T.C.
NİĞDE ÖMER HALİSDEMİR ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
BİTKİSEL ÜRETİM VE TEKNOLOJİLERİ ANABİLİM DALI
ASMADA HASTALIK YAPAN RODİTİS YAPRAK RENK DEĞİŞİKLİĞİ İLE İLİŞKİLİ VİRÜS (RODITIS LEAF DISCOLARATION ASSOCIATED VIRUS)’ÜN
MOLEKÜLER TEŞHİSİNİN İYİLEŞTİRİLMESİ
MÜZEYYEN MÜGE DOĞANER
Ocak 2019 M. MÜGE DOĞANER, 2019NİĞDE ÖMER HALİSDEMİR ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜYÜKSEK LİSANS TEZİ
T.C.
NİĞDE ÖMER HALİSDEMİR ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
BİTKİSEL ÜRETİM VE TEKNOLOJİLERİ ANABİLİM DALI
ASMADA HASTALIK YAPAN RODİTİS YAPRAK RENK DEĞİŞİKLİĞİ İLE İLİŞKİLİ VİRÜS (RODITIS LEAF DISCOLARATION ASSOCIATED VIRUS)’ÜN
MOLEKÜLER TEŞHİSİNİN İYİLEŞTİRİLMESİ
MÜZEYYEN MÜGE DOĞANER
Yüksek Lisans Tezi
Danışman
Prof. Dr. Çiğdem ULUBAŞ SERÇE
Ocak 2019
Müzeyyen Müge DOĞANER tarafından Prof. Dr. Çiğdem ULUBAŞ SERÇE danışmanlığında hazırlanan “ASMADA HASTALIK YAPAN RODİTİS YAPRAK RENK DEĞİŞİKLİĞİ İLE İLİŞKİLİ VİRÜS (RODITIS LEAF DISCOLARATION ASSOCIATED VIRUS)’ÜN MOLEKÜLER TEŞHİSİNİN İYİLEŞTİRİLMESİ” adlı bu çalışma jürimiz tarafından Niğde Ömer Halisdemir Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bitkisel Üretim ve Teknolojileri Anabilim Dalı’nda Yüksek Lisans tezi olarak kabul edilmiştir.
Başkan : Prof. Dr. Çiğdem ULUBAŞ SERÇE Selçuk Üniversitesi
Üye : Prof. Dr. Mona GAZEL
Hatay Mustafa Kemal Üniversitesi
Üye : Dr. Öğr. Üyesi Eminur ELÇİ
Niğde Ömer Halisdemir Üniversitesi
ONAY:
Bu tez, Fen Bilimleri Enstitüsü Yönetim Kurulunca belirlenmiş olan yukarıdaki jüri üyeleri tarafından …./…./20.... tarihinde uygun görülmüş ve Enstitü Yönetim Kurulu’nun
…./…./20.... tarih ve …... sayılı kararıyla kabul edilmiştir.
.../.../20...
Doç. Dr. Murat BARUT MÜDÜR V.
1 TEZ BİLDİRİMİ
Tez içindeki bütün bilgilerin bilimsel ve akademik kurallar çerçevesinde elde edilerek sunulduğunu, ayrıca tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu çalışmada bana ait olmayan her türlü ifade ve bilginin kaynağına eksiksiz atıf yapıldığını bildiririm.
Müzeyyen Müge DOĞANER
2 ÖZET
ASMADA HASTALIK YAPAN RODİTİS YAPRAK RENK DEĞİŞİKLİĞİ İLE İLİŞKİLİ VİRÜS (RODITIS LEAF DISCOLARATION ASSOCIATED VIRUS)’ÜN
MOLEKÜLER TEŞHİSİNİN İYİLEŞTİRİLMESİ
DOĞANER, Müzeyyen Müge Niğde Ömer Halisdemir Üniversitesi
Fen Bilimleri Enstitüsü
Bitkisel Üretim ve Teknolojileri Anabilim Dalı
Danışman : Prof. Dr. Çiğdem ULUBAŞ SERÇE
Ocak 2019, 60 sayfa
Asma yaprak renk değişikliği ile ilişkili virüs (Grapevine roditis leaf discoloration associated-virus, GRLDaV) Caulimoviridae familyası, Badnavirüs cinsi üyesi olup, endojenik bir virüsdür. Bu çalışmada GRLDaV’nin doğru teşhis için yuvarlanan halka amplifikasyonu (Rolling circle amplification; RCA), virüsün tüm genomunun nükleotid dizisinin elde edilmesi, PCR ve Realtime-PCR temelli teşhis yöntemleri geliştirilmiştir.
