T.C.
ERCİYES ÜNİVERSİTESİ
BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJELERİ KOORDİNASYON BİRİMİ
MELİSA BİTKİSİNİN (Melisa officinalis) ANTİOKSİDATİF ÖZELLİKLERİ VE BİTKİSEL YAĞLARDA KULLANIM
OLANAKLARININ ARAŞTIRILMASI
Proje No: FYL-2014-5009
TEZ PROJESİ
SONUÇ RAPORU
Proje Yürütücüsü:
Doç. Dr. Hasan YALÇIN
Mühendislik Fakültesi/Gıda Mühendisliği
Araştırmacı:
Gülhanım UÇMAK
Bu çalışma FYL-2014-5009 proje numarası ile Erciyes Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri (BAP) Koordinasyon Birimi tarafından desteklenmiştir. Desteklerinden dolayı BAP birimine teşekkürü bir borç bilirim.
Doç. Dr. Hasan YALÇIN
MELİSA BİTKİSİNİN (Melisa officinalis) ANTİOKSİDATİF ÖZELLİKLERİ VE BİTKİSEL YAĞLARDA KULLANIM OLANAKLARININ ARAŞTIRILMASI
Gülhanım UÇMAK
Danışman: Doç. Dr. Hasan YALÇIN ÖZET
Bu çalışmada ülkemizde yetiştirilen, Melisa bitkisinin hasat zamanı farklılıklarının bitkinin biyoaktif özellikleri üzerine etkisi ve Melisa bitkisinden elde edilen ekstraktların, bitkisel yağların stabilitesi üzerine etkisinin araştırılması amaçlanmıştır. Bu amaçla Melisa bitkisinin, 2009 Haziran ayı, 2010 Haziran ve Ağustos aylarında; günün üç farklı zamanında (sabah, öğle ve akşam) hasat edilen yaprak ve sap kısımlarının 3 farklı çözgen (metanol, su, etanol,) kullanılarak elde edilmiş ekstraktlarının spektrofotometrik yöntemle toplam fenolik madde, DPPH radikali süpürücü aktivite ve toplam antioksidan aktivite analizleri yapılmıştır. DPPH radikali süprücü aktivitesi yapraklarda 15,86 – 132,22 BHAE/g kuru ekstrakt iken saplarda 20,82 – 75,63 BHAE/g kuru ekstrakt olarak saptanmıştır. Farklı ekstraklarla yapılan fenolik madde içeriğinde ise yapraklarda 20,87 – 339,99 mg GAE/g kuru ekstrakt, saplarda ise 49,79 – 186,48 mg GAE/g kuru ekstrakt olarak bulunmuştur. Farklı hasat zamanlarında farklı solventlerle yapılan antioksidan aktivite tayininde ise yapraklarda 184,97 mg AAE/g kuru ekstrakt, saplarda ise 41,47 – 184,97 mg AAE/g kuru ekstrakt olarak belirlenmiştir. Hasat zamanı ve solvent çeşidi arasında istatistiksel olarak önemli farklılıklar saptanmıştır. En yüksek eğerler örneklerinde yapraklarında gözlemlenmiştir. Haziran ve Temmuz ayı hasatları Ağustos ayından daha yüksek bulunmuştur. Melisa ekstraktlarının bitkisel sıvı yağların oksidatif stabilitesi üzerine etkisi ise ransimat yöntemi ile belirlenmiştir. Bu amaçla etanol ile çıkarılan ekstraktlar 1000 ve 2000 ppm dozlarında rafine ayçiçek yağının 120ºC’deki oksidatif stabilitesi ölçülmüştür. 100 ppm BHA ilave edildiğinde indüksiyon periyodu 0,43 ve 0,53h olarak ölçülmüştür.1000 ppm ve 2000 ppm lik etanolik Melisa ekstrakları ilave edildiğinde ise indüksiyon periyodu 0,54 ve 0,485h olarak saptanmıştır.
Elde edilen sonuçlar, hasat zamanının Melisa ekstraktlarının biyoaktif özellikleri üzerine etkili olduğunu ve Melisa ekstraktlarının bitkisel sıvı yağların oksidasyonunu engellemek amacıyla doğal antioksidan kaynağı olarak kullanılabileceğini göstermiştir.
Anahtar Kelimeler: Melisa, Hasat zamanı, Biyoaktivite, Ransimat, Oksidatif stabilite
Bioactive Properties of Melisa (Melissa officinalis), Harvested in the Different Time and the Effect on Oxidative Stability of Vegetable Oils
Gülhanım UÇMAK
Superviser: Assoc. Prof. Dr. Hasan YALÇIN
ABSTRACT
Aim of this study is to determine the effect of Melissa officinalis harvested in different time on bioactive properties and effects their extracts on stability of vegetable oil. For this purpose 2010 June, July and August and three differnet time of day (morning, noon, evening) leaf and steam of Melissa officinalis were harvested and three different solvents ( ethanol, methanol and water) were used to obtain extracts of these two parts of plant and then total phenolic substance, DPPH radical scavenging activity and total antioxidant activity analyses werw determined by using spectrophotometric method. Different solvents are used in different harvest periods DPPH radical scavenging activity in leaves from 15,86 to 132,22 mg BHAE/
g dry ekstract while the stems from 20,82 to 75,63 mg BHAE/ g dry respectively. Different solvents used in the phenolic content of different harvest periods; leaves from 20,87 to 339,99 mg GAE/g dry ekstract, while the stems are between 49,79 to 186,48 mg GAE/g dry ekstract.
Employing different solvents in different harvesting times total antioxidant activity; leaves from 112 to 614,4 mg AAE/ g dry ekstract , while the stems are in the range from 41,47 to 184,97 mg AAE/ g dry ekstract. Significant differences were found on harvesting time and and solvent type of mentioned analyses. The highest content were found for these analyses in plant’s leaf. Results of June and July months were finded higher than August month.
Lemon balm extracts effect on oxidative stability of vegetable oils was determined with the Rancimat method. For this purpose the extract is extracted in ethanol at concentrations of 1000 ppm and 2000 ppm is added to the refined sunflower oil. The oxidative stability of the oil was measured at 120 ° C. Sunflower oil, 100 ppm BHA was added examples induction periods, respectively, 0,43 and 0,53 hours was measured to be 1000 ppm and 2000 ppm concentrations Melissa the ethanolic extract from the added sample in the induction periods of 0,54 and 0,485 h was obtained.At these concentrations added ethanol extracts had significant effect on the oxidative stability was observed.
According these results, harvesting time has effect on bioactive properties of Melissa officinalis and Melissa officinalis extracts can be used as a natural antioxidant to prevent oxidants and vegetable oils.
Keywords: Melisa, Harvesting time, Bioactivity, Rancimat, Oxidative stability
İçindekiler
GİRİŞ ...8
1. BÖLÜM GENEL BİLGİLER ... 11
1.1.Melissa ... 11
1.1.1.Melisa officinalis L. Tür Özellikleri ... 11
1.1.2.Melissa officinalis L. Tarihçesi ... 12
1.1.3. Melisa Bitkisinin Kimyasal Bileşimi ... 13
1.1.3.1.Uçucu Bileşikler ... 14
1.1.3.2.Fenolik Bileşikler... 15
1.1.3.3.Triterpenik Asitler... 16
1.1.4.Melisa ile İlgili Biyoaktivite Çalışmaları ... 16
1.1.4.1. Antioksidan Aktivite ... 16
1.1.4.2. Antimikrobiyal Aktivite ... 18
1.1.4.3. Antiviral Aktivite ... 19
1.1.4.4. Anksiyolitik ve Sedatif etki ... 20
1.1.4.5. Demans ve alzheimer üzerine etkisi ... 20
1.1.4.6. Antitümör Aktivite ... 21
1.1.4.7. İmmün Sistem Üzerine Etkisi ... 21
2. BÖLÜM ... 22
MATERYAL VE YÖNTEM ... 22
2.1.Materyal ... 22
2.1.1.Bitki ... 22
2.1.2.Kimyasallar ... 22
2.1.3.Yağ ... 22
2.2.Yöntem ... 22
2.2.1.Örnek ve Ekstarkt Hazırlama ... 22
2.2.1.1.Standart Maddeleri Hazırlama ve Kalibrasyon Eğrilerinin Elde Edilmesi ... 23
2.2.2. DPPH Radikali Süpürücü Aktivitite Tayini ... 23
2.2.3. Toplam Fenolik Madde Tayini ... 24
2.2.4. Toplam Antioksidan Aktivite Tayini ... 25
2.2.5. Oksidatif Stabilite Tayini ... 25
3.BÖLÜM ... 26
BULGULAR ... 26
3.1. DPPH Radikal Süpürücü Aktivite... 26
3.2. Toplam Fenolik Madde Miktarı ... 28
3.3.Toplam Antioksidan Aktivite ... 30
3.5.Oksidatif Stabilite ... 32
4.BÖLÜM ... 33
TARTIŞMA, SONUÇ ve ÖNERİLER ... 33
4.1. Tartışma ... 33
4.2. Sonuç ve öneriler ... 35
GİRİŞ
Oksidasyon; yemeklik katı ve sıvı yağların kalitesini olumsuz yönde etkileyen bir kimyasal reaksiyonlar serisidir. Oksidasyon olayı, hidrolitik ve oksidatif (otooksidasyon) olmak üzere iki şekilde gerçekleşir. Hidrolitik oksidasyon, daha çok nispeten yüksek sıcaklığa sahip ve sulu ortamlarda gliserid moleküllerinin gliserol ve yağ asitlerine hidrolizi ile olmaktadır.
