Yıl: 2016, Sayfa:90
Jüri : Prof. Dr. Ramazan BİLGİN : Prof. Dr. S.Seyhan TÜKEL : Prof. Dr. Mustafa CANLI : Prof. Dr. Lülüfer TAMER : Yrd. Doç. Dr. Yener TEKELİ
Metilentetrahidrofolat redüktaz (MTHFR), hücre içi folat metabolizmasını düzenleyen, DNA metilasyonu ile karsinogenezde önemli bir rol oynayan anahtar bir enzimdir. Bu çalışmada gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu kullanımı ile 91 KLL’li ve 101 sağlıklı kontrol bireyde MTHFR geni A1298C (rs1801131) ve C677T (rs1801133) polimorfizmleri araştırılmıştır.
MTHFR A1298C polimorfizmi allel ve genotip frekansları kontrol ve hasta grubu arasında karşılaştırılmıştır. İstatistiksel analizlerde, A alleli ve AA genotipi anlamlı şekilde koruyucu olarak bulunmuştur. A1298 C polimorfizminde kontrol ve hasta grupları arasında C alleli ve CC genotipi için anlamlı (p=0.04 ve p=0.03) bir ilişki vardır. 1298CC genotipi KLL için 2,58 kat riski artırmaktadır.
MTHFR C677T polimorfizmi allel ve genotip frekansları kontrol ve hasta grubu arasında karşılaştırılmıştır. Hasta ve kontrol grubu arasında C677T polimorfizminin alel sıklığı yönünden anlamlı bir fark belirlenememiştir. Bununla birlikte, C677T polimorfizminin CT ve CC genotipleri KLL riskini anlamlı bir şekilde arttırmıştır (P=0.04, OR=4,21 (1,10-16,09) and P=0.05, OR=3,77 (1,00- 14,17), sırasıyla).
Haplotip analizi yapıldığında haplotipler açısından hasta ve kontrol grupları arasında anlamlı fark bulunmuştur. AC haplotip bloğu (A1298 ve C677) KLL hastalık riskine karşı koruyucu etki göstermiştir.
Sonuçlarımız MTHFR geni 1298C ve C677 allellerinin KLL hastalık riski üzerine önemli etkiye sahip olduğunu göstermektedir.
Anahtar Kelimeler: KLL, MTHFR, C677T, A1298C, polimorfizm
GENE POLYMORPHISMS INVESTIGATION OF
METHYLENETETRAHYDROFOLATE REDUCTASE (MTHFR) ENZYME AT CHRONIC LYMPHOCYTIC LEUKEMIA (CLL)
Ahmet UMAY
ÇUKUROVA UNIVERSITY
INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES DEPARTMENT OF CHEMISTRY
Supervisor : Prof. Dr. Ramazan BİLGİN Year : 2016, Page:90
Jury : Prof. Dr. Ramazan BİLGİN : Prof. Dr. S. Seyhan TÜKEL : Prof. Dr. Mustafa CANLI : Prof. Dr. Lülüfer TAMER : Asst. Prof. Dr. Yener TEKELİ
Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) is a key enzyme regulating the intracellular folate metabolism which plays an important role in carcinogenesis through DNA methylation. In the current study, MTHFR gene A1298C (rs1801131) and C677T (rs1801133) polymorphisms were investigated in a case–control study of 91 patients with chronic lymphocytic leukemia (CLL) and 101 healthy control subjects by using a real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).
The allele and genotype frequencies of MTHFR gene A1298C polymorphism were compared between control and case groups. In the statistical analysis, the A allele and AA genotype were significantly found to be protective variant. There were significant associations between the control and the case groups for the C allele and CC genotype of A1298C polymorphism (p=0.04 and p=0.03). The 1298CC genotype increased 2.58-fold the risk of CLL.
The allele and genotype frequencies of MTHFR gene C677T polymorphism were compared between control and case groups. There was no association between the control and the case groups for the allele frequencies of C677T polymorphism.
However, in the statistical analysis, 677CT and 677CC genotypes significantly increased the risk of CLL (P=0.04, OR=4,21 (1,10-16,09) and P=0.05, OR=3,77 (1,00-14,17), respectively).
When the haplotype analysis was performed, there were significant differences between the case and control groups in terms of haplotype blocks. The AC haplotype block (A1298 ve C677) showed a protective effect against the risk of CLL (p=0.034). Our results demonstrate that MTHFR gene 1298C and C677 alleles have a major effect on the risk of CLL.
Key Words: CLL, MTHFR, C677T, A1298C, polymorphism
gördüğüm, insanlara yaklaşımını, bilimsel yönlerini ve kültürel birikimlerini kendime örnek aldığım çok kıymetli danışmanım Sayın Prof.Dr. Ramazan BİLGİN’e
Çalışmalarımda bana her zaman manevi destek olan Ç.Ü Fen Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü/Biyokimya ABD’dan Sayın Hocalarım, Prof.Dr. S.Seyhan TÜKEL’e, Prof.Dr. Güzide YÜCEBİLGİÇ’e,
Bu çalışmamda bana her konuda destek olan Ersin AKGÖLLÜ’ye ve Ç.Ü Tıp Fakültesi Gastroenteroloji BD’dan Prof. Dr. Hikmet AKKIZ hocama desteklerinden dolayı,
Doç.Dr. Deniz YILDIM, Öğr. Gör. Dr. Dilek ALAGÖZ, Arş. Gör. Ali TOPRAK ve Dr.Yakup AKKOÇ’a,
KLL’li kan örneklerinin temin edilmesinde destek olan Prof.Dr. Emel GÜRKAN ve hasta biyokimyasal verilerinin temininde yardımcı olan Dr.Cem KİS’e
Beni her zaman destekleyen varlığını hep yanımda hissettiğim değerli eşim Lütfiye UMAY’a
Sonsuz teşekkürlerimi sunarım.
Doktora tez çalışmama maddi olarak destek sağlayan Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi’ne teşekkür ederim.
ÖZ ... I ABSTRACT ... II TEŞEKKÜR ... III İÇİNDEKİLER ... IV ÇİZELGELER DİZİNİ ... VIII ŞEKİLLER DİZİNİ ... X SİMGELER VE KISALTMALAR ... XII
1. GİRİŞ ... 1
1.1. Kronik Lenfositik Lösemi ... 1
1.1.1. Tanı ... 2
1.1.2. Evreleri ... 3
1.1.3. Prognoz ... 4
1.1.4. Tedavi ... 5
1.2. Metilentetrahidrofolat Redüktaz Enzimi ... 5
1.2.1. Homosistein Metabolizması ... 6
1.2.2. MTHFR Geni C677T Polimorfizmi ... 13
1.2.3. MTHFR Geni A1298C Polimorfizmi ... 13
1.2.4. MTHFR Geni A1298C ve C677T Polimorfizmlerinin Birlikteliği... 14
1.2.5. MTHFR Geni A1298C ve C677T Polimorfizmleri İle Alakalı Hastalıklar ... 15
1.2.5.1. Serebrovasküler Hastalıklar ... 15
1.2.5.2. Venöz Tromboz ... 15
1.2.5.3. Nöral Tüp Kusurları ... 16
1.2.5.4. Diyabetes Mellitus ... 16
1.2.5.5. Kanser ... 16
1.3. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ... 17
1.3.1. PCR Cihazı ve İçeriği ... 17
1.3.2. DNA’nın İçeriği, Yapısı ve Replikasyonu ... 18
1.3.2.1. DNA’nın İçeriği ... 18
1.3.3.1. Template Denatürasyonu ... 25
1.3.3.2. Primer Eşleşmesi ... 26
1.3.3.3. Primer Uzaması ... 26
1.3.3.4. Hedef DNA ... 27
1.3.3.5. Primerler (Öncüler) ... 27
1.3.3.6. DNA Polimeraz ... 28
1.3.4. PCR Reaksiyonlarında Reaksiyon Tampon Çözeltileri ve MgCl2 ... 28
1.3.5. Deoksiribonükleosit Trifosfatlar ... 29
1.3.6. Döngü Sayısı ve Plato Etkisi ... 30
1.3.7. PCR için Primer Tasarımı ... 30
1.3.8. Primer Seçimi ... 31
1.3.9. Primer Uzunluğu ... 31
1.3.10. Erime Sıcaklığı (Tm) ... 32
1.3.11. Primer Hassasiyeti ... 32
1.3.12. Tamamlayıcı Primer Sekansları ... 33
1.3.13. G/C Miktarı ve Poliprimidin (T,C) ve Polipurin (A,G) Uzamaları ... 33
1.3.14. 3’- Uç Sekansı (Zinciri) ... 33
1.3.15. Özelleştirilmiş PCR ... 34
1.3.16. Nested PCR ... 34
1.3.17. Multiplex PCR ... 34
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR ... 37
3. MATERYAL VE METOD ... 43
3.1. Kullanılan Kimyasallar ve Deney Cihaz ve Aletleri ... 43
3.2. Kimyasallar ... 43
3.3. Cihaz ve Aletler... 44
3.4. Tam Kandan DNA İzolasyonu ... 45
3.5. DNA İzolasyon Kitinin İçeriği (High Pure PCR Template Preperation Kit, Roche Diagnostics) ... 46
3.7.2. “TaqMan® Probe” Yöntemi ... 50
3.7.3. Moleküler Boncuk Yöntemi ... 52
3.7.4. Hibridizasyon Prob Yöntemi ... 53
3.8. Simple Probe Prensibi ... 54
3.8.1. C677T (rs1801133) Bölgesi ile Primerler ve Simple Prob ... 55
3.8.2. C677T (rs1801133) Bölgesine Primerlerin ve Simple probun Bağlanması ... 55
