STAPHYLOCOCCUS AUREUS İZOLATLARINDA
PANTON-VALENTIN LÖKOSİDİN GENLERİNİN
POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU İLE
AMPLİFİKASYON SONUÇLARI ÜZERİNE
REAKSİYON KOŞULLARININ ETKİSİ*
INFLUENCE OF REACTION OPTIMIZATION ON THE RESULTS
OF PCR AMPLIFICATION OF PANTON-VALENTINE
LEUKOCIDIN GENES AMONG STAPHYLOCOCCUS AUREUS
ISOLATES
Zeynep Ceren KARAHAN1, İştar DOLAPÇI1, Alper TEKELİ1
1Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara.
(ckarahan@medicine.ankara.edu.tr)
ÖZET
Panton-Valentin lökosidini (PVL), Staphylococcus aureus’un önemli bir virülans faktörüdür. PVL pozitif-liğini saptamada, PVL’yi kodlayan gen bölgesinin polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile amplifikasyonu en yaygın kullanılan yöntemdir. Bu çalışmada, iki farklı primer seti ve her set için farklı bağlanma sıcaklıkları kullanılarak, primer seçiminin ve termal döngü koşullarının PCR ile PVL gen amplifikasyon sonuçları üze-rine etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır. Çalışmaya, çeşitli klinik örneklerden izole edilen toplam 321 adet S.aureus suşu (%84.4’ü metisiline dirençli; %76.9’u hastane kökenli) dahil edilmiştir. Suşların PVL gen amplifikasyonları için iki farklı primer seti ile ikişer farklı bağlanma sıcaklığı uygulanmıştır. Bu amaçla, luk-S PV ve luk-F PV genlerini içeren 433 bç’lik bölgeyi çoğaltmak için luk-PV-1 ve luk-PV-2 primerleri ve amplifikasyon için 55°C ve 58°C’lik sıcaklıklar kullanılırken; aynı genleri kapsayan 1918 bç’lik bölgeyi ço-ğaltmak için PVLup ve PVLdn primerleri ve amplifikasyon için 50°C ve 48°C’lik bağlanma sıcaklıkları uy-gulanmıştır. Çalışmamızda, luk-PV-1 ve luk-PV-2 primerleri ile S.aureus izolatlarının %50.2 (161/321)’sin-de 55°C’(161/321)’sin-de amplikon el(161/321)’sin-de edilirken, 58°C’(161/321)’sin-de sa(161/321)’sin-dece %1.6 (5/321)’sında amplikon el(161/321)’sin-de edilmiştir. PVL po-zitif amplikonların, hatalı amplifiye edilen PCR ürünlerinden ayrımını yapabilmek amacıyla, restriksiyon endonükleaz analizi yapılmış ve luk-PV-1 ve luk-PV-2 primerleri ile 58°C’de elde edilen beş amplikonun da, BspH1 enzimi ile PVL pozitif amplikonlarda beklenildiği şekilde kesildiği görülmüştür. PVLup ve PVLdn primerleri ile yapılan deneylerde ise 321 S.aureus izolatının hiçbiri (pozitif kontrol suşu hariç) 50°C’de amplikon vermemiş, sıcaklık 48°C’ye indirildiğinde beş (%1.6) klinik izolatta PVL pozitifliği saptanmıştır. Bu izolatların da luk-PV-1 ve luk-PV-2 primerleri ile 58°C’de PVL pozitif bulunan suşlar ile aynı olduğu iz-lenmiştir. Bu veriler, çalıştığımız izolatlardaki gerçek PVL gen pozitifliğinin %1.6 (5/321) olduğunu
termiştir. Bulgularımız, uygun olmayan döngü koşullarının, PVL gen amplifikasyonunda yalancı negatif ya da yalancı pozitif değerlendirmelere yol açabileceğini göstermiştir. Sonuç olarak, PVL araştırmaların-da, çalışma sonuçlarını yorumlamadan önce, farklı primerler ve farklı bağlanma derecelerinin kullanılma-sı uygun görünmektedir. Her çalışmada pozitif ve negatif kontrol suşlarının kullanılmakullanılma-sı ve çalışma pro-tokolünün sadece literatür bilgilerine dayanarak değil, aynı zamanda laboratuvar deneyimleri ile optimi-zasyonu, güvenilir verilerin elde edilmesinde kritik önem taşımaktadır.
