ÇEVRE ÖRNEKLERİNDEN TÜBERKÜLOZ DIŞI
MİKOBAKTERİLERİN İZOLASYONU VE
TANIMLANMASI
IDENTIFICATION AND ISOLATION OF NON-TUBERCULOUS
MYCOBACTERIA FROM ENVIRONMENTAL SAMPLES
Uğur CAFRİ1, Gönül ASLAN2, Şahin DİREKEL2, Gülnur TARHAN3, İsmail CEYHAN3, Gürol EMEKDAŞ2
1Mersin Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Mersin. (drgaslan@gmail.com) 2Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Mersin.
3Refik Saydam Hıfzıssıhha Merkezi Başkanlığı, Tüberküloz Referans ve Araştırma Laboratuvarı, Ankara.
ÖZET
Doğada ve çevrede yaygın olarak bulunan tüberküloz dışı mikobakteriler (nontuberculous mycobac-teria; NTM), özellikle immün sistemi baskılanmış konaklarda fırsatçı enfeksiyonların en önemli nedenle-rindendir. Bu çalışmada, Mersin’de toprak, çiğ süt ve su dağıtım sistemlerinden alınan örneklerden NTM izolasyonu ve tanımlanması amaçlanmıştır. Çalışmaya, Kasım 2003-Mayıs 2004 tarihleri arasında Mersin ili içinden ve çevresinden toplanan 101 su, 124 toprak ve 40 süt örneği dahil edilmiştir. Su örnekleri, 29 farklı su dağıtım sisteminden; toprak örnekleri, Mersin ve çevresindeki çeşitli park ve bahçelerden; süt ör-nekleri ise değişik bölgelerde pazarlanan çiğ sütlerden toplanmıştır. Örneklere homojenizasyon ve dekon-taminasyon işlemi uygulandıktan sonra aside dirençli boyama ve Löwenstein-Jensen besiyerinde kültür yapılarak aside dirençli bakteriler araştırılmıştır. Kültürden izole edilen aside dirençli bakteriler, polimeraz zincir reaksiyonu temelli RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) ve INNO-LIPA Mycobacteria yöntemleri ile tanımlanmıştır. Çalışmamızda, su örneklerinin %4.9 (5/101)’unda ve toprak örneklerinin %0.8 (1/124)’inde kültür ve polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile NTM pozitifliği saptanırken, çiğ süt ör-neklerinin hiçbirisinde NTM tespit edilmemiştir. Su örneklerinden izole edilen NTM suşlarının üçü, PCR-RFLP ve INNO-LIPA Mycobacteria yöntemleri ile Mycobacterium chelonae tip III, ikisi Mycobacterium
kan-sasii tip II olarak; toprak örneğinden izole edilen bir suş ise Mycobacterium fortuitum olarak
tanımlanmış-tır. NTM varlığı saptanan beş su örneğinin ikisinin hastane musluk suyu örnekleri olduğu dikkati çekmiş-tir. Sonuç olarak, özellikle hastanelerde su ve çevresel ortamların NTM ile kontaminasyon/kolonizasyonu, nozokomiyal enfeksiyonlar için potansiyel risk oluşturduğundan, su sistemleri ve tıbbi donanımların sür-veyans kültürlerinin yapılması, kaynağın en kısa sürede belirlenmesi, izolatların tanımlanması ve tiplendi-rilmesinin, etkili kontrol önlemlerinin (uygun sterilizasyon/dezenfeksiyon yöntemleri, su sistemlerinin ba-kımı ve modernizasyonu vb.) alınması için gerekli olduğu düşünülmüştür.