3.8.3. A1298C (rs1801131) Bölgesi ile Primerler ve Simple Prob ... 55
3.8.4. A1298C (rs1801131) Bölgesine Primerlerin ve Probların Bağlanması 55 3.9. Roche – Tıbmolbiol Hazır Kit ... 56
3.10. Light Cycler ® 480 programlama protokolü (C677T ve A1298C için ortak protokol) ... 56
3.11. İstatistiksel Analizler ... 62
4. BULGULAR VE TARTIŞMA ... 63
4.1. Bulgular ... 63
4.2. Tartışma... 70
5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER ... 75
5.1. Sonuçlar ... 75
5.2. Öneriler ... 77
KAYNAKLAR ... 79
ÖZGEÇMİŞ ... 87
EKLER ... 88
Çizelge 1.2. KLL Tanı Kriterleri ... 3
Çizelge 1.3. Modifiye Rai Evreleme Sistemi ... 4
Çizelge 1.4. Binet evreleme Sistemi ... 4
Çizelge 3.1. Real time PCR protokolü ... 57
Çizelge 4.1. KLL hasta grubu ve kontrol grubu demografik verileri ... 63
Çizelge 4.2. Hasta ve kontrol grubu laboratuvar verileri ... 64
Çizelge 4.3. KLL’li bireylerde MTHFR A1298C genotipleri ve kan parametreleri arasındaki ilişkileri ... 64
Çizelge 4.4. KLL’li bireylerde MTHFR C677T genotipleri ve kan parametreleri arasındaki ilişkileri ... 64
Çizelge 4.5. KLL hasta grubu ve sağlıklı kontrol grubunda MTHFR geni A1298C rs1801131 polimorfizminin allel ve genotiplerin karşılaştırılması ... 65
Çizelge 4.6. KLL hasta grubu ve sağlıklı kontrol grubunda MTHFR geni C677T rs1801133 polimorfizminin allel ve genotiplerin karşılaştırılması ... 66
Çizelge 4.7. KLL hasta grubu ile sağlıklı kontrol grubunda kadın ve erkeklerde MTHFR geni A1298C (rs1801131) polimorfizminin allel ve genotiplerin karşılaştırılması ... 68
Çizelge 4.8. KLL hasta grubu ile sağlıklı kontrol grubunda kadın ve erkeklerde MTHFR geni C677T rs1801133 polimorfizminin allel ve genotiplerin karşılaştırılması ... 69
Çizelge 4.9. Cinsiyete göre uyarlanmış MTHFR A1298C (rs1801131) C677T (rs1801133) polimorfizmlerinin KLL ve sağlıklı kontrol grubuna karşı haplotip analizi ... 70
Şekil 1.1. MTHFR enzimine ait genin genomdaki yeri (1p.36.32) ... 6
Şekil 1.2. Metilentetrahidrofolat redüktaz enzimi ... 6
Şekil 1.3. Sistein homosistein ve metiyoninin kimyasal yapısı ... 7
Şekil 1.4. Homosisteinin transsülfürasyon ve remetilasyon metabolize yolları ... 8
Şekil 1.5. Folat döngüsü ... 10
Şekil 1.6. 5,10 metilen THF’nin MTHFR enzimi ile 5-metil THF’ye indirgenmesi ... 10
Şekil 1.7. Homosistein remetilasyonu ... 11
Şekil 1.8. PCR sıcaklığı değişim profili ... 18
Şekil 1.9. Nükleotidlerin içeriği ... 19
Şekil 1.10. Tek nükleotidlerden DNA zincir oluşumu ... 20
Şekil 1.11. Hücrede DNA’nın yapısı ... 21
Şekil 1.12. Replikasyon çatalı ... 22
Şekil 1.13. PCR çoğalmasının basamakları ... 24
Şekil 1.14. DNA’nın PCR ile üstel çoğaltılması ... 25
Şekil 3.1. Asimetrik siyanin boya SYBR Green I’in kimyasal yapısı ... 48
Şekil 3.2. SYBR green I yöntemi ... 50
Şekil 3.3. Taqman probe yöntemi... 51
Şekil 3.4. Moleküler boncuk yöntemi ... 52
Şekil 3.5. Hibridizasyon prob yöntemi ... 53
Şekil 3.6. Simple prob çalışma mekanizması ... 54
Şekil 3.7. PCR Sıcaklık döngüleri ... 57
Şekil 3.8. Amplifikasyon (çoğalma) eğrisi ... 58
Şekil 3.9. C677T Erime eğrileri (melting curves) ... 58
Şekil 3.10. C677T tüm olası genotip piklerinin ortak gösterimi ... 59
Şekil 3.11. C677T Homozigot TT genotipinin erime piki ... 59
Şekil 3.12. C677T Homozigot CC genotipinin erime piki ... 59
Şekil 3.13. C677T Heterozigot CT genotipinin erime piki ... 60
Şekil 3.14. A1298C Erime eğrileri (melting curves) ... 60
Şekil 3.17. A1298C Homozigot AA genotipinin erime piki ... 61 Şekil 3.18. A1298C Heterozigot AC genotipinin erime piki ... 62
A : Adenin
ALL : Akut lenfositik (lenfoblastik) lösemi AML : Akut myelositik (miyeloblastik) lösemi ATP : Adenozin 3-fosfat
BHMT : Betain Homosistein Metil Transferaz
bp : Baz çifti
C : Sitozin
CBS : Sistationin beta sentaz
CI : Güven aralığı
DMG : Dimetil Glisin
DNA : Deoksiribonükleik asit
dNTP : Deoksinükleotid
ds : Çift zincir
dsDNA : Çift zincirli DNA
EDTA : Etilendiamintetraasetik asit FAD : Flavin adenin dinükleotit FAM : Fluorescein amidite
FRET : Fluorescens Resonance Energy Transfer
G : Guanin
HCT : Hematokrit
HGB : Hemoglobin
IWCLL : International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia
kDa : Kilodalton
KLL : Kronik lenfositik lösemi KML : Kronik miyelositik lösemi LDH : Laktat dehidrojenaz
MAT I,II : Metiyonin adenozil tranferaz enzimleri
MM : Multipl myelom
NCIWG : National Cancer Institute-sponsered Working Group
OR : Risk oranı
PCR : Polimeraz Zincir Reaksiyonu PLT : Platelets (Trombositler)
RNA : Ribonükleik asit
RT-PCR : Real Time Polimeraz Zincir Reaksiyonu SAH : S-Adenozil Homosistein
SAM : S-Adonozilmetiyoninin
SEER : Surveillance Epidemiology and End Results SNP : Tek nükleotit polimorfizmi
ss : Tek zincir
ssDNA : Tek zincirli DNA
T : Timin
TAMRA : 6-karboksitetrametil-rodamin
Taq : Thermus aquaticus
THF : Tetrahidrofolat
TRIS : Tris(hydroxymethyl)aminomethane Vit B12 : Vitamin B12
WBC : Beyaz kan hücreleri β2M : Beta 2 mikroglobin
1. GİRİŞ
1.1. Kronik Lenfositik Lösemi
Yunanca kökenli (leukemia) Lösemi; kemik iliği ve kan kanseri olarak ifade edilir. Kan hücrelerinin özellikle de akyuvarların normalin çok üzerinde çoğalması ile kendini gösteren bir kanser türüdür. Lösemiler hücre tipine ve hücre olgunlaşma durumuna göre sınıflandırılır. Akut lösemiler olgunlaşmamış hücrelerin (blastlar) kemik iliğini doldurması ve tedavi edilmeyen hastalarda hızlı ve ölümcül seyir ile karakterizedir. Diğer taraftan kronik lösemilerde ise başlangıçta, normal farklılaşma (olgun lökositler) ve nispeten yavaş bir ilerleme görülür (Catovsky ve ark. 2001). Akut ve kronik lösemilerin lenfositik ve miyelositik olmak üzere başlıca iki tipi vardır.
Gruplandırma dört ana başlıkta yapılmaktadır. Akut lenfositik (lenfoblastik) lösemi (ALL), kronik lenfositik lösemi (KLL), akut myelositik (miyeloblastik) lösemi (AML) ve kronik miyelositik lösemidir (KML) (Kumar ve ark, 2000).
Fazla miktardaki olgunlaşmamış ve habis hücrelerin normal ilik hücrelerinin yerine geçmesi ile ilik yapısında hasar oluşur. Bunun sonucunda kan pıhtılaşmasında görev alan trombositler ve savunma sisteminin en önemli elemanlarından olan lökositlerin miktarında azalma boy gösterir. Lösemili bireylerden yaralanmaların ve kanamaların fazla olarak görülmesine, hastaların kolay iltihap kapmasına neden olur.
Bağışıklık sistemi zayıflar. Sonrasında alyuvarların eksikliği anemiye, solunum yetmezliğine neden olabilir. Ayrıca kilo kaybı ve halsizlik, ateş, bazı sinirsel rahatsızlıklar, diş etlerinde şişmeler ve kanamalar gibi belirtiler de ortaya çıkmaktadır.
KLL insan vücudunda bulunan savunma hücreleri akyuvarların alt şekli olan lenfositlerden kaynaklanan kan ve kemik iliği kanser çeşididir (Kay, 2008).
En fazla görülen kronik lösemi tipidir. B veya T lenfositlerin kısmen olgun hücre döneminden köken alan, olgun görünümlü küçük lenfositlerin kan, kemik iliği, lenf bezi ve dalağı infiltre etmesi ve lenfositlerin fonksiyon bozukluğu göstermesi ile karakterize olan kemik iliğinin kötü huylu bir hastalığıdır. Batı ülkelerinde yetişkin dönemde en çok rastlanan lösemi türüdür. KLL olgularının % 95’i B lenfosit kaynaklıdır (Cheson ve ark, 1996).
B lenfositler birçok kan hücre serisini canlının hayatı boyunca üretme kapasitesinde olan hematopoietik kök hücrelerden köken alırlar. B hücrelerinin oluşumu kemik iliğinde başlar, olgunlaşması dalak ve lenf nodlarında devam eder (Hoffman ve ark, 2009).