Anahtar sözcükler: Staphylococcus aureus, Panton-Valentin lökosidini, polimeraz zincir reaksiyonu.
ABSTRACT
Panton-Valentine leukocidin (PVL) is an important virulence determinant of Staphylococcus aureus. Polymerase chain reaction (PCR) amplification of the genes encoding PVL is the most widely used met-hod for determining PVL-positivity. In this study, we used two different primer sets and different anne-aling temperatures for each set to investigate the effect of optimization of PCR parameters on the amp-lification results. A total of 321 S.aureus clinical isolates (84.4% methicillin-resistant S.aureus, 76.9% no-socomial) were included to the study. Two different primer sets and two different annealing temperatu-res were applied for the amplification of PVL gene. For this purpose while luk-PV-1 and luk-PV-2 primers and 55°C and 58°C annealing temperatures were used to amplify the 433 bp region inhabiting the luk-S PV and luk-F PV genes, PVLup and PVLdn primers and 50°C and 48°C annealing temperatures were used to amplify the 1918 bp region inhabiting the same genes. luk-PV-1 and luk-PV-2 primers yielded ampli-cons at 55°C in 50.2% (161/321) and at 58°C in 1.6% (5/321) of the isolates. To discriminate the posi-tive amplicons from the crossly amplified PCR products, restriction endonuclease analysis was performed and it was observed that the five amplicons generated by luk-PV-1 and luk-PV-2 primers at 58°C were cut by BspH1 enzyme as expected for the positive amplicons. None of the isolates yielded amplicons by PVLup and PVLdn primers at 50°C, however, only 1.6% of the isolates yielded amplicons at 48°C. These isolates were the same with the ones that were PVL positive with luk-PV-1 and luk-PV-2 primers at 58°C. These data revealed that only 1.6% of the study isolates were PVL positive. These results showed that inappropriate cycling conditions may lead to false-negative or false-positive results in PVL-gene amplifi-cation. Restriction endonuclease or sequence analysis may be used to differentiate crossly-amplified se-quences from PVL-positive amplicons. We suggest using different primers and different annealing tem-peratures in PVL gene amplification before concluding on the study results. Using positive and negative control strains in each run and optimization of the study protocol not only according to the literature da-ta but also due view to the laboratory experience seems critical for obda-taining reliable dada-ta.
Key words: Staphylococcus aureus, Panton-Valentine leukocidin, polymerase chain reaction.
GİRİŞ
prote-inler, sırasıyla 32 ve 38 kDa büyüklüğünde olup, lukS-PV ve LukF-PV genleri tarafından kodlanmaktadır. Bu genler iki ayrı açık okuma bölgesi içerir ve sırasıyla 939 ve 978 nük-leotid büyüklüğündedir. Bunlar birbirinden tek bir timin nüknük-leotidi ile ayrılırlar ve tek bir mRNA molekülü olarak transkribe olurlar2. Bu genler, PVL negatif S.aureus suşlarını PVL üreticilerine dönüştüren çeşitli ılımlı bakteriyofajlar üzerinde taşınmaktadır3,6,7.
PVL üreten S.aureus suşları sıklıkla primer deri ve yumuşak doku enfeksiyonları ve top-lumdan kazanılan nekrotizan pnömoni ile ilişkilidirler; ancak bütün sistemlerde enfeksi-yon oluşturabilirler1,8-20. PVL üretiminin saptanmasında en yaygın olarak kullanılan yön-tem, PVL kodlayan genlerin polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile amplifiye edilmesidir. Bu çalışmada, iki farklı primer seti ve her set için farklı bağlanma sıcaklıkları kullanarak, primer seçimi ve döngü koşullarının PCR ile PVL gen amplifikasyon sonuçları üzerine et-kilerinin araştırılması amaçlanmıştır.