GRLDaV’un YHA sonucunda amplifikasyonlar edide edilmiş, ancak virüse ait fragmentler bulunamamıştır. Etmen Nicotiana tabacum cv Samsun ve Xanthi ile Chenopodium quinoa test bitkilerine inoküle edilmiş, buradan tekrar tütün bitkisine aktarılmış, PCR analizleri ile teyid edilmiştir. Gen bankasında kayıtlı GRLDaV genomları kullanılarak tasarlanan primerlerle amplifiye edilen 10 genom bölgesinin birleştirilmesi ile tüm GRLDaV B42 izolatının 7,086 nt uzunluğunda tüm genom nükleotid bilgisi elde edilmiştir. Diğer ülkelerde teşhisi yapılan GLRDaV izolatleri ile aynı genom organizasyonuna sahip olup, yüksek oranda nükleotid benzerliği göstermiştir.
Sonuç olarak rutin teşhislerde kullanılabilecek primer çiftleri PCR ve real-time PCR analizleri için önerilmiştir.
Anahtar Sözcükler: Asma, GLRDaV, PCR, yuvarlanan halka amplifikasyonu, tüm genom
3 SUMMARY
MOLECULAR DIAGNOSIS IMPROVEMENT OF RODITIS LEAF
DISCOLORATION-ASSOCIATED VIRUS CAUSING DISEASE IN GRAPEVINES
DOĞANER, Müzeyyen Müge Nigde Ömer Halisdemir University
Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Plant Production and Technologies
Supervisor : Prof. Dr. Çiğdem ULUBAŞ SERÇE
January 2019, 60 pages
Grapevine leaf discoloration associated virus (GRLDaV) the family of Caulimoviridae is a member of the genus Badnavirus and is an endogenous virus. Rolling circle amplification (RCA), obtaining the nucleotide sequence of the whole genome of the virus, PCR and Realtime-PCR based diagnostic methods have been developed for the correct diagnosis of the GRLDaV under this study. As a result of GRLDaV's YHA, amplification was performed but no virus fragments were found. The pathogen was inoculated with Nicotiana tabacum cv Samsun and Xanthi and Chenopodium quinoa test plants, It was confirmed by PCR analysis. All genomic nucleotide information of 7,048 nt of all GRLDaV B42 isolates was obtained by combining 10 amplified genome regions with primers designed using GRLDaV genomes registered in the gene bank. It has the same genome organization as the GLRDaV isolates diagnosed in other countries and has shown a high nucleotide similarity. The primer pairs that can be used in routine diagnostics have been proposed for PCR and real-time PCR analysis.
Keywords: Grapevine, GLRDaV, PCR, rolling circle amplification, complete genome
4 ÖN SÖZ
Tez çalışmamın her aşamasında desteğiyle bana yardımcı olan, bilimsel gelişimime tecrübe ve önerileriyle katkıda bulunan danışman hocam Sayın Prof. Dr. Çiğdem ULUBAŞ SERÇE’ye ve eğitim hayatım boyunca maddi manevi desteklerini hiçbir zaman benden esirgemeyen aileme en içten saygı ve teşekkürlerimi sunarım.
