T.C.
NİĞDE ÖMER HALİSDEMİR ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI
ELMA SUYUNDA ISIL İŞLEM SÜRESİNCE POLİFENOL OKSİDAZ, PEROKSİDAZ İNAKTİVASYONU VE FENOLİK BİLEŞİKLERDEKİ DEĞİŞİMİN FTIR SPEKTROSKOPİSİ KULLANILARAK BELİRLENMESİ
GÖZDE DOĞANAY
Ekim 2019 DE ÖMER HALİSDEMİR ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜG.DOĞANAY, 2019YÜKSEK LİSANS TEZİ
T.C.
NİĞDE ÖMER HALİSDEMİR ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI
ELMA SUYUNDA ISIL İŞLEM SÜRESİNCE POLİFENOL OKSİDAZ, PEROKSİDAZ İNAKTİVASYONU VE
FENOLİK BİLEŞİKLERDEKİ DEĞİŞİMİN FTIR SPEKTROSKOPİ KULLANILARAK BELİRLENMESİ
GÖZDE DOĞANAY
Yüksek Lisans Tezi
Danışman
Dr. Öğr. Üyesi Hande BALTACIOĞLU
Ekim 2019
ÖZET
ELMA SUYUNDA ISIL İŞLEM SÜRESİNCE POLİFENOL OKSİDAZ, PEROKSİDAZ İNAKTİVASYONU VE FENOLİK BİLEŞİKLERDEKİ DEĞİŞİMİN
FTIR SPEKTROSKOPİSİ KULLANILARAK BELİRLENMESİ
DOĞANAY, Gözde
Niğde Ömer Halisdemir Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı
Danışman : Dr. Öğr. Üyesi Hande BALTACIOĞLU
Ekim 2019, 60 sayfa
Bu çalışmada farklı sıcaklık (40 °C, 50 °C, 60 °C, 70 °C, 80 °C) ve farklı sürede (5, 10, 15, 20, 25, 30 dakika) uygulanan ısıl işlemin elma suyundaki Polifenol oksidaz ve Peroksidaz enzim inaktivasyonu üzerine etkisi incelenmiş, fenolik bileşiklerdeki değişim FTIR spektroskopisi ve HPLC ile belirlenmiştir. PPO enziminde 80 °C’de 20 dakika sonunda % 99 enzim inaktivasyon sağlanırken, POD enziminde 80 °C’de 20 dakika sonunda % 93,29 inaktivasyon sağlanmıştır. Genellikle 70 °C ve 80 °C sıcaklıkta toplam fenolik ve antioksidan aktivitede artış belirlenmiştir. 80 °C’ de 20 dakika ısıl işlemden sonra toplam fenolik madde miktarı 668,41 ± 12,70 mg GAE/ kg yaş ağırlık, EC50 değeri 24,28 ± 0,69 mg/ml olarak belirlenmiştir. Bu durum enzim inaktivasyonunun sağlanmasıyla ilişkilendirilmiştir. HPLC ile elma suyunda belirlenen fenolik bileşikler kateşin, klorojenik asit, epikateşin ve kamferol olmuştur. FTIR spektrumları incelendiğinde ısıl işlem uygulaması sonucunda fenolik bileşiklerde bir değişim gözlenmemiştir. HPLC sonuçları ile FTIR sonuçları paralellik göstermektedir.
Anahtar Sözcükler: Elma suyu, enzim inaktivasyonu, fenolik bileşikler, FTIR, HPLC, ısıl işlem, polifenol oksidaz, peroksidaz
SUMMARY
DOĞANAY, Gözde
Niğde Ömer Halisdemir University
Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Food Engineering
Supervisor : Assist. Prof. Dr. Hande BALTACIOĞLU
October 2019, 60 pages
In this study,the effect of thermal treatment with different temperatures (40, 50, 60, 70, 80 ° C) and different times (5, 10, 15, 20, 25, 30 minutes) on Polyphenol oxidase and Peroxidase enzyme was investigated and the change in phenolic compounds was determined by FTIR spectroscopy and HPLC in apple juice. Enzyme inactivation generally increased with increasing temperature and time. In PPO enzyme, 99% enzyme inactivation was achieved after 20 minutes at 80 °C, whereas in POD enzyme 93.29%
inactivation was achieved after 20 minutes at 80 °C. Generally, an increase was determined at 70 °C and 80 °C in total phenolic content and antioxidant activity. After 20 minutes thermal treatment at 80 °C, total phenolic content was determined as 668.41
± 12.70 mg GAE / kg fresh weight, EC50value was 24.28 ± 0.69 mg / ml. This has been associated with achieving enzyme inactivation. The phenolic compounds identified in apple juice by HPLC were catechin, chlorogenic acid, epicatechin and kaempferol.
When FTIR spectra were examined, no change in phenolic compounds was observed as a result of thermal treatment. HPLC result and FTIR result were found to be parallel.
Keywords: Apple juice, enzyme inactivation, FTIR, HPLC, peroxidase, phenolic compounds, polyphenol oxidase, thermal treatment
DETERMINATION OF INACTIVATION OF POLYPHENOL OXIDASE (PPO), PEROXIDASE (POD) AND CHANGES IN PHENOLIC COMPOUNDS IN APPLE
JUICE DURING THERMAL TREATMENT BY FTIR SPECTROSCOPY
ÖN SÖZ
Yüksek Lisans tez çalışmamın her aşamasında bana yol gösteren, araştırmamın gerçekleştirilmesi ve değerlendirilmesinde katkılarını esirgemeyen; bana her konuda destek olan ve bilimsel bir bakış açısı kazanmamı sağlayan değerli danışman hocam Sayın Dr. Öğr. Üyesi Hande BALTACIOĞLU’ na
Çalışmam sırasında öneri ve bakış açılarıyla önemli katkılarda bulunan Tez jürisinin değerli üyeleri Sayın Prof. Dr. Hasan USLU ve Sayın Doç. Dr. Erkan KARACABEY’e
Çalışmalarım sırasında bilgi ve deneyimini esirgemeyen sayın bölüm hocalarıma,
Tez için kullandığımız elmaları temin eden Mehmet Ali GÖK’e
Beraber çalışmaktan her zaman keyif aldığım, tez çalışmamın laboratuvar aşamasında yardımlarını esirgemeyen Yüksek Lisans öğrencisi Emine Melike ŞAHİN’e
Çalışmamın başından beri desteğini hiçbir zaman esirgemeyen ve sevgisiyle hep yanımda olan anneme ve tüm aileme teşekkürlerimi sunarım.
İÇİNDEKİLER DİZİNİ
2.2.1 Polifenol oksidaz (PPO) enzimi ... 6
2.2.2 Peroksidaz (POD) enzimi... 8
2.4.1 Fenolik asitler... 13
2.4.2 Flavonoidler ... 14
3.2.1 Isıl işlem uygulaması ... 25
3.2.2 Kalan polifenoloksidaz enzim aktivitesinin belirlenmesi... 26
2.3 Isıl İşlem Uygulamalarının Elma Suyunda PPO ve POD Enzimlerine Etkisi ... 10
2.4 Fenolik Maddeler ... 12
2.5 Fourier Dönüşüm Kızıl Ötesi (FTIR) Spektroskopisi... 15
2.6 Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi... 18
2.7 Isıl İşlem Uygulamasının Elma Suyundaki Fenolik Bileşikler ve Antioksidan Aktivite Üzerine Etkisi ... 22
BÖLÜM III ... 25
DENEYSEL ÇALIŞMALAR... 25
3.1 Materyal ... 25
3.2 Yöntem... 25
ÖZET ... iv
SUMMARY... v
ÖN SÖZ ... vi
İÇİNDEKİLER DİZİNİ ... vii
ÇİZELGELER DİZİNİ ... ix
ŞEKİLLER DİZİNİ ... x
SİMGE VE KISALTMALAR ... xi
BÖLÜM I... 1
GİRİŞ ... 1
BÖLÜM II ... 2
KAYNAK ARAŞTIRMASI ... 2
2.1 Elma ... 2
2.2 Enzim ... 5
3.2.3 Kalan peroksidaz enzim aktivitesinin belirlenmesi... 26
3.2.4 Toplam fenolik madde tayini ... 27
3.2.5 DPPH yöntemiyle antioksidan aktivite tayini ... 27
3.2.6 Fenolik madde değişiminin FTIR spektroskopisi kullanılarak belirlenmesi ... 28
3.2.7 HPLC yöntemi ile fenolik madde belirlenmesi... 28
3.2.8 Verilerin analizi ... 29
BÖLÜM IV... 30
BULGULAR VE TARTIŞMA ... 30
4.1 Isıl İşlem Sonrasında Elma Suyunda Kalan PPO Enzim Aktivitesi ... 30
4.2 Isıl İşlem Sonrasında Elma Suyunda Kalan POD Enzim Aktivitesi ... 32
4.3 Isıl İşlem İle Toplam Fenolik Maddeki Değişim... 34
4.4 Isıl İşlem İle Antioksidan Aktivitedeki Değişim ... 38
4.5 FTIR Çalışmaları ... 41
4.6 HPLC Çalışmaları... 44
BÖLÜM V ... 46
SONUÇLAR ... 46
KAYNAKLAR ... 48
EKLER... 57
ÖZ GEÇMİŞ ... 60
ÇİZELGELER DİZİNİ
Çizelge 2.1. Fenolik asitlerin sınıflandırılması ... 14
Çizelge 2.2. Flavonoidlerin sınıflandırılması ... 15
Çizelge 3.1. Gradient programı... 29
Çizelge 4.1. Isıl işlem süresince elde edilen EC50değerleri ... 39
Çizelge 4.2. HPLC ile belirlenen fenolik bileşikler ve miktarları ... 44
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 2.1. 2016-2017 yılında elma üretiminde önemli ülkeler ... 3
Şekil 2.2. 2010 yılında meyve suyuna işlenen meyve miktar dağılımı (%) ... 4
Şekil 2.3. Fenol halkası... 13
Şekil 4.1. Isıl işlem sonunda kalan PPO enzim aktivitesi... 31
Şekil 4.2. Isıl işlem sonunda kalan POD enzim aktivitesi ... 33
Şekil 4.3. Toplam fenolik madde standart eğrisi ... 35
Şekil 4.4. Isıl işlem süresince toplam fenolik madde miktarındaki değişim ... 36
Şekil 4.5. Isıl işlem süresince EC50değerindeki değişim ... 39
Şekil 4.6. Elma suyu örneklerinin FTIR spektrumları... 42
Şekil 4.7. Elma suyunun ayrıştırılmış FTIR spektrumları ... 43
SİMGE VE KISALTMALAR
Simgeler Açıklama
dak Dakika
° Derece
g Gram
kg Kilogram
ml Mililitre
mg Miligram
μg Mikrogram
μl Mikrolitre
C Santigrat
rpm Dakika devir sayısı
nm Nanometre
Kısaltmalar
DPPH
Açıklama
1,1-difenil-2-pikrilhidrazil
FC Folin-Ciocaltaeu
FTIR Fourier Dönüşüm Spektroskopisi
FW Taze Ağırlık
GAE Gallik Asit Eşdeğeri
HPLC Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi
MH Hafif Isı
PEF Vurgulu Elektrik Alan
POD Peroksidaz
PPO Polifenol Oksidaz
PLSR Kısmi En Küçük Kareler Regresyonu
VCEAC C Vitamini Antioksidan Kapasite Eşdeğeri
BÖLÜM I
GİRİŞ
Meyvelerin ve sebzelerin işlenmesinde gıda kalitesinin sağlanması için enzimlerin inaktive edilmesi oldukça önem taşımaktadır. Polifenol oksidaz (PPO) ve Peroksidaz (POD) kaynaklı enzimatik esmerleşmeye bağlı olarak meydana gelen renk değişimleri, meyve suyunda kaliteyi etkileyen önemli bir problem olarak görülmektedir.