ABSTRACT
Non-tuberculous mycobacteria (NTM) found frequently in tap water and environment cause impor-tant opportunistic infections in immunocompromised patients. The aim of this study was to isolate and identify non-tuberculous mycobacteria in soil, raw milk and water distribution system samples in Mersin (a province located at Mediterranean region of Turkey). A total of 101 water, 124 soil and 40 milk samp-les collected from the central part and suburban parts of Mersin during November 2003-May 2004 pe-riod were included in the study. Water samples were collected from 29 different water distribution sys-tems; soil samples from different parks and gardens and milk samples from raw milks sold at different districts. After the samples were processed by homogenization and decontamination, acid-fast staining and culture into Löwenstein-Jensen medium were performed. Acid-fast bacilli isolated from culture me-dium were identified by using conventional methods, polymerase chain reaction (PCR)-RFLP (Restricti-on Fragment Length Polymorphism) and INNO-LIPA Mycobacteria methods. NTM were identified from 4.9% (5/101) of water samples and 0.8% (1/124) of soil samples by culture and PCR. No NTM were de-tected in the raw milk samples. Three of the NTM strains isolated from water samples were defined as
Mycobacterium chelonae type III and two as Mycobacterium kansasii type II. One NTM strain isolated from
soil was defined as Mycobacterium fortuitum. It was of note that two of the five NTM positive water samp-les were tap water sampsamp-les collected from hospitals. It was concluded that NTM colonization/contami-nation of water and environment in the hospitals was a potential risk factor in terms of nosocomial in-fections. Thus surveillance cultures of the water systems and the medical devices in the hospital are ne-cessary to fix the source of NTM, to identify and type the strains and to establish effective control me-asures such as sterilization, disinfection, maintenance and modernization of water systems.
Key words: Atypical mycobacteria, non-tuberculous mycobacteria, water, soil, raw milk, Turkey.
GİRİŞ
Endüstrileşmiş dünyanın değişik bölgelerinde, tüberküloz dışı mikobakterilerin (non-tuberculous mycobacteria; NTM), diğer bir deyişle atipik mikobakterilerin neden oldu-ğu enfeksiyonların sayısı giderek artmaktadır1. NTM, su, toprak, besinler, toz ve
aero-solleri içeren tüm doğal ekosistemlerde yaygın olarak bulunur ve çevresel kaynaklardan insana sindirim, inhalasyon ve inokülasyon yoluyla bulaşabilir1-3. Bu mikroorganizma-lar, özellikle immün sistemi baskılanmış kişilerde fırsatçı patojen olabilmekte ve lokalize kütanöz lezyonlar, pulmoner enfeksiyonlar, lenfadenit ve yaygın enfeksiyonlara yol aça-bilmektedir.
Hem hastadan hem de kaynaktan aynı mikobakteri türü izole edildiği zaman geçiş yolu belirlenebilir; ancak çoğu zaman mikobakteriler, varsayılan enfeksiyon kaynakların-dan nadir olarak izole edilir4,5. NTM insanlarda önemli morbidite ve mortalite nedeni ol-masının yanı sıra tarımda da önemli ekonomik kayıplara yol açmaktadır2. NTM’ler
sıcak-lık aralığına direnç göstermektedir. Daha da önemlisi, çevresel mikobakteriler biyofilm oluşturarak (Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium chelonae) mikobakteri popülasyo-nunun, su dağıtım sisteminde sürekli kalmasını sağlamaktadır2,6.
Bu çalışmada, Mersin bölgesinde toprak, çiğ süt ve su dağıtım sistemlerinden alınan örneklerde NTM izolasyonu ve tanımlanması amaçlanmıştır.
GEREÇ ve YÖNTEM Örnekler
Çalışmaya, Kasım 2003-Mayıs 2004 tarihleri arasında Mersin ili içinden ve çevresin-den toplanan 101 su, 124 toprak ve 40 süt örneği dahil edildi. Su örnekleri, 29 farklı su dağıtım sisteminden (Mersin iline içme suyu sağlayan Berdan Barajı, işlenmiş kaynak su-ları, hastane musluk suları ve su depoları), içinde kloru nötralize etmek için 2 g sodyum sülfat bulunan 1 litrelik geniş ağızlı steril plastik şişelere toplandı. Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi, Mikrobiyoloji Laboratuvarına getirilen örnekler aynı gün işleme alındı. Bir litre-lik su örnekleri membran filtreden (por çapı 0.45 µm; Milipore) süzüldü ve membran alı-narak içerisinde 10 ml buyyon bulunan steril tüplere konuldu. Örneklerin işlemlenmesi daha önce tanımlanan yönteme7,8göre yapıldı.