Otooksidasyon ise yağların bileşiminde bulunan doymamış yağ asitlerinin oksijenle yükseltgenmesi ile aldehit, keton, hidroksiasit, alkol ve küçük moleküllü yağ asitlerinin oluşumuyla sonuçlanan bir seri olaylar zinciridir. Yağların oksidasyona uğraması gıdaların kalitesini ve besinsel değerini düşürür [1]. Yağ oksidasyon ürünleri; yaşlanma, hücre zarı hasarı, kalp ve kanser gibi hastalıklarla ilişkilendirildiğinden sağlık açısından risk oluşturabilmektedir [2]. Yağlarda görülen bütün bu olaylar, yağları; ısı, ışık, nem, atmosferik oksijen, metal ve mikroorganizma etkisinden korumak, uygun antioksidantlar ilave etmek ve uygun ambalajlama materyalleri ile vakum altında ambalajlayarak düşük sıcaklıklarda muhafaza ederek engellenebilir.
Uluslararası Gıda Kodeks Komisyonu (CAC)’nin tanımında antioksidanlar “gıdada yağın acılaşması ve renk değişimleri gibi oksidasyon reaksiyonları sonucunda oluşan bozulmaları önleyerek raf ömrünü uzatan maddeler” olarak ifade edilmektedirler. Pek çok gıda maddesinin bozulmasının önemli bir kaynağının oksijen olduğu bilinmektedir. İstenilmeyen lezzet ve koku oluşumlarına neden olan oksidatif acılaşma reaksiyonu nem, ısı, ışık,metaller, metal içeren bileşikler ve enzimler ile katalizlenebilmektedirler. Gıdalara uygulanan hazırlama, paketleme ve soğutma işlemleri acılaşmayı geciktirmekte ancak bunu engelleyememektedir. Antioksidanlar, gıdalara oksidasyonunun başlangıcından önce ilave edildiklerinde reaksiyonu önleyebilmekte veya azaltabilmektedirler.
Antioksidanlar, gıdalarda oksidatif bozulmayı önleyen veya geciktiren bileşikler olarak da tanımlanmaktadırlar. Bu bileşikler oksidatif ve otooksidatif işlemlerinin başlangıcında etki göstererek oksidasyonu ve buna bağlı olarak oluşan istenmeyen reaksiyon ürünlerinin (kötü koku ve lezzet) oluşumunu engelleyebilmektedirler. Geniş ifadeyle, antioksidanlar oksijen ile
reaksiyona girerek, gıdalar içindeki olumsuz etkilerini engelleyen maddeler olarak tanımlanabilirler. Antioksidasyon katkısı yağların ve yağ içeren besinlerin oksidasyonunu geciktirmekte etkilidir. Bütilleştirilmiş hidroksianisol (BHA) , Bütilleştirilmiş hidroksitoluen (BHT) ve tersiyerhidro kinon (TBHQ) gibi sentetik antioksidanlar, doğal antioksidanlardan daha ucuz ve etkili olduklarından besin sanayiinde yaygın kullanılmaktadırlar [3]. Bununla beraber, güvenli olup olmadıkları sorgulanmaktadır [4]. TBHQ Japonya’da ve bazı Avrupa ülkelerinde yasaklı [5] ve BHA ve BHT’nin kansorojen olduğu bildirilmektedir [6]. Bu yüzden güvenli ve etkileyici doğal bir antioksidan için araştırmalar devam etmekte ve birkaç doğal kaynak denenmektedir. Rosemary gibi doğal kaynaklardan elde edilen antioksidant ekstraktelerinin bazısı koruyucu etkileri için bitkisel yağ ve besinlerde yaygın bir şekilde üzerinde çalışılmaktadır [7]. Ayrıca diğer bazı çalışmalar yulaf ve yer fıstığı kabuğu ekstraktının bitkisel yağların depolanmasında antioksidan olarak kullanılabileceğini bildirilmektedir [8,9].
Son yıllarda, gıda bilimi alanında yapılan çalışmalar ve gözlenen gelişmeler, gıda ürünlerine vücudumuz için yararlı bazı doğal maddelerin, ekstrelerin veya kimyasalların katılmasıyla bu maddelerin eksikliklerin giderilmesi, eksiklikten kaynaklanan rahatsızlıkların önlenmesi ve gıda kalitesinin iyileştirilmesi fikrini açığa çıkarmıştır.
Fenolik maddece yüksek değere sahip olan bitki ekstraktları lipitlerin oksidatif degradasyonunu önledikleri için besinsel değeri ve kaliteyi artırırlar. Bu yüzden gıda endüstrisinde önemli bir yere sahiptirler. Melissa officinalis L. subsp. officinalis ekstarktlarında bulunan fenolik madde içeriğinin de yüksek antioksidan aktiviteye sahip olduğu bilinmektedir.
Bitkilerin biyoaktif bileşenlerinin miktarı ve içeriği ise, bitkinin cinsi, türü, elde edildiği bitki kısmı, yetiştirme ve iklim şartları, kurutma ve saklama şartları, hasat zamanı, analiz şartları gibi faktörlere bağlı olarak değişim göstermektedir [10,11,12]. Bu sebeple bitkilerin biyoaktif özellikleri üzerine kapsamlı çalışmaların yapılması büyük önem taşımaktadır.
Melissa officinalis bitkisi ticari preparatlar halinde yurtdışından ithal edilen ürünler şeklinde ülkemizde kullanılmaktadır. Çalışmamızda kullanacağımız Melissa officinalis bitkileri Konya Selçuk Üniversitesi Çumra MYO araştırma arazilerinde yetiştirilmiş ve İç Anadolu şartlarında yetiştirilebileceği gözlemlenmiştir. Bitkinin farklı kısımlarının ve farklı hasat dönemlerindeki sahip olduğu biyoaktif özelliklerin farklılığı bu çalışma ile ortaya konmaya çalışılacaktır.
Bitkinin farklı kısımlarından elde edilen ekstraktlar, bazı bitkisel sıvı yağların oksidatif
bozulmalara karşı koruyuculuğunun ölçülmesinde kullanılacaktır. Çalışmamızda elde edeceğimiz pozitif sonuçların, söz konusu bitkinin ülkemizde yaygın olarak yetiştirilmesini teşvik edebileceği ve bitkinin yüksek antioksidan aktiviteye sahip kısımlarının bitkisel yağların stabilitelerinin artırılmasında kullanımını sağlayabileceği düşünülmektedir.
Bu çalışma mevcut örneklerle ilgili bilimsel veriler elde edilmesi ve araştırmacıların Melisa bitkisi üzerine dikkatini çekmek amacıyla son derece önemlidir.
1. BÖLÜM
GENEL BİLGİLER 1.1.Melisa
Melisa; Lamiaceae familyasına bağlı, dik ya da yarı dik gövdeli, boyu 20-150 cm arasında, nadiren 120 cm' nin üzerinde olan çok yıllık (iyi koşullarda ömrü 15-20 yıl),tüylü, otsu, tıbbi ve aromatik bir bitkidir.Yaprakları basit,saplı,dişli kenarlı,çiçekleri ise beyaz, sarımsı veya kırmızımsı renktedir.Çok sayıda yan kökler içeren bir kök yumrusu bulunur. Bitki Haziran-Eylül aylarında çiçeklidir. Deniz seviyesinden 1800 m ye kadar, orman açıklıkları, çalılıklar, makilikler, dere kenarları, boş araziler ve yol kenarlarında yetişmektedir [13].
Fazla sıcak olmayan nemli, güneşli, sıcak yerleri sever.Besin maddelerince zengin kumlu- tınlı topraklarda iyi yetişir.
Doğal olarak Batı Asya ve Avrupa’da yetişmektedir.Türkiye’de; subspecies officinalis, subspecies altissima, subspecies inodora olmak üzere 3 alt türü yetişmektedir [13] Bu üç alttürden yalnız subsp. officinalis limon kokulu olup tedavide kullanılmaktadır. Diğer 2 alttür kokusuz ya da fena kokulu oldukları için tedavi alanında kullanılmamaktadır [14].
1.1.1.Melisa officinalis L. Tür Özellikleri
Gövdede uzun tüyler yok, çok kısa, ince salgı tüyleriyle kaplı, yapraklar tabanda kuneat, kaliksin üst dudağının orta dişi genişçe üçgenseldir. 28-95 cm veya daha uzun, dik, dallanmış, tüylü, çok yıllık otsu bir bitkidir. Yapraklar 18-95 X 12-75 mm, genişçe ovat, romboidal veya eliptik, kuneat-kordat, akut veya obtus, tabanı hariç derin krenat, uzun veya kısa ince tüylerle kaplı veya yarı çıplaktır. Kaliks 6-10 mm, kısa salgı tüyü veya uzun örtü tüyleri taşır, üst dudak 2-3 dişli, ortadaki diş çoğu kez kısa sivri uç şeklinde veya yoktur, alt dudağın dişleri dar triangular-lanseolattır. Korolla 9-16 mm, beyazımsı açık sarı bazen açık leylak rengi [13].
Kültürü yapıldığında ekonomik ömrü 3-4 yıldır [15]. Türkiye’de “Oğul otu, Limon otu veya Kovan otu” olarak da bilinmektedir. Melisa ( Melisa officinalis L.) sahip olduğu uçucu yağlardan dolayı farklı amaçlar için kullanılması sebebiyle ekonomik değere sahip olan bir tıbbi ve aromatik bitkidir. Melisa limona benzer kokuya sahip olup, bu durum içerdiği uçucu yağın bileşimindeki citralden kaynaklanmaktadır. Uçucu yağ oranı genelde
% 0,01-0,25 arasında değişmektedir. Bu oranın DAB 8’ e göre en az % 0,05 olması istenmektedir. Başlıca uçucu yağ bileşenleri Citral, citronellal ve linaloal’ dir [16].
