• Sonuç bulunamadı

Prof. Dr. Bektaş TEPE

N/A
N/A
Info
İndir
Protected

Academic year: 2021

Share "Prof. Dr. Bektaş TEPE"

Copied!
134
0
0

Yükleniyor.... (view fulltext now)

Şimdi indir ( 134 sayfa )

Tam metin

(1)Prof. Dr. Bektaş TEPE.

(2) Rekombinasyon-Rekombinant DNA nedir? — İki farklı DNA parçasının bir araya getirilmesine rekombinasyon adı verilir. — Bu şekilde oluşan DNA’ya da rekombinant DNA molekülü denir. — Bu molekül deneysel olarak oluşturulabileceği gibi, iplikler arasındaki kopmalar ve yeniden birleşmeler sonucunda da meydana gelebilir.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 2.

(3) Neden E. coli? — Klonlama çalışmalarında en sık kullanılan mikroorganizma E. coli’dir. — Bunun bazı nedenleri vardır: — Kontrol edilebilir bir mikroorganizmadır. — Elde edilmesi kolay ve ucuzdur. — Kısa sürede çoğalır. — Sekansı tümüyle bilinmektedir. — Antibiyotiklere direnç göstermeleri, seçici ortamlarda ayırt edilmelerini kolaylaştırır. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 3.

(4) Rekombinasyon hangi canlılar arasında meydana gelebilir? — Doğal olarak — Bakteri-bakteri arasında — Bakteri-faj arasında — Bakteri-plazmid arasında — Faj-faj arasında — Plazmid-plazmid arasında — Virüs-virüs arasında meydana gelebildiği gibi — In vitro ortamda — Herhangi iki canlının DNA’ları arasında da olabilir. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 4.

(5) Süreç ana hatlarıyla şu şekildedir:. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 5.

(6) DNA rekombinasyonunun baş aktörleri — Polimerazlar — DNA ligaz — Restriksiyon endonükleazlar — Ekzonükleazlar — Endonükleazlar — Primaz — Topoizomerazlar. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 6.

(7) Polimerazlar — DNA polimeraz I — Klenow fragmenti — DNA polimeraz II — DNA polimeraz III — T4 DNA polimeraz — T7 DNA polimeraz — Taq DNA polimeraz — RNA polimeraz Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 7.

(8) DNA polimeraz I — DNA’ya bağımlıdır. — Tek bir polipeptid zincirinden oluşur. — Replikasyonun başlangıcında kullanılan RNA primerlerini zincirden uzaklaştırır. — Okazaki fragmentleri arasındaki boşlukları nükleotidlerle doldurur. — 5’à3’ veya 3’à5’ ekzonükleaz aktivitesi gösterir. — Mutasyonların tamirinde görev alır.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 8.

(9) Klenow fragmenti — E. coli’den elde edilen DNA polimeraz I’in, iki fragmentinden biridir (moleküler ağırlığı 68 kDa). — 5’à3’ yönünde polimerizasyon ve 3’à5’ yönünde ekzonükleaz aktivitesine sahiptir. — DNA iplikleri üzerindeki nükleotid boşluklarını doldurur.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 9.

(10) Klenow fragmenti. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 10.

(11) DNA polimeraz II — Görevi tam olarak bilinmese de; — 3’à5’ yönünde ekzonükleaz aktivitesine sahiptir. — DNA polimerizasyonunda görev aldığı düşünülmektedir. — Ayrıca, DNA’da UV ışınlarının etkisi ile meydana gelen hasarın tamirinde görev aldığı düşünülmektedir.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 11.

(12) DNA polimeraz III — 12 polipeptidden oluşan bir holoenzimdir. — 600 kDa ağırlığındadır. — 5’à3’ yönünde polimerizasyon gerçekleştirir.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 12.

(13) T4 DNA polimeraz — T4 bakteriyofajından elde edilmiştir. — Tek iplikten oluşan bir DNA üzerinde — 5’à3’ yönünde polimerizasyon ve — 3’à5’ yönünde ekzonükleaz aktivitesi gösterir. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 13.

(14) T7 DNA polimeraz — T7 bakteriyofajından elde edilmiştir. — İki alt üniteden oluşur. — DNA polimerizasyonunda yüksek bir katalitik aktiviteye sahiptir. — DNA sekansının belirlenmesi ve sentetik primerlerin işaretlenmesinde kullanılır. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 14.

(15) Taq DNA polimeraz — Termofilik bir bakteri olan Thermus aquaticus’tan izole edilmiştir. — 95 °C’lik ısıya dayanıklı 94 kDA molekül büyüklüğüne sahip bir enzimdir.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 15.

(16) Taq DNA polimeraz — Enzim, 70-75 °C’de 5’à3’ yönünde polimerizasyon aktivitesine sahiptir. — PCR reaksiyonlarında sıklıkla kullanılmaktadır. — Gen klonlama yöntemleri ile başka bakterilerce ticari olarak sentezlenmektedir.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 16.

(17) RNA polimeraz — DNA’dan RNA’nın transkripsiyonunu katalizler. — Prokaryotlarda tüm RNA’lar tekp tip RNA polimeraz tarafından katalizlenir. — Ökaryotlarda ise RNA polimeraz I, II ve III şeklinde bulunur.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 17.

(18) Ökaryotik RNA polimerazların görevleri — RNA polimeraz I: rRNA’ları sentezler. — RNA polimeraz II: mRNA’ları ve çekirdekteki küçük RNA’ları sentezler. — RNA polimeraz III: tRNA’ları ve 5S rRNA’ları sentezler.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 18.