GEREÇ ve YÖNTEM
S.aureus Suşları
PVL gen varlığının araştırılması için, çeşitli klinik örneklerden (yara, balgam, endotra-keal aspirat, dren, kan, steril vücut sıvıları, beyin omurilik sıvısı, kateter) izole edilen, top-lam 321 adet S.aureus suşu kullanıldı. Suşların 74 (%23.1)’ü toplumdan kazanılmış, 247 (%76.9)’si ise hastane kökenliydi. Tanımlama, standart mikrobiyolojik yöntemlerle (kolo-ni ve mikroskopik morfoloji, katalaz reaksiyonu ve tavşan plazması ile koagülaz testi) ya-pıldı. Toplumdan kazanılmış izolatların 64 (%86.5)’ü ile hastane kökenli izolatların 207 (%83.8)’sinin metisiline dirençli S.aureus (MRSA) olduğu belirlendi. Metisilin direnci se-foksitin disk difüzyon yöntemi ile saptandı ve mecA geninin PCR amplifikasyonu ile doğ-rulandı.
DNA Ekstraksiyonu
Genomik DNA daha önce tarif edilen şekliyle standart fenol-kloroform ekstraksiyon yön-temi ile elde edildi21. Ekstrakte edilen DNA örnekleri çalışılıncaya kadar -20°C’de saklandı.
PVL Genlerinin Amplifikasyonu
S.aureus suşlarının PVL gen amplifikasyonları için iki farklı primer seti seçildi ve farklı bağlanma sıcaklıkları uygulandı. luk-PV-1 (5’ATC ATT AGG TAA AAT GTC TGG ACA TGA TCC A3’) ve luk-PV-2 primerleri (5’GCA TCA AST GTA TTG GAT AGC AAA AGC 3’) ile ya-pılan PCR amplifikasyonu, luk-S PV ve luk-F PV genlerini içeren 433 bç’lik bölgeyi çoğalt-mak için literatürde belirtilen şekilde gerçekleştirildi1. Amplifikasyon için iki ayrı bağlan-ma sıcaklığı (55°C ve 58°C) kullanıldı (Resim 1).
Sekans Analizi
Çoğaltılan bölgenin DNA dizisini belirlemek için, luk-PV-1 ve luk-PV-2 primerleri ile el-de edilen daha kısa (yaklaşık 350 bç) iki amplikon, yine luk-PV-1 ve luk-PV-2 primerleri kullanılarak, ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, ABD) cihazında çift yönlü otomatize DNA sekans analizine tabi tutuldu.
Restriksiyon Endonükleaz Analizi
PVL pozitif amplikonların hatalı amplifiye edilen PCR ürünlerinden ayrımını yapmak amacıyla, sekanslanan bölgenin ve PVL amplikonunun kesim alanları internette bulunan WebCutter Programı (http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/) kullanılarak analiz edildi. Farklı amplikonlarda farklı kesim bölgelerine sahip uygun enzimler arasından, laboratuvarımız-da halihazırlaboratuvarımız-da bulunması nedeniyle, BspH1 (T/CATGA, New England Biolabs, İngiltere) restriksiyon endonükleazı seçildi. luk-PV-1 ve luk-PV-2 primerleri ile 55°C’de saptanan bü-tün PVL pozitif amplikonlar (161 izolat), BspH1 ile restriksiyon endonükleaz analizine
ta-Resim 1. luk-PV-1 ve luk-PV-2 primerleri ile 55°C (1A) ve 58°C (1B) bağlanma sıcaklıklarında elde edilen PCR
bi tutuldu. PVL pozitif PCR ürünleri (433 bç) 151. ve 331. nükleotidler hizasında iki kesim bölgesi taşır ve kesim işlemi sonucunda 180, 151 ve 102 bç’lik üç fragman elde edilmek-tedir. Primerlerin hatalı bağlanması sonucunda ortaya çıkan amplikonlar (347 bç) BspH1 ile herhangi bir kesim bölgesi içermemektedir (Resim 3).