Resim 1: Melissa officinalis subsp. officinalis
1.1.2.Melissa officinalis L. Tarihçesi
Tabip İbn-i Şerif 1425’de yazdığı Yadigar isimli tıp kitabında “oğulotu Arapça bandrencbuye, Farsca badrenbuye, Türkçe dadrenbu da denilen turunç kokulu bir bitkidir, yemeklere ıspanak yerine bile doğranıp yenir, ağız kokusunu giderir” demektedir [17]. Fransız halk hekimi Maurice Messegue “oğulotunun ne gibi harikalar yaratacağını ilk anlayan Arap hekimleri bitkinin kalp güçlendirici, iç açıcı olup tüm yaşamsal organları güçlendirmeye, nevrasteninin,
iç sıkıntılarının, sinirsel baş ağrılarının giderilmesine elverişli olduğunu ileri sürdüler. Rahip ve rahibeler oğulotunun yetiştirilmesini Araplardan öğrendikten sonradır ki papazlar bu konuda uzmanlaştı. Oğulotu suyu bütün dünyada ünlü bir ilaç olarak tanındı” demektedir [18].
17. yüzyıl İngiliz hekimi olan Nicholas Culpeper, Complete Herbal adlı kitabında oğulotundan bahsederken, Arap hekimler bu bitkinin faydalarını göklere çıkarırken Yunanlılar bahse değer bulmamıştır ifadesini kullanmaktadır. Yine aynı eserinde, İbn-i Sina’nın “oğulotu sindirimi kolaylaştırır, beyindeki tıkanıklıkları açar, kalp ve damarlardaki kanı ve ruhu melankolinin sebep olduğu yan etkilerden temizler fakat bu etkisini vücuttaki diğer organlarda gösteremez” dediğini belirtmiştir [19]. Babulka da oğulotu ile ilgili makalesinde, İbn-i Sina’nın oğulotunu kardiyotonik olarak önerdiğini Paraselsus’un da etkili bir kardiyotropik bitki olarak belirttiğini yazmıştır [20].
Nörolojik rahatsızlıklarda geleneksel kullanımı olan belli başlı Lübnan bitkileriyle yapılan bir çalışmada, oğulotunun o bölgede halk arasında migren ve mide rahatsızlıklarına karşı ve hafızayı kuvvetlendirmek için kullanılışı dışında kalbi kuvvetlendirici olarak da kullanıldığı açıklanmaktadır [21]. Ürdün'de yapılan bir çalışmada halk arasında en çok kullanılan 20 tıbbi bitkiden biri olan oğulotunun bu bölgede kalp ferahlatıcısı manasına gelen mifrahatül kalb ismiyle de anıldığı ifade edilmektedir [22]. Bulgaristan tıbbi bitkileri arasında ön sıralarda yer alan oğulotu bu ülkede de geleneksel olarak antispazmodik ve sedatif olduğu kadar hipotansif amaçla da kullanılmaktadır [23].
Günümüzde Güney Avrupa, Kafkasya, Kuzey İran ve Kuzey Irak’da doğal olarak yetişmekte ve birçok ülkede de kültürü yapılmaktadır ve o yörelerde naturalize olmuştur. Türkiye’de de İstanbul, Bilecik, Bursa, Bolu, Ankara, Amasya, Samsun, Kütahya, Muğla, Tunceli ve Malatya yörelerinde yayılış göstermektedir [13].
1.1.3. Melisa Bitkisinin Kimyasal Bileşimi
Melisanın kimyasal yapısı incelendiğinde, bileşiminde flavonoidler (luteolin-7-glukozid, ramnazin), polifenolikler (kafeik asit, protokafekuik asit, rosmarinik asit), taninler, terpenler (sitral, sitronellal, linalol, sitronellol, geraniol, nerol), triterpenik asitler (pomolik asit, ursolik asit) ve uçucu yağlar bulunmaktadır [24]. Yeşil aksamında %0,01-%0,3 arasında değişen oranlarda uçucu yağ içermektedir. Yapraklarındaki uçucu yağ oranı yeşil kısmındakinden
biraz daha fazladır [25]. Bu uçucu yağın ana bileşenleri %39 citronellal, %33 citral (citronellol, linalool) ve geraniol’dür [26].
Melissa officinalis L. subsp. officinalis türünün antimikrobiyal, antifungal, antipasmotik, analjezik, sinir sistemi uyarıcısı, sedatif, stomasik ve antikonvulzan aktiviteleri olduğu da bilinmektedir [14]. Melissa officinalis L. subsp. officinalis ekstraktlarında bulunan fenolik madde içeriğinin yüksek antioksidan aktiviteye sahip olduğu da bilinmektedir [27].
1.1.3.1.Uçucu Bileşikler
Melissa officinalis yapraklarındaki uçucu yağ miktarı bitkinin yetiştiği toprak ve iklim, yaprağın ilk ya da ikinci kesim olması gibi değişik faktörlere bağlı olarak % 0.02-0.3 arasında değişmektedir. Eğer özel şartlarda ve uygun bir iklimde kültürü yapılırsa uçucu yağ oranı
%0,8 e kadar yükselmektedir [28].
Carnat ve arkadaşları, Melissa officinalis’in kurutulmuş yapraklarından hazırlanan infuzyonun aromatik içeriğini, kurutulmuş yaprakların infuzyon hazırlanmadan önceki ve sonraki içeriği ile karşılaştırmak üzere bir çalışma yapmışlardır. Bu çalışmada kurutulmuş yaprakların % 0,32 oranında uçucu yağ içerdiğini göstermişlerdir. Uçucu yağın % 48’ini sitral (neral+geranial), % 40’ını sitronellal ve % 2’sini de β-karyofillen oluşturmaktadır. Aldehitler (%90) yönünden zengin olan infüzyon uçucu yağında sitral (%74) miktarı yüksek olup sitronellal %16 oranındadır. İnfüzyondan sonra yapraklardaki uçucu yağda sitral miktarı (%36) azalmıştır, sitronellal ise %43 oranındadır [29]. Bu çalışmada tespit edilen ve %87’si aldehit, %3‘ü hidrokarbon, %1’i oksit, %0,5’i ester ve %0,3’ü keton yapısında olan 14 adet uçucu yağ bileşen sayısı [29] bazı çalışmalarda 72’ye kadar çıkmaktadır [30].
Schultze ve arkadaşları ise Melissa officinalis uçucu yağının GC-MS analizi neticesinde 14 tane teşhis edilemeyen bileşik ile birlikte 72 bileşik bulunduğunu açıklamışlardır. Sitronellal
%36 ile ana bileşen olup sitral (neral+geranial) % 12 civarında kalmaktadır [30].
Baerheim Svendsen ve Merkx Melissa officinalis yapraklarında bulunan glukozitleri hidroliz etmişler ve GC-MS yöntemi ile cis-hekzen-1-ol, 1- hekzanol, okten-3-ol, 3-oktanol, benzil alkol, β-feniletil alkol, nerol, geraniol, sitronellol ve öjenol gibi uçucu bileşikleri aglikon olarak belirlemişlerdir [31].
Mulkens ve arkadaşları Melissa officinalis yapraklarından aglikonu nerol, geraniol, nerik asit, geranik asit, öjenol, benzil alkol ve β-feniletil alkol olan 7 glukozit izole etmişlerdir [32].
Mulkens ve Kapetanidis ise yaptıkları çalışmada, daha önce geranik asit, nerol, geraniol, feniletil alkol ve benzil alkol glikozitleri ile karışım halinde elde edilebilmiş olan öjenilglikozidi ilk defa saf olarak Melissa officinalis yapraklarından elde etmişlerdir [33].
1.1.3.2.Fenolik Bileşikler
Carnat ve arkadaşları, Melissa officinalis’nın kurutulmuş yapraklarından hazırlanan infuzyonun polifenolik içeriğini, kurutulmuş yaprakların infuzyon hazırlanmadan önceki ve sonraki içeriği ile karşılaştırmak üzere bir çalışma yapmışlardır. Bu çalışmada kurutulmuş yaprakların % 11.8 oranında polifenolik bileşikler (% 11.3’ü hidroksisinnamik asit türevleri ve % 0,5’i flavonoit) içerdiğini göstermişlerdir. Hidroksisinnamik asit türevleri arasında rozmarinik asit % 4,1 oranı ile ilk sırayı almıştır [29].
Mulkens ve Kapetanidis Melissa officinalis yapraklarını flavonoit yönünden çalıştıklarında luteolol-7-O-glukozit, apigenin-7-O-glukozit, izokersitrin ve ramnositrin izole etmişlerdir [34].
Heitz ve arkadaşları Melissa officinalis yapraklarından luteolol 3′-glukuronit’i major flavonoit olarak izole etmişlerdir [35].
Herodez ve arkadaşları HPLC analizi ile Melissa officinalis yapraklarının etanollü ektresinde, antioksidan olarak bilinen karnosik asit (fenolik asit)’in varlığını saptamışlardır [36].
Karasova ve arkadaşları HPLC analizi neticesinde Melissa officinalis de gallik asit, p- hidroksibenzoik asit, protokateşik asit, vanilik asit ve siringik asit bulunduğunu açıklamışlardır [37,38].
Hohmann ve arkadaşları Melissa officinalis topraküstü kısımlarından % 50 lik metanol ile hazırlanan ekstrede % 12.5 total hidroksisinnamik asit ve % 0.229 total flavonoit bulunduğunu ve ekstrenin antioksidan aktivite gösteren rozmarinik asit (%2.21), kafeik asit (%0.196), luteolol (%0.027) ve luteolol 7-O-glukozit (% 0.175) içerdiğini açıklamışlardır [39].
Lamaison ve arkadaşları Apiaceae, Boraginacae ve Lamiaceae familyalarına ait bitkilerde yaptıkları çalışmada; Sanicula, Lycopus,Mentha, Origanum, Salvia türleri ve Melissa officinalis’in %3’ün üzerinde rozmarinik asit ihtiva ettiğini tespit etmişlerdir. Bu çalışmada Melissa officinalis’de tayin edilen total hidroksisinnamik asit % 6.8, rozmarinik asit % 4.7 oranındadır. Aynı çalışmada bitkilerin antioksidan aktiviteleri de araştırılmış ve bu aktiviteden rozmarinik asit ön planda sorumlu tutulmuştur [40].