Günümüzde meyve suyu üretiminde mikroorganizma ve enzimlerin inaktivasyonu için genellikle ısıl işlem kullanılmaktadır. Ancak, ısıl işlemler sırasında seçilen parametrelere göre gıdanın besinsel ve duyusal özellikleri olumsuz etkilenmektedir. Bu nedenle ısıl işlem ile enzim inaktivasyonu sağlanırken meyve sularında önemli bioaktif bileşenlerden olan fenolik bileşiklerin değişiminin de belirlenmesi önemlidir.
Yapılan bu çalışmada ülkemizde meyve suyu sektöründe en fazla üretilen elma suyuna, ısıl işlem uygulamasının etkisi incelenmiştir. Bu amaçla ısıl işlem uygulamasının meyve sularının kalitesini olumsuz etkileyen PPO ve POD enzimleri üzerine etkisi araştırılmıştır. Bu çalışmada ilk defa Red Chief elma çeşidine ısıl işlemin etkisi araştırılmıştır. Bununla birlikte ısıl işlem uygulamasının fenolik bileşikler üzerine etkisi belirlenmiştir. Bu amaçla toplam fenolik madde miktarı Folin-Ciocalteu yöntemiyle belirlenirken, antioksidan aktivite tayini DPPH yöntemiyle tespit edilmiştir. Ayrıca bireysel fenolik bileşiklerin ısıl işlem ile değişimi yaygın kullanılan HPLC yöntemiyle ve FTIR spektroskopisiyle belirlenmiştir.
Son yıllarda FTIR spektroskopisi meyve veya meyve suyu gibi çeşitli gıdalarda farklı kalite özelliklerini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. FTIR spektroskopisi fenolik bileşik gibi çeşitli biyoaktif bileşenlerin belirlenmesinde hızlı, ekonomik, güvenilir ve kolay bir metot olarak önem kazanmaya başlamıştır. Bu çalışma ile ısıl işlem uygulamasının hem PPO ve POD gibi enzimatik esmerleşmeden sorumlu enzimlere etkisi hem de fenolik bileşiklere etkisinin belirlenmesi amaçlanmıştır.
BÖLÜM II
KAYNAK ARAŞTIRMASI
2.1 Elma
Elma, Rosaceae familyasından olup Malus communis L. cinsindendir. Genel olarak, elmalar %85 su, %11 karbonhidrat, %2 diyet lif, %0,6 yağ, %0,5 organik asit ve %0,3 proteinden oluşur. Malik asit en fazla bulunan asittir, ayrıca fenolik asitler (kafeik ve klorojenik gibi) ve vitaminler de mevcuttur (Van der Sluis, 2005).
Elma, lezzetli ve ekonomik olması, kolay bulunabilmesi ve sağlık üzerine olumlu etkileri bakımından en çok tüketilen gıdalardan biridir. İnsan beslenmesinde monosakkaritlerin, minerallerin, diyet lifinin, çeşitli biyolojik aktif bileşiklerin, C vitamini ve doğal antioksidan olarak bilinen fenolik bileşenlerin kaynağıdır (Erdogan ve Demirci, 2014).
Ülkemizde sıklıkla tüketilen elmanın anavatanı Orta Asya ve Kafkasya olarak bilinmektedir. Türklerin yaşadıkları bölgelere göre elma “Alma” veya “Almıla” gibi farklı isimlendirilse de zamanla Türklerin hepsi elmaya ‘alma’ demişlerdir. Türkiyede ekolojik şartların uygunluğu nedeniyle Kuzey Anadolu, Karadeniz kıyı bölgesi ile İç Anadolu ve Doğu Anadolu bölgeleri elmanın önemli yetiştiricilik alanlarını oluşturmaktadır (Küçükkömürler ve Karakuş, 2009). Türkiye’de toplam elma üretiminin %20,4’ü Isparta’da gerçekleştirilirken, Isparta’yı Karaman (%13,6) ve Niğde (%12) illeri takip etmektedir (Anonim, 2018).
Dünyada toplam meyve üretiminin yaklaşık %12’sini oluşturan elma, muzdan sonra ikinci sırada yer alan önemli bir türdür. Aynı zamanda dünyada ticareti en fazla yapılan ve tüketici talebinin hızlı değişim gösterdiği meyvelerdendir. 2017 yılı verilerine göre dünya elma üretimi şekil 2.1.’de gösterilmektedir (Anonim, 2018).
Şekil 2.1. 2016-2017 yılında elma üretiminde önemli ülkeler (Anonim, 2018)
Türkiye, dünya elma üretiminde önemli ülkelerden biri olup ilk beş ülke arasında yer almaktadır (Anonim, 2018). Dünya’da elma çeşitlerinin sayısı 6500’ü aşmaktadır.
Ülkemizde ise bu sayı 460’ı bulmaktadır. Bunlar arasında kalite ve verim yönünden yüksek ve ticari anlamda yetiştiriciliği yapılanların sayısı çok azdır (Yıkar, 2003).
Elma kullanım alanına göre taze tüketimi içeren “sofralık” ve işlenerek tüketiciye sunulan “sanayi tipi” olmak üzere iki genel başlık altında toplanabilir. Sofralık elmalar taze piyasada tüketilenler ve ihracat pazarlarına sevk edilenler olarak ayrılırken; sanayi tipi elmalar meyve suyu, şarap, sirke, reçel, marmelat, dondurulmuş, kurutulmuş vs.
şeklinde sınıflandırılabilmektedir (Bulantekin ve Kuşçu, 2016).
Ülkemizde meyve suyu ve benzeri ürünlere işlenen başlıca meyveler elma, şeftali, kayısı, vişne ve portakaldır. Bunlar içerisinde meyve suyu üretiminde hammadde kaynağı olarak kullanılan elma, önemli üretim payına sahiptir (Anonim, 2011).
Türkiye’de 2010 yılında meyve suyuna işlenen meyvelerin miktar dağılımı Şekil 2.2’ de gösterilmektedir.
%62 ÇİN
% 18 AB
% 7 ABD
% 4 TÜRKİYE
% 3 HİNDİSTAN %6 DİĞER
Şekil 2.2. 2010 yılında meyve suyuna işlenen meyve miktar dağılımı (%) (Anonim, 2011)
Ülkemiz meyve suyu sanayisinde işlenen meyvelerde en büyük payı yaklaşık % 46 ile elma almaktadır. İkinci sırada yer alan şeftaliyi, son dönemde hızlı bir artış göstererek payını % 10’a çıkaran nar izlemektedir. Bunların ardından ise sırasıyla vişne, portakal ve kayısı gelmektedir (Anonim, 2011).
Elmada bulunan A, C ve E vitaminleri dışında fitokimyasal grubu içerisinde yer alan flavonoidler de antioksidan özellik taşımaktadır. Flavonoidler fenolik bileşikler olarak bilinen ve diyette yaygın olarak bulunan polifenollerdir (Işıksoluğu, 2001; Wardlaw vd., 2004).
Elmada yer alan bu maddelere bağlı olarak yapılan Epidemiyolojik çalışmalarda, elma tüketimine bağlı olarak astım, diyabet, kalp ve bazı kanser hastalık risklerinin azaldığı belirtilmiştir (Boyer ve Liu, 2004). Yapılan bir araştırmada, günde 110 g ve üzerinde elma yiyen erkeklerde, 18 g’ dan daha az elma yiyenlere göre kalp krizi riskinin % 49 oranında azaldığı görülmüştür (Hertog vd., 1993; Yınrog ve Foo, 2000). Zhao vd.
(2013) yaptıkları bir çalışmada günde bir elma tüketiminin koroner arter hastalığı,
% 46 Elma
%11 Şeftali
%10 Nar
%9 Vişne
%7 Portakal
%5 Limon
% 4 Kayısı
%3 Siyah Havuç
%2 Üzüm %1 Çilek %1 Ayva
% 1 Diğerleri
damar tıkanıklığı gibi damar hastalıklarına bağlı kan değerlerinde önemli etkide bulunduğunu ortaya koymuşlardır. Knekt vd., (2002) flavonoidlerin etkili antioksidan olması ve bazı kronik hastalıklara karşı koruyabilmesinden, Finlandiya’da 10.000 kişi üzerinde çalışma yapmışlar ve elma tüketimiyle Tip-2 diyabet hastalığı riskinin azaldığını gözlemlemişlerdir. Bu durum elma kabuğunda yüksek miktarda bulunan kuersetin alımı ile ilişkili bulunmuştur. Balasuriya ve Rupasinghe (2012) elma kabuğuyla yaptıkları araştırmada, kabukta bulunan polifenollerin hipertansiyona neden olan enzimi inhibe ederek yüksek tansiyonu önlediğini ortaya koymuşlardır. Gosse vd.
(2005) elmadaki prosiyanidinlerin kanser hücrelerine antagonistik etkide bulunduğu ve antitümör etki gösterdiğini in vivo çalışmayla tespit etmişlerdir.
2.2 Enzim
Enzimler bitkilerin metabolizması ve fizyolojisinde gerekli olan biyokatalizörlerdir.