Toprak örnekleri, Mersin ve çevresindeki çeşitli park ve bahçelerden yaklaşık 5 g ola-cak şekilde toplandı. Örnekler 10 ml adi buyyon içinde süspanse edildi ve vorteks ile ka-rıştırıldı. 37°C’de 6 saat inkübe edilen örnekler, 4°C’de 10 dakika 1500xg’de santrifüj edildi ve süpernatan alınarak daha önce tanımlandığı8,9şekilde işlemlendi.
Çiğ süt örnekleri, Mersin’in değişik bölgelerinden her birisi birer lt’lik örneklemeler ha-linde 40 ml olacak şekilde toplandı. 6 ml %10 trisodyum fosfat ve 4 ml %0.1 benzalko-nium klorid ile dekontamine edildikten sonra oda ısısında 20-30 dakika çalkalandı. 4°C’de 5000xg’de 30 dakika santrifüj edildi, süpernatan alındı ve daha önce tanımlan-dığı10şekilde işlemlendi.
Kültür
Homojenizasyon ve dekontaminasyon işlemlerinden sonra tüm su, toprak ve süt ör-nekleri, Löwenstein-Jensen (LJ) ve siklohekzimid, nalidiksik asit ve linkomisin eklenmiş se-çici LJ (BioMerieux-France) besiyerlerine ekildi. 35-37°C’de 6 hafta süreyle inkübe edilen besiyerleri 3 günde bir kontrol edildi ve üreme varlığında litredeki koloni sayısı ve kolo-ni morfolojisi kaydedildi. Üreyen kolokolo-niler Ziehl-Neelsen ve Auramin boyama yöntemle-riyle boyanarak incelendi ve aside dirençli basil saptanması durumunda LJ besiyerine pa-sajları yapılarak moleküler yöntemler ile ileri değerlendirmeye alındı.
Moleküler Tanımlama
Örneklerden DNA ekstraksiyonu daha önce tanımlandığı şekilde yapıldı11. Kısaca; LJ
besiyerinde üreyen kolonilerden 10 µl tek kullanımlık öze ile alınarak 10 mM Tris-HCl ve 1 mM EDTA (pH: 8.0) içeren 500 µl Tris-EDTA solüsyonu ile süspanse edildi. 80°C’lik ısı bloğunda 10 dakika bekletilen örnekler 13.000xg’de 15 dakika santrifüj edildi. Çökelti, 200 µl TE solüsyonu ile iki kez yıkandı ve aynı solüsyonun 200 µl’si ile tekrar sulandırıldı. Kaynayan sıcak su banyosunda 20 dakika inkübasyondan sonra, örnekler tekrar 13.000xg’de 10 dakika santrifüj edildi ve DNA içeren süpernatanlar alınarak kullanılınca-ya kadar -20°C’de saklandı.
Amplifikasyon için; 10 µl DNA 1x PCR tamponu (Epicentre Technologies, ABD), PCR-Enhancer (1X), 2.5 mM MgCl2(Epicenter Technologies, ABD), 200 µM dNTP (Epicent-re Technologies, ABD), 50 pM/µl primer Tb 11 (5’-ACCAACGATGGTGTGTCCAT) ve 50 pM/µl Tb12 (5’CTTGTCGAACCGCATACCCT), 2.5 U/µl Taq DNA polimeraz (Epicentre Technologies, ABD) içeren 50 µl reaksiyon karışımı kullanılarak PCR yapıldı12. Reaksiyon
tüpleri ilk olarak 94°C’de 3 dakika ısıtıldı, sonra 44 amplifikasyon döngüsü (1 dakika 94°C, 1 dakika 58°C, 1 dakika 30 saniye 72°C) uygulandı. 72°C’de 4 dakika uzama için bekletildikten sonra amplifikasyon ürünleri %1.5 agaroz jelde (A8455; Sigma, ABD) yü-rütülerek etidyum bromür ile boyandı ve UV lambası altında değerlendirildi (Resim 1).
