KONTAMİNASYONSUZ ÇALIŞMA KURALLARI

KONTAMİNASYONSUZ ÇALIŞMA KURALLARI

Doç. Dr. Hilâl Özdağ

GÜVENLİ VE ETKİN

LABORATUVAR UYGULAMALARI

111-546

STERİL ÇALIŞMAK

• Her ne kadar moleküler biyoloji laboratuvarlarındaki genel çalışmalar kesin sterilite gerektirmiyorsa da steril çalışma kurallarını rutin olarak uygulama alışkanlığı deneylerin sağlıklı akışını güvene alır.

• Steril çalışma alışkanlığı RNA çalışmaları,

radyoaktif çalışmalarını çok kolay ve güvenilir

hale getirecektir.

NE ZAMAN STERİL ÇALIŞMAK GEREKİR?

 Transformasyon için E.coli kültürü hazırlandığında

 LB petrileri hazırlandığında,

 Hücreler ayırılıp/bölündüğünde (split)

 Besiyeri için serum filtre edilirken

 Liyofilize bakterileri açıp rehidrate ederken

STERİL ÇALIŞMAK NE ZAMAN TAVSİYE EDİLİR?

 Restriksiyon kesimi hazırlarken: Birçok enzim gliserol içinde hazırlanmasına ve gliserol bakteriyostatik olmasına rağmen (%50 ve üzeri) dilüe enzimler bakteriyel kontaminasyona açıktır. Ayrıca enzimler dışardan gelecek yabancı elementlerce inhibe olabilirler.

 PCR: PCR makinelerinin bulunduğu yer ve PCR ürünlerinin kontrol edildiği/kullanıldığı yerin PCR reaksiyonlarının kurulduğu mekanın birbirlerinden ayrı olması gerekmektedir.

 Hücrelerin 32P ile işaretlenmesi: Steril çalışmak ile kendinizi

korumuş olursunuz. Radyoaktif reaktiflerin ağzını açık bırakıp aerosol

oluşturmaz radyoaktif pipetleri yeniden kullanmamış olursunuz.

STERİL TEKNİK

STERİL TEKNİK

 Çalışma alanınız kalabalık ve hareketten mümkün olduğunca uzakta olmalıdır: Pencereler kapalı olmalıdır. Kapı yanında çalışılmaz.

 Çalışma alanı boş olmalıdır: Çalışma tezgahında kullanmadığınız şişe, reaktif benzeri malzemeler bulunmamalıdır. Çalışmanız bittikten sonra kullandığınız malzemeleri yerlerine yerleştirip tezgahı temizleyip bırakmalısınız.

 Çalışma tezgahı kullanılmadan önce antiseptik/temizleme malzemesi ile silinmelidir: Genellikle %70 EtOH bu işi görür.

Çalışma tezgahında %70 EtOH içeren bir şişe mutlaka

bulundurulmalıdır.

STERİL TEKNİK

 Bütün pipetler ve şişeler steril olmalıdır: Eğer birşeyin steril olup olmadığında emin değilseniz kullanmayın.

 Çalışma alanınızı ve kullanacağınız araç ve reaktifleri en az hareket yapmanız gerekecek şekilde yerleştirin.

 Kullanacağınız herşeyi tezgah üzerinde hazır bulundurun.

 Mutlaka eldiven giyin. Eldivenlerinizin kontamine olduğunu

düşündüğünüz anda değiştirin.

STERİL ÇALIŞMADA TEKNİK İPUÇLARI

 ASGARİYE DÜŞÜRÜN

 Mesafeyi

 Maruz bırakma/kalma süresini

 Hareketleri

 Dökerek transfer etmeyi (Pipetle transfer tercih edilmeli)

STERİL ÇALIŞMADA TEKNİK İPUÇLARI

 ŞİŞE AĞZINI 45

C AÇIYLA AÇIN

 EĞER BİR KAPAĞI YERE KOYMANIZ GEREKİYORSA KAPAĞI AĞZI AŞAĞI DÖNÜK OLACAK ŞEKİLDE TEMİZ BİR YÜZEYE BIRAKIN. (Kapak ağzını yukarı dönük olarak da bırakabilirsiniz ancak bu durumda elinizi kapak üzerine değdirmemelisiniz!)