KLL yetişkinlerde görülen lösemilerin %25’ini oluşturur. Batı toplumlarında görülme oranı 4/100000 olmakla birlikte Asya’da bu oran çok daha düşüktür. SEER (Surveillance Epidemiology and End Results) veritabanı 2000-2005 verilerine göre ortanca tanı yaşı 72’dir. KLL görülme insidansı yaşla orantılı olarak artmaktadır (Catovsk ve ark, 2001).
KLL’nin tam olarak nedenleri bilinmemesine rağmen, hem kalıtsal hem de çevresel etkenlerin önemli rol oynadığı düşünülmektedir. Somatik hücrelerdeki DNA'larda meydana gelen mutasyonlar onkogenlerin aktive olması ya da tümör baskılayıcı genlerin inaktive olmasına neden olur. Böylece hücre ölümünün ve bölünmesinin düzenlenmesi sekteye uğrayabilir. Bu hasara kalıtsal etkenlerin dışında, petrokimyasalların, radyasyonun, kanserojen maddelerin ve bazı virüslerin neden olduğu düşünülmektedir (Goldin ve ark, 2010).
1.1.1. Tanı
KLL’li hastalar da en sık görülen belirti ve bulgular yorgunluk, kilo kaybı ve yaygın lenf bezlerinin şişmesidir. Ancak hastalığın normal seyri gereği tanı sürecinde asemptomatik olan hastaların büyük bir kısmında izleme sırasında lenfadenopati, organomegali ve kemik iliği infiltrasyonuna bağlı sitopeniler (kan hücrelerinin azalması) gelişir. Bunun yanı sıra KLL hastalarında otoimmun sitopeniler, hipogamaglobulinemi ilişkili enfeksiyonlar, hastalığın hızlı seyirli lenfoproliferatif hastalıklara dönüşümü ve artmış ikincil kanser sıklığı görülebilir.
Genellikle farklı nedenlerle yapılan rutin kan tahlillerinde lenfositoz saptanması, olguyu KLL açısından değerlendirmenin başlangıç ayağını oluşturmaktadır. Tabloya ilerleyen dönemlerde, anemi ve trombositopeni eklenebilir.
KLL tanısı için birçok kriter geliştirilmesine rağmen, en sık kullanılan 1988’de
“National Cancer Institute-sponsered Working Group (NCIWG)” ve “International
Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia (IWCLL)”nin ortaya koyduğu kriterlerdir (Cheson ve ark, 1996).
Aynı zamanda NCIWG ve IWCLL’nin, KLL’de evreleme ve tedavi yöntemleri üzerinde de çalışmaları mevcuttur.
Çizelge 1.1. KLL Tanı Kriterleri (NCIWG) 1.Periferik kanda lenfositoz: 5.000/mm³
2.İmmunfenotipleme: En az 1 adet B hücre işareti (CD19, CD20, CD23) + CD5 3.Kemik iliğinde lenfositoz: ≥ %30
4.Atipik hücre oranı: < %50
Tanı: 1 no’lu kriter ile birlikte 2 veya 3 no’lu kriter; ya da lenfosit sayısı 5.000/mm³’ten düşükse, 2 ve 3 no’lu kriter birlikte bulunmalıdır.
Çizelge 1.2. KLL Tanı Kriterleri (IWCLL)
≥10.000 lenfositoz + B fenotipi veya kemik iliği tutulumu
<10.000 lenfositoz+ B fenotipi + kemik iliği tutulumu
>%30 kemik iliği lenfosit oranı
1.1.2. Evreleri
KLL hastalarında klinik seyir oldukça değişkendir. KLL evreleme sistemleri, bireysel prognozu tayin etmek için kullanılan sistemlerdir. KLL’de güncel olarak 2 evreleme sistemi kullanılır. Bunlar Modifiye Rai ve Binet evreleme sistemleridir (Rai ve ark, 1975), (Binet ve ark, 1981).
Bu evreleme sistemleri ile tahmini sağ kalım süresi belirlenebilir.
Çizelge 1.3. Modifiye Rai evreleme sistemi
Evre Klinik Medyan
Sağkalım
0 Lenfositoz >10 yıl
1 Evre 0 ve Lenfadenomegali 7
2 Evre 0 veya 1 ve splenomegali ve/veya hepatomegali 7
3 Evre 0, 1 veya 2 ve anemi (Hb <11gr/dl) 2
4 Evre 0-3 ve trombositopeni (Plt <100.000/mm3) 2 Evre 0: Düşük risk evre 1-2: Orta risk evre 3-4: Yüksek risk
Çizelge 1.4. Binet evreleme sistemi
Evre Klinik Lenfoid
Sayısı
Medyan Sağkalım
A Hb≥10gr/dl; Plt≥100.000/mm3 <3 >10 yıl
B Hb≥10gr/dl; Plt≥100.000/mm3 ≥3 5
C Hb<10gr/dl veya Plt<100.000/mm3 2
1.1.3. Prognoz
Çok değişkenlik gösteren bir hastalık olan KLL’de, yaşam ömrü aylarla sınırlı olabileceği gibi, onlarca yılda olabilir. Rai ve Binet evreleme sistemleri, KLL hastalarının klinik seyrinin, sağkalım süresinin ve tedavi gereksiniminin belirlenmesinde klinisyenin başvurduğu kaynaklardır (Hamblin, 2002).
1981’de NCIWG KLL’de her iki sistemin birlikte kullanılmasını önermiştir. Fakat bu evreleme sistemleri, özellikle erken evre hastalarda tedavi gereksinimi olan hastaların belirlenmesinde yetersiz kalmaktadır (Byrd ve ark, 2004) Binet A ve Rai 0 veya 1 evresinde, tedaviye başlamak için hastalığın ilerleyici olduğunun bilinmesi gerekir. Erken evrede tespit edilen KLL’li hastaların %40-%50’si ilerleyici olup, tedavi gereksinimi mevcutken, hastaların
%50-60’ında tedavi gereksinimi yoktur ( Montserrat ve ark, 1988).
Rai ve Binet evreleme sistemlerinin bu ayrımı yapmada yetersiz kalması nedeniyle, prognozu belirlemeye katkı sağlayabilecek farklı faktörler üzerinde çalışmalar yapılmaktadır. Bunlardan başlıcaları; cinsiyet, kemik iliği tutulum şekli, kromozomal değişiklikler, kemik iliğinde lenfosit oranı, lenfosit morfolojisi, β2 mikroglobin düzeyi, immunglobulin ağır zincir mutasyonu, timidin kinaz, ZAP70 ekspresyonu, CD38 pozitiflik oranı ve p53 mutasyonu sayılabilir (Düring ve ark, 2003).
1.1.4. Tedavi
Genel olarak erken evrede, alkilleyici ajanların sağ kalımı etkilememesi nedeniyle “bekle-gör” politikası uygulanmaktadır. Ateş, gece terlemesi, kilo kaybı, güçsüzlük gibi belirtiler, sorun oluşturan lenfadenopati, splenomegali, hızla artan lenfosit sayısı, trombositopeni (100.000x10U/L) tedaviyi başlatan nedenlerdir.
İleri evre semptomatik hastalığın tedavisinde başlıca seçenekler; klorambusil ve siklofosfomid gibi oral alkilleyiciler, fludarabin, kladribin gibi pürin analogları, kemoterapi kombinasyonları, monoklonal antikorlar ve transplantasyondur. Mevcut veriler, 11q22.3 veya 17p13.1 delesyonlu olgularda, bu bölgeler açısından normal olan olgulara göre, klorambusil’e cevap oranı düşük ve kısa remisyon süresi bildirilmiştir (Hillmen ve ark, 2006).
1.2. Metilentetrahidrofolat Redüktaz Enzimi
Metilentetrahidrofolat redüktaz (MTHFR) homosistein metabolizmasında anahtar enzimdir. İnsan MTHFR geni, kromozom 1p36.32’de lokalize olmuştur ve 656 aminoasitten oluşan MTHFR enzimini kodlar.
Şekil 1.1. MTHFR enzimine ait genin genomdaki yeri (1p.36.32)
(http://wellnessadvocate.com/index.php?uid=91001#MTHFR)
MTHFR, 5,10 metilentetrahidrofolatı (5,10-metilen THF) geri dönüşümsüz olarak 5-metiltetrahidrofolata (5-metil THF) dönüştürür. 5-metiltetrahidrofolat; DNA metilasyonu ve metiyonin sentezi için metil grubu sağlar. 5,10-metilentetrahidrofolat ise deoksiüridilatın timidilata dönüşümünde kullanılırken diğer taraftan da pürin sentezi için 10-formil THF’a oksitlenmektedir (Weisberg ve ark,1998).
Şekil 1.2. Metilentetrahidrofolat redüktaz enzimi (https://addictiondoctor.org/this-genes- a-mthfr)
1.2.1. Homosistein Metabolizması
Homosistein, protein yapısında olmayan sülfürlü bir aminoasittir. Bu aminoasit, diyetle alınan ve endojen proteinlerden sentezlenen esansiyel bir
aminoasit olan metiyoninin metil grubu alınmış bir türevidir. Remetilasyon yoluyla tekrar metiyonine dönüşerek ya da transsülfürasyon yoluyla sistein, metilmalonik ve 2-metilsitrik aside dönüşerek metabolize edilir (Bolander, 2002).