BULGULAR
Toplam 321 S.aureus izolatının 161 (%50.2)’i, luk-PV-1 ve luk-PV-2 primerleri ile 55°C’de, çoğunluğu pozitif kontrolden biraz daha kısa olmakla beraber, amplikon ver-miştir. Bu 161 suşun 128 (%79.5)’i hastane kökenli olup, 109’u MRSA, 19’u metisiline duyarlı S.aureus (MSSA)’tur. PVL-pozitif bulunan 33 (%44.6) toplumdan kazanılmış S. aureus suşunun ise 26’sı MRSA, 7’si MSSA’dır. Bu primerlerle 58°C’de sadece 5 suşta
Resim 2. PVLup ve PVLdn primerleri ile 50°C (2A) ve 48°C (2B) bağlanma sıcaklıklarında elde edilen PCR
amp-likonları. M: Moleküler ağırlık belirteci (2A. Mass Ruler DNA Ladder Mix, Fermentas, Litvanya; 2B. O’Range Ruler 50 bp ladder, Fermentas, Litvanya), PK: PVL-pozitif kontrol (GRE-14), NK: DNA içermeyen negatif kont-rol. Aynı numaralar her iki jelde de aynı suşlara karşılık gelmektedir.
(%1.6) pozitif sonuç alınmıştır. Bunların 1’i hastane kökenli MRSA, diğer 4’ü toplumdan kazanılmış MRSA suşlarıdır.
Pozitif kontrol suşu hariç 321 S.aureus izolatının hiçbiri, 50°C’de PVLup ve PVLdn pri-merleri ile amplikon vermemiştir. Bağlanma sıcaklığı 48°C’ye indirildiğinde, 5 (%1.6) kli-nik izolatta PVL pozitifliği saptanmıştır. Bu 5 izolat, luk-PV-1 ve luk-PV-2 primerleriyle 58°C’de PVL pozitif bulunan suşlar ile aynıdır.
luk-PV-1 ve luk-PV-2 primerleri ile elde edilen amplikonların çift yönlü DNA dizi anali-zi, amplifiye edilen bölgenin beklenen PVL gen bölgesine (GenBank Accession Number: AB256039) karşılık gelmediğini göstermiştir. Hatalı amplifiye edilen gen dizisi 347 nük-leotid uzunluğunda olup, luk-PV-1 primerinin son 18 bazı ile başladığı, luk-PV-2 primeri-nin ilk 16 bazı ile bittiği tespit edilmiştir. Bu bölgede yer alan 313 nükleotid, amplifiye edilmesi beklenen PVL gen bölgesindekilerden tamamıyla farklı bulunmuştur (Tablo I). Bu 347 bç’lik DNA dizisinin karşılık geldiği gen bölgesi BLAST programı (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) ile araştırılmıştır. Bu bölgenin %95’inin, S.aure-us’un hücre duvarı ile ilişkili “fibronectin-binding protein” (Acc. No: gb|CP000046.1|), “conserved hypothetical protein” (Acc. No: gb|CP000253.1| ve dbj|AP009351.1|), ve hücre yüzey proteini (Acc. No: gb|CP000255.1|) gibi bazı korunmuş proteinlerini kodla-yan gen bölgeleri ile %99 oranında benzerlik gösterdiği bulunmuştur.
luk-PV-1 ve luk-PV-2 primerleri ile elde edilen 161 amplikonun 5 (%1.6)’i BspH1 enzi-mi ile PVL pozitif amplikonlarda beklendiği gibi kesilenzi-miştir. Bu 5 amplikon, aynı primer çifti ile 58°C’de çalışıldığında bant veren izolatlara aittir. Kesim bölgesi taşımayan korun-muş bölgelere ait amplikonlar kesilmeden kalmıştır.
Resim 3. Gerçek PVL-pozitif amplikonlar ile luk-PV-1 ve luk-PV-2 primerlerinin hatalı bağlanmasına bağlı
olu-şan yalancı pozitif amplikonların BspH1 enzimi ile elde edilen kesim paternleri. U: Kesilmemiş PCR ürünü, 1-3: Kesilmeyen 347 bç’lik PCR ürünleri (primerlerin hatalı bağlanmasına bağlı elde edilen yalancı pozitif amp-likonlar), 4-8: BspH1 ile kesim sonrasında elde edilen 102, 151 ve 180 bç’lik PCR ürünleri (gerçek PVL pozitif suşlar), PK: BspH1 ile kesilmiş PVL-pozitif kontrol suşu (GRE-14).