(19) DNA ligaz — T4 bakteriyofajından elde edilmiştir. — Çift iplikli DNA’nın kopuk tek iplikleri veya farklı iki DNA molekülünün 3’OH ve 5’ –P uçları arasında fosfodiester bağı kurarak bağlanmalarını sağlar.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 19.

(20) DNA ligaz — DNA sarmalını oluşturan ipliklerden biri üzerinde herhangi bir nedenle oluşan baz eksikliklerini tamamlar.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 20.

(21) DNA ligazın kofaktörleri — DNA ligaz, aktive olabilmek için uygun bir kofaktöre ihtiyaç duyar. — Bu kofaktör; — Prokaryotlarda ATP ve — Ökaryotlarda NAD’dır.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 21.

(22) Restriksiyon endonükleazlar — DNA’nın iki ucu arasında kalan kısımları kestiklerinden bu adı almışlardır. — Bakterilerin, kendilerini enfekte eden fajların DNA’larını parçalamak amacıyla kullandıkları enzimlerdir.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 22.

(23) Restriksiyon endonükleazlar — DNA’yı spesifik bir baz dizisinden kesebilirler. — DNA’daki büyük oluklara tutunurlar ve bu bölgedeki tanıma dizisinden oluşan çift zincire bağlanırlar. — Zincirlerden önce birisi, sonra da diğeri kesilir.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 23.

(24) Konak hücre, kendi ürettiği enzimden nasıl korunur? — Herhangi bir hücre, kendi üretmiş olduğu restriksiyon endonükleazlara karşı kendi DNA’sını koruyabilmek için, tanıma bölgelerini metilleyerek kapatır. — Böylece kendi DNA’sını kesim işlemine karşı korur.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 24.

(25) Restriksiyon endonükleaz çeşitleri — Çoğu bakteri kendisine özgün bir veya daha fazla çeşitte restriksiyon endonükleaz sentezler. — Günümüzde yüzlerce farklı türden 600’den fazla restriksiyon endonükleaz tanımlanmıştır.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 25.

(26) Nasıl adlandırılırlar? — Bu enzimler, kendilerini sentezleyen bakterilerin isimlerindeki kısaltmalarla ifade edilirler. — Örneğin; EcoR1 veya EcoR5 enzimleri, E. coli’den elde edilir. — Bu enzimler, DNA kesme şekillerine göre iki tip uç oluştururlar: — Yapışkan uçlar — Küt uçlar. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 26.

(27) Yapışkan uçlar — Bu tür uçlar oluşturan restriksiyon endonükleazlar, DNA’yı karşılıklı ve asimetrik bir şekilde keserler. — Uçlar bir araya kolay gelebildiğinden ‘yapışkan’ olarak adlandırılır ve rekombinant DNA uygulamalarında sıklıkla tercih edilmektedirler. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 27.

(28) Küt uçlar — DNA ipliklerinin her ikisini de aynı noktadan kesen enzimlerin oluşturdukları uçlardır. — Yapışkan uçlara göre bir araya gelerek bağlanma olasılıkları daha düşüktür.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 28.

(29) Ekzonükleazlar — Doğrusal DNA molekülünün uç kısımlarındaki baz dizilerini 5’à3’ yönünde koparan enzimlerdir. — Bu aktivite 3’à5’ yönlü de gerçekleşebilir.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 29.

(30) Primaz — DNA replikasyonu sırasında RNA perimerlerinin sentezini katalizleyen enzimdir.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 30.

(31) Topoizomeraz — Süperheliks yapısındaki DNA’yı belirli noktalardan keserek çözülmeyi sağlayan enzimdir.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 31.

(32) Rekombinasyonda kullanılan vektörler — Plazmitler — Fajlar — Ekspresyon vektörleri. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 32.

(33) Plazmitler — Çoğu bakteride, bazı maya mantar ve bitkilerde bulunan kromozom dışı halkasal DNA’lardır. — Plazmitler, hücre kromozomundan bağımsız olarak replike olurlar.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 33.

(34) Plazmitler — Bakteri kromozomunun % 0.2-4.0’ü kadar büyüklüğe sahiptir. — Çoğu halkasal olmasına karşın, son yıllarda, bazı Streptomyces türlerinin lineer plazmitlere sahip olabileceği bildirilmiştir.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 34.

(35) Epizom — Plazmit sitoplazmada serbest halde değil de, konak kromozomuna entegre halde bulunursa, bu yapıya epizom adı verilir.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 35.

(36) Plazmitlerin konak organizmaya ne faydası vardır? — Plazmitlerin çoğu, taşıdıkları genetik bilgi ile bakterileri ekstrem çevre şartlarına dirençli hale getirirler. — Örn; civa, naftalin, toluen gibi toksik maddelere dirençlilik — Antibiyotiklere dirençlilik vb.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 36.

(37) Plazmitin yapısı — Plazmitler; — Replikasyon orijinine — Çevresel stres koşullarına dirençlilik genlerine (çoğunlukla antibiyotik dirençliliği) — Patojeniteden sorumlu genlere sahiptir.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 37.

(38) Plazmit çeşitleri — F plazmitleri — R plazmitleri — Col plazmitleri — Virulans plazmitler. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 38.

(39) F plazmitleri — Bu plazmiti taşıyan hücrelerden (F+, donör, verici) taşımayan hücrelere (F-, recipient, alıcı) aktarıldıklarında, o hücreyi de F+’ya dönüştürürler. — İki bakteri arasındaki bu alışveriş konjugasyon yoluyla gerçekleşir. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 39.