5 İÇİNDEKİLER
ÖZET ... iv
SUMMARY ... v
ÖN SÖZ ... vi
İÇİNDEKİLER DİZİNİ ... vii
ÇİZELGELER DİZİNİ ... ix
ŞEKİLLER DİZİNİ ... x
SİMGE VE KISALTMALAR ... xii
BÖLÜM I GİRİŞ ... 1
BÖLÜM II GENEL BİLGİLER ... 4
2.1 Asmanın Önemi ... 4
2.2 Asma ve Virüs Hastalıkları İlişkisi ... 4
2.3 Asma Virüs Hastalıklarının Ekonomik Etkisi ... 6
2.4 Dünyada Önemli Bazı Bağ Virüs Hastalıkları ... 7
2.4.1 Asma yaprak kıvrılma hastalığı (GLRD: grapevine leafroll disease) ... 7
2.4.2 Kısa boğum hastalığı (GFLV: grapevine fanleaf virus disease) ... 9
2.5 Asma Virüs Hastalıkları ile ilgili Ulusal Çalışmalar ... 10
2.6 Asmada Yeni Ortaya Çıkan DNA Virüs Hastalıkları ... 10
2.6.1 Asma kırmızı leke ile ilişkili virüs (GRBaV: grapevine red blotch disease) .. 10
2.6.2 Damar açılması ve asma geriye ölüm hastalığı (GVCV: vein-clearing and vine decline syndrome) ... 11
2.6.3 Roditis yaprak renk değişikliği hastalığı (GRLDaV: roditis leaf discoloration- associated virus disease) ... 12
2.7 Asmada Yeni Ortaya Çıkan RNA Virüs Hastalıkları ... 14
2.7.1 Chlorotic mottling and leaf deformation (GPGV: grapevine pinot gris virus) 14 2.7.2 Decline of syrah grapevines (GSyV-1: grapevine syrah virus-1) ... 15
2.8 Badnavirüsler ... 16
2.9 Bitki Virüs Teşhisi ... 17
2.9.1 Biyolojik indeksleme ... 18
2.9.2 Nükleik asit temelli moleküler tanılama metotları ... 19
2.9.2.1 Polimeraz zincir reaksiyonu... 19
2.9.2.2 Yuvarlanan halka amplifikasyonu ... 21
BÖLÜM III MATERYAL VE METOT ... 25
3.1 Grapevine Roditis Leaf Discolaration-associated Virus (GRLDaV) İzolatları ... 25
3.2 GRLDaV Teşhisi Amacıyla Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ... 25
3.2.1 Nükleik asit izolasyonu... 25
3.2.2 Reverse transcription (RT) – komplementer DNA (cDNA) eldesi ... 25
3.2.3 Polimeraz zincir reaksiyonu ... 26
3.3 GRLDaV İzolatlarının Mekanik İnokülasyonu ... 27
3.4 GRLDaV İzolatının Tüm Genom Nükleotid Dizlerinin Belirlenmesi ... 28
3.4.1 Yuvarlanan halka amplifikasyonu (rolling circle amplification) ... 28
3.4.1.1 YHA ürünlerine restriksiyon endonükleaz uygulaması ... 28
3.4.2 Genomun kısa nükleotid dizilerinin birleştirilmesi yöntemi ... 29
3.5 GRLDaV Teşhis Yönteminin İyileştirilmesi ... 31
BÖLÜM IV BULGULAR VE TARTIŞMA ... 33
4.1 Arazideki Asma Örneklerinde GLRDaV İlişkin Bulgular ... 33
4.2 GRLDaV Mekanik İnokulasyon Uygulamasına İlişkin Bulgular... 34
4.3 GRLDaV Yuvarlanan Halka Amplifikasyonuna İlişkin Bulgular ... 38
4.4 GRLDaV Genomun Kısa Nükleotid Dizilerinin Birleştirilmesi ile Tüm Genom Eldesi ... 42
BÖLÜM V SONUÇLAR ... 48
KAYNAKLAR ... 50
ÖZ GEÇMİŞ ... 60
6 ÇİZELGELER DİZİNİ
Çizelge 2.1. Asmanın taksonomik sınıflandırması ... 4
Çizelge 2.2. GLRaVs’nin (Grapevine leafroll-associated viruses) ırkları ... 8
Çizelge 2.3. GLRaVs’nin (Grapevine leafroll-associated viruses) ırkları ... 9
Çizelge 3.1. Komplelementer DNA (cDNA) reaksiyon karışımı ... 26
Çizelge 3.2. PCR reaksiyon karışımı ... 27