PCR ürünlerinin restriksiyon fragment analizi için BstEII ve HaeIII restriksiyon enzimleri kullanıldı. Her iki enzim için 11.5 µl H2O, 0.5 µl (5U) enzim ve 2.5 µl restriksiyon solüsyo-nu hazırlandı. Karışıma direkt olarak 20 µl PCR ürünü eklendi. Karışım 60°C’de BstEII ve 37°C’de HaeIII enzimleriyle bir gece inkübe edildi13,14. Restriksiyon fragmentlere %8’lik
poliakrilamid jelde elektroforez uygulandı. Fragmentler etidyum bromür ile boyandı ve Ergin ve arkadaşlarının14 referans algoritmasına göre yorumlandı. Moleküler standardı olarak “HaeIII-digested φX 174” ve “HinfI-digested φX 174” DNA’ları kullanıldı (Resim 2). Çalışmada elde edilen sonuçlar ayrıca “Line Prob” testi (INNO-LIPA Mycobacteria; In-nogenetics NV, Belçika) ile de doğrulandı. Bu amaçla mikobakteri DNA’sı LJ ve selektif LJ’de üreyen izolatlardan ekstrakte edildi. PCR; 5 µl DNA ekstraktı, dNTP (D59104; Epi-centre Technologies, ABD), biotinlenmiş primer ve Taq DNA polimeraz içeren 50 µl
re-Resim 1. PCR ürünlerinin görüntüsü. MW: Moleküler ağırlık belirteci (HaeIII-digested φX 174 DNA); Hat 1 ve 2: Negatif kontrol; Hat 3-12: Kültür pozitif su ve toprak örnekleri.
aksiyon karışımı kullanılarak yapıldı. Biotin işaretli PCR ürünleri denatüre edildi ve 14 öz-gül oligonükleotid prob ile (MYC’ye özöz-gül prob, MTB’ye özöz-gül prob ve MKA1, MKA3, MXE, MGO, MAIS, MAV, MIN, MSC, MCH1, MCH3 probları) bir stripte hibridize edildi (INNO-LIPA Mycobacterium v2 stribi üzerinde farklı oligonükleotid problarının pozisyon-ları Resim 3’te görülmektedir). Hibridize edilen PCR ürünleri tespit edildi ve LIPA sonuç-ları üreticinin (Innogenetics NV, Belçika) önerilerine göre pembe/kahverengi bantsonuç-ların görülmesi pozitif olarak değerlendirildi.
Tüm çalışmalarda kontrol olarak Mycobacterium tuberculosis H37Ra ATCC 25177 stan-dart suşu kullanıldı.
BULGULAR
Çalışmamızda, 101 su örneğinin 5 (%4.9)’inde ve 124 toprak örneğinin 1 (%0.8)’in-de kültür ve PCR ile NTM pozitifliği saptanırken, çiğ süt örneklerinin hiçbirisin(%0.8)’in-de NTM tespit edilmemiştir.
NTM varlığı saptanan 5 su örneğinin ikisi hastane musluk suyu örnekleridir. LJ besiye-rinde su örneklebesiye-rinden NTM izolasyon süresi 18-23 gün (ortalama 18.5) arasında deği-şiklik göstermiştir.
Su örneklerinden LJ besiyerinde izole edilen NTM suşlarının 3’ü, PCR-RFLP ve INNO-LIPA Mycobacteria testi ile M.chelonae tip III, ikisi ise M.kansasii tip II olarak tanımlanmış-tır (Resim 1-3).
LJ besiyerinde 7. günde NTM üremesi olan bir toprak örneğinden izole edilen suş ise moleküler yöntemlerle M.fortuitum olarak tanımlanmıştır (Resim 2,3).