Tablo I.
luk-PV
-1 ve luk-PV
-2 Primerleri ile Çoğaltılan PVL Gen Bölgesinin (GenBank Acc.No. AB256039), A
ynı Primerler ile Hatalı Çoğaltı
lan Gen Bölgesi
(HGB)’nin ve Korunmuş Gen Bölgesi (KGB)’nin (GenBank Acc.No. dbj|AP009351.1|) Dizileri* KGB
gga cat gct cc a cat caa aat atg atc ttt HGB a atg tct gga cat gat cc a cat caa aat atg atc ttt PVL a tca tta ggt aaa atg tct gga cat gat cc a aat tta ttt gtt gga tat KGB tgg ttt gca tta cca gca gac caa gtg cca gta gga aga act gac ttt gta HGB tgg ttt gca tta cca gca gac caa gtg cca gta gga aga act gac ttt gta PVL aaa cca tat agt caa aat ccg aga gac tat ttt gtg cca gac aat gaa tta KGB aca gtt aat tca gat gga aca aat gta caa tgg agt cat gga gca gga gca HGB aca gtt aat tca gat gga aca aat gta caa tgg agt cat gga gca gga gca PVL ccc cca tta gta cac agt ggt ttc aat cct tca ttt att gca act gtt tct_ KGB ggt gca aat aaa cca ctt caa caa atg tgg gaa tat gga gta aat gat cct HGB ggt gca aat aaa cca ctt caa caa atg tgg gaa tat gga gta aat gat cct PVL cat gaa aaa ggc tca gga gat aca agt gaa ttt gaa ata acg tat ggc aga KGB cat cgt tca cat gac ttt aaa ata aga aat aga agt ggc caa gta ata tat HGB cat cgt tca cat gac ttt aaa ata aga aat aga agt ggc caa gta ata tat PVL aat atg gat gtt act cat gct act aga aga aca aca cac tat ggc aat agt KGB gac tgg cca act gtc cat att tat tct tta gaa gat tta tct aga gcg agt HGB gac tgg cca act gtc cat att tat tct tta gaa gat tta tct aga gcg agt PVL tat tta gaa gga tct aga ata cac aac gca ttt gta aac aga aat tac aca KGB gat tat ttt agt gaa gct gga gcg aca cct gct act aaa HGB gat tat ttt agt gaa gct gga gcg aca cct gct act aaa PVL gtt aaa tat gaa gtg aac tgg aaa act_ cat gaa att aaa gtg aaa gga cat KGB HGB PVL aat tga t atg aaa aaa ata gtc aaa tca tca gtt gtt aca tca att gca KGB g ctt ttg HGB g ctt ttg cta tcc aat PVL tt g ctt ttg cta tcc aat aca gtt gat gc *
Primer dizileri koyu ile yazılarak belirtilmiş ve diziler arasındaki tek nükleotid değişikliklerinin altı çizilmiştir
. BspH1 r
estriksiyon endonükleazı ile tanımlanan dizilerin altı
çi-zilmiş ve kesim bölgeleri ok işareti ile belirtilmiştir
. Boş kutuların herhangi bir anlamı yoktur
.
▼
TARTIŞMA
PVL, özellikle direkt invazyon ve doku hasarı yoluyla hastalık oluşturan S.aureus suşlarının önemli bir virülans faktörüdür1. Enfeksiyon yerine bağlı olmaksızın PVL pozitifliği, enfeksi-yonun ciddiyeti ve komplikasyon risklerini artırmaktadır23. PVL taşıyan suşlar, hastane orta-mında kolaylıkla yayılıp, salgınlara yol açabilmekle birlikte9,24-26, PVL taşıyıcılığı, toplumdan izole edilen suşlarda, hastane kaynaklı olanlara göre daha yaygın bulunmaktadır8,24,27,28.