(40) Konjugasyon — Konjugasyonda, verici hücreler, alıcı hücrelerde bulunmayan yüzey bileşenlerine sahiptir. — F- hücreler, pili (pilus) adı verilen yüzey yapılarına sahiptir.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 40.

(41) Konjugasyon — Verici hücrenin endonükleazları ile çift iplikli DNA, belirli, bir bölgesinden kesilir. — Kesin noktasından itibaren tek iplik halinde alıcı hücreye transfer edilir. — Alıcı hücreye geçen ipliğin karşısına komplementeri sentezlenir. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 41.

(42) R plazmitleri — Çeşitli antibiyotiklere, ilaçlara, metallere ve kemoterapötik maddelere karşı dirençten sorumlu proteinleri kodlayan gen bölgelerine sahiptirler. — Bu plazmiti taşıyan bakterilere R+, taşımayanlara ise Radı verilir.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 42.

(43) R plazmitleri nasıl aktarılır? — R plazmitleri, bu plazmiti taşıyan R+ hücrelerden, Rhücrelere transdüksiyon yoluyla aktarılır.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 43.

(44) R plazmitinin yapısı — Bir R plazmitinde üç temel bölge bulunmaktadır: — Replikasyon orijini — R determinant bölgesi: Dirençliliği sağlayan gen bölgelerinin bulunduğu bölgedir. — Dirençlilik transfer bölgesi (RTF): Dirençlilik genlerini başka bakterilere transfer etmekten sorumlu genlerin yer aldığı bölgedir. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 44.

(45) Col plazmitleri — Kolisinojenik faktörler olarak da bilinen kolisin’leri üreten plazmitlerdir. — Kolisinojenik faktörler, değişik bakteri türleri tarafından salgılanan ve düğer suşlar üzerinde öldürücü etkisi olan toksik proteinlerdir. — Değişik bakterilerden izole edilen bu proteinlere genel olarak bakteriyosinler adı verilir. — Col plazmitleri, konjugasyon yoluyla bir bakteriden diğerine geçebilir. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 45.

(46) Virulans plazmitler — Bazı bakterilerde, virulans özelliği artırıcı yetenekte plazmitler bulunabilmektedir. — Virulansı sağlayan faktörler şu şekilde özetlenebilir: — Kapsül ve toksin formasyonu — Toksik madde sentezi — Bakteriyosinler — Hemolizinler. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 46.

(47) Ti plazmiti — Agrobacterium tumefaciens, sahip olduğu Ti plazmidi ile dikotiledon bitkilerde gal oluşumuna neden olmaktadır. — Günümüzde bu plazmitler, bitkilere gen aktarımında vektör olarak kullanılmaktadır. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 47.

(48) Ti plazmidi ile gen transferi. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 48.

(49) Fajlar-M13 fajı — Klonlama çalışmalarında en sık kullanılan faj M13’tür. — Tek iplikli DNA molekülüne sahiptir. — Bu nedenle dizi analizinde ve nokta mutasyonların tespitinde sıklıkla kullanılmaktadır. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 49.

(50) M13 fajı — Tek iplikli M13 faj DNA’sı E. coli’ye girdikten sonra, replike olur ve çift iplikli DNA haline dönüşür. — Çift iplikli M13 genomuna yabancı DNA yerleştirilerek konak hücreye transfer edilebilir.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 50.

(51)

(52) Gen klonlaması nedir? — Hedef proteini sentezleyen genin, ait olduğu hücresel genomdan restriksiyon endonükleazlarla kesilip çıkarılması, taşıyıcı bir vektör ile alıcı hücreye transfer edilmesi ve alıcı hücrede ifadesinin sağlanmasıdır.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 52.

(53) Ne faydası vardır? — Doğal yollarla elde edilmesi güç olan ya da pahalı ürünler bol miktarda üretilebilir. — Örneğin; insan insülininin sentezinden sorumlu gen bakteriye aktarılarak, bu hormonun bol miktarda üretimi sağlanmıştır. — İnsülin, rekombinant DNA teknolojisi ile üretilen ilk ticari proteindir.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 53.

(54) Gen aktarımının temel basamakları — Üzerinde çalışılacak DNA’nın ana organizmadan elde edilmesi — Hedef genin DNA’dan restriksiyon endonükleazlarla kesilip çıkarılması — Vektör DNA’sının aynı restriksiyon endonükleazlarla kesilmesi — Hedef genin vektör DNA’sı ile DNA ligaz yardımıyla birleştirilmesi Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 54.

(55) Gen aktarımının temel basamakları — Oluşan rekombinant vektörün alıcı hücreye transfer edilmesi — Alıcı hücrelerin rekombinant DNA’yı alıp almadıklarının tespiti için seçim yapılması — Alıcı hücrelerin sentezlediği ürünlerin kontrol edilmesi. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 55.

(56) Geni taşıyan DNA’nın izole edilmesi — Hedef geni taşıyan hücre genomu saf olarak elde edilmelidir. — Bunun için, ilgili genoma sahip hücreler kültür ortamında çoğaltılır. — Böylelikle, genomun bol miktarda replikasyonu sağlanmış olur.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 56.

(57) Geni taşıyan DNA’nın izole edilmesi — Kültür santrifüj edilerek çökelen hücrelerden uygun yöntemlerle DNA izole edilir. — Genom içindeki hedef gen, spesifik bir restriksiyon endonükleaz kullanılarak kesilir ve saflaştırılır. — Hedef gen, gerekirse PCR ile çoğaltılabilir.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 57.