726 1353 MW1 1 2 3 4 5 6 7 8 MW2 713 553 500 427,417,413 311 249 200 151 140 118 100 1073 872 642 310 271 234 194 118 72
TARTIŞMA
Musluk suyundan kaynak alan mikobakterilerin insan vücudunda kolonizasyon veya enfeksiyona yol açmasında etkili olduğunu ileri süren çalışmalar gittikçe artmaktadır
3,5,15-17. M.kansasii, M.fortuitum, M.chelonae, Mycobacterium avium ve M.xenopi gibi
etkenle-rin hastalardan ve kontaminasyona neden olduğu düşünülen musluk suyundan aynı an-da izole edildikleri bildirilmektedir5. Son yıllarda NTM, kazanılmış immün yetmezlik sendromu (AIDS) olan hastalarda fırsatçı enfeksiyonların en önemli nedeni olarak karşı-mıza çıkmaktadır15.
Mikobakteriler, cerrahi veya klinik araştırmalarda kullanılan ekipmanların yetersiz ste-rilizasyon veya dezenfeksiyonu sonucu kolonize olabilmekte ve nozokomiyal enfeksiyon-lar için kaynak oluşturmaktadır. Atipik mikobakterilerin hemodiyaliz sıvıenfeksiyon-larında, farmasö-tik preparatlarda ve dezenfektan solüsyonlarında kontaminant olarak bulunabildiği ve buna bağlı olarak, M.fortuitum ve M.chelonae’nin kardiyak cerrahi sonrası ortaya çıkan endokardit ve ciddi yaralanma sonrası gelişen enfeksiyonlardan; M.xenopi, M.kansasii ve M.fortuitum’un ise eklem içi steroid enjeksiyonu sonrasında gelişen septik artrit ve oste-omyelitten sorumlu olduğu bildirilmektedir6. Nadiren sağlıklı kişilerde, kontamine solüs-yon enjeksisolüs-yonundan sonra lokal enfeksisolüs-yonların yanı sıra yaygın hastalıklar da ortaya çı-kabilmektedir6. Grubek-Jaworska ve arkadaşları11999-2005 yılları arasında inceledikleri
1 2 3 4 5 6 Marker line 1. Conj. control 2. MYC control 3. MTB complex 4. MKA-1 5. MKA-2 6. MKA-3 7. MXE 8. MGO 9. MAIS 10. MAV 11. MIN 12. MSC 13. MCH-1 14. MCH-2 15. MCH-3
Resim 3. NTM’nin INNO-LIPA sonuçları. 1: Negatif kontrol; 2: Pozitif kontrol; 3: M.fortuitum; 4: M.kansasii
4192 hasta örneğinin 445’inde mikobakteri varlığı tespit etmişler; bunlardan 142’sinin M.tuberculosis, 303’ünün ise NTM olduğunu belirlemişler ve NTM izolatlarının %8.9 (27/303)’unu akciğer enfeksiyonu etkeni, diğerlerini (%91.1) ise çevresel kontaminas-yon veya kolonizaskontaminas-yon olarak değerlendirmişlerdir. Bu araştırıcılar, pulmoner enfeksikontaminas-yon ile ilişkili NTM’nin akciğer tüberkülozlu hastaların yaklaşık 1/5’i kadar olduğu sonucuna varmışlardır1.
Çalışmamızda, incelenen su örneklerinde NTM pozitiflik oranı %4.9 (5/101) olarak saptanmış olup, bu suşların 2 (%1.9)’sinin hastane örneklerinden izole edildiği dikkati çekmiştir. Bu durumun, hastanenin su dağıtım sisteminin eski oluşu ve bakım eksikliğin-den kaynaklandığı düşünülmüştür. Kültüreksikliğin-den izole edilen NTM suşlarının üçü PCR-RFLP ve INNO-LIPA yöntemleri ile M.chelonae, ikisi ise M.kansasii olarak tanımlanmıştır. Bu bulgu da, Mersin’de su temin ve dağıtım sistemlerinin M.chelonae ve M.kansasii ile ko-lonize olduğunu düşündürmektedir. Su örneklerinde saptadığımız NTM pozitiflik oranı (%4.9), Narang ve arkadaşları17 tarafından bildirilen (%15) orandan düşük olup, İstan-bul’dan Akbal18tarafından bildirilen orana (%6.6) benzerdir.