Meyve ve sebzelerde, hasat sonrası çoğu enzim aktif kalmaktadır. Her ne kadar bu durum hasat sonrası depolama sırasında olgunlaşmanın gerçekleşmesi için istenirse de, renk, flavor, doku ve besin değeri gibi kalite özelliklerinde istenmeyen değişikliklere de yol açabilmekte ve ürünü dezavantajlı duruma getirmektedir.
Meyve ve sebzelerde kalitede renk değişimine katılan iki enzim meyveler için çok önemlidir. Bu enzimler PPO ve POD enzimleridir. Bu enzimler işleme sırasında renk değişimine neden olarak ürünün raf ömrünü kısaltmaktadır.
Meyve ve sebzelerde bulunan doğal enzimlerden işleme teknolojisi açısından en önemlisi kuşkusuz PPO enzimidir. Doğrama, parçalama, ezme gibi işlemler veya başka bir mekanik etki sonucu oluşan zedelenme yerlerinde rengin hızla esmerleşip kararması bu enzimlerin istenmeyen etkilerinin sonucudur. Meyve ve sebzelerin bazı ürünlere işlenmesinde sadece doğal enzimler rol oynamaz. Prosesin gereğine göre bazen ticari enzim preparatları kullanılmaktadır (Terefe vd., 2014).
2.2.1 Polifenol oksidaz (PPO) enzimi
PPO, Uluslararası Biyokimya Birliğinin sınıflandırılmasında monofenol monooksijenez (EC 1.14.18.1) ve kateşol oksidaz (EC 1.10.3.1) olarak yer almıştır. Monofenol oksidaza tirosinaz, fenolaz, monofenol oksidaz ve kresolaz gibi geleneksel isimler verilmiştir. Kateşol oksidaz ise difenol oksidaz, o-difenolaz, fenolaz, polifenoloksidaz ve tirosinaz olarak adlandırılmıştır. PPO’lar bakır içeren oksidoredüktazlardır.
Substratları fenolik bileşiklerdir. Substratlarını oksijen eşliğinde esmer renkli bileşiklere oksitlemektedirler. Bu olay gıda teknolojisinde “enzimatik esmerleşme” olarak bilinmektedir. Özellikle bitkiler âleminde yaygın olarak bulunan PPO’lar hayvansal dokular ve küf mantarlarında da bulunmaktadırlar (Önez, 2006). PPO pek çok reaksiyon katalizleyebilir. Bir monofenol olan p-kresolü, difenol 4-metil kateşole okside ederlerken, bir o-difenol olan kateşolü ise o-benzokinona parçalarlar. Bu olay gıda teknolojisinde enzimatik esmerleşme olarak da bilinmektedir.
Bakır içeren bir enzim olan PPO iki farklı reaksiyon katalizler:
i) monofenollerin o-difenollere hidroksilasyonu ii) o-difenollerin o-kinonlara dehidrojenasyonu
Bu aktivitelerden ilki monofenolaz (hidroksilaz veya kresolaz) ve ikincisi ise difenolaz (kateşolaz veya oksidaz) aktivitesi olarak adlandırılır. Her iki reaksiyonda da oksijen yardımcı substrat olarak kullanılır. Oluşan o-kinonlar daha sonra enzimatik olmayan reaksiyonlar sonucu kahverengi-siyah renkteki melanin pigmentlerine dönüşür. Bitki ve funguslardan elde edilen PPO’lar hem monofenolleri (p-kresol, tirosin gibi) hem de difenolleri (kateşol ve o-dihidroksifenilalanin gibi) okside ederler. Ancak, bu etki PPO’ın elde edildiği kaynağa göre değişkenlik gösterir (Önez, 2006).
PPO, bitki ve hayvan dokularında yaygın olarak görülen bir enzimdir. Bitkilerde tüm kısımlarda bulunabilirken, gelişmiş hayvanlarda deri, saç, tüy ve gözlerde bulunur.
PPO enzimleri bitkisel dokularda öncelikle latent (inaktif) formlar halinde sentezlenmekte ve zamanla çeşitli etkenlerle, örneğin dokuda doğal olarak bulunan proteazlar veya etilen gibi birtakım solunum metabolitlerince aktif hale getirilmektedirler (Cemeroğlu vd., 2001).
Bitkilerdeki PPO dağılımı, birçok araştırıcı tarafından incelenmiş ve son yıllarda farklı kaynaklardan da izole edilmiş ve üzerinde çalışmalar yapılmıştır. PPO aktivitesine rastlanan gıda ürünleri: buğday unu, makarna, enginar, biber, trabzon hurması, baklagil, kakao çekirdeği, soya, yabani pirinç, çilek, mantar, karidesler, ıstakoz ve yengeç bunlardan bazılarıdır. Bitkilerdeki PPO miktarı çeşit, kültürel işlemler, olgunluk ve yaşa bağlı olarak değişmektedir. Yapılan çalışmalarda en yüksek enzimatik aktivite üzüm kabuklarında, bazı elma kültürlerinde ve diğer bazı meyvelerde görülmüştür (Gökkaya, 2009).
Sağlıklı meyve ve sebze dokularında, PPO enzimlerinin, substratları olan fenolik bileşiklerle teması yok denecek kadar sınırlıdır. Bunun başlıca nedeni, enzim ve substratlarının bitkisel hücrenin farklı kısımlarında yer almalarıdır. PPO enzimlerinin bir kısmı sitoplazmada serbest halde bulunurken, büyük bir kısmı hücrenin tilakoid ve kloroplast gibi unsurlarında, membrana bağlı olarak bulunmaktadır. Buna karşın, fenolik bileşiklerin neredeyse tamamı vakuollerde yoğunlaşmış halde bulunmaktadır.
Örneğin elmalarda bulunan fenolik bileşiklerin % 97’ sinin vakuollerdeki hücre özsuyu içerisinde bulunduğu belirtilmektedir. Ancak doku olgunlaşmasının ileri aşamalarında hücredeki pektinazların faaliyetiyle, doku kontrollü ve sınırlı bir şekilde doğal olarak değişimlere uğrar. Ayrıca, hasat, taşıma ve işleme sırasındaki etkiler veya uygulanan çeşitli işlemlerle hücre ve buna bağlı olarak doku bütünlüğü bozulmaktadır. Böylece enzimler kendi subsratları olan fenolik bileşiklerle ve havadaki oksijenle bir araya gelerek birçok üründe istenmeyen esmerleşme reaksiyonlarına sebep olmaktadır. Bu durum ürünün işlenmesi sırasında önemlidir ve esmerleşme reaksiyonlarını önlemek için gerekli bazı tedbirler alınmalıdır (Cemeroğlu vd., 2001).
Meyve ve sebzelerde (özellikle meyve sularında) PPO’ları inaktive etmek için kullanılan en yaygın yöntem ısıl işlem uygulamalarıdır. Genel olarak, PPO’ ın 70-90 °C sıcaklıklara maruz kalması katalitik aktivitelerini yok eder, ancak inaktivasyon için gerekli olan zaman ürüne bağlıdır (Christiane vd., 2008).
Diğer önlemlerden biri ise kesilmiş meyve ve sebzelerde kahverengileşmeyi önlemek için askorbik asit, tiyol bileşikleri ve sülfitler gibi bazı bileşiklerin ilavesidir. Gıdaların esmerleşmesi, oksijenin uzaklaştırılması, asitlendirme, siklodekstrin ve
polivinilpirolidon gibi kompleks oluşturucu maddelerle fenollerin uzaklaştırılması ile önlenebilir (Önez, 2006).
Enzimatik esmerleşmeyi önleyici olarak kullanılan en etkin kimyasal hiç kuşkusuz ülkemizde de yaygın olarak kullanılan SO2’dir. Ancak, özellikle son yıllarda bu kimyasalın bazı astımatik reaksiyonlara neden olduğunun belirlenmesiyle, kullanımına FDA tarafından önemli sınırlamalar getirilmiştir. Bu nedenle, SO2’ye alternatif kimyasalların bulunması çalışmaları büyük bir yoğunluk kazanmıştır. Halen SO2 kadar etkin bir kimyasal bulunamamış olsa da, özellikle askorbik asit ve türevlerinin ısı uygulaması ve birtakım başka kimyasallarla kombine edilerek SO2’ye alternatif olarak kullanılması üzerinde durulmaktadır (Cemeroğlu vd., 2001).
2.2.2 Peroksidaz (POD) enzimi
POD’lar (EC 1.11.1.7), peroksidaz enzimlerinin de dâhil olduğu, büyük bir enzim sınıfı olan oksidoredüktazlar grubundan bir enzim topluluğudur. Yüksek yapılı bitkiler, hayvanlar ve mikroorganizmalarda bulunmaktadır. Özellikle bitkiler âleminde çok yaygındır ve bitkilerin gelişmesinde çok önemli rollere sahiptirler. Meyve ve sebzelerin işlenmesinde önemle dikkate alınan enzimlerden birisidir. Sebzeler, meyvelere göre daha fazla peroksidaz aktivitesine sahiptirler. Bitkisel dokularda kısmen stoplazmada çözünmüş formda, kısmen de hücre duvarına bağlı olarak çözünmez formda bulunan bu enzim peroksidasyon, hidroksilasyon veya oksidasyon reaksiyonlarını katalizleyebilir (Cemeroğlu vd., 2001).
POD’ların optimum sıcaklıkları ve optimum pH dereceleri, başta kökenine bağlı olarak çeşitli faktörlere göre değişmektedir. Örneğin optimum sıcaklığın patateslerde 55 °C, karnabaharda 35-40 °C olduğu belirtilmektedir. Aynı şekilde optimum pH derecesinin yeşil fasulye kökenli olanlarda 5,0 muz kökenli olanlarda ise 5,0-6,0 arasında değiştiği saptanmıştır (Cemeroğlu vd., 2001).
Peroksidazlar aşağıda verilen tipteki reaksiyonları katalize ederler;
POD
ROOH + AH2 H2O + ROH + A
Bu peroksidatik reaksiyonda;
R: H+, CH3, C2H5
AH2: İndirgenmiş formda hidrojen donörü A: Oksitlenmiş formda hidrojen donörü
Bu açıklamaya göre; POD enzimleri bir hidrojen donörü eşliğinde, peroksitleri parçalayan reaksiyonu katalize ederler. Şu halde temel substratı peroksitlerdir ve bunların başında hidrojen peroksit gelir. Yukarıda değinildiği gibi, metil veya etil hidrojen peroksit gibi organik peroksitler de substrat olarak kullanılmaktadır. Diğer taraftan çok sayıda çeşitli bileşikler hidrojen donörü olarak görev alabilmektedir. Bunlar arasında askorbat, fenoller, aminler veya benzer organik bileşikler sayılabilir. Donör substratlar arasında bulunan bazı maddeler bu enzim eşliğinde belirli amaçlarla kullanılabilmektedir. POD, hidrojen peroksit varlığında fenolik bileşiklerin oksidasyonunu katalizleyerek kahverengi bozunma ürünlerinin oluşumuna öncülük eder (Cemeroğlu vd., 2001).