Çizelge 3.3. Mekanik inokülasyon testinde kullanılan indikatör bitkilerin isimleri ve inoküle edildiği dönem ... 27
Çizelge 3.4. Yuvarlanan halka amplifikasyonu (YHA) için reaksiyon karışımı ... 28
Çizelge 3.5. GRLDaV (Gen bankası kayıt no: NC_027131) genomunu tek bölgeden kesdiği belirlenen enzimler ... 29
Çizelge 3.6. YHA ürünlerinin restriksiyon endonükleaz ile uygulaması reaksiyon karışımı ... 29
Çizelge 3.7. GRLDaV primer dizileri ve beklenen PCR ürünü büyüklükleri ... 30
Çizelge 3.8. GLRDaV izolatının tüm genomunun elde edilmesi için tasarlanan primer dizileri ... 31
Çizelge 3.9. GRLDaV teşhisinin iyleştirilmesinde kullanılan primerler ... 32
Çizelge 3.10. FastStart DNA master SYBR green I reaksiyon karışımı ... 32
Çizelge 4.1. Test bitkilerinde inokülasyon sonrası oluşan simptomlar ve PCR bulguları ... 36
Çizelge 4.2. GRLDaV tüm genom elde edilmesinde kulanılan primer çiftleri ... 44
7 ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 2.1. Sağlıklı bir bağ görseli ... 5 Şekil 2.2. Grapevine leafroll disease (GLRD) yaprak simptomu. ... 8 Şekil 2.3. Kısa boğum hastalığı (GFLV: grapevine fanleaf virus disease) yaprak
simptomu ... 9 Şekil 2.4. Grapevine kırmızı leke ile ilişkili virüs (GRBaV) yaprak simptomu ... 11 Şekil 2.5. (GVCV) Damar açıklığı ve üzüm azalması hastalığı yaprak simptomu ... 12 Şekil 2.6. Roditis çeşidinin yapraklarında (a-c) ve asma salkımlarında (d ve e) roditis
yaprak lekesi (RLD) hastalığı belirtileri. ... 13 Şekil 2.7. GLRDaV’nin dünyada tespit edildiği yerler (kırmızı halka) ... 14 Şekil 2.8. Grapevine pinot gris virus (GPGV) yaprak simptomları ... 15 Şekil 2.9. Grapevine syrah virus (GSyV) simptomları; yaprak kızarması ve aşı bölgesi
şişmesi ... 15 Şekil 2.10. Polimeraz zincir reaksiyonu aşamaları ... 20 Şekil 2.11. Mikro-diziler üzerinde RCA (Rolling circle amplification)™ 'nın kimyasal
yapısı ... 22 Şekil 2.12. Yuvarlanan-halka amplifikasyonunun genel prensibi ... 23 Şekil 2.13. Halkasal viral DNA genomuna çok primerli YHA uygulaması aşamaları... 24 Şekil 4.1. Arazide asma yapraklarında gözlenen simptomlar İlkbaharda gözlenen
simptomlar, sonbaharda gözlenen simptomlar ... 33 Şekil 4.2. Araziden temin edilen asma örneklerinin GRLDaV bakımndan örneklerin
BadnUp-6262/BadnDo-6757 primer çifti ile PCR testi sonucu elde edilen agaroz jel. ... 34 Şekil 4.3. GRLDaV enfekteli asma örneklerinin mekanik inokulasyonu sonucu test
bitkilerinde 16 gün sonra gözlenen simptomlar ... 35 Şekil 4.4. GRLDaV enfekteli asma örneklerinin inokule edildiği test bitkilerinin BadnUp- 6262/BadnDo-6757 primer çifti ile PCR analizi. ... 36 Şekil 4.5. GRLDaV enfekteli tütün örneklerinin N. benthamiana ve N. tabacum cv
Samsun bitkilerine mekanik inokulasyonu sonucu gözlenen simptomlar ... 37 Şekil 4.6. GRLDaV enfekteli tütün örneklerinin inokule edildiği tütün bitkilerin BadnUp- 6262/BadnDo-6757 primer çifti ile PCR analizi. ... 37