Toprak örneklerinden genellikle M.fortuitum, Mycobacterium smegmatis, Mycobacteri-um terrae ve MycobacteriMycobacteri-um phlei gibi hızlı üreyen mikobakteri türleri izole edilmekte-dir19-21. Mikobakterilerin, az oksijen içeren ve pH’sı düşük olan topraklarda daha sık bu-lunduğu belirtilmektedir9. Akbal’ın18 çalışmasında, toprak örneklerinde NTM pozitifliği
%80 (16/20) gibi yüksek bir oranda elde edilmiş ve izolatların hepsi M.gordonae olarak tanımlanmıştır. Narang ve arkadaşları17 da 20 toprak örneğinin 15 (%75)’inden NTM izole etmişlerdir. Bizim çalışmamızda incelenen 124 toprak örneğinin ise sadece 1 (%0.8)’inde NTM saptanmış ve bu izolat da M.fortuitum olarak tanımlanmıştır. Çalışma-mızda elde edilen bu oran diğer çalışmalara göre oldukça düşük bulunmuş; bu durumun iklim ve toprak yapısının farklı olması ya da örneklemeden kaynaklanmış olabileceği dü-şünülmüştür.
Süt örneklerinde yapılan çalışmalarda da NTM kontaminasyonu bildirilmektedir10,22-24. Leite ve arkadaşlarının22çalışmasında, süt örneklerinden mikobakteri izolasyon oranı %18 (23/128) olarak saptanmıştır. Bu oran, pastörize süt örnekleri için %22.5 ve çiğ süt örnek-leri için %16.7 iken, UHT uygulanmış süt örnekörnek-lerinde mikobakteri bulunmamıştır22. Süt
örneklerinden en sık izole edilen türlerin ise M.fortuitum, M.gordonae ve Mycobacterium marinum olduğu ifade edilmiştir22. Junior ve arkadaşları23da, peynir üretiminde kullanılan çiğ sütlerde %21.7 (5/23) oranında NTM tespit ettiklerini bildirmişlerdir23. Ülkemizde
Ko-nuk ve arkadaşlarının24Afyonkarahisar bölgesinde yaptıkları çalışmada, 35 çiğ süt
örneği-nin 15’inde aside dirençli bakteri gözlenmiş; PCR-RFLP analizi ile suşların altısı M.terrae, üçü M.kansasii, üçü Mycobacterium haemophilum, biri Mycobacterium agri olarak tiplendi-rilirken iki izolat tiplendirilememiştir24. Buna karşın Akbal’ın18İstanbul bölgesinde yaptığı
çalışmada, çiğ ve pastörize süt örneklerinde NTM pozitifliği tespit edilememiştir. Benzer şekilde bizim çalışmamızda da çiğ süt örneklerinde NTM varlığına rastlanmamıştır.
yatan hastalar için büyük risk oluşturmaktadır25. Dolayısıyla NTM’ye bağlı nozokomiyal
enfeksiyonlarla mücadele amacıyla, su sistemleri ve tıbbi donanımların sürveyans kültür-lerinin yapılması, kaynağın en kısa sürede belirlenmesi, izolatların tanımlanması ve tip-lendirilmesi ve etkili kontrol önlemlerinin alınması (uygun sterilizasyon/dezenfeksiyon yöntemleri, su sistemlerinin bakımı ve modernizasyonu vb.) gerekliliği açıktır.
KAYNAKLAR
1. Grubek-Jaworska H, Walkiewicz R, Safianowska A, et al. Nontuberculous mycobacterial infections among patients suspected of pulmonary tuberculosis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2009; 28: 739-44.
2. Primm TP, Lucero CA, Falkinham JO. Health impacts of environmental Mycobacteria. Clin Microbiol Rev 2004; 17: 98-106.
3. Falkinham JO. Surrounded by mycobacteria: nontuberculous mycobacteria in the human environment J Appl Microbiol 2009; 107: 356-67.
4. Choudhri S, Manfreda J, Wolfe J, Parker S, Long R. Clinical significance of nontuberculous mycobacteria iso-lates in a Canadian tertiary care center. Clin Infect Dis 1995; 21: 128-33.