POD enzimi yukarıda belirtilen ve başlıca aktivitesi olan “peroksisatif etki” yanında birtakım yan aktivitelere de sahiptir. Bunlardan en önemlisi hiç kuşkusuz H2O2olmadan da yürüyebilen “oksidatif etki” dir. Ancak bu defa O2ve Mn+2veya fenol gibi birtakım kofaktörlere ihtiyaç vardır. POD enzimi, H donörü bulunmayan ortamlarda adeta katalaz enzimi gibi davranarak hidrojen peroksitin su ve oksijene parçalanması reaksiyonunu da katalize edebilmektedir. Bu etki şekli ise “katalitik etki” olarak adlandırılmaktadır. Bu enzimin bir diğer ve sonuncu aktivitesi ise “hidroksilatif etki”
şeklidir. Bu etki yoluyla; O2 veya monofenolik bileşiklerden aynen polifenol oksidaz enzimlerinin yaptığı gibi difenolik bileşikler oluşturulmaktadır. Ancak farklı olarak POD enzimi hidroksilasyon yeteneğini gösterebilmek için bir hidrojen donörüne ihtiyaç duymaktadır (Cemeroğlu vd., 2001).
POD ısıya en dirençli enzim olması dolayısıyla, ısıl işlem sonucunda eğer inaktif olmuş ise diğer enzimlerin hepsinin inaktif olduğu düşünülmektedir. Bundan dolayı sebzelerin haşlanma yeterliliğinde POD enziminin inaktivasyonu bir kriterdir (Cemeroğlu vd., 2001). Isıya en direçli enzim olmasının yanında enzimin kökenine, bulunduğu meyve ve sebzeye göre direnci değişiklik gösterebilir. Örneğin, patates POD’ ı 95 °C’ de 10
dakikada tamamen inaktif olduğu halde, lahana kökenli olanlar 120 °C’ de 10 dakika sonunda başlangıç aktivitesinin %0,3’ ünü koruyabilmektedir (Bahçeci, 2003).
2.3 Isıl İşlem Uygulamalarının Elma Suyunda PPO ve POD Enzimlerine Etkisi
Meyve suyu üretiminde uygulanan işlemler sırasında enzimatik esmerleşmeye bağlı olarak meydana gelen renk değişimleri, meyve suyunda kaliteyi etkileyen önemli bir problem olarak görülmektedir. Gıdalarda renk kalitesini etkileyen en önemli enzim PPO ve POD enzimleridir. Moleküler oksijen ve PPO varlığında, doğal fenolik bileşikler okside olmakta ve daha sonra bu bileşikler enzimatik olmayan polimerizasyon ile kahverengi pigmentlere dönüşmektedir. Enzimatik esmerleşme, elma, kayısı, şeftali, armut, muz, üzüm, patates, kıvırcık salata ve mantarda belirgin şekilde görülmektedir (Cemeroğlu vd., 2001).
Gıdalarda kalite kayıplarına neden olan enzimleri inaktif hale getirmek için çeşitli yöntemler uygulanmaktadır. Isıl işlemler enzim inaktivasyonunda gıda endüstrisinde en yaygın kullanılan yöntemlerdir (Adams, 1991). Literatürde ısıl işlem uygulaması ile elma PPO ve POD inakitvasyonu üzerine çalışmalar bulunmaktadır. Doğal enzimler, farklı termal kararlılıklara sahip izoenzimlerden oluşabilmektedir. Bu nedenle farklı meyvelerde veya aynı meyvenin farklı çeşitlerinde inaktivasyon süreleri ve sıcaklıkları farklılık göstermektedir (Yemenicioğlu vd., 1997).
Yemenicioğlu vd. (1997), 6 farklı elma çeşidinden (Golden Delicious, Starking Delicious, Granny Smith, Gloster, Starcrimson ve Amasya) elde edilen PPO’ın ısıl paremetlerini belirlemek için üç farklı sıcaklık (68, 73, 78 °C) kullanmışlardır. 78 °C’
de Amasya elması PPO’ ı ısıya en dirençsiz enzim olup, Starking Delicious çeşidi PPO’
ı ısıya karşı en dirençli enzim olarak bulunmuştur. Isıl inaktivasyon kinetiği birinci dereceden bulunmuştur. Hız sabitleri 78 °C’ de 15,99-28,27 x 10-2/dak, aktivasyon enerjisi 54,7-77,2 kcal/mol, z değeri 7,1-10,0 °C arasında değişmektedir. Elmadan elde edilen PPO’ ın diğer meyvelerden elde edilene göre ısıya karşı daha dirençli olduğu bildirilmiştir.
Krapfenbauer vd. (2006), sekiz farklı elma çeşidinden üretilen elma sularına (Florina, Gala, Golden Delicious, Idared, Jonagold, Pilot, Pinova ve Topaz) yüksek sıcaklıkta
(60-90 °C) ve kısa süreli (20-100 s) (HTST) ısıl işlem uygulamışlardır. Isıtma koşullarının elma sularında enzimatik esmerleşme ve serum ayrılması üzerindeki etkisini belirlemek için, PPO ve pektinesteraz aktivitesi analiz edilmiştir. Bu sonuçlara göre 60 °C’ de, PPO aktivitesinde önemli bir azalma olmamıştır. Ancak 20, 50 ve 100 s ısıtma süresinden sonra 70 °C’ de enzim aktivitesinde önemli bir azalma olduğu belirlenirken, ısıtma süresi arasında bir fark gözlenmemiştir. PPO enzimi 80 °C’ de tamamen inaktive olurken, pektinesteraz enziminin aktivitesinin yarıya düştüğü ve 90
°C’ de bile tamamen inaktivasyon sağlanamadığı belirlenmiştir. Ayrıca en yüksek PPO aktivitesi Idared ve Florina cinsi elmalardan üretilen meyve suyunda bulunmuştur.
3 farklı elma çeşidinde (Red Fuji, Granny Smith ve Golden Delicious) PPO enziminin membrana bağlı formunun ısıl stabilitesinin belirlendiği bir çalışmada, Granny Smith PPO enzimi 25-45 °C sıcaklık aralığında üç çeşit arasında en fazla ısıya dayanıklı enzim iken, Red Fuji PPO enziminin 65 °C’ de en çok stabil kalan enzim olduğu belirlenmiştir (Liu vd., 2017).
Yi vd. (2017), yüksek basınçlı işlem (HPP; 600 MPa, 3 dak) ile ısıl işlemin (85 °C, 5 dk) meyve suyu kalitesine (renk, şekerler, asitler ve enzimler) etkilerini incelemişlerdir.
Bu çalışma için kullanılan elma çeşileri; Pink Lady, Granny Smith ve Jonagold olarak seçilmiştir. HPP ile doğal elma suyu renginin ısıl işleme kıyasla daha iyi bir şekilde kaldığı belirlenmiştir. Şeker ve organik asitler, HPP ve ısıl işlemden sonra oldukça stabil kalmıştır. Üç elma çeşidi arasında Pink Lady en yüksek şeker/asit oranını gösterirken Granny Smith en düşük şeker/asit oranını göstermiştir. Bununla birlikte, PPO ve POD enzimi ısıl işlem ile tamamen inaktif hale getirilirken, PPO ve POD basınca dayanıklı bulunmuş ve HPP’den sonra kalan aktivite (>% 50) tespit edilmiştir.
Niu vd. (2010), yaptıkları bir çalışmada hafif ısı (MH) ile işlem görmüş elma dilimlerinden elde edilen bulanık elma sularının kalitesi değerlendirilmiştir. MH işlemi ise sırasıyla 25, 35, 45, 55 ve 65 °C’ de 20 dakikada su banyosunda gerçekleştirilmiştir.
Bulanık elma suyunda 55 °C’ de hafif ısı uygulaması ile PPO enziminin minimum kalıntı aktivitesi % 66,4 iken, 65 °C ise % 38,6 bulunmuştur.
Yapılan başka bir çalışmada, Royal Gala cinsi elmadan elde edilen meyve suyuna
kV/cm, 60 darbe, 169 µs işlem süresi, 53.8 °C) ve ısıl işlem (75 °C, 20 dakika) uygulanmış ve işlem görmüş meyve suları 30 gün boyunca 3 °C ve 20 °C’de depolanmıştır. Royal Gala elma suyu TS ve PEF işlemlerinden sonra sırasıyla kalan PPO aktivitesi %14,9 ile %17,7 oranında belirlenmiştir. Ancak ısıl işlemden sonra kalan PPO aktivitesi %3,2 oranında bulunmuştur. TS ve ısıl işlem görmüş numuneler için depolama sırasında PPO aktivitesinde önemli bir değişiklik (p <0,05) kaydedilmemiştir. PEF ile muamele edilmiş meyve suyu için, PPO aktivitesi 3°C ve 20
°C’ de depolama sırasında kademeli olarak % 17,7’ den 11,5–13,5’ e düşmüştür (Sulaiman vd., 2016).
Dubey vd. (2006), yaptıkları bir çalışmada hint elması çeşitleri olan Golden delicious (HP), Golden delicious (JK), Red delicious ve Royal delicious kullanmıştır. Pulp haline getirilen elmalar tülbentle süzülüp 15 dk sanrifüj edilmiştir. Uygulanan ısıl işlem parametreleri 40, 50, 60 ve 70 °C’de 5, 10, 15, 20, 25 ve 30 dakikadır. Golden HP ve Red delicious cinsinde POD enzimi 70 °C’ de 10 dakika sonunda inaktif olurken, Golden JK ve Royal delicious 70 °C de 5 dakika sonunda inaktif olmuştur. Royal cinsinde 50 °C’ 10 ve 25 dk ısıl işlem sonrasında enzim aktivasyonunda belli oranda artış görülmüştür. Aynı şekilde Red delicious cinsinde 50 °C’ de 25 dakikada enzim aktivasyonunda artış belirlenmiştir.