Şekil 4.7. GRLDaV B42 izolatının yuvarlanan halka amplifikasyon (YHA) yöntemi ile primer kullanılmadan çoğaltılması ... 39 Şekil 4.8. GRLDaV B42 izolatının yuvarlanan halka amplifikasyon (YHA) yöntemi ile
çoğaltılması ... 39 Şekil 4.9. GRLDaV B42 izolatının yuvarlanan halka amplifikasyon (YHA) yöntemi ile
çoğaltılan ürünlerin SmaI enzimi uygulaması ... 40 Şekil 4.10. GRLDaV B42 izolatının yuvarlanan halka amplifikasyon (YHA) yöntemi ile
farklı primerlerle çoğaltılan ürünler ... 41 Şekil 4.11. GRLDaV B42 izolatının yuvarlanan halka amplifikasyon (YHA) yöntemi ile
farklı primerlerle çoğaltılan ürünlerin çeşitli enzimlerle uygulaması ... 41 Şekil 4.12. GRLDaV tüm genomunun nükleotid dizi bilgisinin elde edilmesinde dizilenen
fragmentlerin genoma ait şematik yerleşimi ... 43 Şekil 4.13. GRLDaV B42 izolatının tüm genomunun nükleotid dizi bilgisinin elde
edilmesinde dizilenen fragmentlerin amplikon büyüklükleri jel görüntüsü ... 43 Şekil 4.14. GRLDaV genomu nükleotid dizileri ... 45 Şekil 4.15. GRLDaV B42 (Query_155161) izolatının diğer bazı badnavirüs türleri ile
filogenetik analizi ... 45 Şekil 4.16. GRLDaV izolatlarının teşhisi için tasarlanan primer çiftlerinin klasik PCR
analizinde agaroz jel görüntüsü ... 46 Şekil 4.17. GRLDaV izolatlarının teşhisi için tasarlanan primer çiftlerinin SYBR green
real time PCR analizinde amplifikasyon grafiği ve erime analizi grafiği. ... 47 Şekil 4.18. GRLDaV izolatlarının teşhisi için tasarlanan primer çiftlerinin SYBR green
real time PCR analizinden sonra agaroz jel görüntüsü ... 47
8 SİMGE VE KISALTMALAR
Simgeler Açıklama
Bp Base pair
°C Santigrad derece
g Gram
ml Mililitre
µl Mikrolitre
% Yüzde
pH Alkalilik ve asitlik faktörü
Kısaltmalar Açıklama
TÜİK Türkiye İstatistik Kurumu
FAO Food and Agricultural Organization
DNA Deoksiribonükleik asit
PCR Polimeraz Zincir Reaksiyonu
cDNA Komplementer deoksiribonükleikasid
ORF Açık Okuma Çerçevesi
1 BÖLÜM I
1 GİRİŞ
Kültüre alınan ilk meyve türlerinden biri olan asma, ekonomik açıdan dünyada en önemli meyvelerden biri olarak bilinmektedir. Asma (omca)’ nın, dünyanın en eski bitkilerinden birisi olduğu ve tarihinin 150 milyon yıl öncesine dayandığı, M.Ö.6000-5000 yıllarında Hazar ve Kafkasya Denizi’ nin Güneyi ile Anadolu’da kültüre alındığı ve zamanla buradan dünyaya yayıldığı belirtilmiştir (Türkben, 2010). Tüm dünyada asma yetiştiriciliğinin yapıldığı her yerde hastalık ve zararlıların önemli etkilere yol açtığı görülebilmektedir. Bağcılıkta üretimin ve kalitenin artırılmasında; yüksek verimli çeşitlerin kullanılması, bağ tesisinin şekli, toprak işleme ve bakım gibi çeşitli işlemlerin yanı sıra hastalık ve zararlılarla mücadele yöntemleri de oldukça önemli rol oynamaktadır (Semerci vd., 2015). Asma, toprak özellikleri ve iklim açısından seçici olmaması yönünden ve alternatif olarak değerlendirme olanaklarına sahip bir bitki olması nedeniyle dünyada ve Türkiye’de yaygın şekilde yetiştiriciliği yapılan kültür bitkilerinden biridir.