Tagashira ve arkadaşları Melissa officinalis yapraklarındaki antioksidan bileşenleri tayin için yaptıkları deneyde, rozmarinik asit dahil antioksidan özellikte 6 ana bileşen izole ettiklerini ve 1,3-benzodioksol yapısındaki 2- (3’,4’-dihidroksifenil)-1,3-benzodioksol-5-aldehit‘in bitkiden ilk kez elde edildiğini açıklamışlardır [41].
Toth ve arkadaşları Slovakya’da yetişen Melissa officinalis yapraklarındaki rozmarinik asit miktarını bitkinin çiçeklenme öncesi ve sonrasında araştırmışlardır. Bu çalışmada en yüksek rozmarinik asit miktarı bitki tamamen çiçeklendiğinde (%3,91), en düşük rozmarinik asit oranı ise çiçeklenmeden hemen önce (% 3,5) tespit edilmiştir [43].
1.1.3.3.Triterpenik Asitler
Herodez ve arkadaşları HPLC analizi ile Melissa officinalis yapraklarının etanollü ektresinde, antioksidan olarak bilinen ursolik asit ve oleanolik asit (triterpen asit)’in varlığını saptamışlardır [36].
1.1.4.Melisa ile İlgili Biyoaktivite Çalışmaları
Melissa officinalis ile gerek in vitro ve in vivo deneysel çalışmalar gerekse klinik çalışmalar olmak üzere birçok biyoaktivite çalışması yapılmıştır.
1.1.4.1. Antioksidan Aktivite
Melissa officinalis, Mentha piperita ve Origanum vulgare taze ve kuru yapraklarının antioksidan aktivite açısından değerlendirildiği bir çalışmada, her 3 bitkinin de serbest radikal süpürücü etkisi yüksek bulunmuştur. Ancak kurutulmuş Melissa officinalis yapraklarının linoleik asit peroksidasyonunu inhibe edici etkisinin taze yapraklarınkine oranla belirgin şekilde azaldığı tespit edilmiştir [43].
Başka bir çalışmada, Melissa officinalis’in hekzan, etil asetat ve etanol ekstrelerinin ayçiçeği yağındaki antioksidan aktivitesi diğer Lamiceae familyası bitkilerininki ile karşılaştırılmıştır.
Ocimum basilicum ve Origanum vulgare’nin ayçiçeği yağının oksidasyon stabilitesini arttırmadığı, Melissa officinalis etanollü ekstresinin ise ayçiçeği yağının otooksidasyonunu geciktirici etkisinin Saturae hartensis ve Mentha piperita ekstrelerininkinden sonra geldiği gözlenmiştir [44].
Ayrıca Lamaison ve arkadaşları yaptıkları antioksidan aktivite çalışmaları neticesinde aktiviteden Melissa officinalis’de bulunan rozmarinik asitin sorumlu olduğunu açıklamışlardır [40,45].
Tagashira ve arkadaşları Melissa officinalis yapraklarında antioksidan özellikteki bileşenleri tayin için yaptıkları çalışmada, Lamaison ve arkadaşlarının çalışmalarında Melissa officinalis’in antioksidan özelliğinin yalnızca rozmarinik asit içeriğine bağlandığını ve ekstrenin diğer antioksidatif bileşenlerinin detaylı incelenmediğini tenkit ederek kendi çalışmalarında rozmarinik asit dahil biri ilk kez olmak üzere, antioksidan özellikte 6 ana bileşen izole ettiklerini ve ilk kez izole edilen 1,3-benzodioksol yapısındaki 2-(3’,4’- dihidroksifenil)- 1,3-benzodioksol-5-aldehit‘in en güçlü antioksidan etkiyi gösterdiğini ifade etmişlerdir [41].
Hohmann ve arkadaşları; Melissa officinalis topraküstü kısımlarından % 50 lik metanol ile hazırlanan ekstrenin antioksidan aktivite gösterdiğini ve bu ekstrede antioksidan aktivite gösteren rozmarinik asit, kafeik asit, luteolol ve luteolol 7-O-glukozit bulunduğunu belirtmişlerdir [39].
Marongiu ve arkadaşları da yaptıkları çalışma neticesinde Melissa officinalis’in antioksidan aktivite gösterdiğini açıklamışlardır [46].
İngiliz tıbbi bitkilerinin antioksidan aktivitelerini kıyaslamak amacıyla yapılan bir çalışmada Melissa officinalis, kayda değer antioksidan özellik göstermiştir [47]. Türkiye’de yapılan benzer bir çalışmada ise, Reşat Apak ve arkadaşları, çay hazırlayarak kullanılmak amacıyla satılan bitkiler ve hazır poşet çaylar üzerinde yaptıkları çalışmada Melissa officinalis’in Anagallis arvensis, Ocimum basilicum ve Camellia sinensis ’ten sonra en fazla antioksidan aktivite gösteren bitki olduğunu açıklamışlardır [48].
Bulgaristan’da fitoterapide kullanılan 21 bitkinin sulu ekstresine antioksidan aktivite yönünden bakılmış ve Melissa officinalis ekstresinin siyah çay ve yeşil çayınki ile kıyaslanabilecek kadar yüksek antioksidan aktivite gösterdiği saptanmıştır [23].
Dokuz farklı tıbbi bitkinin etanol ekstrelerinden hazırlanan ve gastrointestinal sistem rahatsızlıklarında kullanılan bir fitoterapötik olan Iberogast’ın antioksidan kapasitesini ölçmek için yapılan bir çalışmada, Melissa officinalis ekstresi karışımda yer alan diğer bitki ekstrelerinin hepsinden daha yüksek antioksidan aktivite göstermiştir [49].
DPPH testinde Melissa officinalis dekoksiyonu % 96, etanollü ekstresi % 76, uçucu yağı % 8, β-karoten-linoleik asit testinde ise dekoksiyonu % 46, uçucu yağı % 52 oranında antioksidan
aktivite göstermiş etanollü ekstrenin β-karoten-linoleik asit testindeki aktivitesi ise belirlenememiştir [50].
Toplam fenolik bileşik içeriği ve antioksidan kapasitesi yönünden incelenen 70 tıbbi bitki infüzyonu arasında en iyi netice Melissa officinalis yapraklarından hazırlanan infüzyon ile alınmıştır. Melissa officinalis infüzyonunun kırmızı şarap ve çay ile kıyaslanabilecek derecede yüksek antioksidan kapasitesi ile önemli bir fenolik bileşik kaynağı olabileceği belirtilmiştir [51].
On sekiz Lamiceae familyası bitkisinden farklı polaritede çözücülerle hazırlanmış olan seksen sekiz ekstre antioksidan aktivite yönünden incelenmiş, en yüksek antioksidan aktivite Melissa officinalis ve Lycopus europaeus ’un polar ekstrelerinde görülmüştür [52].
Brezilya’da nörolojik hastalıklarda kullanılan üç bitkinin (Melissa officinalis, Matricaria recutita, Cymbopogon citratus) serebral lipid peroksidasyonuna karşı gösterdiği antioksidan kapasitesinin test edildiği araştırmada Melissa officinalis sulu ekstresinin en yüksek antioksidan aktiviteyi göstermiş olduğu belirtilmiştir [53].
Melissa officinalis’in petrol eteri, kloroform, etil asetat, n-bütanol ve su ile hazırlanan ekstreleri antioksidan aktiviteleri yönünden araştırılmış ve en yüksek aktivite n-bütanol ekstresinde görülmüştür [54].
Melissa officinalis uçucu yağı doza bağlı olarak antioksidan aktivite gösterdiği açıklanmıştır [55].
Melissa officinalis uçucu yağı peroksidaz enziminin aktivitesini azaltarak antioksidan aktivite göstermiştir [56].
Melissa officinalis uçucu yağı DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil)’i redükleyerek kuvvetli antioksidan aktivite göstermiştir [57].
1.1.4.2. Antimikrobiyal Aktivite
Ertürk tarafından Melissa officinalis etanollü ekstresinin farklı 10 bitki ekstresi ile beraber in vitro antibakteriyel ve antifungal etkisi agar dilüsyon yöntemi ile değerlendirilmiştir.
Ekstrelerin 3 gram pozitif (Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis) ve 2 gram negatif (Escherichia coli, Pseudomonas aeroginosa) bakteriye; ayrıca Candida albicans ve Aspergillus niger mantarlarına karşı aktiviteleri ölçülmüştür. Diğer ekstreler gibi Melissa officinalis ekstresi de hem gram pozitif hem de gram negatif bakterilere karşı antibakteriyel ve mantarlara karşı da antifungal aktivite göstermiştir [58].
Melissa officinalis yapraklarının sulu ve metanollü ekstresi anaerop ve fakültatif aerop periodontal bakterilere karşı etkili bulunmuştur [59].
Melissa officinalis etanollü ekstresi Staphylococcus aureus, Salmonella choleraesuis ve Klebsiella pneumoniae karşı antibakteriyel aktivite göstermiştir [60].
Melissa officinalis yaprak uçucu yağı da antibakteriyel ve antifungal aktivite göstermiştir [61].
Melissa officinalis uçucu yağı 5 gram pozitif, 8 gram negatif bakteri ve 6 mantara karşı antimikrobiyal aktivite göstermiştir [57].
1.1.4.3. Antiviral Aktivite
Antiviral aktivite açısından incelenen bitkiler arasında olan Melissa officinalis’in yapraklarından hazırlanan sulu ekstrenin influenza-, herpes- ve vaccine virüse karşı kuvvetli antiviral aktivite gösterdiği tespit edilmiştir [62].
Yamasaki ve arkadaşları yaptıkları çalışmada, Melissa officinalis sulu ekstresinin HIV-1’e karşı antiviral aktivite gösterdiğini ve bu etkinin ekstredeki suda çözünen polar maddelerden kaynaklandığını açıklamışlardır. Ayrıca Melissa officinalis sulu ekstresinin Molt-4 hücrelerinden oluşan kültürdeki dev hücre formasyonunu önlediğini ve HIV-1 revers transkriptaz enzimini inhibe ettiğini eklemişlerdir [63].