Riener vd. (2007), elma suyuna geleneksel pastörizasyon (72°C, 26 sn) uygulayarak POD ve PPO inaktivasyonu üzerindeki etkilerini araştırmışlardır. Çalışmada Jonagold Red cinsi elmalar kullanılmıştır. Pastörizasyon sonunda POD’ ın kalıntı aktivitesi % 52 ve PPO’ ın ise % 54 olarak belirlenmiştir.
2.4 Fenolik Maddeler
Fenolik bileşikler bitkiler tarafından sentezlenen ikincil metobolitlerdir (Karadeniz ve Ekşi, 2001). Bu bileşikler genellikle bitkilerin yaprak, çiçek, meyve gibi dokularında glikozitler şeklinde, odunsu dokularında aglikonlar şeklinde, çekirdeklerinde ise her iki formda bulunabilmektedir (Shahidi ve Naczk, 1995). Fenolik bileşikler yapılarında bir veya birden fazla hidroksil grubu içeren bir aromatik halkaya sahip olmakta ve bitkiler aleminde en yaygın bulunan maddeler grubunu oluşturmaktadır. Doğal kaynaklardan, 8000’den fazla fenolik bileşik izole edilmiştir (Luthria, 2008). Fenolik bileşikler daha
yaygın ismiyle polifenoller, benzen halkası içeren maddelerdir. Bilindiği gibi hidroksi benzen çoğunlukla “fenol” adı ile anılmaktadır. Buna göre en basit fenolik bileşik, bir tane hidroksil grubu içeren benzendir ve fenol olarak isimlendirilmektedir. Diğer tüm fenolik maddeler bunlardan türemişlerdir (Cemeroğlu vd., 2001). Şekil 2.3’ de fenol halkası gösterilmiştir.
Şekil 2.3. Fenol halkası
Fenolik bileşikler bitkiler aleminde çok yaygındır, birçok meyve ve sebzede bulunmaktadır. Meyveler, sebzelere oranla daha yüksek fenolik bileşik içermektedir.
Ayrıca fenolik bileşikler; insan sağlığı açısından olumlu etkileri, meyve sebzelerin kendine özgü renklerinin ve lezzetinin oluşmasında katkıda bulunmaları, gibi birçok açıdan önem taşımaktadır (Cemeroğlu vd., 2001). Fenolik bileşikler fenolik asitler ve flavonoidler olarak iki gruba ayrılmaktadırlar (Karadeniz ve Ekşi, 2001).
2.4.1 Fenolik Asitler
Fenolik asitler, genel olarak serbest halde bulunmamaktadır. Fenolik asitlerin, fenolik hidroksil grupları da çok aktif olup, şekerlerle bileşerek glikozitleri oluşturmaktadırlar (Cemeroğlu vd., 2001). Fenolik asitlerin meyvelerdeki miktarları olgunluk durumuna ve depolama süresine göre değişmektedir. Fenolik asitlerin sınıflandırılması Çizelge 2.1’
de gösterilmektedir.
Çizelge 2.1. Fenolik asitlerin sınıflandırılması (Karadeniz ve Ekşi, 2001) A. Fenolik Asitler
Grup adı Başlıcaları
A.1. Hidroksisinamik asitler
o-Kumarik asit p-Kumarik asit
Kafeik asit Ferulik asit
izoferulik asit Sinapik asit
A.2. Hidroksibenzoik asitler
m-hidroksibenzoik asit p-hidroksibenzoik asit o- hidrobenzoik asit β-Rezorsilik asit
Sirinjik asit Gentisik asit Vanillik asit İzovanilikasit
A.3. Hidrosisinnamik asit
Klorojenik asit Neoklorojenik asit Kutarik asit Kriptoklorojenik asit İzoklorojenik asit p- Kumaroilquinik asit
Kaftarik asit
Hidroksisinamik asitler ise C6-C3 fenilpropan yapısındadırlar. Fenilpropan halkasına bağlanan OH grubunun konumu ve yapısına göre farklı özellik gösterirler (Bravo, 1998). Hidroksibenzoik asitler C6-C1 fenilmetan yapısına sahipirler. Bitkisel gıdaların yapısında genellikle iz miktarlarda (10 ppm kadar) bulunur veya hiç bulunmayabilirler (Cemeroğlu vd., 2001).
2.4.2 Flavonoidler
Bikilerden elde edilen ve genellikle sarı renkli olmaları nedeniyle latince ‘sarı’ anlamına gelen ‘flavus’ sözcüğünden türetilerek “flavonoid” adını almışlardır (Kahraman vd., 2002). Flavonoidler, 15 karbon atomu içeren, difenilpropan (C6-C3-C6) yapısındadır.
Flavonoidlerin yapısındaki OH grupları, reaktif özelliklerinden dolayı kolaylıkla glikozitlenir (Nizamlıoğlu ve Nas 2010). Çizelge 2.2’de flavonoidlerin sınıflandırılması gösterilmişir.
Çizelge 1.2. Flavonoidlerin sınıflandırılması (Karadeniz ve Ekşi, 2001)
B. Flavonoidler
Grup adı Başlıcaları
B.1. Antosiyanidinler
Pelergoidin Siyenidin
Petunidin Delfinidin
Malvidin Peonidin
B.2. Kateşinler (+)-Kateşin (-)-Epikateşin
(+)-Gellokateşin (-)-Epigallokateşin B.3. Lökoantosiyanidinler Lökoantosiyanidin Lökoantodelfrinidin
B.4. Flavonoller Kamferol Kuersetin
Mirisetin İzoramnetin
B.5. Flavonlar Apigenin Luteolin
B.6. Flavononlar Narincenin Hesperitin
Eriyodiktol İzosekuranetin
B.7.Prosiyanidinler Prosiyanidin dimer P. Oligomer
P.polimer
B.8. Dihidrokalkonlar Floridzin Floretin
Flavonoidler gıdalarda en yaygın bulunan polifenollerdir. Bugüne kadar en az 5000 tane fenolik madde tanımlanmış olup bunların 2000’ den fazlası doğal flavonoidlerdir.
(Shahidi ve Naczk, 1995). Flavonoidlerin serbest radikalleri yakalama, demir ve bakır gibi minerallerle şelat yapma, damar sertliğini önleme gibi antioksidan özellikleri vardır (Okçu ve Keleş 2009).
2.5 Fourier Dönüşüm Kızıl Ötesi (FTIR) Spektroskopisi
Son yıllarda çok popüler hale gelen tekniklerden biri de FTIR spektroskopisidir. FTIR spektroskopisi fenolik bileşikler gibi çeşitli biyoaktif bileşenlerin belirlenmesinde hızlı, ekonomik, güvenilir ve kolay bir metot olarak yaygın bir şekilde kullanılmaya başlanmıştır. FTIR spektroskopisi bir titreşim spektroskopisi tekniğidir ve moleküllerin döndükleri ve titreştikleri frekanslara bağlı olarak özel ayrık enerji seviyelerine sahip olmaları prensibine dayanmaktadır. Bu yöntem nispeten düşük maliyeti ile kısa ölçüm
süresine sahiptir. FTIR spektroskopisinin fenolik bileşiklerin belirlenmesinde kullanımı üzerine çalışmalarda artış gözlenmektedir (Ricci vd., 2015).
FTIR spektroskopisi, hızlı ve hassas sonuç vermesi, kullanım kolaylığı, tecrübeye ihtiyaç duymaması, örneğe zarar vermemesi, küçük miktar örnek ile bile sonuç verebilmesi, boyama-işaretleme gibi ek madde veya kimyasal kullanımına gerek duymaması, maliyet ve zaman tasarrufu açısından diğer yöntemlere göre büyük üstünlük sağlaması gibi avantajları nedeniyle tercih edilmektedir (Ertugay ve Başlar, 2011).
FTIR spektroskopisi karbonhidratlar, proteinler, yağ asitleri, nükleik asitler ve polisakkaritler gibi birçok kimyasal bileşiklerin belirlenmesi ve yapılarının aydınlatılması için kullanılan yöntemlerden biridir (Çırak, 2017).
FTIR spektroskopisi, matematiksel Fourier dönüşümü ile ışığın kızılötesi yoğunluğuna karşı dalga sayısının ölçümünü esas alan analitik bir metottur. Kızılötesi bölge yakın, orta ve uzak olmak üzere 3’e ayrılmaktadır. Yakın dalga boylu kızılötesi (NIR);
14.000 cm-1ile 4.000 cm-1, orta dalga boylu kızılötesi (MIR); 400 cm-1ile 4.000 cm-1ve uzak dalga boylu kızılötesi (FIR); 40 cm-1ile 400 cm-1arasındadır (Stuart, 2004).
Gıdalarda bulunan kimyasal bağların gerilme, büzülme ve bükülme gibi titreşimsel hareketleri sayesinde kızılötesi ışın absorbe edilmektedir. Bu titreşimsel hareketler ve absorbsiyon sebebi ile spektral pikler meydana gelmektedir (Çırak, 2017). Kimyasal analizler genelde MIR da yapılır (Stuart 1997).
Bueneo vd. (2017), şarabın fenolik içeriğinin, esas olarak üzümde bulunan fenolik bileşiklerin miktarına bağlı olduğunu ve üzüm kabuğundaki fenoliklerin ekstrakte edilebilirliğini belirlemede FTIR spektroskopisiden yararlandıklarını söylemişlerdir.
Ragupathi vd. (2011), yaptıkları bir çalışmada Hindistan’ın Mannar Körfezi altındaki deniz yosunlarının polifenol içeriğini ölçmek için FTIR spektroskopisi tekniğini kullanıp fenolik bileşikler hakkında temel bilgileri ortaya koymuştur. Fenolik bileşik standartlarına karşılık gelen FTIR spektrumları dalga boyu gallik asit için 669, 763, 1025, 1100 ve 1627 cm-1, vanilin için 668, 1498, 1534, 1617, 1654 ve 3392 cm-1, tannik
asit için 669, 860, 1172, 1511 ve 1627 cm-1ve p-kumarik asit için 669, 1124, 1171 cm-1 olarak belirlenmiştir. Buna göre deniz yosunları ekstraktları için belirlenen bantların p- kumarik asit bantları ile uyumlu bulunduğu belirlenmiştir.