(58) Ökaryotik bir geni prokaryota aktarmadan önce! — Klonlamadan önce intronlar çıkarılmalıdır. — Çünkü prokaryotlarda intronları uzaklaştıracak mekanizma bulunmaz. — Elde edilecek proteinin özelliğine göre glikozilasyon ya da sinyal peptid süreçleri sağlanmalıdır. — Çünkü prokaryotların kendi proteinlerini glikozile etme mekanizması yoktur. — Gerekiyorsa, hedef proteini hücre dışına salgılayacak modifikasyonların sağlanması gerekmektedir. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 58.

(59) Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 59.

(60) DNA miktarının ölçülmesi — Örneklerin DNA miktarını tayin etmek için spektrofotometrede 260 ve 280 nm’de absorbans ölçümleri yapılır. — 260 nm’deki absorbans, örnek içindeki nükleik asit konsantrasyonunun hesaplanmasında kullanılır. — Absorbansın 1.0 olması, ölçülen örnekte yaklaşık 50 µg/ml çift zincirli DNA, 40 µg/ml tek zincirli DNA ya da RNA bulunması anlamına gelir.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 60.

(61) DNA miktarının ölçülmesi — 1 ml örnekteki DNA’nın µg cinsinden miktarını hesaplamak için 260 nm’deki absorbans değerini; — Çift zincirli DNA için 50 — Tek zincirli DNA için 40 ile çarpmak gerekir. — Örnekteki nükleik asit saflığı hakkında bilgi sahibi olabilmek için OD260/OD280 oranını bilmek gerekir. — Bu oran, 1.0’den ne kadar büyük ise, örnekteki protein kontaminasyonu o kadar azdır.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 61.

(62) DNA’nın görüntülenmesi — Jel elektroforezinde DNA molekülleri; — Elektrik yüklerine — Molekül ağırlıklarına ve — Yapılarına göre farklı hızlarda hareket ederler. — Molekül ağırlığı küçük olanlar daha hızlı hareket ederken, büyük olanlar daha yavaş hareket eder. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 62.

(63) DNA’nın görüntülenmesi — Hazırlanacak olan jeldeki agar oranı genellikle % 0.81.5 arasında değişir. — Bu şekilde, 10 nükleotitten birkaç bin nükleotide kadar olan farklı büyüklüklerdeki DNA bantları görünür hale gelecektir. — Eğer DNA molekülleri büyük ise, kullanılacak olan agarın konsantrasyonunu azaltmak gerekir. — Ancak, DNA’nın molekül büyüklüğü azaldıkça, bantların birbirinden daha etkili ayrılabilmesi için agar konsantrasyonunun artırılması zorunludur. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 63.

(64) Jelden DNA izolasyonu — Elektroforez sonrasında bantlar jelden kesilerek izole edilebilir. — Jelden DNA izole edilecekse, agar konsantrasyonunun düşük olması gerekir. — Bu sayede, DNA’daki muhtemel jel kontaminasyonu minimuma indirilebilir.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 64.

(65) Vektör DNA’sının hazırlanması — Plazmitlerin, kendilerine özgü replikasyon mekanizmaları ve gen setleri vardır. — Ancak, in vitro ortamda yapılacak modifikasyonlarla transfer edilecek geni taşıyacak hale getirilebilirler.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 65.

(66) Vektörün sahip olması gereken özellikler — Küçük olmalıdır. — Replikasyon orijini bulunmalıdır. — Restriksiyon endonükleaz tanıma bölgeleri bulunmalıdır. — Marker genleri bulunmalıdır.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 66.

(67) Küçük olmalıdır! — Vektör, hücreye transfer edilebilme özelliğine sahip olmalıdır. — Vektör DNA’sının, transfer edilecek hücrenin membran porlarından geçebilmesi için 10 kb’den daha küçük olmalıdır.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 67.

(68) Replikasyon orijini bulunmalıdır — Vektör DNA, transfer edildikten sonra, hem kendisini hem de yabancı DNA’yı yüksek oranda replike edebilecek bir replikasyon orijinine sahip olmalıdır.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 68.

(69) Restriksiyon endonükleaz tanıma bölgeleri bulunmalıdır — Yabancı genin vektör DNA’sına aktarılabilmesi için, uygun restriksiyon endonükleaz kesim noktalarına sahip olması gerekir.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 69.

(70) Marker genleri bulunmalıdır — Transfer edildiği hücrenin diğer hücrelerden ayırt edilmesini sağlayan bazı marker genlere sahip olmalıdır. — Örn; ampisilin’e dirençlilik geni, AmpR. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 70.

(71) Ne tür vektörler kullanılabilir? — Plazmitler — Fajlar — Viral genomlar — Kozmidler — Shuttle DNA’lar. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 71.

(72) Nasıl yapılır? — Önce vektör DNA’sı spesifik restriksiyon endonükleazlarla kesilerek halkasal yapıdan lineer yapıya geçiş sağlanır.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 72.

(73) Nasıl yapılır? — Ortama, aynı restriksiyon endonükleaz ile kesilerek izole edilmiş yabancı DNA ilave edilir.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 73.

(74) Nasıl yapılır? — DNA ligaz, vektör DNA’sını yabancı DNA ile birleştirerek vektörü tekrar halkasal hale getirir.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 74.

(75) Vektör, yabancı DNA’yı almadan tekrar halkasal hale geçebilir mi? — Bazı durumlarda, vektör, yabancı DNA’yı alarak halkasal hale geçmek yerine, rekombinasyona uğramaksızın tekrar halkasal hale (eski haline) dönüşebilir.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 75.