Allahverdiyev ve arkadaşlarının bir çalışmasında Melissa officinalis uçucu yağının, insan larinks epidermoid kanser hücrelerinde (HEp-2) Herpes simplex tip II (HSV-2) replikasyonu üzerine etkisi araştırılmıştır. Bu amaçla HSV-2 ile infekte ve infekte olmayan (kontrol) (HEp- 2) hücrelerine 25, 50, 100, 150 ve 200 μg/ml konsantrasyonlarındaki Melissa officinalis uçucu yağı tatbik edilmiş ve nontoksik bulunan 25-100 μg/ml konsantrasyondaki uçucu yağın HSV- 2 replikasyonu üzerindeki etkileri değerlendirmeye alınmış, bu konsantrasyon aralığındaki Melissa officinalis uçucu yağının HSV-2 ‘ye karşı antiviral aktivite gösterdiği sonucuna varılmıştır [64].
Melissa officinalis uçucu yağının etkinliğinin araştırıldığı benzer bir çalışmada ise hem HSV- 1 hem de HSV-2‘e karşı doğrudan antiviral etkinlik gösteren Melissa officinalis uçucu yağı in vitro maymun böbrek hücrelerinde plak formasyonunu HSV-1 için % 98,8 HSV-2 içinse
%97,2 oranında azaltmıştır. Çalışmanın sonucunda Melissa officinalis uçucu yağının herpes infeksiyonlarının topikal tedavisi için uygun olduğu açıklanmıştır [65].
1.1.4.4. Anksiyolitik ve Sedatif etki
Farelere 3-6 mg/kg dozda intraperitonal olarak uygulanan %30’luk etanol ile hazırlanmış ve liyofilize edilmiş Melissa officinalis ekstresi, hipnotik dozda pentobarbital ile oluşturulan uykunun süresini uzatmış, daha düşük dozda pentobarbital verilen farelerde ise uyku oluşturmuştur. Ekstre 400 mg/kg dozda uygulandığında asetik asit ile oluşturulan ağrıyı azaltarak periferik analjezik aktivite göstermiştir [66].
Melissa officinalis uçucu yağı farelere oral yolla 3,16 mg/kg ve daha yüksek dozlarda verildiğinde sedatif ve narkotik etki göstermiştir [67].
Açık, çok merkezli bir çalışmada, huzursuzluk semptomları olan 12 yaşın altındaki 918 çocukta Melissa oficinalis yaprak ekstresi ve Valeriana officinalis kök ekstresi içeren bir preperat denenmiş ve çocukların % 70’inde ise huzursuzluk şikayetinde iyileşme tespit edilmiştir [68].
1.1.4.5. Demans ve alzheimer üzerine etkisi
Lübnan’da geleneksel olarak Alzheimer ve epilepside kullanıldığı bilinen ve aralarında Melissa officinalis’in de bulunduğu yedi bitkinin su, etanol ve etil asetat ekstresinin asetilkolinesteraz inhibisyonu, GABA reseptörüne bağlanma afinitesi ve serotonin geri alım reseptörüne bağlanma aktivitileri araştırılmıştır. Bu çalışmada Melissa officinalis etanol ekstresinin, epilepsi tedavisinde yararlı bir unsur olan endojen GABA reseptör duyarlılığını arttırıcı etkisi bulunan benzodiazepin alanındaki reseptöre zayıf da olsa bağlanma affinitesi gösterdiği tespit edilmiştir [21].
Kanada’da yapılan benzer bir çalışmada bu ülkede ticari olarak kullanıma sunulan tıbbi bitkilerin GABA metabolizmasına etkili primer beyin enzimlerine doğrudan etki yapıp yapmadığı araştırılmıştır. Test edilen bitki ekstrelerinin % 70 inin etkisiz ya da çok az etkili bulunduğu bu çalışmada, GABA transaminaz (GABA-T) aktivitesini en yüksek oranda inhibe eden Melissa officinalis sulu ekstresi olmuştur [69].
Melissa officinalis uçucu yağının % 50’nin üzerinde asetilkolinesteraz inhibitörü aktivite gösterdiği açıklanmıştır [50].
Melissa officinalis ekstresinin en önemli bileşeni sayılan rozmarinik asitle yapılan bir çalışmada ise farelerde anksiyete, hafıza ve lökomotor aktivite üzerine rozmarinik asidin etkisi ölçülmüş ve görülmüştür ki rozmarinik asit anksiyolitik etki gösterirken lökomotor
aktivite göstermemiş ayrıca beyin dokusunda da DNA zedelenmesi ile neticelenebilecek toksik bir etki gözlenmemiştir [70].
1.1.4.6. Antitümör Aktivite
Melissa officinalis uçucu yağı insan akciğer (A549), kolon (Caco-2), meme (MCF-7) ve lösemi (HL-60, K562) hücrelerine ve fare melanoma (B16F10) hücresine karşı antitümör aktivite göstermiş olması nedeniyle antitümör olarak kullanılabileceği belirtilmiştir [57].
1.1.4.7. İmmün Sistem Üzerine Etkisi
Drozd ve arkadaşları Melissa officinalis ekstresinin farelerde immün cevap üzerine etkisini araştırmak için yaptıkları çalışmada, ekstrenin immünostimulan etkisini immün sistem üzerindeki etkisi iyi bilinen bir madde olan Levamizol’ünki ile karşılaştırmışlar ve Melissa officinalis sulu ekstresinin hem humoral hem de hücresel immün cevabı arttırdığı sonucuna varmışlardır [71].
2. BÖLÜM
MATERYAL VE YÖNTEM
2.1.Materyal 2.1.1.Bitki
Çalışmada Konya Selçuk Üniversitesi Çumra MYO araştırma arazilerinde yetiştirilen Melissa officinalis bitkileri kullanılmıştır. Bitkiler 2010 yılının haziran, temmuz ve ağustos aylarında sabah, öğle ve akşam saatlerinde olmak üzere üç farklı ay ve üç farklı fotoperiyot döneminde hasat edilmiştir. Bitki sap ve yaprak olmak üzere sınıflandırılarak laboratuara getirilmiş ve oda sıcaklığında muhafaza edilmiştir.
2.1.2.Kimyasallar
Çalışmada kullanılan kimyasal maddeler etanol ve metanol (Merck, Darmstdt, Almanya), DPPH (Aldrich Chem.,Amerika), BHA (Aldrich Chem., Amerika), Folin-Ciocalteu (Merck, Darmstdt, Almanya), gallik asit (Aldrich Chem., Amerika), sülfürik asit (Merck, Darmstdt, Almanya), sodyum fosfat (Merck, Darmstdt, Almanya), amonyum molibdat (Merck, Darmstdt, Almanya), askorbik asit (Aldrich Chem., Amerika) analitik saflıktadır.
2.1.3.Yağ
Çalışmada kullanılan ayçiçeği yağı piyasadan temin edilmiştir.
2.2.Yöntem
2.2.1.Örnek ve Ekstarkt Hazırlama
Bitki örnekleri blendırda (Waring 7011S, Amerika) küçük parçalar haline getirildikten sonra laboratuar tipi bir değirmende (Retsch MM400, Almanya) öğütüldü. Öğütülen örneklerden 2 g tartılarak 50 ml çözgen ilave edildi. Ekstraksiyon işlemlerinde etanol, metanol ve su kullanıldı. Çözgen ilave edilen örnekler ektraksiyon için çalkalamalı su banyosunda 40 °C’de 30 dakika bekletildi. Bu süre sonunda 4100 dak/devir ile 15 dakika santrifüj edildi. Süzüntü önce kaba filtre kağıdından sonrada ince filtre kağıdından (Filter Discs No. 391) süzüldü.
Ekstaktlar analiz aşamasına kadar -22°C’de depolandı.
2.2.1.1.Standart Maddeleri Hazırlama ve Kalibrasyon Eğrilerinin Elde Edilmesi
Ekstraktlar analiz için hazırlanırken ekstraksiyon aşamasında kullanılan çözgen çeşidi ve konsantrasyonu aynı olacak şekilde hazırlanan çözgenlerle, belirli konsantrasyonlara seyreltilmiştir.
Analiz sonuçlarının değerlendirilmesinde kullanılan standart maddelerin çözeltilerinin hazırlanmasında ekstarkların hazırlanması ve analizi sırasında kullanılan çözgenler dikkate alınarak hazırlanan stok çözeltisinden 10 ppm ve 500 ppm arasında değişen konsantrasyonlarda Tablo 2.1’de belirtildiği şekilde hazırlanmış ve çözeltiler ile elde edilen kalibrasyon eğrileri vasıtasıyla elde edilen denklemler ile analiz sonuçları değerlendirilmiştir.
Tablo 2.1. Standart maddelerin hazırlanması ve değerlendirme denklemleri Standart
Madde
Kullanılan Çözgen
Çözelti
Konsantrasyonu (ppm)
Regresyon Denklemi (y=ax+b)
Korelasyon Katsayısı (r2)
Gallik Asit Su 10-100 y = 99,983x - 0,880 0.999
Gallik Asit Etanol 10-100 y = 98,77x - 1,247 0.999
Gallik Asit Metanol 10-100 y = 99,922x - 1,617 0.999
Askorbik Asit Su 25-500 y = 199,7x - 4,779 0.998
Askorbik Asit Etanol 25-500 y = 201,91x - 9,371 0.999
Askorbik Asit Metanol 25-500 y = 188,05x + 1,406 0.993
BHA Su - - -
BHA Etanol 25-400 y = 7,1304x - 22,084 0.985
BHA Metanol 25-400 y = 6,1066x - 52,677 0.916
2.2.2. DPPH Radikali Süpürücü Aktivitite Tayini
Ekstraktların antiradikal aktivite tayinleri Sanchez- Moreno [72] tarafından verilen yönteme göre yapılmıştır. Stabil bir serbest radikal olan DPPH radikali antiradikal maddelerle reaksiyona girdiğinde serbest elektronu eşlemekte ve örneğin mor rengi sarıya dönmektedir.