Lu vd. (2011), dört soğan çeşidinin (kırmızı, beyaz, sarı ve tatlı) ve arpacık soğanının toplam fenolik içeriği (TPC) ve toplam antioksidan kapasitesini (TAC), FTIR spektroskopisi (4000–400 cm-1) kullanarak belirlemişlerdir. Aynı zamanda TPC’yi ölçmek için Folin Ciocalteu (FC) deneyi, antioksidan aktivite ise; (DPPH) metodu, Trolox eşdeğer antioksidan kapasitesi (TEAC) deneyi ve ferrik indirgeyici antioksidan güç (FRAP) gibi geleneksel yöntemleri kullanmışlardır. Örneklerin TPC ve TAC tahmin etmek için en küçük kısmi kareler (PLS) yöntemi uygulanmıştır. 1800-750 cm-1 dalga sayıları arasındaki bantlar (parmak izi bölgeleri) biyokimyasal bileşimleri, özellikle karbonhidrat, lipit, protein sekonder yapılarını ve bitkilerin polifenol kısımlarını yansıttığını ifade etmişlerdir. 1618 cm-1 dalga sayısındaki belirgin tepe, C-C uzaması polifenolik bileşenlerde yüksek seviyelerde bulunan fenil halkasını ifade eder.
FTIR spektroskopisi ile TAC ve TPC’nin tahmini değerleri, TEAC, FRAP, DPPH ve FC analizleriyle ölçülen referans değerleri ile iyi korelasyon katsayıları (r > 0.95) vermiştir. Genel olarak, FTIR spektroskopisinin çeşitli soğanların ve arpacık soğanının antioksidan kapasitesini, geleneksel kimyasal analizlerde elde edilene benzer bir hassasiyetle tahmin etmek için kullanılabileceği ifade edilmiştir.
Tahir vd. (2017), yaptıkları bir çalışmada baldaki fenolik bileşiklerin ve antioksidan aktivitenin belirlenmesi için, FTIR-ATR ve Raman spektroskopisi kısmi en küçük kareler regresyonu (PLSR) ile kombine olarak incelenmiştir. FTIR sonucuna göre 1700- 1600 cm-1arasında yer alan bantlar, karbonil gruplarının C-O ve C-C germe hareketine bağlanmış ve bu bölge fenolik moleküllerle ilişkilendirilmiştir. FTIR-ATR ve Raman spektroskopisinin, baldaki fenolik bileşikleri ve antioksidan etkinlikleri ölçmek için basit, hızlı ve tahribatsız yöntemler olduğunu göstermiştir.
Okur vd. (2019), yaptıkları çalışmada vişne posasından fenolik bileşiklerin ekstraksiyonu için mikrodalga destekli ekstraksiyon (MAE) (30, 60 ve 90 sn için 900 W), yüksek hidrostatik basınç (HHP) (20 °C’de 1, 5 ve 10 dakika için 400 ve 500 MPa) ve ultrasonik destekli ekstraksiyon (UAE) (% 100 güç, 5, 10 ve 15 dakika için) gibi yeni
spektrometresi kullanmışlardır. FTIR sonuçlarına göre, farklı ekstraksiyon teknikleri uygulandığında fenolik bileşiklerin kimyasal yapılarında önemli bir yapısal değişiklikler görülmemiştir. 1800 - 750 cm-1 (parmak izi bölgeleri) dalga sayıları arasında pozitif olarak bulunan bantlar, bitkilerde bulunan polifenollerle ilgilidir. Aromatik halkanın C- H germe titreşimleri sonucu bant 3000–3300 cm-1’den 2800 cm-1’e kadar uzayabildiği belirlenmiştir. 1730 cm-1 civarında bir bant, karbonil grubunun germe titreşimine bağlanmış ve sadece hidrolize edilebilir tanenler için mevcut denilmişir. 1500–1150 cm-1 aralığı CH (fenoller) ve OH deformasyon titreşimlerinden kaynaklanan absorpsiyonları içerir. 1014 cm-1de bulunan bant ise, piran halkasının OH ikame edicisi için uzanan C = O esnemesini ifade eder ve epikateşin ile ilişkilendirilmiştir.
2.6 Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi
Fenolik maddeleri belirlemek için birçok farklı yöntem geliştirilmiştir. Elma ve elma sularında toplam fenolik içeriği geniş bir aralıkta değişkenlik gösterir. Elma ve elma sularında fenolik bileşiklerin belirlenmesinde genellikle HPLC (high performance liquid chromatography, yüksek performanslı sıvı kromatografisi) kullanılmaktadır (Biedrzycka ve Amarowicz 2008). Polifenolik bileşiklerin tanımlanma işlemi, kolonda alıkonulma sürelerine göre gerçekleşmektedir (Gökşen, 2012).
Genel olarak kromatografi biri sabit diğeri hareketli faz olmak üzere birbiriyle karışmayan iki fazlı bir sistemde ayrılması ve saflaştırılmasıdır. Çeşitli maddelerin hareketli faz yardımıyla, sabit faz üzerinde, farklı hızlarla hareket etmeleri prensibine dayanmaktadır. Hareketli faz, sabit faz üzerinde sürüklenerek örnek bileşenlerinin ayrılmasını sağlar. HPLC birimleri; hareketli (taşırıcı) faz, pompa, enjektör, kolon, dedektör ve verileri kaydeden bilgisayardan oluşmaktadır. HPLC pompası, sistemde mobil fazın enjektör, kolon ve dedektör boyunca sürekli sabit akışını sağlayan sıvı kromatografinin önemli kısımlarından biridir. Kromatografik süreç, numunenin kolona enjeksiyon edilmesiyle başlar. Numune bileşenlerinin ayrılması kolon kısmında gerçekleşmektedir. Dedektör, cihazdan geçen bir maddenin varlığını tespit ederek bilgisayar ekranına bununla ilgili sinyal gönderen bölümdür. HPLC’ de kullanılan dedektör tiplerinden bazıları UV (ultraviyole), RI (refraktif indeks), FD (flüoresan detektör), MS (mass spektrofotometri)’ dir (Akkaya, 2016).
Kalinowska vd. (2014), yaptıkları bir çalışmada, elmada bulunan fenolik bileşiklerle ilgili bilgileri derleme olarak özetlemişlerdir. Literatürde daha çok elmaların kabuk kısımlarıyla ilgili çalışmalar olduğunu ifade etmişlerdir. Genel olarak, elma kabuğu ete göre toplam fenolik bileşikler açısından daha zengindir ancak bazı bireysel fenolik bileşiklerin elma çeşidine bağlı olarak ette kabuktan daha fazla bulunduğu ifade edilmiştir. Bu çalışmalardan bazılarında elmada bulunan fenoliklerden klorojenik asit Idared cinsinde kabuk kısmında 7,15 mg/100 g YA bulunurken, meyve eti kısmında 11,69 mg/100 g YA, Golden Delicious kabuk kısmında 17-37g mg/kg YA, meyve etinde 29-57 mg/kg YA, Granny Smith kabukta 6-60g mg/kg YA, etinde 28-71 mg/kg YA olarak belirlenmiştir. Kateşin için Golden Delicious cinsinde kabuk kısmında 66- 164 mg/kg YA, 28-49 mg/kg YA, Granny Smith kabuk kısmında 374-486 mg/kg YA, meyve etinde 136-182 mg/kg olarak belirlenmiştir. Epikateşin için Fuji cinsinin kabuk kısmında 2,5 ± 0,14 mg/100g YA, meyve etinde 0,37 ± 0,015 mg/100g YA, Elstar cinsinde kabukta 4,2 ± 0,07 mg/100g YA, meyve etinde 0,7 ± 0,04 mg/100g YA olarak belirlendiği söylenmiştir.
McGhie vd. (2005), yaptıkları çalışmada farklı coğrafi bölgeden tedarik edilen Yeni Zelanda’da ticari olarak yetiştirilen 10 farklı elma çeşidinde polifenol konsantrasyonunu HPLC kullanarak ölçmüştür. Tespit edilen flavonoller (kuersetin türevleri), sinamik asitler (klorojenik asit), dihidrokolik (floridzin); flavanoller (kateşin ve epikateşin), antosiyaninler (siyanidin 3-galaktosit) ve prosiyanidinlerdir. Elma etinde bulunan toplam fenolikler 1089- 337 µg/g YA aralığındadır. Bütün elmadaki toplam fenolik ise 263,1- 97,7 mg/elma olarak hesaplanmıştır.
Türkiye’de yetiştirilen bazı elma çeşitlerinin başlıca fenolik bileşikler HPLC ile incelenmiştir. Elma türlerindeki meyve eti ve kabuk kısımları homojen şekilde ayrılmış,
%70 metanolle ekstrakte edilmiş ve elde edilen elma suları seyreltilerek kullanılmıştır.
HPLC analizleri sonucuna göre elma sularında kateşin (9,09-115,30 mg/l), klorojenik asit (41,10-276,3 mg/l), epikateşin (3,38-6,76 mg/l), kafeik asit (3,04-79,09 mg/l) ve floridzin (0,52-20,13 mg/l) tespit edilmiştir (Karaman, 2008).
Pearson vd. (1999), yaptıkları bir çalışmada 6 farklı ticari elma suyunun ve Red Delisious cinsi elmanın toplam fenolik madde miktarını ve fenolik bileşimini HPLC ile
belirlenmiştir. Bütün bir elmada 482,4 mg/l iken, kabuk kısmında 2075,6 mg/l bulunmuştur. Ticari elma suyundaki fenolik bileşenlerden kateşin (33,8-7,6 mg/l), klorojenik asit (58,3-17,0 mg/l) ve rutin (7,8-1,1 mg/l) aralığında belirlenmiştir. Red Delisious cinsi elmadaki kateşin miktarı (228,2 mg/l), klorojenik asit miktarı (66,6 mg/l) ve rutin miktarı (20,7 mg/l) olarak belirlenirken, kabuk kısmındaki miktarlar sırasıyla (654,3-74,3- 222,4 mg/l ) olarak belirlenmiştir.
Karadeniz vd. (2001), 3 farklı çeşitten ve (Amasya, Golden, Starking) 5 farklı yöreden ardarda 3 yılda temin edilen elmalardan hazırlanan 45 elma suyu örneğinde fenolik madde kompozisyonunu araştırmışlardır. Elmalar yıkama, ayıklama, presleme ve filtrasyon gibi işlemlerden sonra şişelenip 97 °C sıcaklıkta 20 dakika pastörize edilmiş ve hemen 20 °C’ye soğutulmuştur. Fenolik bileşiklerin kantitatif analizi için yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) kullanılmıştır. Bulgulara göre elma suyunda konsantrasyonu en yüksek fenolik bileşik klorojenik asittir (62,3-342,6 mg/l). Bunu epikateşin (5,3- 240,1 mg/l), floretinglikozit (5,5-60,0 mg/l), floridzin (6,9-29,7 mg/l) ve p-kumarik asit (1,1-16,0 mg/l) izlemektedir. Elma suyunda fenolik madde miktarı öncelikle meyve çeşidine bağlı olarak değişmektedir. Fenolik madde miktarı en çok Amasya çeşidinde olup, bunu Starking izlemektedir. Golden ise, floretin glikozit hariç fenolik bileşik miktarı en düşük elma çeşididir. Yetişme yılına göre de elma suyundaki fenolik madde miktarı değişmektedir. Fenoliklerden klorojenik asit 1991 yılı örneklerinde daha yüksektir (197,7 mg/l). Bunu 180,7 mg/l ile 1992 ve 164,3 mg/l ile 1990 yılı örnekleri izlemektedir. Elma suyundaki fenolik madde kompozisyonu çeşit ve yıldan önemli düzeyde etkilenmekteyken, yöreden etkilenmemektedir.