Tüm hücrelerde bulunan metiyonin, hem protein sentezi hem de S- Adonozilmetiyoninin (SAM) oluşmasını sağlayan bir maddedir. Şekil 1.7’de gösterildiği üzere Metiyoninin ihtiva ettiği metil grubu, SAM’e dönüşümü sırasında aktive olur. SAM biçimlenmesi, adenozin 3-fosfat (ATP) ve metiyonin adenozil tranferaz enzimleri aracılığıyla gerçekleşir. Bu reaksiyonlarla hücre içi SAM miktarı regüle edilir. Metiyoninin kükürt atomuna ATP’den bir adenozil grubunun bağlanmasıyla SAM molekülü meydana gelir. Adenozil grubunun aktarılmasıyla kükürt atomu pozitif yük ile yüklenir. Bu durum sonucunda kükürt oldukça reaktif bir duruma geçerek içerdiği metil grubu akseptör, substratlarca kolayca transfer edilir. Metil grubu fosfatidil etanol amin (sefalin) akseptör olarak iş gördüğünde alınır ve S-Adenozil Homosistein (SAH) oluşur.
Bu molekül de daha sonra adenozin ve homosisteine hidrolizlenir. SAM organizmalarda başlıca metil grubu vericisidir (Hankey ve ark, 1999).
Şekil 1.3. Sistein homosistein ve metiyoninin kimyasal yapısı.
Remetilasyon yolunda homosistein kofaktör olarak vitamin B12 (kobalamin)’nin substrat olarak da 5-metiltetrahidrofolatın (5-MTHF) kullanıldığı ve metiyonin sentaz enziminin görev yaptığı bir reaksiyonla metillenir ve metiyonine tekrar dönüşür. Bu metabolik yolun substratı olan 5-MTHF termolabil MTHFR enziminin katalizlediği bir reaksiyonla metilentetrahidrofolat (MTHF)’tan sentezlenir (Friedman ve ark. 2001).
Karaciğer ve böbreklerde remetilasyon için metil verici olarak betain de kullanılabilir. Betain/Hcy metiltransferaz enziminin katalizlediği reaksiyonla homosistein remetillenerek de metiyonine dönüştürülebilir (Bostom ve ark, 1997).
Transsülfürasyon yolunda ise homosistein, kofaktör olarak vitamin B6'yı (pridoksin) kullanan sistationin beta sentaz (CBS) enzimi aracılığıyla sistationine çevrilir. Sistationin ise B6 vitamininin kofaktörlüğünde sistationinaz enzimi ile sistein ve α- ketobutirata çevrilir, α-ketobutirat ise 2-metilsitrik asit ve metilmalonik aside parçalanır (Chauveau ve ark. 1993).
Homosisteinden metiyonin dönüşümünün ve SAM miktarının azalması, metilasyon reaksiyonlarının işleyişini bozabilir. Nitrik oksit geri dönüşümsüz olarak MS’i metilkobalamin (aktif koenzim)’in içerdiği kobaltı okside ederek inaktive eder.
Böylece SAM’in biyosentezi engellenir. Hayvan deneylerinde nörolojik fonksiyonları inceleyen araştırmacılar, metilasyon reaksiyonlarında bu enzimin inaktif olmasının yüksek derecedeki etkisini göstermişlerdir (Scott ve ark. 1994).
Şekil 1.4. Homosisteinin transsülfürasyon ve remetilasyon metabolize yolları (Dikmen, 2004)
(MTHFR: metilentetrahidrofolat redüktaz, MS: Metiyonin sentetaz CS:
Sistatyonin β sentetaz, CL: Sistatyonin γ liyaz, BHMT: Betain homosistein metil transferaz, MT: Metil transferaz SAM: S-adenozilmetiyonin, SAH:S-adenozilhomosistein THF: Tetrahidrofolat, DMG: Dimetilglisin) Vücuttaki homosistein transsülfürasyon veya yeniden metilasyon (remetilasyon) yollarını kullanarak metabolize olur. Transsülfürasyon yolunda; homosistein, vitamin B6
bağımlı bir enzim olan sistatyonin β sentetaz katalizörlüğünde sistatyonine, o da sisteine hidrolize olur. Bu sistein de daha sonra sülfata hidrolize olarak idrarla atılır.
Remetilasyon yolunda; homosisteinden, metiyoninin yeniden sentezi iki farklı yolla gerçekleşir. Kısa yolda; betain homosistein metiltransferaz (BHMT) enzimi, bir metil vericisi olan betainin metil grubunu, homosisteine aktararak metiyonin oluştururken kendisi dimetilglisine dönüşür. Uzun yolda; 5-metiltetrahidrofolat bir metil grubu vericisidir. 5,10 metilentetrahidrofolat, metilentetrahidrofolat redüktaz (MTHFR) enzimi aracılığıyla 5- metiltetrahidrofolata dönüşür. Metilen, metil grubundan daha yükseltgenmiş olduğundan metilentetrahidrofolatın hem bir karbon verici hemde bir hidrid iyonu tedarik edici rolü vardır. 5-metiltetrahidrofolatın bir metil grubu, kobalamin (vitamin B12) bağımlı enzim olan metiyonin sentaz aracılığı ile homosisteine aktarılarak metiyonin oluşurturulurken diğer taraftan da tetrahidrofolat meydana gelir. Bu tetrahidrofolat tekrar 5-10 metilentetrahidrofolata dönüşür. Fazla metiyoninin bir kısmı proteinlerin yapısına katılırken, bir taraftan da SAM’ı, o da SAH’ı meydana getirir. (Dikmen, 2004).
Şekil 1.5. Folat döngüsü (Lehninger principles of biochemistry 2005, s 673)
Şekil 1.6. 5,10 metilen THF’nin MTHFR enzimi ile 5 metil THF’ye indirgenmesi (https://en.wikipedia.org/wiki/Methylenetetrahydrofolate_reductase)
Şekil 1.7. Homosistein remetilasyonu (https://en.wikipedia.org/wiki/Homocysteine)
Metilentetrahidrofolat redüktaz geninde meydana gelen bir mutasyon (en yaygın olanı C677T polimorfizmi) enzim aktivitesini azaltmaktadır. Azalan MTHFR aktivitesi sonucunda 5-metil THF düzeyi azalmakta, 5,10- metilen THF miktarı ile plazma homosistein seviyesi artmaktadır. Hiperhomosisteinemi ve homosisteinürinin meydana geldiği ciddi MTHFR eksikliğinde, periferal nöropati, gelişme geriliği, hipotoni, felç ve tromboz gibi hastalıklar görülür. MTHFR eksikliğinin az olduğu durumlara nüfus genelinde oldukça fazla karşılaşılmakta olup, Bilhassa damar hastalıklarının oluşumunda bir risk etkeni olduğu ortaya atılmaktadır. (Goyette ve ark, 1998).
MTHFR geninde var olan birtakım mutasyonlar, kardiyovasküler ve serebrovasküler rahatsızlıklar için önemli bir risk etkeni olan hiperhomosisteinemi ve homosisteinüri meydana gelmesine neden olur. 5,10 MTHFR enzimi, bir flavoprotein olup MTHFR ailesinin bir üyesidir. Memelilerde MTHFR’nin yapısı hakkındaki ilk bilgiler, MTHFR enzimi ilk olarak domuz karaciğerinden saflaştırılmıştır. Enzim sitoplazmik bir protein olup, iki alt birimden oluşan homodimer yapıdadır. İnsanlarda yapılan Western analizleri sonucunda 2 izoformunun olduğu ortaya çıkarılmıştır. Bu izoformlar dokulara özel olup, 70 kilodalton (kDa)’luk küçük alt birimlere sahip izoform karaciğerden, 77 kDa’luk büyük alt birimlere sahip izoform ise başka dokulardan saflaştırılarak elde edilmiştir.
Enzim, tripsinle sindirime uğratıldığında, 77 kDa’luk altbirim 40 kDa ve 37 kDa’luk iki bölüme ayrılmıştır. Bu kopma vesilesiyle S-adenozil metiyonin (SAM) inhibisyonu kaybolur, fakat enzimin katalitik aktivitesi etkilenmez. Gerçekleştirilen deneyler aracılığıyla katalitik bölge olan 40 kDa’luk N-uç bölgenin substrat ve koenzim bağlama kısımlarına sahip olduğu, düzenleyici bölge olan 37 kDa’luk C-uç bölgesinin ise, SAM bağlama kısmına sahip olduğu ortaya çıkarılmıştır. Memeli enzimi kendisine kovalent olmayacak şekilde bağlı flavin adenin dinükleotit (FAD) koenzimi içerir. Bu koenzim, nikotinamid adenin dinükleotit (NAD) fosfatın M transferini sağlar ( Weisberg ve ark, 1998).
Çeşitli DNA çalışmalarıyla insan ve fare MTHFR geninin yapısı araştırılmıştır. Her iki geninde de 11 ekzon içerdiği, ekzon uzunluklarının ve ekzon intron sınırlarının ortak karakter gösterdiği belirlenmiştir. İnsan MTHFR geninin kromozom 1p36.3’de yer aldığı belirlenirken, bu genin N-terminal ucunun yapısı henüz tam olarak açıklanamamıştır. İnsan genomik klonunun (17 kb), 2,2 kb uzunluğundaki MTHFR cDNA dizisinin tamamını içerdiği belirlenmiştir (Robien ve ark, 2003).
İnsan ve fare MTHFR geni üzerinde gerçekleştirilen çalışmalar aracılığıyla MTHFR geninde 15 değişik mutasyon olduğu ortaya çıkarılmıştır. Bu mutasyonlardan, damarlara ait hastalık, nöral tüp hasarları ve kalın bağırsak kanseri ile yakından alakalı olduğu açıklanmış olan C677T polimorfizmi, enzimin katalitik bölgesinde, özellikle nöral tüp hasarlarında etkili olan A1298C polimorfizmi ise
enzimin düzenleyici bölgesinde ortaya çıkmaktadır (Botto ve ark, 2000).