Absorbans değerlerindeki düşme ile serbest radikali süpürücü etki tayin edilmektedir. Bu amaçla 0,1mM/L konsantrasyonunda metanol içinde hazırlanmış olan DPPH çözeltisi kullanılmıştır. Her bir analiz tüpüne 50mL DPPH çözeltisi ilave edilmiştir. Örnekler
vortekslendikten sonra 30 dakika oda sıcaklığında karanlıkta bekletildikten sonra 517nm’de absorbans değerleri tayin edilmiştir. Kontrol örneğinde örnek yerine çözgen kullanılmış ve spektrofotometre saf metanol ile sıfırlanarak örnekler okunmuştur.
Her bir örnek için ortamda bulunan DPPH radikalini süpürücü aktivitesi aşağıda verilen eşitlikle hesaplanmıştır:
% İ = 100 x (1-AÖ/AK)
İ : Örnek tarafından inhibe edilen DPPH, % AÖ : Örneğin absorbansı
AK : Kontrolün absorbansı
DPPH radikali süpürücü aktivitenin hesaplanmasında %İ’ den yararlanılarak, BHA kullanılarak 0-1 mg/mL sınırları düzeyinde bir seri standart çözelti hazırlanmış ve elde edilen kurve yardımıyla örneklerin antiradikal aktiviteleri mg BHAE /g kuru ekstrakt olarak verilmiştir [73].
2.2.3. Toplam Fenolik Madde Tayini
Ekstraktların toplam fenolik madde içeriği Singleton ve Rossi [74] tarafından verilen yöntemde bazı modifikasyonlar yapılarak belirlenmiştir. Folin- Ciocalteu reaktifinin alkali şartlar altında fenolik bileşenler tarafından indirgenmesiyle oluşan mavi rengin tespitiyle toplam fenolik madde içeriği tayini yapılmaktadır. Analiz için her bir tüpe 2400µL saf su ve 40µL örnek ilave edildikten sonra 200µL Folin-Ciocalteu ayıracı ilave edilmiştir. Folin ayracının ilavesinden 3-5dk sonra 600µL %20lik doymuş Na₂CO₃ ilavesi yapılmış ve takiben 760µL saf su ilavesi yapılarak deney tüpleri vortekslenerek karanlık bir ortamda 2 saat süreyle bekletilmiştir. Bekletme süresi sonrasında örneklerin absorbans değerleri UV spektrofotometre (Agilent 8453, Amerika) yardımı ile 765nm’de tayin edilmiştir. Örnek yerine aynı miktarda çözgen kullanılarak hazırlanan kontrol örneği ile spektrofotometre sıfırlanarak örnekler okunmuştur.
Hesaplamada gallik asitten 0-1 mg/mL sınırları düzeyinde bir seri standart çözelti hazırlanmış ve örneklerin toplam fenolik madde miktarları bu şekilde hazırlanan standart kurve yardımı ile hesaplanmıştır (mg GAE/g kuru ekstrakt).
2.2.4. Toplam Antioksidan Aktivite Tayini
Ekstraktların toplam antioksidan aktivite tayini Prieto ve ark. [75] ortaya koyduğu yönteme göre belirlenmiştir. Bu amaçla 100ppm konsantrasyonunda hazırlanmış örnekten 0,4 mL alınarak üzerine 4 mLfosfomolibden çözeltisi (0,6 M sülfürük asit, 28mM sodyum fosfat ve 4 mM amonyum molibdat) ilave edilerek analiz tüpleri sızdırma yapmayan kapaklarla iyice kapatıldıktan sonra vortekslenerek 95°C sıcaklıktaki su banyosunda (memmert WB-22, Almanya) 90 dakika süreyle inkübasyona bırakılmıştır. Bu sürenin sonunda örnekler hızla soğutularak ve 695 nm’de örneklerde reaksiyon sonrası meydana gelen yeşil rengin absorbans değerleri tayin edilmiştir. Spektrofotometre örnek yerine aynı miktarda çözgen kullanılarak hazırlanan kontrol örneği ile sıfırlanarak örnekler okunmuştur.Hesaplamada askorbik asitten 0-1 mg/mL sınırları düzeyinde bir seri standart çözelti hazırlanmış ve elde edilen kurve yardımıyla örneklerin antioksidan aktiviteleri mg AAE/g kuru ekstrakt olarak verilmiştir.
2.2.5. Oksidatif Stabilite Tayini
Melisa bitkisinin çözgen ekstraksiyon yöntemiyle elde edilen ektraktın yağların stabilitesi üzerine etkisi ransimat cihazı (Methorhm 743, Herisau, İsviçre) kullanılarak hızlandırılmış oksidasyon metoduyla tesbit edilmiştir [77]. Bu yöntemle belirli bir hızla gelen havanın yağları okside etmesi sonucu oluşan bozunma ürünleri su tarafından absorbe edilmekte ve suyun iletkenliğinde meydana gelen hızlı değişim zamana karşı grafiğe geçirildiğinde, oluşan eğriye çizilen teğetlerin kesim noktası, indüksiyon periyodu olarak belirlenmektedir.
3.BÖLÜM
BULGULAR
3.1. DPPH Radikal Süpürücü Aktivite
Tablo 3.1.’de gösterildiği gibi bitkinin yaprak kısmının DPPH radikali süpürücü aktivitesi en yüksek Haziran ayı için elde edilirken en düşük aktivite Temmuz ayı için elde edilmiştir.
Farklı çözgenlerin kullanıldığı farklı hasat dönemlerinde DPPH radikali süpürücü aktivitesi çözgen olarak suyun kullanıldığı örneklerde 96,28-132,22 mg BHAE/g kuru ekstrakt arasında, etanolün kullanıldığı örneklerde 15,86-22,91 mg BHAE/g kuru ekstrakt arasında, metanolün kulanıldığı örneklerde ise 57,08-103,75 BHAE/g kuru ekstrakt arasında değişiklik göstermektedir. Bu verilere bağlı olarak en yüksek DPPH radikali süpürücü aktivitesi çözgen olarak suyun kullanıldığı haziran öğle örneğinde, en düşük aktivite ise çözgen olarak etanolün kullanıldığı temmuz öğle örneğinde saptanmıştır.
Tablo 3.2.’de ise bitkinin sap kısımlarının DPPH radikali süpürücü aktivitesi en yüksek Temmuz ayı için elde edilirken en düşük aktivite Haziran ayı için elde edilmiştir.
Farklı çözgenlerin kullanıldığı hasat dönemlerinde DPPH radikali süpürücü aktivitesi çözgen olarak suyun kullanıldığı örneklerde 20,82-27,29 BHAE/g kuru ekstrakt arasında, etanolün kullanıldığı örneklerde 30,84-63,71 BHAE/g kuru ekstrakt arasında, metanolün kullanıldığı örneklerde ise 57,14-75,63 BHAE/g kuru ekstrakt arasında değişmektedir. Bu verilere bağlı olarak en yüksek DPPH radikali süpürücü aktivitesi çözgen olarak metanolün kullanıldığı Temmuz öğle örneklerinde elde edilirken, en düşük aktivite çözgen olarak suyun kullanıldığı Haziran öğle örneklerinde elde edilmiştir.
Tablo 3.1. Melisa yapraklarının DPPH inhibisyon aktiviteleri (mg BHAE/g kuru ekstrakt) Çözgen
Haziran Temmuz Ağustos
Sabah Öğle Akşam Sabah Öğle Akşam Sabah Öğle Akşam
Su 115,53±0,22 132,22±0,16 104,77±0,04 102,10±0,46 100,57±0,17 101,45±0,04 119,65±0,07 110,22±0,12 96,28±0,08 Etanol 22,91±0,06 21,53±0,03 19,38±0,1 16,19±0,1 15,86±0,06 18,04±0,13
- - -
Metanol 76,42±0,07 103,75±0,14 68,38±0,14 57,08±0,34 59,10±0,04 59,56±0,19
- - -
Tablo 3.2. Melisa saplarının DPPH inhibisyon aktiviteleri (mg BHAE/g kuru ekstrakt) Çözgen
Haziran Temmuz Ağustos
Sabah Öğle Akşam Sabah Öğle Akşam Sabah Öğle Akşam
Su 27,29±0,22 20,82±0,01 22,46±0,02 25,07±0,03 26,09±0 25,37±0,06 21,74±0,02 24,42±0,03 21,53±0,01 Etanol 52,54±0,01 39,13±0,12 30,84±0,03 54,36±0,04 63,71±0 57,72±0,17
- - -
Metanol 63,65±0,06 57,14±0,19 60,67±0,07 70,76±0,26 75,63±0,09 75,17±0,17
- - -
3.2. Toplam Fenolik Madde Miktarı
Tablo 3.4.’de gösterildiği gibi bitkinin yaprak kısmının toplam fenolik madde miktarı en yüksek haziran ayı için elde edilirken en düşük miktar temmuz ayı için elde edilmiştir.
Çözgen olarak suyun kullanıldığı örneklerde fenolik madde miktarları 171,75–330,64 mg GAE/g kuru ekstrakt arasında, etanolün kullanıldığı örneklerde 20,87–102,54 mg GAE/g kuru ekstrakt arasında, metanolün kullanıldığı örneklerde ise 272,07–339,99mg GAE/g kuru ekstrakt arasında değişmektedir.
Bu verilere göre en yüksek fenolik madde içeriği çözgen olarak metanolün kullanıldığı haziran ayı akşam örneğinde elde edilirken, en düşük fenolik madde içeriği ise çözgen olarak etanolün kullanıldığı temmuz ayı öğle örneklerinde elde edilmiştir.