(76) Nasıl engellenir? — Vektörün yabancı DNA’yı almadan halkasal hale gelmesini engellemek için ortama alkalin fosfataz ilave edilir. — Bu enzim, açılan vektör DNA’sının uçlarında bulunan fosfat gruplarını uzaklaştırır. — Bu sayede, ortama, uç kısımlarında fosfat bulunduran bir yabancı gen verilmedikçe plazmit tekrar halkasal hale gelemez.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 76.

(77) Transformasyon: Rekombinant DNA’nın bakteriye aktarılması — Bacillus subtilis gibi bazı bakteriler, ortamdaki DNA molekülünü doğrudan alabilmektedirler (doğal transformasyon). — Ancak E. coli gibi birçok bakteri, DNA molekülünü, laboratuvar ortamında membran permeabiliteleri artırıldıktan sonra alabilmektedir (yapay transformasyon).. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 77.

(78) Kompetent (uyumlu) hücre — Bu hücrelerin, DNA’yı hücre içine alabilmeleri için uygun ortamın hazırlanması gerekir. — DNA’yı hücre içine alabilecek yeterlilik kazanan hücrelere kompetent (uyumlu) hücre adı verilir. — Ayrıca, hücre içine alınan DNA molekülünün, bakteri restriksiyon endonükleazları tarafından parçalanmaması için, bu enzimlerin inhibe edilmesi gerekir.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 78.

(79) En yaygın yöntem — DNA’nın bakteri hücresine girebilmesi için uygulanan en yaygın yöntem, hücrelerin CaCI2 ile muamele edilmesidir. — DNA’nın hücre içine alınması Ca2+ ile teşvik edilmektedir. — Öncelikle hücreler CaCI2 içeren besiyerinde 37 °C’de 1 saat inkübe edilir. — Ca2+ iyonları hücre zarının geçirgenliğini artırarak DNA’nın girişini kolaylaştırır. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 79.

(80) En yaygın yöntem — Daha sonra ortama rekombinant DNA süspansiyonu eklenir ve hücre zarının geçirgenliğinin artması için 42 °C’de 1 dk bekletilir. — Ardından, 37 °C’de 45 dk inkübe edilerek hücre içine alınan rekombinant plazmitlerin artışı sağlanır. — Böylece her bir bakteri hücresi yaklaşık olarak 50-100 rekombinant plazmit kopyasına sahip olur.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 80.

(81) En yaygın yöntem. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 81.

(82) Rekombinantların seçimi — Sıradaki işlem rekombinant plazmiti içeren bakterilerin seçimidir. — Bunun için, rekombinant plazmit üzerinde bulunan antibiyotik dirençlilik genlerinden faydalanılmaktadır.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 82.

(83) Rekombinantların seçimi — Eğer rekombinant plazmit üzerinde ampisilin dirençlilik geni bulunuyorsa (AmpR), ampisilin bulunan besiyerinde koloni oluşturabilecektir. — Ancak bakteri rekombinant plazmiti alamadıysa, söz konusu besi ortamında koloni oluşturamayacaktır. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 83.

(84) Rekombinant DNA’nın hücrelerden izolasyonu — Bazı durumlarda, bakteri hücrelerinin rekombinant DNA moleküllerini (plazmitleri) aldığını teyit edebilmek için, doğrudan izole edilerek incelenmeleri gerekebilir. — Bunun için, antibiyotik içeren katı besiyerinde seçilen hücreler, sıvı besiyerine aktarılarak inkübe edilir. — Böylelikle bu hücrelerin saf kültürleri elde edilmiş olur.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 84.

(85) Kloramfenikol kullanılması — Sıvı besiyerindeki hücrelere, kloramfenikol uygulanarak plazmit sayısı hücre başına 20’den 1000’e kadar çıkarılabilir. — Bu antibiyotik, bakteri kromozomunun replikasyonunu ve protein sentezini inhibe ederken, plazmit replikasyonunu teşvik eder.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 85.

(86) Rekombinant DNA’nın hücrelerden izolasyonu — İnkübasyon süreci tamamlanan hücre süspansiyonu santrifüj edilir. — Tüpün dibindeki pellet homojenize edilir. — Proteinlerin uzaklaştırılması için SDS, RNA’nın uzaklaştırılması için ise RNaz uygulanır. — Potasyum asetat/formik asit kullanılarak hücresel kromozomlar uzaklaştırılır. — Elde edilen plazmit süspansiyonu fenol/kloroform ve etil alkolden geçirilerek saflaştırılır. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 86.

(87) Klonlanan yabancı DNA’nın baz dizisinin tespiti — Klonlanan genin baz dizisinde meydana gelebilecek herhangi bir değişiklik, farklı bir ürünün oluşumuna yol açabilir. — Bu nedenle, klonlanan genden ürün sentezine başlanmadan önce, baz dizisinin belirlenmesi gerekir.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 87.

(88) Hangi yöntemler kullanılabilir? — Klonlanan genin baz dizisinin tespitinde kullanılan geleneksel yöntemler şu şekilde ifade edilebilir: — Frederick Sanger ve A. R. Coulson metodu (1975) — Alan Maxam ve Walter Gilbert metodu (1977) — Yukarıdakilere ilave olarak, günümüzde baz dizisi tespiti, yeni nesil sekans analiz yöntemleri ve ekipmanları kullanılarak oldukça hızlı ve hatasız gerçekleştirilebilmektedir.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 88.

(89) Sanger ve Coulson yöntemi — Bu yöntem, Sanger’e ikinci kez Nobel ödülü kazandırmıştır. — Zincir sonlandırma yöntemi olarak da bilinir. — DNA zincirinin enzimatik sentezine ve sentezin 2’,3’dideoksinükleotid trifosfatlar (ddNTP’ler) kullanılarak belirli noktalarda sonlandırılması prensibine dayanmaktadır. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 89.