1.2.2. MTHFR Geni C677T Polimorfizmi
C677T polimorfizmi, MTHFR proteinin N terminal katalitik bölgesini etkileyen 4. ekzonda ortaya çıkar. MTHFR C677T polimorfizminde, MTHFR enzimini kodlayan gende 677. nükleotid olan C (Sitozin)’nin T (Timin)’ye değişimi sonucu ortaya çıkan bir nokta mutasyonu vardır. Bu mutasyon, genin ürünü olan proteinde Alanin’in yerine Valin’in geçmesine neden olarak MTHFR aktivitesini azaltır. Azalan MTHFR aktivitesi, 5-metil THF seviyesinde azalmaya ve sonuçta homosisteinin metiyonine dönüşememesi nedeniyle plazma homosistein seviyesinde artmaya neden olur. MTHFR’nin C677T polimorfizminde, CC (Alanin/Alanin) homozigot normal, CT (Alanin/Valin) heterozigot ve TT (Valin/Valin) homozigot mutant genotipler görülmektedir. MTHFR geni C677T polimorfizminin, kardiyovasküler hastalıklar, nöral tüp kusurları, strok, Down sendromu, meme ve endometrial kanser gibi hastalıklarda bir risk faktörü olduğu açıklanmıştır ( Dikmen, 2004).
677TT allelinin akciğer kanseri, lösemi ve kolon kanserine karşı koruyucu bir potansiyeli olduğu açıklanmasına rağmen, aynı durumun endometrial ve yumurtalık kanseri gibi diğer kanser tipleri için geçerli olmadığı açıklanmıştır (Skibola ve ark, 1999).
C677T mutasyonunda MTHFR aktivitesi, homozigot mutant TT genotipinde, heterozigot CT ve homozigot normal CC genotiplerine göre azalırken, homosistein seviyesi önemli oranda yükselir. MTHFR enzim eksikliğinde, homosisteinden metiyonin oluşumundaki bozukluk, organizmayı hem metiyonin azalmasına hem de homosistein birikiminin neden olduğu toksik etkilere maruz bırakır (Dikmen, 2004)
1.2.3. MTHFR Geni A1298C Polimorfizmi
MTHFR geninde belirlenen başka bir mutasyon da, enzimi kodlayan genin 7.
ekzondaki 1298. nükleotid olan A (Adenin)’nın C (Sitozin)’ye değişimi sonucu,
MTHFR proteinindeki Glutamin’in Alanin’e değişimine neden olan nokta mutasyonudur ve enzimin C-uç düzenleyici bölgesinde etkilidir. Bu mutasyonun varlığında da MTHFR aktivitesi azalır. A1298C polimorfizminin, plazma homosistein konsantrasyonundaki artışı MTHFR C677T polimorfizmi kadar etkilemediği ileri sürülse de, bu polimorfizmin önemi henüz tam olarak açıklanamamıştır. Nöral tüp defektli çocuklarda, bu mutasyonun görülme sıklığının yüksek olduğu açıklanmıştır. Homosistein’in kardiyovasküler hastalıkların gelişiminde öneminin yanında A1298C mutasyonunun da kardiovasküler hastalıklar için önemli bir risk faktörü olabileceği düşünülmektedir (Lievers ve ark, 2001).
1.2.4. MTHFR Geni A1298C ve C677T Polimorfizmlerinin Birlikteliği
A1298C ve C677T polimorfizmlerinin sıklığı popülasyonlara göre ve yaşla birlikte önemli farklılık göstermektedir. A1298C ve C677T polimorfizmlerinin birlikte heterozigot olduğu durumda MTHFR enzim aktivitesi, her iki allelin normal homozigot olduğu durumdaki enzim aktivitesinin %50-60’ı kadardır. Bu aktivite, C677T polimorfizminin heterozigot bireylerinin enzim aktivitesinden daha düşüktür.
MTHFR 677T/1298C heterezigot durumunun birlikte bulunduğu bireylerde, nöral tüp defektlerinde önemli bir artış olduğu ileri sürülmüştür.
A1298C mutasyonu, MTHFR enziminin C-uç regülatör bölgesinde meydana gelmesine karşılık, C677T mutasyonu genin N-uç katalitik bölgesinde meydana gelmektedir. Bu nedenle de C677T mutasyonuna sahip bireylerde MTHFR enzim aktivitesi, A1298C mutasyonlu bireylerden daha düşüktür (Kantar ve ark, 2009).
Daha önceki çalışmalarda da C677T polimorfizminin MTHFR aktivitesinde önemli bir etkiye sahip olduğu açıklanmıştır. 677TT genotipi, termolabil MTHFR enzim özelliğine sahiptir. A1298C polimorfizminde azalan enzim aktivitelerine rağmen ısı inkübasyonundan sonra A1298C genotipleri arasında artan aktivasyon yüzdesinde önemli bir farklılık görülmediği için, bu polimorfizmin enzimin termostabilitesini etkilemediği bildirilmiştir. A1298C polimorfizminde MTHFR aktivitesinde önemli etkiler görülmesine rağmen ne 1298AC, ne de 1298CC genotipinde artan homosistein düzeylerine rastlanmamıştır. 677CC/1298AC ve
677CC/1298CC genotiplerinde MTHFR aktiviteleri, 677CC/1298AA genotip enzim aktivitesi ile karşılaştırıldığında sırasıyla %60-92 ve %52-66 olarak bulunmuştur.
Heterozigot (677CT/1298AC) genotip durumunda MTHFR aktivitesi ise 677CC/1298AA genotipi ile karşılaştırıldığında, %36- 62 olarak bulunmuştur (Lievers ve ark, 2001).
1.2.5. MTHFR Geni A1298C ve C677T Polimorfizmleri İle Alakalı Hastalıklar
1.2.5.1. Serebrovasküler Hastalıklar
Strok’lu olguların yaklaşık %20-50’sinde orta şiddette hiperhomosisteinemi ortaya çıkabilir. Strok’lu 900 olguyu içeren ve 1994’ten beri 24 çalışmanın yeraldığı bir meta-analiz çalışmasında, kontrollere göre strok’lu olguların, artan homosistein düzeylerine sahip olduğu belirlenmiştir (Fodinger ve ark, 2000).
Morita ve ark.’nın 256 felçli hastalarda yaptığı bir çalışmada, TT genotipi ile felç arasında önemli derecede ilişki olduğu ileri sürülmüştür (Morita ve ark, 1998).
1.2.5.2. Venöz Tromboz
Homosisteine ait sülfidril grubunun, etkisi nedeniyle damar endotelinde hasar oluştuğu bilinmektedir. Bu etkinin sonucunda trombosit tüketimini arttırdığı, sonuçta da pıhtılaşmaya bağlı tıkanmalara neden olduğu belirtilmiştir.
Transsülfürasyon enzimi olan sistatyonin beta- sentetazın, homozigot eksikliği gibi diğer bir risk faktörü taşıyan bireyler arasında, MTHFR C677T’nin mutasyonu tromboembolizm için önemli bir risk faktörü olabilir. Yine konjenital trombolitik olgularda, faktör II 20210G*A veya faktör V 1691G*A mutasyonunun MTHFR C677T mutasyonu ile birlikte bulunmasının venöz tromboz riskini önemli derecede arttırdığı rapor edilmiştir (Donnelly ve ark, 1999).
1.2.5.3. Nöral Tüp Kusurları
Mutant T allelinin, nöral tüp defektleri için risk faktörü olduğu ileri sürülmektedir. Yine nöral tüp defektlerinde kan folat seviyesinin düşük olması da önemli bir risk faktörüdür. Yapılan çalışmalar, MTHFR geni C677T ve A1298C polimorfizmleri ile birlikte oluşan folat eksikliğinin, nöronal gelişimi etkilediği ve nöral tüp kusuru oluşumunu arttırdığını göstermiştir (Van der Put ve ark, 1998).
1.2.5.4. Diyabetes Mellitus
Diyabetik nefropati, diabetes mellitusun yaygın bir durumudur. A1298C ve C677T insan MTHFR gen mutasyonlarının diyabetik nefropati ile ilişkili olduğu bildirilmektedir. Bu her iki mutasyonun diyabetik populasyonlarda sıklığı yüksektir.
Yapılan bir çalışmada, her iki polimorfizm açısından diyabetik nefropatisi olan ya da olmayan olgularda, allel sıklığı ile genotip dağılımı açısından önemli bir farklılık bulunamamıştır. Ancak serum folat düzeyi 15,4 nmol/l‘den küçük olan olgularda diyabetik nefropati insidansı oldukça yüksek bulunmuştur (Shpichinetsky ve ark, 2000).
1.2.5.5. Kanser
MTHFR polimorfizminden kaynaklanan azalmış enzim aktivitesi, tümör süpressör genlerin stabilitesini ve hipometilasyonunu etkiler. Akciğer kanserli olgu örnekleri ile yapılan çalışmalarda, C677T allelinin, bir tümör süpressör gen olan p16’nın ekspresyonunun artışı ile ilişkili olduğu gösterilmiştir (Skibola ve ark, 1996).
C677T allelinin, muhtemelen, yeterli folat alımı ile bireylerde timin ve pürin sentezi için artan 5,10 metilen THF düzeyi oluşturarak, kolerektal kanser riskini azalttığı ileri sürülmüştür. Servikal intraepitelial kanserli olgular ile yapılan bir çalışmada da 677TT ve CT genotip sıklığının yüksek olduğu bildirilmiştir. Larsson ve ark, 2006)
1.3. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)
PCR (Polymerase Chain Reaction), “Polimeraz Zincir Reaksiyonu” bir DNA zincirinin bilinen iki parçası arasında bulunan özel bir DNA bölgesinin enzim aracılığıyla kopyalandığı laboratuvar ortamında gerçekleştirilen bir yöntemdir. Bu yöntemin ilk zamanlarında belirli bir genin yalnızca küçük bir bölümü elde edilebiliyorken, şimdilerde birkaç saat içerisinde bir genin kopyasından milyonlara varan miktarlarda çoğaltılabilmektedir
PCR sayesinde; teşhis işlemlerin de ve adli tıpta genlerin belirlenmesi ve belirli DNA kısımlarının kopyalanması ve gen ifadelerinin tespit edilmesi gerçekleştirilebilmektedir. Günümüzde PCR sayesinde; bulaşmış bakteriler, genetiği değiştirilmiş DNA’lar ve gıda içeriklerinin kontrolleri tespit edilebilmektedir.