5. Le Dantec C, Duguet JP, Montiel A, Dumoutier N, Dubrou S, Vincent V. Occurrence of mycobacteria in wa-ter treatment lines and in wawa-ter distribution systems. Appl Environ Microbiol 2002; 68: 5318-25. 6. Phillips MS, Von Reyn CF. Nosocomial infections due to nontuberculous mycobacteria. Clin Infect Dis 2001;
33: 1363-74.
7. Goslee S, Wolinsky E. Water as a source of potentially pathogenic mycobacteria. Am Rev Respir Dis 1976; 113: 287-92.
8. Parashar D, Chauhan DS, Sharma VD, Chauhan A, Chauhan SV, Katoch VM. Optimization of procedures for isolation of mycobacteria from soil and water samples obtained in northern India. Appl Environ Micro-biol 2004; 70: 3751-3.
9. Brooks RW, Parker BC, Gruft H, Falkinham, JO. Epidemiology of infection by nontuberculous mycobacteria. Am Rev Respir Dis 1984; 130: 630-3.
10. Chapman JS, Speight M. Isolation of atypical mycobacteria from pasteurized milk. Am Rev Respir Dis 1968; 98: 1052-4.
11. Durmaz R (ed). Nükleik asit amplifikasyon yöntemlerinde sorunlar ve standardizasyon, s: 45-6. Uygulamalı Moleküler Mikrobiyoloji. 2001, 2. Baskı. Kozan Ofset, Ankara.
12. Shinnick T. The 65-kilodalton antigen of Mycobacterium tuberculosis. J Bacteriol 1987; 169: 1080-8. 13. Telenti A, Marchesi F, Balz M, Bally F, Böttger EC, Bodmer T. Rapid identification of mycobacteria to
speci-es level by polymerase chain reaction and rspeci-estriction enzyme analysis. J Clin Microbiol 1993; 31: 175 -8. 14. Ergin MA, Kocagöz T, Us D, Günalp A. Evaluation of 120 Mycobacterial strains isolated from clinical
speci-mens to the species level by polymerase chain reaction-restriction enzyme analysis. Scand J Infect Dis 2000; 32: 657-62.
15. Covert TC, Rodgers MR, Reyes AL, Stelma GN. Occurrence of nontuberculous mycobacteria in environmen-tal samples. Appl Environ Microbiol 1999; 65: 2492-6.
16. Chang CT, Wang LY, Liao CY, Huang SP. Identification of nontuberculous mycobacteria existing in tap wa-ter by PCR-restriction fragment length polymorphism. Appl Environ Microbiol 2002; 68: 3159-61. 17. Narang R, Narang P, Mendiratta DK. Isolation and identification of nontuberculosis mycobacteria from
wa-ter and soil in central India. Indian J Med Microbiol 2009; 27: 247-50.
18. Akbal H. Çevre örnekleri ve klinik materyallerden üretilen mikobakterilerin tiplendirilmesi. İstanbul Üniver-sitesi Tıp Fakültesi Yüksek Lisans Tezi, 1998.
20. Donoghue HD, Overend E, Stanford JL. A longitudinal study of environmental mycobacteria on a farm in south-west England. J Appl Microbiol 1997; 82: 57-67.
21. Katila ML, Iivanainen E, Torkko P, Kauppinen J, Martikainen P, Väänänen P. Isolation of potentially pathoge-nic mycobacteria in the Finish environment. Scand J Infect Dis Suppl 1995; 98: 9-11.
22. Leite CQ, Anno IS, Leite SR, Roxo E, Morlock GP, Cooksey RC. Isolation and identification of mycobacteria from livestock specimens and milk obtained in Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz 2003; 98: 319-23. 23. Jordao Junior CM, Lopes FC, David S, Farache Filho A, Leite CQ. Detection of nontuberculous
mycobacte-ria from water buffalo raw milk in Brazil. Food Microbiol 2009; 26: 658-61.
24. Konuk M, Korcan E, Dülgerbaki S, Altındiş M. Isolation and identification of mycobacteria from raw milk samples in Afyonkarahisar district of Turkey. Intern J Food Microbiol 2007; 115: 343-7.