(90) Sanger ve Coulson yöntemi — ddNTP’lerin, dNTP’lerden (normal DNA bazları) farkı, üçüncü karbon atomlarında bir oksijenin eksik olmasıdır. — Bu nedenle, ddNTP’ler bir sonraki nükleotid ile fosfodiester bağı kuramaz ve sentez durdurulmuş olur. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 90.

(91) Nasıl yapılır? — Dizileme için şu bileşenler gereklidir: — dNTP’ler (dATP, dGTP, dCTP ve dTTP) — 32P ile işaretlenmiş ddNTP’ler (ddATP, ddGTP, ddCTP ve ddTTP) — Tek iplikli kalıp DNA — Primer — DNA polimeraz. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 91.

(92) Nasıl yapılır? — Öncelikle dizisi tespit edilecek olan çift iplikli DNA denatüre edilerek (ısı ile) tek iplikli hale getirilir.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 92.

(93) Nasıl yapılır? — Dört adet deney tüpü A, G, C ve T şeklinde etiketlenir.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 93.

(94) Nasıl yapılır? — Tüplere kalıp DNA, DNA polimeraz ve dNTP’lerin tümünden yeterli miktarda konulur.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 94.

(95) Nasıl yapılır? — Daha sonra her bir ddNTP, üzerinde ilgili harf kodunun yer aldığı tüpe eklenir: — A tüpüne ddATP — G tüpüne ddGTP — C tüpüne ddCTP — T tüpüne ddTTP — Sentez reaksiyonu başlatılır.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 95.

(96) Nasıl yapılır? — Sentez sırasında her bir tüpte bulunan ddNTP, uzamakta olan zincirde kendisine uygun olan yere yerleştiğinde, o zincirin sentezi durur.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 96.

(97) Nasıl yapılır? — Örneğin, zincire dGTP yerine ddGTP girerse, zincir uzaması o noktada durmuş olur.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 97.

(98) Nasıl yapılır? — Bu reaksiyon, her ddNTP için dört ayrı tüpte tekrarlanır.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 98.

(99) Nasıl yapılır? — Sentez bittikten sonra, her bir tüpte çeşitli uzunluklarda çok sayıda fragment meydana gelmiş olur.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 99.

(100) Nasıl yapılır? — Oluşan çift zincirli fragmentler ısı ile denatüre edilerek tek zincirli hale getirilir.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 100.

(101) Nasıl yapılır? — Her bir reaksiyondan elde edilen DNA parçaları jelde yürütülür.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 101.

(102) Nasıl yapılır? — ddNTP’lerin her biri 32P ile işaretlenmiş olduğundan, jeldeki bantlar bir dedektör yardımı ile okunarak ilgili ddNTP’nin, her ipliğin kaçıncı pozisyonunda yer aldığı tespit edilir.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 102.

(103) Nasıl yapılır? — Bu sayede, dört ddNTP’nin her birinin zincirin nerelerine yerleştiği belirlenerek tüm DNA’nın baz dizisi tespit edilir.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 103.

(104) Maxam-Gilbert yöntemi — Bu yöntemde kullanılan kimyasal maddeler oldukça toksik olduğundan, çalışırken dikkatli olunması gerekmektedir. — Sanger ve Coulson yöntemi daha pratik olduğundan, bu yöntem günümüzde popülerliğini yitirmiştir.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 104.

(105) Nasıl yapılır? — Hedef DNA, spesifik restriksiyon endonükleazlarla kesilerek değişik uzunluklarda çift iplikli fragmentler elde edilir. — Bu fragmentler, 3’ uçlarından 32P ile işaretlenir. — Fragmentler çeşitli yöntemlerle denatüre edilerek tek iplikli hale getirilir. — Denatüre edilen iplikler 4 eşit kısma ayrılarak tüplere dağıtılır.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 105.

(106) Nasıl yapılır? — Tüpler G, A+G, T ve T+C şeklinde etiketlenir. — Tüplerin her birine, spesifik bazları parçalayan aşağıdaki kimyasallardan belirli miktar ve sürelerde ilave edilir: — Dimetil sülfat — Hidrazin — Formik asit — Piperidin. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 106.

(107) Nasıl yapılır? — G tüpüne ilave edilen dimetil sülfat, fragmentlerdeki guaninleri parçalar. — A+G tüpüne ilave edilen ilgili kimyasal, fragmentlerdeki A ve G bazlarını parçalar. — T tüpüne ilave edilen kimyasal, fragmentlerdeki T bazlarını parçalar. — T+C tüpüne ilave edilen kimyasal ise fragmentlerdeki T ve C bazlarına zarar verir, diğer bazlar zarar görmez.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 107.

(108) Nasıl yapılır? — Sonuçta; — G tüpünde değişik boyda ve yalnızca G bazlarından kesilmiş fragmentler bulunur. — A+G tüpünde, hem A hem de G bazlarının bulunduğu bölgelerden kesilmiş fragmentler bulunur. — T tüpünde yalnızca T bazlarından kesilmiş fragmentler bulunur. — T+C tüpünde ise hem T hem de C bazlarının bulunduğu bölgelerden kesilmiş fragmentler bulunur. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 108.