2017 yılı TÜİK verilerine göre Türkiye’de 4 milyon 200 bin ton üzüm üretimi gerçekleştirilmiştir. Üretilen üzümün yaklaşık %63’ü çekirdekli, %37’si ise çekirdeksiz üzümlerden oluşmaktadır. Türkiye, asmanın anavatanı olması nedeniyle 1200’ün üzerinde üzüm çeşidine sahiptir (Semerci vd., 2015). Üretilen üzümlerin yaklaşık %30’u sofralık, %37’si kurutmalık, %30’u pekmez, pestil, sucuk, şıra ve %3’ü de şaraplık olarak değerlendirilmektedir (Nazlı, 2007). Türkiye bağlarında, son yıllarda yapılan yeni çalışmalar ve gelişen teşhis yöntemleri ile pekçok viroid, virüs ve benzeri hastalıklar, bazı fitoplazmalar bildirilmiş ve moleküler olarak karakterize edilmiştir. Asma bitkisi etiyolojisi henüz bilinmeyen çeşitli hastalıklara neden olan ve aşılama ile bulaşan etmenlere karşı hassastır (Maliogka vd., 2015a; Martelli, 2014). Bitki materyalinin ülke ve kıtalar arası transferi bu patojenlerin dünya çapında yayılmasına neden olmuş, bunun sonucu olarak karmaşık viral hastalıkların ortaya çıkmasına yardımcı olmuştur (Al Rwahnih vd., 2009; Basso vd., 2014). Bütün patojenlerin uzak mesafelere yayılması vejetatif yolla olurken, aynı coğrafyadaki yayılımı genellikle böcek, akar veya nematod vektörleri ile olmaktadır.
Türkiye, çok sayıda bağ alanları ve asmanın gen merkezi olması sebebiyle dünya genelinde önemli üzüm üreticisi ülkeler arasında yerini almaktadır. Asma yetiştiriciliği için uygun iklim koşulları ve yetiştirme şartlarının geniş olması, ülke genelinde bağcılığın önemli bir geçim kaynağı olmasını sağlamıştır. Diğer bitki türlerinde olduğu gibi, asmayı hastalandıran virüslerin kontrolü, zorunlu olarak omcaların sağlık durumlarının belirlenmesine dayanmaktadır. Bu nedenle, bu patojenlerin neden olduğu simptomları tanımanın yanı sıra, etkili teşhis ve tanı tekniklerinin ve araçların kullanılabilirliği de önemlidir. Bitki viral hastalıklarıyla mücadelede ilk adım bitkisel ürünlerde virüs sörveylerinde, karantina ve sertifikasyon sistemlerinde kullanılabilecek, doğru ve hızlı teşhis metotlarının geliştirilmesi ve geniş uygulama alanı bulmasıdır. Moleküler biyolojideki son gelişmeler, bağlarda bulunan viral popülasyonu araştırmaya hız kazandırmıştır. Bu doğrultu da yapılan çalışmalar sonucunda, bilinen ya da yeni viral türlerin ve ırkların etkili bir şekilde saptanması, tanımlanması sağlanmıştır (Al Rwahnih vd., 2015; Burger ve Maree, 2015; Roossinck vd., 2015).
Son yıllarda özellikle yeni nesil dizileme (YND; new generation sequencing; NGS) teknolojileri ve yuvarlanan halka amplifikasyonu (YHA; rolling circle amplification;
RCA) yöntemleri ile yeni bitki virüsleri tespit edilmektedir. YND teknolojilerinin ortaya çıkması, bitki virolojisinde yeni virüslerin keşfine yeni bir yaklaşım getirmiş ve virüs teşhis potansiyelini genişletmiştir, sonuç olarak asmayı hastalandıran viral patojenler hakkındaki bilgimizi arttırmıştır (Al Rwahnih vd., 2013; Zhang vd., 2011). Bu stratejiler kullanılarak, Brezilya asmalarında onsekiz virus, üç viroid, iki virüs benzeri hastalık ve bazı fitoplazmalar bildirilmiş ve moleküler olarak karakterize edilmiştir (Basso vd., 2014).