1.3.1. PCR Cihazı ve İçeriği
PCR işleminin otomatik hale gelmesini iki temel gelişme izin sağlamıştır:
a) Sıcağa dayanıklı, yüksek sıcaklıkta aktivitesini koruyan DNA polimerazların kullanımı. Böylece reaksiyonun başlangıcında eklenen polimeraz sayısız işlem döngüsü boyunca aynı aktiviteyi gösterir.
b) Sıcaklığın programlı olarak hızlı bir şekilde düşürüp yükseltilebildiği ısı banyolarının gelişmiş olması.
Bunlar PCR cihazları ya da termal cycler olarak bilinir.
Kullanılan PCR cihazlarının farklı tasarımları mevcuttur. Örneğin:
sıvılarla ısıtma ve soğutma, elektriksel rezistansla ısıtma ve sıvılarla soğutma ve elektrik rezistansla ısıtma yarı iletkenlerle soğutma. Üç aşamalı işlemin tipik sıcaklık döngü profili aşağıdaki şekilde görülmektedir.
Aşağıda bahsedilecek olan reaksiyon girdileri ve döngü sayısının yanısıra, denatürasyon, primer bağlanması, primer uzaması gibi daha önce bahsedilen termal döngü parametreleri de başarılı bir PCR için kritiktir.
Şekil 1.8. PCR sıcaklığı değişim profili
1.3.2. DNA’nın İçeriği, Yapısı ve Replikasyonu
1.3.2.1. DNA’nın İçeriği
DNA genetik bilgiyi taşıdığı nükleotidlerin sekansında şifrelenmiş olarak saklayan, fosforik asit ve deoksiriboz ünitelerinin oluşturduğu iki paralel zincirin, pürin ve pirimidin bazlarınca çapraz olarak bağlanması ile ortaya çıkan sağ yönlü sarmal yapıya sahip bir moleküldür. Ökaryot hücrelerde DNA’nın çoğu çekirdek içinde bulunur ve kromozomal DNA olarak adlandırılır. Çift katlı bir zar (çekirdek kılıfı) ile hücrenin geri kalanından (sitoplazma) ayrılır.
Buna ek olarak, mitokondri ve kloroplastlarda ekstra kromozomal DNA bulunabilir.
DNA nın yapı taşı olan nükleotidler aşağıdaki gibidir.
dATP (deoksiadenozin trifosfat) dGTP (deoksiguanin trifosfat) dCTP (deoksisitozin trifosfat) dTTP (deoksitimin trifosfat)
İsimlendirme kolaylığı için bu dört nükleotid dNTP (deoksinükleosid trifosfat) olarak adlandırılır. Bir nükleotid üç ana bölümden oluşur, pürin (adenin A veya guanin G) veya pirimidin bazları (sitozin C veya timin T), pentoz şeker molekülü (deoksiriboz) ve trifosfat grup. Şekil 1.9. da görüldüğü gibi pürin veya
pirimidin bazları pentoz zincirine N- glikosidik bağ ile ve fosfat grubu 5’ şekerin karbon atomuna diester bağ ile bağlanır. Ribonükleik asitte (RNA), timinin yerini urasil, deoksiribozun yerini de riboz alır.
Şekil 1.9. Nükleotidlerin içeriği (Andy Vierstraete, 1999)
1.3.2.2. DNA’nın Yapısı
Şekil 1.10. da nükleotidlerin bir DNA zincirini nasıl oluşturduğunu göstermektedir. DNA nükleotidleri, fosfat grubunun (şeker molekülünün beşinci karbon atomuna bağlanmış) önceki nükleotidin şeker molekülünün 3. karbon atomundaki hidroksil grup ile bağlanması ile oluşur. Bunu sağlamak için difosfat grubu ayrılır (ve enerji açığa çıkar). Bu zincirin daima 3’ ucuna yeni nükleotidlerin eklenebildiği anlamına gelir. Şekil 1.11. de görüldüğü gibi DNA çift ipliklidir (bazı virüsler dışında). İki iplik birbiriyle tam bir şekilde eşleşir.
İplikteki her baz diğer iplikte yalnız bir tip bazla eşleşerek baz çiftini (bp) oluşturur. A daima T ile iki hidrojen bağı, C daima G ile üç hidrojen bağı oluşturur.
Bu yolla, iki zincir birbirine tamamlayıcı (komplement) olur. Bir zincir diğerinin üretimi için atasal olarak görev yapar.
Şekil 1.10. Tek nükleotidlerden DNA zincir oluşumu (Andy Vierstraete, 1999)
Bazlar çift sarmal yapının içinde hidrofobik bir çekirdek oluşturur. Şekerler ve fosfat grupları (anyonik formlarında) molekülün dış hidrofilik katmanını oluşturur. Fizyolojik durumlarda çift iplikli DNA sarmalı tek iplikli DNA sarmalından daha dayanıklıdır.
1.3.2.3. DNA’nın Replikasyonu
DNA bir organizmanın yapısını ve fonksiyonunu bütünüyle tanımlayan tüm genetik bilgiyi içerir. Genetik bilginin aktarımından üç farklı işlem sorumludur;
replikasyon, transkripsiyon ve translasyon.
Replikasyon esnasında çift iplikli bir nükleik asit molekülü, eş kopyalar verebilmek için birebir çoğaltılır. Bu işlem genetik bilginin değişmeden korunarak sürekliliğini sağlar. Transkripsiyon sırasında, bir gene karşılık gelen DNA parçası okunurak tek iplikli bir RNA sekansı ile ifade edilir. Bu RNA molekülü çekirdekten sitoplazmaya hareket eder. Translasyon sırasında RNA sekansı sitoplazmada, protein oluşturan aminoasit zincirine çevrilir (Alberts ve ark, 1983).
Şekil 1.11. Hücrede DNA’nın yapısı (Andy Vierstraete, 1999)
DNA replikasyonu PCR amplifikasyonunun dayandığı işlemdir.
Replikasyon sırasında, DNA molekülünün çift sarmal yapısı çözülerek açılır ve her iplik, yeni bir tamamlayıcı ipliğin sentezi için ata olur. Her yavru molekül bir eski bir de yeni DNA ipliğinden oluşur ve ana molekülün birebir kopyasıdır.
Şekil 1.12 Replikasyon çatalı
Çift sarmalın açılması ve yeni DNA ipliğinin sentezlenmesi için birçok enzim gereklidir. Topoizomeraz ve helikazlar DNA’nın sarmal yapısını kırarak çözmek ve DNA’nın tek ipliğinin çentiklenerek açılmasından sorumludur.
Böylece primaz (primezom olarak tanımlanan bir protein grubunun bir parçası) enzimi DNA polimerazın senteze başlayacağı 3’ OH bölgesinde görev yapmak için küçük bir RNA primerini tek iplikli DNA’ya bağlar. Bu RNA primeri daha sonra RNAaz H tarafından uzaklaştırılır ve kalan boşluk DNA polimeraz I tarafından doldurulur. Bu safhada, DNA polimeraz DNA’nın tek ipliğinde ilerler. DNA polimerazın farklı tipleri vardır, fakat yeni DNA ipliklerinin ilerleyen sentezinden prokaryotlarda DNA polimeraz III sorumludur.
DNA polimeraz ata iplikteki bazları uygun komplementer serbest dNTP ile hidrojen bağları ile bağlar (A, T ile; G, C ile). Aynı zamanda oluşan ipliğin bir önceki nükleotidi ile bu yeni nükleotid arasında kovalent fosfodiester bağ oluşturur. Trifosfatta saklanan enerji her yeni nükleotidin büyüyen ikinci ipliğe
kovalent bağla bağlanması için kullanılır. DNA polimeraz yalnızca 5’ uçtan 3’
uca doğru çalışır. Çift sarmalın bir ipliği 5’ uçtan 3’ uca doğru olduğu için, diğeri de 3’uçtan 5’ uca doğrudur. DNA polimeraz 5’ uçtan 3’ uca doğru olan ipliğin (lagging strand) ikinci kopyasını parçalar halinde (Okazaki fragmanları) oluşturur (Ogawa ve Okazaki 1980). 5’ uçtan 3’ uca olan ipliğin gen kopyasının sentezlenmesi şekil 1.10 da görülmektedir. Diğer iplik (leading strand) sarmal açıldıkça 5’ uçtan 3’ uca direkt olarak sentezlenir. DNA polimeraz boş bir tek iplikte, ex novo olarak sentezlemeye başlayamaz, mutlaka dNTP’yi bağlayacağı serbest bir OH grubuna sahip bir primere ihtiyaç duyar.
Ligaz enzimi serbest ama komşu olan 3’ OH ve 5’ fosfat grupları arasında fosfodiester bağın oluşumunu katalize eder. Bu aktivite, RNA primerinin ayrılmasını takiben arada kalan küçük bölümlerin, molekülün geri kalanına bağlanmasını sağlar. SSB (single strand binding, tek iplik bağlanıcısı) proteinleri replikasyon çatalının dayanıklılığını korumak için çok önemlidir. Tek iplikli DNA oldukça kırılgan ve dayanıksızdır bu nedenle bu proteinler tek iplikli kaldığında DNA’ya bağlanarak onu parçalanmaktan korur.