Tablo 3.4. deki sonuçlara göre bitkinin sap kısmının toplam fenolik madde miktarı en yüksek temmuz ayı için elde edilirken en düşük miktar haziran ayı için saptanmıştır.
Çözgen olarak suyun kullanıldığı örneklerde fenolik madde miktarları 56,22-112,88 mg GAE/g kuru ekstrakt arasında, etanolün kullanıldığı örneklerde 49,79-143,95 mg GAE/g kuru ekstrakt arasında, metanolün kullanıldığı örneklerde ise 67,35-186,48 mg GAE/g kuru ekstrakt arasında değiştiği tespit edilmiştir.
Elde edilen bu verilere göre en yüksek fenolik madde içeriği çözgen olarak metanolün kullanıldığı temmuz ayı akşam örneklerinde elde edilirken, en düşük fenolik madde içeriği ise çözgen olarak etanolün kullanıldığı haziran ayı sabah örneklerinde elde edilmiştir.
Tablo 3.3.Melisa yapraklarının toplam fenolik madde miktarları (mg GAE/g kuru ekstakt)
Tablo 3.4.Melisa saplarının toplam fenolik madde miktarları (mg GAE/g kuru ekstakt)
Çözgen
Haziran Temmuz Ağustos
Sabah Öğle Akşam Sabah Öğle Akşam Sabah Öğle Akşam
Su 56,22±0,42 64,59±0,15 84,801±0,56 92,98±2,44 112,88±17,89 83,64±3,76 88,55±1,24 91,12±2,08 85,36±0,32 Etanol 49,79±0,6 110,44±0,84 97,97±0,95 143,95±5,31 142,71±17,59 142,07±4,49
- - -
Metanol 67,35±3,03 134,88±1,25 180,07±1,38 178,43±1,25 176,56±2,08 186,48±14,97
- - -
Çözgen
Haziran Temmuz Ağustos
Sabah Öğle Akşam Sabah Öğle Akşam Sabah Öğle Akşam
Su 281±1,68 302,27±2,62 330,64±6,23 323,27±1,85 316,38±2,24 266,01±3,24 171,75±2,15 171,88±0,36 172,23±1,8 Etanol 94,82±0,34 61,21±0,27 102,54±1,98 23,93±0,1 20,87±0,8 22,33±0,25
- - -
Metanol 317,83±1,67 272,07±4,16 339,99±17,57 314,89±23,09 315,54±42,68 279,42±7,53
- - -
3.3.Toplam Antioksidan Aktivite
Tablo 3.5.’de gösterildiği gibi bitkinin yaprak kısmının toplam antioksidan aktivesi en yüksek temmuz ayı için elde edilirken en düşük aktivite haziran ayı için elde edilmiştir.
Çözgen olarak suyun kullanıldığı örneklerde toplam antioksidan aktiviteleri 203,47-450,79 mg AAE/g kuru ekstrakt arasında, etanolün kullanıldığı örneklerde 112-276,02 mg AAE/g kuru ekstrakt arasında, metanolün kullanıldığı örneklerde ise 284,6-614,4 mg AAE/g kuru ekstrakt arasında değişmektedir.
Bu verilere göre en yüksek toplam antioksidan aktivite çözgen olarak metanolün kullanıldığı temmuz ayı öğle örneğinde elde edilirken, en düşük antioksidan aktivite ise çözgen olarak etanolün kullanıldığı haziran ayı öğle örneklerinde elde edilmiştir.
Tablo 3.6.’de gösterildiği gibi bitkinin sap kısmının toplam antioksidan aktivesi en yüksek ve en düşük aktivite haziran ayı için elde edilmiştir.
Çözgen olarak suyun kullanıldığı örneklerde toplam antioksidan aktiviteleri 41,47-75,36 mg AAE/g kuru ekstrakt arasında, etanolün kullanıldığı örneklerde 87,46-126,93 mg AAE/g kuru ekstrakt arasında, metanolün kullanıldığı örneklerde ise 76,71-184,97 mg AAE/g kuru ekstrakt arasında değişmektedir.
Bu verilere göre en yüksek toplam antioksidan aktivite çözgen olarak metanolün kullanıldığı haziran ayı öğle örneğinde elde edilirken, en düşük antioksidan aktivte ise çözgen olarak suyun kullanıldığı haziran ayı sabah örneklerinde elde edilmiştir.
Tablo3.5. Melisa yapraklarının toplam antioksidan aktiviteleri (mg AAE/g kuru ekstrakt)
Tablo3.6. Melisa saplarının toplam antioksidan aktiviteleri (mg AAE/g kuru ekstrakt)
Melisa bitkisinin %100 etanol kullanılarak çıkarılan ekstraktı ayçiçeği yağına 1000 ppm ve 2000 ppm konsantrasyonlarında ilave edilmesi sonucu elde edilen ransimat değerleri indüksiyon periyodu (saat) olarak Tablo 3.7’de verilmiştir.
Tablo 3.7.’deki değerlere göre ayçiçek yağı (kontrol örneği) , ayçiçek yağına 100 ppm BHA ilave edilmiş örneklerin indüksiyon periyodları sırası ile 0,43 ve 0,53 saat olarak belirlenirken, 1000 ppm ve 2000 ppm konsantrasyonlarında Melisa’nın etanollü ekstraktından ilave edilen örneklerde indüksiyon periyodları 0,54 ve 0,485 saat olarak elde edilmiştir.
Tablo 3.7. Melisa ekstraktlarının ransimat değerleri İndüksiyon Periyodu (saat)
Kontrol BHA(100 ppm) Etanol
ekstraktı(1000ppm)
Etanol
ekstraktı(2000ppm)
0,43±0,04 0,53±0,06 0,54±0,05 0,485±0,04
TARTIŞMA, SONUÇ ve ÖNERİLER 4.1. Tartışma
Bu tez çalışması kapsamında Melisa bitkisinin 2010 Haziran, Temmuz, Ağustos ayları ve günün üç farklı hasat zamanının bitkinin yaprak ve sap kısımlarının toplam fenolik madde miktarı, antioksidan aktivite, serbest radikal süpürücü aktiviteleri ve uçucu bileşenleri üzerine etkisi araştırılmıştır. Ayrıca melisa bitkisinden çıkarılan ekstraktın yağların oksidatif stabilitesi üzerine etkisi incelenmiştir.
Ekstraksiyonda kullanılan çözgene göre ekstraktların toplam fenolik madde miktarı, DPPH radikalini süpürme aktivitesi ve toplam antioksidan aktiviteleri büyük oranda değişmektedir.
Bitkinin yaprak kısmının toplam fenolik madde miktarı çözgen olarak suyun kullanıldığı örneklerde 171,75–330,64 mg GAE/g kuru ekstrakt arasında, etanolün kullanıldığı örneklerde 20,87–102,54 mg GAE/g kuru ekstrakt arasında, metanolün kullanıldığı örneklerde ise 272,07–339,99mg GAE/g kuru ekstrakt arasında değişmektedir. Bitkinin sap kısmının toplam fenolik madde miktarları ise; çözgen olarak suyun kullanıldığı örneklerde 56,22-112,88 mg GAE/g kuru ekstrakt arasında, etanolün kullanıldığı örneklerde 49,79-143,95 mg GAE/g kuru ekstrakt arasında, metanolün kullanıldığı örneklerde ise 67,35-186,48 mg GAE/g kuru ekstrakt arasında değişmektedir.
Çözgen olarak suyun kullanıldığı yaprak örneklerinde fenolik madde miktarları haziran ayında sabahtan akşama doğru artarken (281-302,27-330,64 mg GAE/g kuru ekstrakt) , diğerleri için böyle bir genelleme yapılamamıştır. Bitkinin sap kısımları için ise çözgen olarak su (56,22-64,59-84,80 mg GAE/g kuru ekstrakt ) ve metanolün (67,35-134,88-180,07 mg GAE/g kuru ekstrakt) kullanıldığı örneklerde haziran ayı içinde sabahtan akşama doğru artış görülürken diğer örneklerde böyle bir şeye rastlanmamıştır.
Bu verilere göre en yüksek fenolik madde içeriği çözgen olarak metanolün kullanıldığı haziran ayı akşam örneğinde elde edilirken, en düşük fenolik madde içeriği ise çözgen olarak etanolün kullanıldığı temmuz ayı öğle örneklerinde elde edilmiştir. Bu sonuçlarda daha yüksek biyoaktif içerikli ürün elde etmek için hasat zamanının önemli olduğu göstermektedir.
Dastmalchi ve ark. [78] yaptıkları bir çalışmada İran’da yetiştirilen Melissa yapraklarını kullanmışlardır. Yapılan çalışmada Melissanın ekstraksiyonu için çözgen olarak etanollü su kullanmış ve toplam fenolik madde içeriğini 268,9 mg GAE/g kuru ekstrakt olarak bulmuşlardır.
yetiştirilmiş Melissa ve ticari olarak piyasada çay olarak satılan Melissa kullanılarak bir çalışma yapılmıştır. Çözgen olarak Metanol:su 80:20 oranında kullanılmıştır. Çalışma sonucunda toplam fenolik madde miktarları doğal ortamda yetişmiş Melissada 595,34 mg GAE/ ml, in vitro koşullarda yetişmiş olanda 293,32 mg GAE/ ml ve piyasadan temin edilen Melissada ise 657,06 mg GAE/ ml olarak elde edilmiştir [79].
2012 yılında yapılan bir başka çalışmada ise Tayvan’da yetiştirilmiş olan Melissa üzerinde çalışılmıştır. Bu çalışmada çözgen olarak etanol kullanılmış ve toplam fenolik madde içeriği 175,15 mg/g kuru ekstrakt olarak bulunmuştur [80].
Literatürdeki bu çalışmalar ile tez çalışmasındaki sonuçlar kısmen benzerlik göstermektedir.