YHA metodu asma bitkilerinde virüs teşhisi amacıyla başarılı bir şekilde kullanılmaktadır (Basso vd., 2015; Krenz vd., 2012). Bakteriyofaj Phi29 DNA polimeraz kullanan YHA, halkasal DNA genomlarının amplikasyonunda kullanılabilen, nükleik asit dizisinden bağımsız bir yöntemdir. Bu açıdan klasik PCR sistemlerinde gerekli olan hedefe spesifik primer bilgisi gerektirmemektedir (Dean vd., 2001; James vd., 2011; Reagin vd., 2003;
Rector vd., 2004). YHA metodu şimdiye kadar Geminiviridae, Nanoviridae ve Caulimoviridae familyalarında başarılı bir şekilde uygulanmıştır (Homs vd., 2008; James vd., 2011; Laney vd., 2012; Paprotka vd., 2010).
YND teknolojisi yardımı ile tespit edilen hastalıklardan birisi de Roditis yaprak lekesi (Roditis leaf discoloration; RLD) hastalığıdır. RLD hastalığı, asmada aşı yoluyla bulaşan bir hastalık olup ilk olarak 1980'lerde Yunanistan’da görülmüştür. 1980'lerin başında asmanın yeni bir hastalığı, “Roditis yaprak lekesi” olarak Orta Yunanistan'da gözlenen, öncelikle yerel çeşit “Roditis” ve daha sonra düşük oranda diğer bir çeşit “Savastiano” da belirlenmiştir (Rumbos ve Avgelis, 1989). RLD belirtileri geç yaz aylarında görünür ve genç yapraklarda sarı ve/veya kırmızımsı bir lekesi ve deformasyonlar oluşturur. Ayrıca, üzüm tane sayısı ve büyüklüğü azalır ve şeker içeriği daha düşük olur. Etkilenen asmalarda bilinen bazı farklı asma virüsleri serolojik olarak saptanmış olsa da bu simptomların tam olarak etmeni bilinmemekteydi (Rumbos ve Avgelis, 1989) YND teknolojisi kullanılarak (Maliogka vd., 2015b). bu hastalığın bir Badnavirüs ile ilişkili olduğunu bildirmiş ve virüse Roditis yaprak lekesi ile ilişkili virüs (Grapevine roditis leaf discoloration- associated virus; GRLDaV) adını vermiştir. Bu virüsün dünyada yaygınlığı bilinmemekle birlikte diğer kayıtlar İtalya, Türkiye ve Hırvatistan’dan olmuştur (Giampetruzzi vd., 2012; Ulubaş Serçe vd., 2018; Vončina ve Almeida, 2018).
GRLDaV antiserumu olmadığı için ELISA yöntemleri ile virüsün teşhisi mümkün değildir. Bu nedenle, teşhis amaçlı kullanılacak PCR yöntemlerinin geliştirilmesi gereklidir. PCR yöntemlerinin hassaiyeti ve güvenilirliğini sağlayan faktörlerden birisi de tasarlanan primerlerdir. Teşhiste kullanılacak primerlerin, çok sayıda etmen genomunda korunmuş bir bölgede lokalize olması teşhisin gücünü artıracaktır. Bu nedenle, daha fazla sayıda GRLDaV genomunun bilinmesi ve bunların karşılaştırılarak daha güvenilir primerlerin tasarlanması gereklidir. Bu amaçla, Türkiye’de tespit edilen bir GRLDaV izolatının tüm genomunun baz dizilerinin belirlenmesi amaçlanmıştır.
Virüsün var olduğu ülkeler dünyada sınırlı alanlarda olduğu için yeni araştırmalar ve teşhiste iyileştirme çalışmaları yapılmaya devam edilmektedir.
2 BÖLÜM II
2 GENEL BİLGİLER
2.1 Asmanın Önemi
Binlerce yıllık bir geçmişe sahip ve çeşit zenginliği olan asma (V.vinifera L.)’nın dünya üzerindeki yayılışı Kuzey Yarımküresi'nde 10˚ ile 52˚ kuzey enlemleri arasındadır.