(109) Nasıl yapılır? — Fragmentler elektroforezde yürütülerek bant profilleri elde edilir. — Daha sonra jel üzerine X ışınlarına duyarlı bir film yerleştirilerek 32P’den kaynaklanan radyoaktivitenin siyah bantlar şeklinde filme geçmesi sağlanır (otoradyografi). — Her bir tüpten alınan örneğin elektroforezde yürütülmesi sonucunda elde edilen bu bantlar birbirleriyle karşılaştırılarak değerlendirme yapılır. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 109.

(110) Örneğin; — G tüpüne ait sütunda 3 tane G bandı — A+G tüpüne ait sütunda 3 A ve 3 G bandı — T tüpüne ait sütunda 2 tane T bandı — T+C tüpüne ait sütunda 2 T ve 2 C bandı. bulunduğunu varsayalım. — İncelenen fragmentlerin baz sıraları, yukarıdan aşağıya ya da aşağıdan yukarıya doğru bantlar birbirleriyle karşılaştırılarak saptanır.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 110.

(111) Maxam-Gilbert yöntemi. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 111.

(112) Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) — Gen amplifikasyonu (çoğaltılması) işlemini in vitro ortamda daha kısa sürede ve doğru olarak gerçekleştirdiği için, bu yöntem, günümüzde sıklıkla kullanılmaktadır. — İlk olarak 1985’te R. Saiki, K. Mullis ve arkadaşları tarafından orak hücre anemisinin tanısının konulması için geliştirilmiştir. — Yöntem, 1993 yılında bu araştırıcılara Nobel ödülü kazandırmıştır. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 112.

(113) Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) — PCR ile, 20.000 baza kadar olan genlerin yüz milyonlarca kopyası elde edilebilmektedir. — Fosil örneklerde ya da faili meçhul bir cinayette olay yerinden alınan bir damla kan örneğinde yeterli miktarda DNA bulunmaz.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 113.

(114) Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) — Ancak PCR ile bu örneklerdeki DNA miktarı artırılabilir. — PCR ayrıca, virüs tarafından yeni enfekte olmuş kan ya da lenf dokularındaki az miktarda viral genetik materyali tespit etmek için de etkili bir yöntemdir. — PCR’nin optimum şartlarda sentez hızı saniyede 75 nükleotiddir. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 114.

(115) PCR’nin temel aşamaları — Denatürasyon: Yüksek sıcaklık uygulanarak çift iplikli DNA’nın tek iplikli hale getirilmesi — Hibridizasyon: Primerlerin kalıp DNA’ya bağlanması — Uzama: DNA polimeraz ile primerlerden itibaren yeni zincirlerin uzatılması Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 115.

(116) Reaksiyon bileşenleri — Kalıp DNA — 15-30 baz uzunluğundaki oligonükleotid primerler — Taq DNA polimeraz — Dört tip dNTP (dATP, dGTP, dCTP ve dTTP). Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 116.

(117) Nasıl yapılır? — Çift sarmallı DNA 90-95 °C’de 3-4 dk ısıtılarak denatüre edilir. — İpliklerin 3’ uçlarına 4555 °C’de primerlerin bağlanması sağlanır. — 70-75 °C’de zincir uzaması sağlanır.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 117.

(118) 2+ Mg. gereklidir. — Taq DNA polimerazın çalışabilmesi için ortamda serbest Mg2+ iyonlarının bulunması gerekmektedir.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 118.

(119) Görüntüleme — PCR ile çoğaltılan DNA segmentleri restriksiyon endonükleazlarla kesilir. — Fragmentler elektroforezde yürütülür. — Bantlar, etidyum bromid uygulanarak doğrudan görünür hale getirilebileceği gibi, UV ışık altında da görüntülenebilir. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 119.

(120) RNA amplifikasyonu (RT-PCR) — PCR, RNA’nın amplifikasyonunda da kullanılabilmektedir. — Bunun için, RNA’dan öncelikle revers transkriptaz ile cDNA elde edilir. — Daha sonra da DNA için uygulanan normal basamaklar izlenir.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 120.

(121) RNA amplifikasyonu (RT-PCR). Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 121.

(122) PCR’de hata oranı: Pfu DNA polimeraz — PCR sırasında, uzamakta olan zincire hatalı bit nükleotidin yerleşme olasılığı 3 x 10-4 – 3 x 10-6 arasında değişmektedir. — Ancak son zamanlarda Pfu DNA polimeraz enzimi kullanılarak hata oranı 2 x 10-7’ye kadar düşürülebilmektedir. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 122.

(123) Failin tespitinde PCR — Adli bir olayda, suç mahallindeki bir kıl, birkaç deri hücresi ya da bir damla kandaki DNA PCR ile çoğaltılabilir. — Çoğaltılan DNA’nın baz dizisi ile şüphelinin DNA’sının baz dizisi karşılaştırılarak fail tespit edilebilir. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 123.

(124) Babalık testinde PCR — PCR babalık testinde de kullanılmaktadır.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 124.

(125) Babalık testinde PCR — Bu işlem için, çocukta, babadan gelen insan lökosit antijeninin (human leucocyte antigen-HLA) gen dizisi ile babanınki karşılaştırılır. — Bu sebeple çocuğun babaya ait olup olmadığı anlaşılabilir. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 125.

(126) DNA parmak izi (fingerprinting) — Adli olaylarda bireyler arasındaki dizi benzerliklerinin ya da farklılıklarının karşılaştırılmasına aslında DNA parmak izin (fingerprinting) adı da verilmektedir.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 126.

(127) DNA parmak izi (fingerprinting) — Bu teknikte bireylere özgü; — Hiper-değişken bölgeler (HVR) olarak bilinen polimorfik bölgeler ve — Değişken sayıda sıralı tekrar bölgeleri (VNTR) tespit edilir.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 127.