1.3.3. PCR Prensipleri
PCR hücre içinde (in vivo) DNA’nın kendini eşlemesi mekanizmasına dayanır. Çift zincirli DNA (dsDNA), tek zincirli DNA (ssDNA) biçimine çözülür, kopyalanarak çoğaltılır ve tekrar bağlanır. Bu teknik;
· Çift sarmal DNA’nın yüksek sıcaklıkta çözülerek tek sarmal haline gelmesi: denatürasyon
· Primer olarak kullanılan iki oligonükleotidin hedef DNA’ya bağlanması:
primer eşleşmesi
· Mg+2 iyonlarının varlığında, katalizör olan DNA polimeraz ile primerlere nükleotid eklenmesi ve DNA zincirinin uzaması: primer uzaması
İşlem döngülerinin birçok tekrarından oluşur.
Genellikle kısa zincirlerden oluşan oligonükleotidler, birbirlerinden dizin olarak farklıdır. Primerlerin sekansı, çoğaltacak hedef DNA’ya komşu tanımlama bölgelerine eştir. Denatürasyon, primer birleşmesi ve primer uzaması PCR metodunda bir döngüyü oluşturur. Şekil 1.11’de PCR işlemindeki üç ana basamak gösterilmektedir.
Şekil 1.13. PCR çoğalmasının basamakları (Andy Vierstraete,1999)
Her döngünün sonunda yeni sentezlenen DNA zincirleri, bir sonraki döngü için hedef (ata) zincir olabilir. Şekil 1.13’te görüldüğü gibi, bu reaksiyonun ana ürünü, sonu oligonükleotid primerlerin 5’ ucu olan ve uzunluğu primerler arası uzaklıkla tanımlanan bir dsDNA parçasıdır. Başarılı bir amplifikasyonun ilk döngüsünün ürünleri, iki primerin bağlanma bölgeleri arasındaki uzaklıktan daha fazla uzunluğa sahip, farklı boyutlarda DNA moleküllerdir. İkinci döngüde, istenen uzunluktaki DNA zincirleri oluşur. Bu ürünün miktarı diğer amplifikasyon
döngülerinde lineer olarak çoğalır ve reaksiyonun temel çıktısını oluşturur.
Amplifikasyon, başlangıçtaki ana zincirin reaksiyon sonundaki kopya sayısı biçiminde aşağıdaki formülle açıklanır:
(2n-2n)x
Burada n döngü sayısı, 2n ilk ve ikinci döngüden sonra elde edilen uzunluğu bilinmeyen ürünler, x ana zincirin kopya sayısıdır. Potansiyel olarak 20 döngüden sonra her döngüde %100 başarı ile, 220 kez amplifikasyon olacaktır. PCR’ın başarısı, uygulanan optimizasyon düzeyine göre ve atadan ataya değişir. PCR amplifikasyonunun üç aşamasının detaylı tanımları (ata denatürasyonu, primer bağlanması ve uzaması) aşağıdaki paragraflarda verilmiştir (Sambrook ve ark, 1989).
Şekil 1.14. DNA’nın PCR ile üstel çoğaltılması (Sambrook ve ark, 1989).
1.3.3.1. Template Denatürasyonu
Denatürasyon esnasında, çift sarmal çözülür, bütün enzimatik reaksiyonlar durur (örn. bir önceki döngüdeki uzama). İki eş zincir artan sıcaklık ile birbirinden ayrılır. Bu işlem denatürasyon (bozulma) olarak adlandırılır. DNA denatürasyonunu sağlamak için sıcaklık yaklaşık 93-96°C ‘ye çıkarılır. Bu sayede kuvvetli hidrojen bağları kırılır ve eşleşmemiş bazların sayısı artar. Ortamdaki tüm çift sarmal (ds) DNA, tek sarmal (ss) DNA formuna dönüştüğünde reaksiyon
tamamlanır. Mevcut dsDNA’nın yarısının tek sarmal haline dönüştüğü sıcaklık Tm, erime sıcaklığı olarak bilinir. Kullanılan çözücü, tuz derişimleri ve ortam pH’sı denatürasyon işlemini etkiler. Örneğin, düşük tuz derişimlerinde, yüksek pH ve formaldehit gibi organik çözücülerin varlığında Tm düşer. DNA’nın içerdiği nükleotid çiftlerinin oranı yani G/C ve T/A miktarları da Tm değerini etkiler. G/C miktarı yüksek olan DNA’nın Tm’i, T/A miktarı yüksek olan DNA’ya göre daha yüksektir. Örneğin Serratia marecescens %60 G/C ile yaklaşık 94°C Tm’e sahipken, Pneumococcus %40 G/C ile 85°C Tm’e sahiptir.
1.3.3.2. Primer Eşleşmesi
DNA zincirlerinin eşleşmesi veya yeniden bağlanması daha düşük sıcaklıklarda gerçekleşir (genellikle 55-65°C). Sıcaklık düşünce, birbirine eş iki ssDNA zinciri yeniden bağlanarak dsDNA oluşturur. Bu fazda, tek zincir primerler ile tek zincir hedef DNA arasında hidrojen bağları oluşur ve kırılır.
Hedef DNA’ya tam olarak eşleşen primer ile ana zincir arasındaki bağlar daha sağlam ve uzun süreli olur. Ortaya çıkan bu küçük dsDNA parçası (primer- template) üzerine DNA polimeraz bağlanarak ana zinciri kopyalamaya başlar.
Birkaç baz eklendikten sonra primer ve template arasındaki iyonik bağ kuvvetlenir ve kırılmaz.
1.3.3.3. Primer Uzaması
Sıcaklığa dayanıklı DNA polimeraz (genellikle Taq DNA Polimeraz) ile dNTP’lerin varlığında primerler hedef zincir boyunca uzatılır. Bu reaksiyon başlangıçtaki hedef DNA materyalinin iki katına çıkması ile sonuçlanır (birebir kopyalama). Taq Polimerazın optimum çalışma sıcakllığı 72°C’dir. Primerler bir kaç baz uzadıktan sonra, hedef DNA’ya karşı daha yüksek iyonik çekime sahip olurlar. Bu da yapılan işlemin geri dönüşünü engeller. Tam olarak eşleşmeyen (uyuşmayan) primerler yüksek sıcaklıktan dolayı gevşer ve böylelikle reaksiyon DNA parçasının uzaması ile sonuçlanmaz. Ana DNA’ya eş olan bazlar primere 3’
kısmından bağlanır. Polimeraz ana zinciri 3’-5’ yönünde okurken, 5’-3’ yönünde dNTP ekler. Primer uzama basamağının süresi, çoğaltılacak DNA uzun ise arttırılabilir. Ancak genellikle PCR deneylerinde 1 dakikalık uzama zamanı tam sentez için yeterlidir.
1.3.3.4. Hedef DNA
PCR amplifikasyonu prensip olarak, hedef genin en azından bir tam kopyası bulunduğunda yapılabilir. Çok sayıda hedef gen kopya sayısı başarılı DNA amplifikasyon olasılığını arttırır. Hedef DNA yapısında herhangi bir hasar (örneğin kırılma) PCR amplifikasyonunu durdurur. Hedef zincirin uzunluğu 0,1’den birkaç kilobaza kadar olabilir. PCR’de kullanılan toplam DNA miktarı hedef DNA’nın tek kopyasının belirlenmesine olanak sağladığı için 0,05 µg ile 1 µg arasında olur. Kullanılan numunenin çok saf olması gerekmemekle beraber heparin, heme, formalin, Mg+2 şelatlayıcı ve deterjan gibi maddeler amplifikasyon işlemini engelleyebilir.
1.3.3.5. Primerler (Öncüler)
Genellikle yüksek bağlanma sıcaklıklarında kullanılabilmesi açısından 16-30 nükleotid uzunlukta primerler kullanılır. Primerlerde hedef ile uygun olmayan bağlanmalar yapabilecek polibaz zincir uzamalarından (örneğin poli dG), veya tekrar eden motiflerden kaçınılmalıdır. Hedef DNA’ya hibridizasyonu engelleyeceği için primerde ikincil yapı oluşmasına yol açan tekrar eden ters zincirlerden kaçınılmalıdır.
PCR’da kullanılan primerlerin birbirlerine tamamlayıcı olmaması primerler arasında hibridizasyon veya primer–dimer oluşumlarını engellemek için önemlidir (özellikler primerin 3’ ucu için). Eğer mümkünse uzayacak olan kısmın bağlanmasını arttırmak için primerin 3’ ucunda çok sayıda G ve C bazları bulunmalıdır. Primerler arasındaki mesafe 10kb’den az olmalıdır. Genellikle primerler arasındaki uzaklık 3kb’den fazla olunca PCR ürününde önemli ölçüde azalma görülür. Genelde PCR’da oligonükleotidler 1 µM derişimde kullanılırlar.
Bu miktar 30 döngülük bir PCR için yeterlidir. Yüksek miktarlarda oligonükleotid istenmeyen bölgelerin amplifikasyonuna sebep olabilir. Buna karşılık düşük primer konsantrasyonları PCR verimini azaltır.
1.3.3.6. DNA Polimeraz
Orijinal PCR metodunda E. coli DNA polimeraz I’in Klenow parçası kullanılmıştır ( Saiki ve ark, 1985).
Ancak bu enzim hedef dsDNA’yı denatüre etmek için gerekli olan sıcaklıktan daha düşük sıcaklıklarda bozulmaktadır. Bu nedenle ilk çalışmalarda her döngüden sonra reaksiyona yeni enzim eklenmesi gerekiyordu. Buna ek olarak farklı sıcaklıklarda gerçekleşen denatürasyon, bağlanma ve uzama basamakları için örneklerin bir sıcaklık banyosundan diğerine aktarılması gerekiyordu. Sıcağa dayanıklı DNA polimerazın kullanımı, her denatürasyon basamağından sonra enzim eklenmesi gereğini ortadan kaldırdığı için PCR işlemini kolaylaştırmıştır. DNA polimerazlar polinükleotidin sadece 3’ ucuna yeni nükleotid ekleyebilmektedir.