Markowski ve Płocharski (2005), elmalardaki fenolik bileşiklerin içeriğini belirlemek ve işlenmiş ürünlerini değerlendirmek amacıyla Jonagold, Sampion, Idared ve Topaz cinsi elmaları kullanmışlardır. Elmaların fenolik bileşik içeriği, HPLC ile belirlenmiştir.
Berrak elma suları üretimi, 50 °C’ de Panzym MK ile veya 20 °C’ de Rohapect MA Plus ile enzimatik olarak gerçekleşmiştir. Meyveler de en yüksek fenolik asit içeriği Idared (346 mg/kg) cinsinde bulunmuştur. En yüksek miktarda kuersetin glikozit içeriği Jonagold (87 mg/kg ) ve Topaz (83 mg/kg) cinslerindedir. Berrak meyve suları üretimi sırasında fenolik kayıplarının çok yüksek olduğu bulunmuştur. Panzym MK ile üretilen berrak meyve sularının, toplam fenolik içeriği başlangıca göre % 40 oranında bulunurken, Rohapect MA Plus ile üretilen berrak meyve sularının, toplam fenolik
içeriği başlangıca göre % 20 oranında bulunmuştur. Berrak suların üretimi sırasında sıcaklığın fenolik içerik üzerinde güçlü bir etkisi olduğu ifade edilmiştir.
Lee vd. (2003), yaptıkları bir çalışmada altı elma çeşidinin ana fenolik fitokimyasalları tanımlanmış ve bunların toplam antioksidan aktivitesine katkıları belirlenmiştir.
Antioksidan aktivite 2,2′-azinobis (3-etilbenzotiyazolin-6-sülfonik asit) radikal süpürücü kullanılarak belirlenmiş ve C vitamini antioksidan kapasite eşdeğeri (VCEAC) olarak ifade edilmiştir. Altı elmadaki majör fenolik ve C vitamini konsantrasyonları aşağıdaki gibidir (mg/100g taze elma ağırlığı): kuersetin glikozitler, 13.20; prosiyanidin B2, 9,35; klorojenik asit, 9,02; epikateşin, 8,65; floretin glikozitler, 5,59; C vitamini, 12,80. Bu bileşiklerin nispi VCEAC değerleri, kuersetin (3,06)> epikateşin (2,67)>
prosiyanidin B2 (2,36)> floretin (1,63)> C vitamini (1,00)> klorojenik asit (0,97) olarak belirlenmiştir. Bu nedenle, ana fenoliklerin ve C vitamininin 100 g taze elmanın toplam antioksidan kapasitesine tahmini katkısı: kuersetin (40,39 VCEAC)> epikateşin (23,10)> prosiyanidin B2 (22,07)> C vitamini (12,80)> floretin (9,11)> klorojenik asit (8,75) olarak sıralanmıştır. Sonuca göre kuersetin, epikateşin ve prosiyanidin B2 gibi flavonoidlerin, elmaların toplam antioksidan aktivitesine C vitamininden daha fazla katkıda bulunduğu belirlenmiştir.
Erzincan yerli elması olan Ak Sakı ve Kara Sakı elma çeşitlerinin meyvelerinin kimyasal bileşimi belirlenmiştir. Bu elmalar liyofilizatörde -50°C’ de 24-36 saat süreyle dondurularak kurutulmuştur. Kurutulan elmalarda (tüm meyve, meyve eti ve kabuk) fenolik bileşiklerin tanımlanması ve miktarlarının belirlenmesinde HPLC kullanılmıştır.
Elmaların toplam fenolik madde miktarını belirlemede Folin-Ciocalteu yöntemi kullanılmış, değerler 25,00-11,63 mg GAE/g kuru madde aralığında bulunmuştur. En yüksek toplam fenolik madde miktarı, Kara Sakı elmasının kabuğunda, en düşük toplam fenolik madde miktarı Ak Sakı elmasının meyve etinde tespit edilmiştir. Elma çeşitleri, ferulik asit ve hidroksisinnamik asit bakımından anlamlı farklılık göstermiştir (p<0,001). Epikateşin en fazla Kara Sakı elmasının kabuğunda, p-kumarik asit en az Kara Sakı elmasının meyve etinde bulunmuştur. Hidroksisinnamik asit, Ak Sakı ve Kara Sakı elma çeşitlerinin sadece kabuklarında tespit edilmiştir. Sakı elmasının her iki çeşidinin kabuklarında bulunan toplam fenolik madde ve fenolik bileşikler, elma etine ve meyvesine göre daha fazla olduğu belirlenmiştir (Gökşen, 2012).
2.7 Isıl İşlem Uygulamasının Elma Suyundaki Fenolik Bileşikler ve Antioksidan Aktivite Üzerine Etkisi
Isıl işlemin etkinliğini belirlemek için sadece enzim inaktivasyonuna bakmak yeterli değildir. Enzim inaktivasyonu ile birlikte uygulanan prosesin gıdanın kalite parametreleri üzerindeki etkisi de incelenmelidir. Özellikle yüksek sıcaklıklardaki ısıl işlemler gıdanın besinsel ve duyusal özellikleri üzerinde olumsuz etkilere sahiptirler.
Yüksek sıcaklığın etkisiyle gıdanın uçucu tat-koku maddeleri, vitaminler ve diğer besin ögeleri (fenolik bileşikler ve karotenoidler gibi) kaybı, tekstür bozuklukları gibi olumsuzluklar ortaya çıkmaktadır.
Antioksidanlar, oksidasyondan kaynaklanan acılaşmayı ve diğer tat bozulmalarını geciktirme veya önleme özelliğine sahip olan maddelerdir. Tokoferoller, askorbik asit, flavonoidler ve fenolik asitler en önemli doğal antioksidan gruplarıdır. Antioksidanların oksidatif stres sonucu oluşan dejeneratif ve yaşla ilgili çeşitli hastalıkları önlemedeki rolünün anlaşılmasıyla bu maddelere olan ilgi artmıştır (Tavman vd., 2009).
Meral (2016), derleme çalışmasında farklı ısıl işlem uygulamalarının fenolik bileşikler üzerine etkisini araştırmıştır. Fenolik bileşenlerin ısıya duyarlı ve kompleks bileşenler olduğunu ve ısıtma işleminin toplam fenolikleri, flavonoidleri ve antioksidan aktiviteyi etkilediği belirlenmiştir. Toplam fenolik madde ve antioksidan aktivite üzerine ısıl işlemin etkisini araştıran çalışmaların sonuçları çelişkili bulunmuştur. Bazı çalışmalar, ısıl işlem ile hücre duvarı ve hücre matriksinin yapısının bozulması nedeniyle fenolik asitlerin miktarının arttığını ifade ederken bazı çalışmalar ise ısıl işlem ile fenolik bileşenlerde ve antioksidan aktivitede azalma veya bir değişiklik olmadığını ifade etmektedir.
Aguilar-Rosas vd. (2007), yaptıkları bir çalışmada elma suyunda geleneksel bir yöntem olan yüksek sıcaklık-kısa süreli (HTST) pastörizasyon uygulamışlardır. Termal pastörizasyon, 30 saniye boyunca 90 °C’ de gerçekleştirilmiştir. Sonuçlara göre termal pastörizasyon ile toplam fenolik maddede %32,2’lik bir azalma belirlenmiştir.
Yapılan bir başka çalışmada Golden delicious cinsi elmalara ısıl işlem (90 °C 1 dak) uygulamışlardır. Toplam fenolik maddede kayıp ısıl işlem sonrasında % 21-26 arasında
tespit edilmiştir (Başlar ve Erturgay, 2013). Yapılan başka bir çalışmada HTST pastörizasyonunun (85 °C, 30 s; 90 °C, 15 s) bulanık elma suyunun fenolik içeriği üzerine düşük bir etkisi olduğu saptanmıştır. Isıl işlem uygulanmış elma sularında 60 gün depolama ile toplam fenolik maddede azalma belirlenmiştir, bunun nedeninin fenolik bileşiklerin termal olarak stabil olmaması olduğu belirtilmiştir (Nayak vd., 2017).
He vd. (2016), yaptıkları bir çalışmada elma suyuna 80 °C 30 dakika ve 90 °C 30 saniye su banyosunda ısıl işlem uygulamışlardır. Elma suyunun fenolik bileşik içeriği, HPLC yöntemiyle belirlenmiştir. Toplam fenolik madde miktarında 80 °C’lik işlemden sonra
% 1,35 artış belirlenirken, 90 °C’de ısıl işlem gören elma suyu örneklerinde % 9,82 azalış belirlenmiştir.
Francini ve Sebastiani (2013), yaptıkları derleme çalışmasında bazı elma çeşilerinin toplam fenolik madde miktarlarından bahsetmişlerdir. Gala ve Panaia kırmızısı çeşitlerinde sırasıyla (56 ve 221 mg GAE/100g ıslak ağırlık) toplam fenolik belirlemişlerdir. Idared ve Rome Beauty elmalarının kabuklarındaki fenolikler (588,9 ve 500,2 mg GAE /100 gr) yüksek seviyedeyken, meyve etinde (75,7 ve 93,0 mg GAE/100 gr) daha düşük olduğunu söylemişlerdir.
Ćetković vd. (2008), yaptıkları bir çalışmada farklı elma çeşitlerini (Pinova, Reinders, Jonagold, Iduna, Braeburn) kullanarak elde ettikleri elma posasının fenolik ve antioksidan kapasitesini araştırmışlardır. Toplam fenolik madde FC yöntemiyle belirlenirken, antioksidan aktiviteyi belirlemede DPPH radikalinden yararlanmışlardır.