(128) Polimorfizm — DNA dizisi bireyden bireye farklılık gösterir. — Bireylerin aynı kromozom ve lokuslarında görülen nükleotid farklılıkları polimorfizm olarak adlandırılır. — İnsanlar arasında DNA dizi benzerliği yaklaşık olarak % 99.9 oranındadır. — % 0.1’lik farklılıktan faydalanarak her bireye özgü DNA parmak izi elektroforez ile tespit edilebilir.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 128.

(129) Ölüm meleği Dr. Josef Mengele! — 1985’te Brezilya’da bulunan iskelet kalıntılarının, Hitler döneminde Almanya’da Yahudilerin tutulduğu Auschwitz Kampı’nda ‘Ölüm Meleği’ olarak bilinen Dr. Josef Mengele’ye ait olup olmadığı tespit edilmiştir. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 129.

(130) Ölüm meleği Dr. Josef Mengele! — Bunun için, iskeletin femur kemiğinden az miktardaki ve parçalanmış DNA izole edilmiştir. — Mengele’nin oğlu ve karısından da DNA elde edilmiş ve bu DNA’ların 10 farklı bölgesi karşılaştırılmıştır. — Sonuçta kalıntıların Mengele’ye ait olduğu anlaşılmıştır.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 130.

(131) Mutagenez — Kalıtım materyalinin baz dizisinde meydana gelen değişikliklere mutasyon adı verilir. — Mutasyona uğramış bireye mutant denir. — Mutasyon, organizmanın fenotipik görünümünde değişime yol açabileceği gibi, herhangi bir değişim meydana getirmeden de oluşabilir.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 131.

(132) Her mutasyon zararlı mıdır? — Bazı mutasyonlar, bazı kalıtsal hastalıklara neden olarak bireyin yaşam başarısını azaltabilirler. — Bazı mutasyonlar ise çeşitli metabolik yolların daha etkin ve alternatif bir şekilde kullanılmasını sağlayarak bireyin hayatta kalma başarısını artırabilir.. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 132.

(133) Mutasyon kaynakları — Mutasyonlar doğal ya da yapay etkenlerle meydana gelebilmektedir. — DNA replikasyonu sırasında meydana gelen hatalı baz eşleşmeleri doğal mutasyonlara örnek verilebilir. — Bu tür mutasyonlar, milyarda bir oranında ortaya çıkar. — Hücreler, meydana gelen bu hataları genelde tamir edebilme yeteneğine sahiptir. — Ancak mitokondriler, genomlarında ortaya çıkan hataları tamir edecek enzimlere sahip olmadıklarından, bu hatalar tamir edilemez. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 133.

(134) Site-directed mutagenez — Laboratuvar ortamında, bir genin belirli bir noktasında baz düzeyinde sentetik primerler yardımıyla ve PCR kullanılarak gerçekleştirilen mutasyonlardır. — Amaç, proteinin oluşturan aminoasitlerden birinin ya da birkaçının değiştirilmesidir. — Mutasyon sonucunda, proteinin üç boyutlu yapısı ve aktivitesi değişebilir. — Bu teknikle, aminoasit değişikliklerinin, proteinin yapı ve fonksiyonu üzerindeki etkisi tespit edilmiş olur. Prof. Dr. Bektaş TEPE (Kaynak: Moleküler BiyolojiPalme Yayıncılık-2004). 134.

(135)

Referanslar

Şimdi indir ( PDF - 134 sayfa - 27.71 MB )

Benzer Belgeler

DNA isolation

• Denaturation of proteins is achieved by using sodium dodecyl sulfate (SDS), proteinase K, phenol and organic solvents.. • SDS is a powerful detergent which separates proteins

DNA izolasyonu

• Hücre zarı, aşağıdaki yöntemlerden herhangi biriyle bozulur: akışkanlığı arttırmak için ısı, disülfit bağlarını azaltmak için dithiothreitol (DTT) veya

Oksidatif DNA

Çekirdek DNA’sına göre mitokondriyal DNA’da oksidatif baz hasarının fazla şekillenmesinin olası nedenleri, mtDNA’nın en önemli hücre içi ROS kaynağı

Prof. Dr. Bektaş TEPE

Kovalent bağ — Ortaklaşa elektron kullanan atomlar arasında oluşan bağa kovalent bağ denir.. — Kovalent bağlar iyonik bağlara göre

Prof. Dr. Bektaş TEPE

Nükleotidler arası bağ — DNA zinciri üzerinde peş peşe dizilen nükleotidlerden birinin şeker molekülü ile diğerinin fosfat grubu arasında fosfodiester bağı meydana gelir..

Prof. Dr. Bektaş TEPE

— 20 temel amino asidin dışında, modifiye amino asit olarak değerlendirilen selenosistein ve pirolizin amino asitlerinin de dur kodonlarının UGA ve UAG yeniden programlanması

DNA üzerinde kalıtsal özellik taşıyan genler bulunur. DNA hücrenin sentez ve yönetim özelliğine sahiptir. İlk DNA modelini James Watson ve Francis Crick yapmıştır.

Böylece, her şeker- fosfat omuru, 5’ – 3’çekimine veya istikametine sahip olarak nitelenir ve bunu anlamak DNA’nın rollerini nasıl yerine getirdiğini anlamak

Hücrede DNA

• Hibridizasyon, Bazların kendileri için tamamlayıcı olan bazlar ile etkileşmesi esasına dayanarak , iki tek sarmal (ss) Nükleik Asit (NA) molekülünün bir çift sarmal (ds)