S.aureus suşlarının PVL üretimi, çoğunlukla lukS-PV ve luk-F-PV genlerinin PCR ile amp-likasyonu yoluyla ortaya konulmaktadır. Çalışmaların çoğunda, Lina ve arkadaşları1 tara-fından tasarlanan primerler kullanılmıştır1,9,11,12,16,18,19,24,29-34. Bu çalışmalarda PVL üre-timinin görülme sıklığı %0.4 ile %94.1 arasında değişen oranlarda bulunmuştur29,32. En yüksek oranlar, California’da acil servis hastalarının deri ve yumuşak doku enfeksiyonla-rından elde edilen izolatlarda (%94.1) ve Cezayir’de toplum (%86) ve hastane kaynaklı (%67.5) MRSA suşlarında gösterilmiştir30,32. Cape Verde adalarında hastane kaynaklı MSSA izolatlarında PVL pozitifliği %35 oranında saptanmıştır27. Yunanistan’dan yapılan bir çalışmada ise, aynı primerler kullanılarak 498 MRSA izolatının %45’inin PVL geni ta-şıdığı gösterilmiştir9. Bu yüksek oranlar, bizim 55°C bağlanma sıcaklığı kullandığımızda elde ettiğimiz sıklıkla (%50.2) benzerlik göstermektedir. Bağlanma derecesinin 58°C’ye çıkarılması, değerlendirdiğimiz izolatlarda PVL pozitifliği sıklığında belirgin azalmaya (%1.6) yol açmıştır. Bu bulgu, bu primerler ile, özellikle düşük bağlanma sıcaklıkları kul-lanıldığında hatalı bağlanmalara bağlı olarak, yanlış pozitif sonuçların alınabileceğini göstermektedir. Hatalı bağlanma sonucu elde edilen amplikonlar beklenen amplikonlar-dan yaklaşık 100 bç kadar daha kısa olduğunamplikonlar-dan, bu amplikonların ayrımının yapılma-sında elektroforezin uzun sürelerde gerçekleştirilmesi (100V’da en az bir saat) yardımcı olabilir. Ayrıca amplifiye edilen gen bölgesinin doğruluğundan emin olmak için, elde edilen PCR amplikonlarının DNA dizi analizi ya da restriksiyon endonükleaz analizi ile de-ğerlendirilmesi yapılabilir. PVL’yi kodlayan genlerin diğer lökosidinleri kodlayan genlerle yüksek oranda homoloji gösterdikleri bilinmektedir35, ancak bildiğimiz kadarıyla bu ça-lışma, bahsi geçen primerlerin başka korunmuş gen bölgelerine de hatalı bağlanabilece-ğini gösteren ilk çalışmadır.
Sonuç olarak; S.aureus izolatları arasında PVL pozitifliğini araştıran laboratuvarların ça-lışma protokollerini sadece literatürde verilen bilgilere dayanarak değil, kendi çalıştıkları laboratuvarların deneyimlerini de dikkate alarak özenle yeniden düzenlemeleri gerektiği-ni düşünmekteyiz. Çalışma protokollerigerektiği-nin oluşturulmasında aynı gen bölgesigerektiği-ni hedefle-yen farklı primer setlerinin kullanılması da, sonuçların doğrulanmasında iyi bir seçenek olabilir. Farklı çalışmalarda elde edilen sonuçları karşılaştırırken de, primer seçimi ya da termal döngü koşullarından kaynaklanan yalancı pozitif ve yalancı negatif sonuçların ola-bileceği akılda tutulmalıdır.
KAYNAKLAR
1. Lina G, Piémont Y, Godail-Gamot F, et al. Involvement of Panton-Valentine leukocidin-producing
Staphylo-coccus aureus in primary skin infections and pneumonia. Clin Infect Dis 1999; 29: 1128-32.
2. Johnsson D, Mölling P, Strålin K, Söderquist B. Detection of Panton-Valentine leukocidin gene in
Staphylococ-cus aureus by LightCycler PCR: clinical and epidemiological aspects. Clin Microbiol Infect 2004; 10: 884-9.