Toplam fenolik madde 4,22 - 8,67 mg/g aralığında olup, en yüksek toplam fenolik 8.67 mg/g ile Reinders cinsinde belirlenmiştir. Sonuçlara göre EC50değerleri sırasıyla 9,22 ± 0,45 mg/ml, 6,33 ± 0,31 mg/ml, 9,50 ± 0,47 mg/ml, 12,22 ± 0,6 mg/ml, 7,95 ± 0,39 mg/ml olarak belirlenmiştir. Elma posaları arasında Reinders cinsinin, en yüksek antioksidan aktiviteye sahip olduğu belirlenmiştir.
Yıldırım vd. (2019), yaptıkları bir çalışmada Isparta ili Eğirdir ilçesinden temin edilen beş farklı elma (Starking Delicious, Golden Delicious, Pink Lady, Arap Kızı ve Granny Smith) çeşitinin meyve eti ve kabuk kısmının antioksidan kapasitesini DPPH ve TFM
meyve eti kısmında en fazla Arap Kızı cinsinde 657,1 mg/100g GAE, en düşük ise Starking Delicius 399,0 mg/100g GAE cinsinde belirlenmiştir. Kabuk kısmında ise fenolik mikarı en fazla Granny Smith 1692,5 mg/100g GAE, en düşük ise Golden Delicius 929, 7 mg/100g GAE olarak belirlenmiştir. Antioksidan aktivite meyve eti kısmında sırasıyla (%44,42; %47,06; %32,52 %51,33; %49,54) olarak belirlenirken, kabuk kısmında sırasıyla (%73,51; %77,28; %66,67; %74,23; %87,21) olarak tespit edilmiştir.
Bahukhandı vd. (2018), çalışmalarında Hindistan’ın Uttarkand (Batı Himalaya) bölgesindeki farklı yerlerinde yetişen üç geleneksel elma çeşidinin (Benoni, Fanny ve Rymerin) fenolik madde içeriği ve antioksidan kapasitelerini araştırmışlardır. Çalışma sonucunda fenolik madde (0,94-7,00 mg/g GAE) aralığında belirlenmiş ve en yüksek fenolik madde Mukhwa bölgesinde yetişen Rymerin cinsinde 7,00 mg/g GAE belirlenmiştir. Antioksidan aktivite ise (DPPH, 4,99–14,06 mmol/kg FW) aralığında olup, en yüksek aktivite Mukhwa bölgesinde yetişen Rymerin 14,06 mmol/kg FW olarak belirlenmiştir.
Literatürde elma suyunda çeşitli sıcaklık ve süre parametrelerine bağlı olarak uygulanan ısıl işlemin enzim aktivitesi üzerine etkisinin belirlendiği çalışmalar bulunuyorken, fenolik maddedeki ve antioksidan aktivitedeki değişimin belirlendiği çalışmalar sınırlıdır. Bu çalışma ile hafif ısı (≤80 °C) uygulaması ve uzun işlem sürelerinde enzim aktivitesi, toplam fenolik madde, antioksidan aktivite ile FTIR spektroskopisi ve HPLC kullanılarak fenolik bileşiklerin değişimi incelenmiştir.
BÖLÜM III
DENEYSEL ÇALIŞMALAR
3.1 Materyal
Bu çalışmada kullanılacak taze elma (Malus domestica) yerel üreticilerden sağlanmıştır.
Çalışmada Red Chief çeşidi elma kullanılmıştır. Meyveler, meyve suyu eldesinden önce 4°C sıcaklıkta depolanmıştır. Yıkanmış ve kâğıt havlu ile kurutulmuş meyveler dörde kesilip, çekirdek evleri ayrılmış ve blenderdan (Arnica AA 1233 GH21530 Orbital Mix, Türkiye) geçirilmiştir. Elde edilen meyve suyu 4 katlı tülbentten süzülmüştür. Taze sıkılmış meyve suları kontrol olarak ayrılmıştır.
3.2 Yöntem
3.2.1 Isıl işlem uygulaması
Elde edilen taze meyve suyu farklı sıcaklık ve sürenin meyve suyu üzerine etkisini belirlemek için ısıl işleme tabi tutulmuştur. 200 ml meyve suyu 7 cm çap ve 9,5 cm uzunluğa sahip cam beher içine konularak, cam beher su banyosu (Yüksel Kaya Makine, YKM-AS209, Türkiye) içine yerleştirilmiştir. Isıl işlem sırasında örnek içinde sıcaklığın eşit dağılımını sağlayabilmek için laboratuvar tipi özel mekanik karıştırıcı (İsolab, 615.01.001, GmbH, Germany) kullanılmıştır. Meyve suyuna farklı sıcaklıklarda (40, 50, 60, 70 ve 80°C) ve farklı sürelerde (5, 10, 15, 20, 25, 30 dakika) ısıl işlem uygulanmıştır. İşlem boyunca örnek sıcaklığı dijital sıcaklık ölçer kullanılarak kontrol edilmiştir. Cam beher içine konulan meyve suyu sıcaklığı istenen değere ulaştığında ısıl işlem başlatılmıştır. Örnekler enzim aktivitesinin ölçümü için ısıl işlemin hemen sonrasında buzlu su banyosuna alınmıştır. Her bir uygulama üç kez tekrarlanmıştır.
3.2.2 Kalan polifenoloksidaz enzim aktivitesinin belirlenmesi
İnaktivasyon sonunda PPO enzim aktivitesi ölçümleri Baltacıoğlu vd. (2015) tarafından kullanılan yöntem modifiye edilerek, spektrofotometrik olarak belirlenmiştir. Bu amaçla Thermo Scientific marka Evolution 300 model (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA) spektrofotometre kullanılmıştır. PPO enzim aktivitesi 420 nm dalga boyunda absorbans artışı ölçülerek belirlenmiştir. Test tüplerine konulacaklar aşağıda listelenmiştir:
Test Şahit 50 mM (pH=6,5) potasyum fosfat tamponu 2,00 ml 2,30 ml 0,25 M kateşol (K- fosfat tamponu içinde çözünmüş) 0,30 ml 0,30 ml
Örnek 0,30 ml 0,00 ml
Reaksiyon, örnek ilavesi ile başlamıştır. Tüp içeriği vorteks ile karıştırıldıktan sonra absorbans değerleri 3 dakika boyunca 5 saniyede bir kaydedilmiştir. Aktivite ölçüm sıcaklığı 25 ± 2°C olarak sağlanmışır. PPO enzim aktivitesi zamana karşı çizilen A420
grafiğinin ilk doğrusal kısmının eğiminin belirlenmesiyle, birim zamanda absorbanstaki 0,001’lik değişim olarak ifade edilmiştir. Kalan enzim aktivitesi kontrolün aktivitesine oranla yüzde olarak ifade edilmiştir.
3.2.3 Kalan peroksidaz enzim aktivitesinin belirlenmesi
İnaktivasyon sonunda POD enzim aktivitesi ölçümleri spektrofotometrik yöntemle Abid vd. (2014) tarafından kullanılan yöntemde değişiklik yapılarak belirlenmiştir. Bu amaçla Thermo Scientific marka Evolution 300 model (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA) spektrofotometre kullanılmıştır. POD aktivitesi substrat olarak pirogallol kullanılarak belirlenmiştir. Tüp içerisine 1 mL örnek, 1,52 mL 100 mM potasyum fosfat tamponu (pH 6), 0,32 mL %5 pirogallol ve 0,16 mL 0,147 M H2O2
karıştırılmıştır. Reaksiyon H2O2 ilavesi ile başlatılacaktır ve absorbansdaki artış 3 dakika boyunca 5 saniyede bir kaydedilmiştir. Aktivite ölçüm sıcaklığı 25 ± 2°C olarak belirlenmiştir. Enzim aktivitesi zamana karşı çizilen A420 grafiğinin ilk doğrusal kısmının eğiminin belirlenmesiyle, birim zamanda absorbanstaki 0,001’lik değişim olarak ifade edilmiştir. Kalan enzim aktivitesi kontrolün aktivitesine oranla yüzde olarak ifade edilmiştir.
3.2.4 Toplam fenolik madde tayini
Toplam fenolik madde tayini Folin-Ciocaltaeu metoduna göre yapılmıştır (Singleton ve Rossi, 1965). Standart olarak gallik asit kullanılmıştır. Gallik asit kalibrasyon eğrisi için, gallik asidin 5 farklı konsantrasyonu hazırlanmıştır. Meyve suyu (1:5) % 1 HCl içeren % 80’lik metanol ile çözülmüştür. Karışım 4 saat boyunca 40 rpm devirde çalkalanmış ve berrak kısmın ayrılması için 9000 devirde, +4 C’de, 15 dakika santrifüj (Nüve marka NR 800R model, Türkiye) edilmiş, elde edilen berrak kısım tüp içine alınmıştır. Toplam fenolik tayini için 100 µl örnek üzerine 0,75 ml Folin- Ciocaltaeu çözeltisi (suda, %10’luk) eklenmiş ve oda sıcaklığında 5 dakika bekletilmiştir. Daha sonra 0,75 ml Na2CO3 (suda, 75g/L) ilave edilerek kuvvetlice karıştırılmıştır. Oda sıcaklığında karanlıkta 1 saat bekletilmiş ve süre sonunda 725 nm’de çözeltilerin absorbansları okunmuştur. Aynı işlemler kalibrasyon eğrisi için hazırlanmış farklı konsantrasyonlardaki gallik asit çözeltilerine de uygulanmıştır. Ekstraktların absorbansları, çizilen gallik asit kalibrasyon eğrisinden okunarak toplam fenolik madde konsantrasyonu eşdeğer gallik asit olarak hesaplanmıştır (mg GAE/kg yaş ağırlık).
3.2.5 DPPH yöntemiyle antioksidan aktivite tayini
Serbest radikal yakalama etkinliği deneyi 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) radikali kullanılarak Blois’in metoduna göre çalışılmış ve aşağıdaki prosedür uygulanmıştır (Blois, 1958).
Farklı konsantrasyonlarda hazırlanan ekstraktlardan 100’er μl alınması
↓
3,9 ml 0,1 mM DPPH (%80 metanolde hazırlanan) çözeltisi ile karıştırılması
↓ Vorteksleme
↓
Oda koşullarında karanlıkta 30 dakika bekletme
↓
517 nm’de absorbansların okunması
Örnek yerine 0,1 ml %80’lik metanol kullanılarak aynı şartlarda kontrol olarak kullanılmış ve kontrolün absorbansı günlük olarak ölçülmüştür. Şahit olarak %80