Bitkinin yaprak kısmının DPPH radikali süpürücü aktivitesi en yüksek haziran ayında elde edilirken, en düşük aktivite temmuz ayında elde edilmiştir. Aynı aktivite sap kısmı için en yüksek temmuz ayında elde edilirken, en düşük haziran ayında elde edilmiştir.
DPPH radikali süpürücü aktivite çözgen olarak etanolün kullanıldığı haziran örneklerinde hasat zamanı ile ters orantılı bulunmuştur. Hasat zamanı ilerledikçe radikal süpürücü aktivitenin hem yaprak (22,91–21,53–19,38 mg BHAE/g kuru ekstrakt) hemde sap (52,54–
39,13–30,84 mg BHAE/g kuru ekstrakt) kısımlarında azaldığı görülmüştür. Çözgen olarak metanolün kullanıldığı temmuz ayı yaprak örneklerinde ise hasat zamanının ilerlemesi ile birlikte radikal süpürücü etkinin arttığı (57,08–59,10–59,56 mg BHAE/g kuru ekstrakt) görülürken diğer örnekler için böyle bir genelleme yapılamamıştır.
Toplam antioksidan aktivite en yüksek çözgen olarak metanol kullanılan örneklerde, en düşük miktar ise etanol kullanılan örneklerde saptanmıştır. Toplam antioksidan aktivite yapraklar için en yüksek temmuz ayında elde edilirken, en düşük aktivite haziran ayında bulunmuştur.
Bitkinin sap kısımları için ise en yüksek aktivite haziran öğle örneklerinde edilirken en düşük aktivite haziran sabah örneklerinde elde edilmiştir.
Toplam antioksidan aktivite, yaprak örneklerinde haziran ayı için çözgen olarak su (280,14- 367,15-397,96 mg AAE/ g kuru ekstrakt) ve metanolün (284,6-286,19-301,18 mg AAE/ g kuru ekstrakt) kullanıldığı ekstraktlarda sabahtan akşama doğru artış göstermektedir. Temmuz ayı için ise çözgen olarak su (450,79-445,35-383,8 mg AAE/ g kuru ekstrakt) ve etanolün (276,02-247,86-197,71 mg AAE/ g kuru ekstrakt ) kullanıldığı ekstraktlarda sabahtan akşama doğru azalma gözlenmiştir. Sap örneklerinde ise temmuz ayı etanollü ekstraktlarda hasat
ekstrakt ) diğer örnekler için böyle bir şeye rastlanmamıştır.
Bitkinin biyoaktif özelliğini belirlemek amacıyla yapılan analizlerde fenolik madde içerğinin yüksek olduğu örneklerde antioksidan aktivite ve DPPH radikali süpürücü aktivitenin de yüksek olduğu gözlenmiştir. Bu pozitif korelasyon fenolik maddelerin serbest radikallerin oluşum mekanizmalarını engelleme ve inhibe etme özelliklerinden kaynaklanmaktadır.
Melisanın etanol ile çıkarılan ekstarktının ilave edildiği ayçiçeği yağı bütün konsantrasyonlarda kontrol örneğine göre indüksiyon periyotları daha yüksek bulunurken 100 ppm BHA ilave edilmiş örnekler ile yakın sonuçlar elde edilmiştir.
4.2. Sonuç ve öneriler
Bu çalışmada bitkinin farklı kısımlarının biyoaktif bileşenleri yaprakta saptan daha fazla bulunmuştur.
Melisanın fenolik bileşiklerinin ekstraksiyonunda çözgenler içinde metanol ve su, etanole göre daha etkili bulunmuştur. Bundan sonra yapılacak çalışmalarda fenolik bileşiklerin ekstraksiyonu için etkisi yüksek olan bu çözgenler önerilmektedir.
Hasat zamanının Melisanın biyoaktivitesi üzerine önemli bir etkisi olduğu saptanmıştır.
Ransimat ve diğer antioksidatif içerik belirleme analiz verilerine dayanarak melisanın yağ sanayinde doğal antioksidan kaynağı olarak kullanılabileceği sonucuna varılmıştır.
Tezde kullanılan materyal için farklı ekstarksiyon metotları kullanılarak farklı ekstraksiyon koşulları ile ekstrakte edilerek en verimli ektsraksiyon işlemi belirlenebilir.
Daha ileri bileşen tanımlama teknikleri ile hasat zamanının bitkinin majör bileşikleri ve antioksidan özelliğe sahip bileşenleri üzerine etkisi tespit edilebilir.
izolatlar halinde ede edilerek bu izolatların bitkisel yağların oksidatif stabilitesi üzerine etkisi incelenebilir.
1. Suja, K.P., Abraham, J.T. Thamizh, S.N. Jayalekshmy, A. Arumughan, C. (2004).
Antioxidant efficacy of sesame cake extract in vegetable oil protection. Food Chemistry 84 , 393-400.
2. Cosgrove, J. P., Church, D. F., Pryor, W. A. (1987). The kinetics of the autoxidation of polyunsaturated fatty acids. Lipids 22 , 299-304.
3. Pin-Der, Duh., Gow-Chin, Yen. (1997). Antioxidant efficacy of methanolic extracts of peanut hulls in soybean and peanut oils. Journal of the American Oil Chemists Society 74(6) , 745-748.
4. Labuza, T. P. (1971). Kinetics of lipid oxidation in foods. CRC Critical Review of Food Technology 2 , 355-405.
5. Shahidi, F. . (1997). Natural antioxidants-chemistry, health effects, and applications.
AOAC Press .
6. Ito, N., Hagiwara, A., Shibata, M., Ogiso, T., & Fukushima. (1982). Induction of squamous cell carcinoma in the forestomach of F344 rats treated with butylated hydroxyanisole. Gann 73 , 332-334.
7. Joyeux et al . (1998). Method and pharmaceutical compositions containing rossignol derivatives. US patent,5 , 697-753.
8. Pin-Der, Duh., Wen Jye, Yen., Pin-Chan, Du., Gow-Chin, Yen. (1997). Antioxidant activity of mung bean hulls. Journal of the American Oil Chemists Society, 74(9) , 1059-1063.
9. Tian, L. L., White, P. J. (1994). Antioxidant activity of oat extractin soybean and cottonseed oils. Journal of the American Oil Chemists Society, 71(10) , 1079–1086.
10. Miliauskas, G.,Venskunonis, P.R., Van Beek, T.A.,. (2004). Screening of radical scavenging activity of some medicinal and aromatic plant extracts. Food Chemistry, 85 , 231-237.
11. Cuvelier, M.E., Richard, H., Berset, C. (1996). Antioksidative activity and phenolic composition of pilot- plant and commercial extracts of sage and rosemary. Journal of the American Oil Chemists' Society, 73 , 645-652.
12. Kahkönen, M.P., Hopia, A.I., Vuorela, H.J., Rauha, J.P., Pijlaha, K.,Kujala, T.S., Heinonen, M. (1999). Antioksidant activty of plant extarcts containing phenolic compounds. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 47 , 3954-3962.
13. Mill RR. . (1982). Melissa L. In: Davis PH, editor. Flora of Turkey and the East Aegean Islands. Edinburgh: Edinburgh University Press; vol. 7 , 262-264.
Kitabevleri.
15. Ceylan A. (1997). Ceylan, A., 19 Tıbbi Bitkiler II (Uçucu Yağ Bitkileri). Ege Üniversitesi Ziraat Fakültesi Yayını, No:481.
16. Cuervo, S. P., Hensel O. (2008). Drying of Lemon Balm (Melissa Officinalis L.) using stepwise process control. Tropentag 2008 (s. 7-9 Ekim). Germany: University of Hohenheim.
17. Tabib İbn-i Şerif. (2003). Yadigar. istanbul: Merkezefendi ve Halk Hekimliği Derneği.
18. Messegue M. (1982). Hayat Veren Şifalı Otlar. İstanbul: Milliyet Yayınları.
19. Culpeper N. (1992). Culpeper’s Complete Herbal. London.
20. Babulka P. . (2005). La mélisse (Melissa officinalis L.). Phytothérapie 3 , 114-117.
21. Salah S.M., Jager A.K. (2005). Screening of traditionally used Lebanese herbs for neurological activities. J Ethnopharmacol 97 , 145-149.
22. Abu-Hamdah S, Afifi FL, Shehadeh M, Khalid S. (2005). Simple quality control procedures for selected medicinal plants commonly used in Jordan. Pharm Biol 43 , 1- 7.
23. Ivanova D, Gerova D, Chercenkov T , Yankova T. . (2004). Polyphenols and antioxidant capacity of Bulgarian medicinal plants. J Ethnopharmacol 96 , 145-150.
24. Karagöz A., Yazgan M., Kuş S. ve Cevahir G. (2004). Melissa Officinalis L. Subsp.
Officinalis Bitkisinden Hazırlanan Ekstrelerin Antiviral Aktivite Potansiyellerinin Değerlendirilmesi. 14. Bitkisel İlaç Hammaddeleri Toplantısı , 335-338.
25. Katar D. ve Gürbüz B. (2008). Oğulotu (Melissa Officinalis L.)’nda Farklı Bitki Sıklığı ve Azot Dozlarının Drog Yaprak Verimi ve Bazı Özellikler Üzerine Etkisi . Tar. Bil. Derg., 14 (1) , 78-81.
26. Bağdat R.B. ve Coşge B. (2005). The Essential Oil of Lemon Balm (Melıssa Offıcınalıs L.), Its Components and Using Fields. Omü Zir. Fak. Derg., 21 (1) , 116- 121.
27. Salman, U. (2006). Lactuca sativa L.’den Elde Edilen Polifenoloksidazın Kısmi Karakterizasyonu. Balıkesir: Yüksek Lisans Tezi, Balıkesir Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyoloji Anabilim Dalı.
28. Wichtl, M. (1994). Herbal Drugs and Phytopharmaceuticals. (Edited and translated from the second German edition by Grainger Bisset N.). Stutgart: Medpharm Scientific Publishers.