 CAM PİPET VE AÇIK ŞİŞELERLE ALEV YANINDA

ÇALIŞIN.

STERİL ÇALIŞMADA TEKNİK İPUÇLARI

 PLASTİK ŞİŞE VE PİPETLERLE ÇALIŞIRKEN ALEV YANINDA OLMAYIN.

 PİPETLEMEYİ YAVAŞÇA YAPIN ŞİŞEYİ ÇALKALAMAYIN (Aerosol oluşumunu engeller).

 ŞİŞELERİN AĞIZLARINI AÇIK BIRAKMAYIN.

STERİLİTENİN KAYBOLDUĞU DURUMLAR

 Pipetin içine çok fazla sıvı çekmek: Pipeti atın pipetörü kontrol edin, filtreyi değiştirmeniz gerekebilir.

 Pipetin ucunu şişeye, yere veya pipet kutusunun dışına değdirmek: Pipeti atın.

 Ağzı açık bir kap veya tüpü yere düşürmek: Düşeni atın!

 Filtreye değmiş olan herhangi birşeyi atın: Vakum filtresi

 Çalışırken pipetleri tekrar tekrar kullanmak: Bir pipet bir

kez ıslandıktan sonra artık havadan kontamine olması çok

kolay hale gelir.

PİPETLEME Cam Pipetler

 Cam pipetler metal kutularda steril edilerek kullanılır.

 Hücre veya bakteri için kullanılanlarının pamuk tıkaçlı olması gerekir.

 Kutunun kapağını gevşet.

 Bir el ile kutuyu tutarken diğer el ile kapağı çıkar.

 Kutunun ağzını ve kapağını ateşten geçir. Kapağı yere koy.

 Kutuyu yatay olarak tutarken hafifçe sallayarak pipetlerin

uca doğru gelmesini sağla.

PİPETLEME Cam Pipetler

 Bir pipeti baş ve işaret parmaklarını kullanarak ucundan tutup kutunun dışına değdirmeden çek.

 Pipetin alt 1-3’ünü 180

C çevirerek 1-3 sn alevden geçir.

 Pipetleme yapacağın şişeyi 45oC açı ile eğdikten sonra.

Şişeyi tuttuğun elin iki parmağıyla şişenin kapağını aç.

 Diğer elinde pipet yardımcısına bağlı pipet var iken şişenin ağzını alevden geçir.

 Pipeti yeniden alevden geçir.

PİPETLEME Cam Pipetler

 Pipeti şişe içindeki sıvıya daldır. Yeterince sıvıyı pipete çektikten sonra pipeti şişeden yavaşça çıkar.

 Şişeyi ve kapağını alevden geçirdikten sonra şişenin ağzını kapayıp bir kenara koy.

 Bu arada bir elinde içinde sıvı dolu pipet var iken sıvıyı transfer edeceğin şişeyi aç.

 Pipeti şişenin içine daldırıp sıvıyı transfer et.

 Pipeti dezenfektan solüsyon içeren kaba koy.

 Şişenin ağzını ve kapağını alevden geçirip kapat.

PİPETLEME

Tek Kullanımlık Pipetler

 Cam pipet gibi kullanılır. Alev aşaması yapılmaz.

 Kullanıldıktan sonra çift biyoatık torbası geçirilmiş çöp kutusuna veya özel pipet tek kullanımlık çöp kutusuna atılır.

 Tek kullanımlık pipetin paketi yukarıdan (pipetin tıkaçlı uç

tarafı) açılıp pipet yavaşça hiçbir yere temas etmemesi

sağlanarak çıkarılır.

DÖKME

 Bir elinizle içine dökeceğiniz kabı diğer elinizle içinden dökeceğiniz kabı tutun:

 Her iki kabın ağzını teker teker ateşten geçirin.

 Alıcı kabı bir açı ile tutarken verici kabı alıcı doğru eğip yaklaşık 5 cm yukarıdan tutup yavaşça dökün.