3. Narita S, Kaneko J, Chiba J, et al. Phage conversion of Panton-Valentine leukocidin in Staphylococcus
aure-us: molecular analysis of a PVL-converting phage, ΦSLT. Gene 2001; 268: 195-206.
4. Prévost G, Cribier B, Couppié P, et al. Panton-Valentine leukocidin and gamma-hemolysin from
Staphylo-coccus aureus ATCC 49775 are encoded by distinct genetic loci and have different biological activities.
In-fect Immun 1995; 63: 4121-9.
5. Prévost G, Mourey L, Colin DA, Menestrina G. Staphylococcal pore-forming toxins. Curr Top Microbiol Im-munol 2001; 257: 53-83.
6. Kaneko J, Kimura T, Kawakami Y, Tomita T, Kamio Y. Panton-Valentine leukocidin genes in a phage-like par-ticle isolated from mitomycin C-treated Staphylococcus aureus V8 (ATCC49775). Biosci Biotechnol Biochem 1997; 61: 1960-2.
7. Kaneko J, Kimura T, Narita S, Tomita T, Kamio Y. Complete nucleotide sequence and molecular characteri-zation of the temperate staphylococcal bacteriophage ΦPVL carrying Panton-Valentine leukocidin genes. Gene 1998; 215: 57-67.
8. Naimi T, LeDell K, Como-Sabetti K, et al. Comparison of community acquired and health care-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection. JAMA 2003; 290: 2976-84.
9. Chini V, Petinaki E, Foka A, Paratiras S, Dimitracopolos G, Spiliopoulou I. Spread of Staphylococcus aureus clinical isolates carrying Panton-Valentine leukocidin genes during a 3-year period in Greece. Clin Microbi-ol Infect 2006; 12: 29-34.
10. Couppié P, Cribier B, Prévost G. Leukocidin from Staphylococcus aureus and cutaneous infections: en epi-demiologic study. Arch Dermatol 1994; 130: 1208-9.
11. Dufour P, Gillet Y, Bes M, et al. Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in France: emergence of a single clone that produces Panton-Valentine leukocidin. Clin Infect Dis 2002; 35: 819-24.
12. Gonzalez BE, Hulten KG, Dishop MK, et al. Pulmonary manifestations in children with invasive community-acquired Staphylococcus aureus infection. Clin Infect Dis 2005; 41: 583-90.
13. Holmes A, Ganner M, McGuane S, Pitt TL, Cookson BD, Kearns AM. Staphylococcus aureus isolates carrying Panton-Valentine leucocidin genes in England and Wales: frequency, characterization, and association with clinical disease. J Clin Microbiol 2005; 43: 2384-90.
14. Li GH, Zhang YY, Wang F, Chen YJ, Nord CE, Fang H. Emergence of methicillin-resistant Staphylococcus
au-reus carrying Panton-Valentine leukocidin gene in Shanghai, China. Int J Infect Dis 2006; 10: 482-3.
15. Rossney A, Morgan P, O’Connell B. Community-acquired PVL+ MRSA in Ireland: a preliminary report. Euro Surveill 2005; 10: E050421.1.
16. Seybold U, Kourbatova EV, Johnson JG, et al. Emergence of community-associated methicillin-resistant
Staphylococcus aureus USA300 genotype as a major cause of health care-associated blood stream
17. Vandenesch F, Naimi T, Enright MC, et al. Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus carrying Panton-Valentine leukocidin genes: worldwide emergence. Emerg Infect Dis 2003; 9: 978-84. 18. Von Eiff C, Friedrich AW, Peters G, Becker K. Prevalence of genes encoding for members of the
staphylo-coccal leukotoxin family among clinical isolates of Staphylococcus aureus. Diagn Microbiol Infect Dis 2004; 49: 157-62.
19. Witte W, Braulke C, Cuny C, et al. Emergence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus with Panton-Va-lentine leukocidin genes in central Europe. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2005; 24: 1-5.