Kullanılan ilk sıcağa dayanıklı DNA polimeraz Thermus aquaticus’dan izole edilen Taq DNA polimerazdır Bu enzim PCR uygulamalarında en yaygın kullanılan enzimdir (Saiki ve ark, 1988).
1.3.4. PCR Reaksiyonlarında Reaksiyon Tampon Çözeltileri ve MgCl2
PCR için reaksiyonda direk olarak yer alan maddelerin yanısıra uygun bir tampon çözeltisine ihtiyaç duyulur. Tampon içeriği kullanılan enzimin özellik ve tipine bağlıdır ve birçok üretici enzimle beraber 10X tamponunu da sağlar.
Taq/AmpliTaq®DNA polimeraz ile en yaygın olarak kullanılan tampon;
10mM Tris, pH 8,3 50mM KCl 1,5-2,5 mM MgCl2 içermektedir.
PCR’da divalent katyonların bulunması çok önemlidir. Reaksiyon karışımında MgCl2 konsantrasyonu 0,5 ile 5 mM arasındadır ve optimum konsantrasyon ampirik olarak belirlenir (Innis ve ark, 1988).
Mg+2 iyonları;
· dNTP bağlanması için gerekli olan dNTP’ler ile çözünebilen bir karışım oluşturur.
· polimeraz aktivitesini artırır.
· primer/hedef DNA etkileşmininin Tm’sini artırır (böylece ikili etkileşimi daha dengeli hale getirir).
Genellikle düşük Mg+2 konsantrasyonu düşük miktarda ürün (ya da hiç) oluşmasına sebep olurken yüksek miktarlardaki Mg+2, özel olmayan ürünlerin (yanlış eşleşme) artmasına sebep olur. Hedef DNA solüsyonunda yüksek miktarlarda fosfat gibi negatif olarak yüklenmiş iyonik gruplardan ya da EDTA gibi şelatlayıcı maddelerden kaçınılması gerekir.
Güncel literatürde çeşitli PCR tamponları ve DMSO, PEG 6000, formamid, gliserol, spermidin ve iyonik olmayan deterjanlar gibi reaksiyon hassasiyeti ve etkisini arttırmak için kullanılan ek maddelerin kullanılması üzerine tartışmalar bulunmaktadır. Belli DNA polimeraz türleri sadece bu tür ek maddelerin varlığında optimum aktivite göstermektedir (Roux ve ark, 1995).
1.3.5. Deoksiribonükleosit Trifosfatlar
Serbest deoksiribonükleosit trifosfatlar (dNTP’ler) DNA sentezi için gereklidir. PCR için kullanılan her dNTP için konsantrasyon 20 µM ile 200 µM arasında olmalıdır ve yanlış bağlanma hatalarını önlemek için 4 dNTP de eşit miktarlarda kullanılmalıdır (Innis ve ark, 1988).
Yüksek saflıkta dNTP’ler üretici firmalar tarafından dört ayrı stok ya da dört dNTP karışımı olarak sağlanmaktadır. dNTP stok solüsyonları (genellikle 100 mM)
için pH, son reaksiyon pH’sı 7,1’in altına düşmeyecek biçimde, 1M NaOH ile pH 7,0-7,5 arasında ayarlanmalıdır.
Şu anda üretilen dNTP stok solüsyonlarının çoğu pH ayarlı olarak sağlanmaktadır. (Sambrook ve ark, 1989).
1.3.6. Döngü Sayısı ve Plato Etkisi
Jelde görülebilecek bir DNA bantı elde edebilmek için gerekli olan amplifikasyon döngülerinin sayısı hedef DNA’nın başlangıç derişimine bağlıdır. 50 hedef molekülü çoğaltmak için 40-45 döngü önerilir, ancak aynı derişimde 3x105 molekülü çoğaltmak için 25-30 döngü de yeterlidir.
Bu oransızlık “Plato etkisi” olarak adlandırılır. Sebebi ürün konsantrasyonu 0,3-1 nM’e ulaştığı PCR’ın son safhalarında reaksiyonun lineer hızındaki azalmadır. Reaksiyon girdilerinin (dNTP, enzim) parçalanması kısa hedefler için, azalması ise (primerler, dNTP)uzun hedefler için bir problem olabilir. Son ürün inhibisyonu (pirofosfat oluşumu), özel olmayan ürünlerin reaksiyon girdileri için yarışması, konsantre ürünün (10 nM) yeniden bağlanma ile primer bağlanması için yarışması bu duruma yol açabilir (Innis ve ark, 1990).
Eğer istenilen ürün 30 döngüde elde edilmiyorsa, döngü sayısını arttırmak yerine çoğaltılan üründen çok az bir örnek (1 μl) alınarak yeni bir reaksiyon karışımı ile 20-30 döngü çoğaltılmalıdır. Ana molekül derişiminin sınırlı olduğu durumlarda bu yeni amplifikasyon iyi sonuç verirken döngü sayısının 40 ya da daha fazla yapılması iyi sonuç vermez.
1.3.7. PCR için Primer Tasarımı
Başarılı bir PCR için en kritik parametre primerlerin tasarımıdır. Tüm koşulların uygun olduğu bir durumda, sadece zayıf tasarlanmış bir primer PCR reaksiyonun çalışmamasına neden olabilir. Primer sekansı ürünün gen üzerindeki pozisyonu ve uzunluğu, erime sıcaklığı, ve nihayetınde PCR verimi dâhil pek çok parametreyi etkiler (Innis ve ark, 1994).
Zayıf tasarlanmış bir primer, ürün oluşumunu bastıracak biçimde rakip olabilen primer-dimer oluşumu ve/veya özel olmayan amplifikasyon sonucu çok az veya hiç ürün üretilmemesine neden olabilir. Bu uygulama notu PCR için primer tasarlanırken dikkat edilmesi gereken kuralları içermektedir. (Dieffenbach ve ark, 1995).
1.3.8. Primer Seçimi
PCR primerleri tasarlanırken çeşitli parametrelere dikkat edilmelidir. En kritikleri;
-Primer uzunluğu -Erime sıcaklığı Tm -Hassasiyet (specificity)
-Tamamlayıcı primer sekansları
-G/C miktarı ve polipirimidin (T, C) ve polipurin (A, G) uzamaları -3’ uc sekansıdır.
İzleyen bölümlerde bu kritik maddeler tartışılacaktır.
1.3.9. Primer Uzunluğu
PCR hassasiyeti, bağlanma sıcaklığı ve bağlanma süresi primer uzunluğuna bağlı olduğundan bu parametre başarılı bir PCR için çok önemlidir. Genel olarak, bağlanma sıcaklığı uygun olduğunda 18 ile 24 bazlık oligonükleotidler belli bir sekansa özel olarak bağlanırlar. Primer uzunluğu aynı zamanda bağlanma verimi ile de doğru orantılıdır. Genel olarak primer uzadıkça, bağlanma verimi azalır. Her basamakta daha az ana molekül primerle bağlandığından çoğaltılan üründe önemli derecede azalmaya neden olur.
Uygulama özellikle gerektirmedikçe, primerler çok kısa olmamalıdır.
Aşağıda bahsedildiği gibi hedef en az 50°C’lik bağlanma sıcaklığına sahip bir
primer tasarlamaktır. Bağlanma sıcaklığı ile erime sıcaklığı arasındaki bağlantı PCR’ın kara kutularından biridir. Genel kural bağlanma sıcaklığını erime sıcaklığından 5°C daha düşük olarak kullanmaktır. Genellikle sadece bu şekilde hesaplanan bağlanma sıcaklığ, enı uygun sıcaklık olmayıp belirlemek için ampirik deneyler yapılmak zorunda kalınabilir. Bu optimizasyon kademeli termal döngü kullanılarak kolaylıkla yapılabilir.
1.3.10. Erime Sıcaklığı (Tm)
Hedef/bölge yönlü PCR reaksiyonu için iki primer kullanıldığı unutulmamalıdır. Her iki oligonükleotid primer de benzer erime sıcaklıklarına sahip olacak şekilde tasarlanmalıdır. Eğer primerler Tm nedeni ile yanlış bağlanırsa, amplifikasyon daha az verimli olacaktır. Düşük sıcaklıkta Tm’ye sahip primer yüksek sıcaklıkta, yüksek sıcaklıkta Tm’ye sahip primer düşük sıcaklıkta çalışmayacaktır.
1.3.11. Primer Hassasiyeti
Yukarıda bahsedildiği gibi, primerin hassasiyeti (specificity), primer uzunluğuna bağlıdır. 24 bazlık özgün oligo sekansları 15 bazlık oligo sekanslarından daha hassastır. Primerler kısmi olarak çoğaltılacak hedef DNA içinde özgün bir sekans taşıyacak biçimde tasarlanmalıdır. Tekrarlanan sekanslar içeren primer ile genomik DNA çoğaltılması bulanıklık ile sonuçlanacaktır ( birden fazla ürün türü).
Ancak aynı primer, genomik kütüphaneden tek bir klon çoğaltıldığında net, tek bir bant verebilir. Taq polimeraz geniş bir sıcaklık aralığında aktif olduğu için primer uzaması düşük bağlanma sıcaklıklarında meydana gelebilir. Sıcaklık çok düşük olduğunda primer ile özgün olmayan bağlanma gerçekleşebilir. Eğer 3’ ucunda kısa da olsa homoloji varsa polimeraz bu noktadan çalışmaya devam eder. Genel olarak 55-72°C arasındaki erime sıcaklığı en iyi sonucu verir. (bu sıcaklık aralığı Wallace kuralına göre 18-24 bazlık primer uzunluğu düşünülerek verilmiştir.)