 Her iki kabın da ağzını ateşten geçirin.

 Dökme usulünü transfer edeceğiniz hacim pipetleme yapılamayacak kadar büyükse tercih edin zira bu usül kontaminasyona davetiye çıkaran bir usüldür.

FİLTRE STERİLİZASYONU

 Küçük hacim için şırınga filtresi ile sterilizasyon:

 Gerekenler:

 0.2 um şırınga filtresi

 Tek kullanımlık steril şırınga

 Steril alıcı tüp

 Tüplük

 Şırınga filtresinin yalnızca üstünü aç (Geniş olan yüzü)

 Şırıngayı paketinden çıkarıp sıvıyı şırıngaya çek.

 Şırıngalı filtreye tak.

 Alıcı tüpü tüplüğün üzerine koyduktan sonra sıvıyı şırıngaya basıp filtreden geçirmek suretiyle tüpe aktar.

 Tüpün ağzını kapat, üzerini etiketle, şırınga ve filtreyi biyolojik atığa at.

FİLTRE STERİLİZASYONU

 Büyük hacim için vakum filtre ünitesi ile ile sterilizasyon:

 Gerekenler:

 Tek kullanımlık 0.2 um filter

 Vakum filtre ünitesi

 Vakum pompası

 Vakum düzeneğini kurulur. Vakum düzeneğinin altında steril şişe veya erlen bulunur.

 Steril tek kullanımlık filtre pens ile düzeneğin içine yerleştirilir.

 Steril edilecek solüsyon üst kaba konup vakum açılır.

 Süzme işi bittiğinde vakum kapatılıp kısa bir süre beklendikten sonra düzenek sökülüp steril solüsyon şişedeyse ağzı steril kapakla kapatılır, erlendeyse steril şişeye aktarılır.

KENDİNİZİ KORUYUN

 Mikroorganizmaların laboratuvar çalışanları ve çevreye verdikleri zarara göre sınıflandırılması:

 Advisory commitee on dangerous pathogens (ACDP)

 US Department of Health and Human Services (USPHS)

 World Health Organisation (WHO) USPHS

(1974)

Class 1

Hiç veya minimal

Class 2 Potansiyel

Class 3 Özel, kişiye

Class 4 Yüksek, kişiye WHO

(1979)

Risk Grubu 1 Düşük birey Düşük toplum

Risk Grubu 2 Orta birey Düşük toplum

Risk Grubu 3 Yüksek birey Düşük toplum

Risk Grubu 4 Yüksek birey Yüksek toplum ACDP

(1990)

Zararlı Grubu 1 İnsan hastalığı yaratmayacak gibi

Zararlı Grubu 2 Laboratuvar çalışanları için hastalık yapabilecek

ancak toplum için tehlikeli değil.

Zararlı Grubu 3 Laboratuvar çalışanlarına bazı

zararları olup topluma yayılabilecek olan

Zararlı Grubu 4 Laboratuvar çalışanları için ciddi

zarar oluştururken toplum için yüksek

risk yaratanlar.

BİYOGÜVENLİK

 Mikroorganizmaların laboratuvar çalışanları ve çevreye verdikleri zarara göre sınıflandırılması:

 Advisory commitee on dangerous pathogens (ACDP)

 US Department of Health and Human Services (USPHS)

 World Health Organisation (WHO)

SEVİYELER ALTYAPI LAB UYGULAMASI GÜVENLİK

DONANIMLARI

1 Temel İyi mikrobiyoloji

tekniği (İMT)

Açık tezgahta çalışma

2 Temel İMS + koruyucu kıyafet

biyozararlı işaretleri

Açık tezgah + Potansiyel aerosol için

güvenlik kabini

3 İzolasyon Seviye 2 + özel kıyafet,

kontrollü giriş

Bütün aktiviteler için güvenlik kabini 4 Azami izolasyon Seviye 3 + hava engelli

giriş, duş çıkışı, özel atık uzaklaştırması

Class II güvenlik kabini + basınç gradienti

BİYOGÜVENLİK

 Laminar akışlı kabinler

 Yalnızca ürünü korur. Kesinlikle biyozararlı veya kimyasal zararlı bir reaktifle bu kabinler içinde çalışılmamalıdır.