20. Aires de Sousa M, Bartzavali C, Spiliopoulou I, Santos Sanches I, Crisostomo MI, de Lencastre H. Two inter-national methicillin-resistant Staphylococcus aureus clones endemic in a university hospital in Patras, Gre-ece. J Clin Microbiol 2003; 41: 2027-32.
21. Ida T, Okamoto R, Shimauchi C, Okubo T, Kuga A, Inoue M. Identification of aminoglycoside-modifying enzymes by susceptibility testing: epidemiology of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in Japan. J Clin Microbiol 2001; 39: 3115-21.
22. Hisata K, Kuwahara-Arai K, Yamanoto M, et al. Dissemination of methicillin-resistant staphylococci among healthy Japanese children. J Clin Microbiol 2005; 43: 3364-72.
23. Etienne J. Panton-Valentine leukocidin: a marker of severity for Staphylococcus aureus infection? Clin Infect Dis 2005; 41: 591-3.
24. Diep BA, Sensabaugh GF, Somboona NS, Carleton HA, Perdreau-Remington F. Widespread skin and soft-tissue infections due to two methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains harboring the genes for Pan-ton-Valentine Leucocidin. J Clin Microbiol 2004; 42: 2080-4.
25. Linde H, Wagenlehner F, Strommenger B, et al. Healthcare-associated outbreaks and community-acquired infections due to MRSA carrying the Panton-Valentine leucocidin gene in southeastern Germany. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2005; 24: 419-22.
26. O’Brien FG, Pearman JW, Gracey M, Riley TV, Grubb WB. Community strain of methicillin-resistant
Staphy-lococcus aureus involved in a hospital outbreak. J Clin Microbiol 1999; 37: 2858-62.
27. Aires de SM, Conceiçao T, de Lencastre H. Unusually high prevalence of nosocomial Panton-Valentine le-ukocidin-positive Staphylococuus aureus isolates in Cape-Verde islands. J Clin Microbiol 2006; 44: 3790-3. 28. Kuehnert MJ, Kruszon-Moran D, Hill HA, et al. Prevalence of Staphylococcus aureus nasal colonization in the
United States, 2001-2002. J Infect Dis 2006; 193: 172-9.
29. Ellington MJ, Hope R, Ganner M, et al. Is Panton-Valentine leucocidin associated with the pathogenesis of
Staphylococcus aureus bacteraemia in the UK? J Antimicrob Chemother 2007; 60: 402-5.
30. Frazee BW, Lynn J, Charlebois ED, Lambert L, Lowery D, Perdreau-Remington F. High prevalence of methi-cillin-resistant Staphylococcus aureus in emergency department skin and soft tissue infections. Ann Emerg Med 2005; 45: 311-20.
31. Johnsson D, Mölling P, Stralin K, et al. Detection of Panton-Valentine leukocidin gene in Staphylococcus
au-reus by using LightCycler PCR: clinical and epidemiological aspects. Clin Microbiol Infect 2004; 10: 884-9.
32. Ramdani-Bouguessa N, Bes M, Meugnier H, Söderquist B. Detection of methicillin-resistant Staphylococcus
aureus strains resistant to multiple antibiotics and carrying the Panton-Valentine leukocidin genes in an
Al-geries hospital. Antimicrob Agents Chemother 2006; 50: 1083-5.
33. Robert J, Etienne J, Bertrand X, on behalf of ONERBA (Observatoire National de l’Epidemiologie de la Ré-sistance Bactérienne aux Antibiotiques). Methicillin-resistant Staphylococcus aureus producing Panton-Va-lentine leukocidin in a retrospective case series from 12 French hospital laboratories, 2000-2003. Clin Mic-robiol Infect 2005; 11: 585-7.
34. Wannet WJ, Spalburg E, Heck M, et al. Emergence of virulent methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains carrying Panton-Valentine leucocidin genes in the Netherlands. J Clin Microbiol 2005; 43: 3341-5. 35. Said-Salim B, Mathema B, Braughton K, et al. Differential distribution and expression of Panton-Valentine
leukocidin among community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains. J Clin Microbiol 2005; 43: 3373-9.