 Herhangi potansiyel enfeksiyöz aerosol kullanıcı ve çevreye bulaşır.

 Yatay hava akışlı tezgahta hedef kullanıcı iken

 Dikey hava akışlı tezgahta hedef çevre olacaktır.

 Biyolojik güvenlik kabinleri

 Hem kullanıcı hem çevre hem de ürün korunabilir.

BİYOGÜVENLİK

 HEPA FİLTRE

 High Efficiency Particulate Air

 Boron silikat mikrofiberlerinden oluşmuş alüminyum separatörlerle ayrılmış ince tabakalardan oluşur

 Havada uçuşan partikül ve mikroorganizmaları filtre eder.

BİYOGÜVENLİK KABİNLERİ

SINIFLAR ÇALIŞANI KORUYOR MU? DENEY MALZEMESİNİ KORUYOR MU?

UYGUN OLDUĞU UYGULAMALAR

I Kısmen

Dolaşan hava bariyeri HEPA filtreli egzos

Hayır

Steril olmayan çalışma yüzeyi.

Filtre olmamış oda havası çalışma alanında dolaşır.

Rutin lab uygulamaları.

Kimyasal karsinojenler, düşük seviyeli radyasyon,

uçucu çözücülere karşı çalışanı korur. Çeker ocaklara benzer ancak filtrasyonu o denli verimli

değildir.

II Kısmen

Dolaşan hava bariyeri HEPA filtreli egzos

Evet

Alınan bütün hava filtre olur.

Düşük orta riskli onkojenik virüsler. Hücre ve bakteri

kültürü.

III Evet

Fiziksel bariyer (eldiven kutusu);

HEPA filtreli egzos

Evet

Alınan bütün hava filtre olur.

Hava dolaşımı Class II’den daha zayıftır; malzeme o kadar

korunmaz.

Yüksek riskli patojenler.

Çok zehirli kimyasal ve karsinojenlerin kullanılması

durumunda.

BİYOGÜVENLİK KABİNLERİ

CLASS I

Çalışanın ve çevrenin korunmasını sağlar.

Hava akışı çalışana doğru değildir ancak HEPA filtreden geçmediği için ürün korunumu sağlamaz.

Çeker ocağa benzer ancak HEPA filtresi ile çevreye çıkan hava temizleyip verir.

BİYOGÜVENLİK KABİNLERİ

CLASS II

Çalışanın, çevrenin ve ürünün korunmasını sağlar.

Gelen ve çıkan hava HEPA filtreden geçer.

İçeri giren havanın debisine göre IIA, B, B1 ve B2 tipleri vardır.

BİYOGÜVENLİK KABİNLERİ

CLASS III

Çalışanın, ürünün ve çevrenin korunmasını sağlar.

Hava geçirmeyecek şekilde kapalıdır.

Bütün prosedürler kol uzunluğunda kauçuk eldiven ile gerçekleştirilir.

Egzos sisteminde iki HEPA filtre bulunur.

Yüksek patojen organizmalar ve çok toksik maddelerin kullanımı bu kabinlerin içinde gerçekleştirilir.

BİYOGÜVENLİK KABİNLERİNDE ORTAK ALAN KURALLARINA UYMAK

 Kabini kullanacak başka kişilerin varlığını unutmadan mümkün olduğunca hızlı kullanmalısınız.

 Çamaşır suyu, %70 EtOH şişelerini bittikçe doldurmaya üşenmemelisiniz.

 Kesici ve biyozararlı çöp kutularını boşaltmayı başkalarından beklememelisiniz.

 İşiniz bitince kendinize ait hiçbir şeyi etrafta bırakmamalı, kabini temizleyip öyle kapatmalısınız.

 Kabinleri sık kullanıldığı lablarda kabinler gün boyunca açık bırakılabilir. Bu durumda işiniz bittikten sonra kabin içini temizleyip öyle çıkmalısınız.