Ülkemizde 36˚ ile 42˚ kuzey enlemleri arasındaki konumu ile Türkiye bağcılık için optimum olanakları sunmaktadır (Orman, 1965). Türkiye bağcılık açısından uygun toprak ve elverişli iklim koşullarına sahip olmasının yanı sıra, asmanın gen merkezidir. Ülkemiz 2017 verilerine göre Dünya’da bağ alanı yönünden 4. ve üzüm üretimi açısından 6. sırada yerini almaktadır. Üzüm yetiştiriciliği dünya çapında geniş bir iklim kuşağında yapılan ve ekonomik önemi oldukça yüksek bir kültür bitkisidir. Bitki materyallerinin ülkeler arasında değişimi ve asmanın vejetatif yolla üretilerek yetiştirilmesi bu bitkide enfeksiyon yapan patojenlerin dünyaya yayılmasına neden olmuştur. Günümüzde asmanın hem kültür hem de yabani populasyonlarını oluşturan zengin bir gen potansiyeli bulunmaktadır (Çizelge 1.1.). Söz konusu asma gen potansiyelinin belirlenerek bir araya getirilmesi ve tanımlanmasına yönelik son yıllarda önemli bilimsel çalışmalar gerçekleştirilmektedir.
Çizelge 2.1. Asmanın taksonomik sınıflandırması
Alem Plantae
Bölüm Spermatophyta Alt bölüm Angiospermae Sınıf Dicotyledoneae Altsınıf Rosidae
Üst takım Celastranae
Takım Rhamnales
Aile Vitaceae
Cins Vitis
Tür Vitis vinifera
2.2 Asma ve Virüs Hastalıkları İlişkisi
Bağ alanlarında üzüm verimini ve kalitesini düşüren en önemli faktörler hastalık ve zararlılardır. Seksenli yıllarda Pearson ve Goheen (1981) abiyotik ve patojenik 43 bağ
hastalığı içinde 8 virüs hastalığına yer vermişlerdir. Dünya’daki bağ alanlarında toplam 21 cinse özgü 58 farklı virüs türü olduğu bilinmektedir. Günümüzde ise farklı familyalardan, 65 virüs, sekiz viroid ve dört satellite RNA’nın asma bitkilerini enfekte ettiği bilinmektedir (Chiumenti vd., 2016; Fiore, 2015; Maliogka vd., 2015a; Martelli, 2014). Ancak bağ virüslerinin ve farklı izolatlarının sayısı gün geçtikçe artmaktadır.
Asma, dünyanın en çok yetiştirilen ürünlerinden biridir. Vejetatif çoğaltma, çok sayıda tür için tanımlanan virüslerin, viroidlerin ve fitoplazmaların yayılmasındaki ana nedendir.
Bu hastalıklar, üretim kalitesini ve verimini önemli ölçüde etkileyen sınırlayıcı bir faktördür. Bu patojenler, enfeksiyon ve çoğalma için bitki hücre mekanizmasına bağlı olduğundan, virüs kontrolü bu etmenlerin hücreye girişi ve bitkide yayılmasının önlenmesine dayanır. Virüs teşhis ve tanısı sağlıklı bitki materyalinin üretimi için önemli bir noktadır. Bu nedenle, çoğaltım materyali olarak kullanılacak kaynak bitkilerin düzenli olarak biyolojik ve moleküler analizlerle test edilmesi ve uygun metotlarla analiz edilmesi gereklidir. Asmalarda genetik olarak farklı virüs ve ırkların enfeksiyonu, virüs teşhisinde sorun yaratabilmektedir.
Şekil 2.1. Sağlıklı bir bağ görseli (URL 1, 15 Aralık 2018)
Asmalar ticari olarak, kalemlerin anaçlara aşılanması veya dalların doğrudan köklendirilmesi ile üretilir. Bu vejetatif çoğaltma uygulamaları, çeşitli virüslerin ve viroidlerin aynı asmada buluşmasına neden olur. Dünya çapında bitki fidanlarının transferi virüslerin uzak mesafelere ulaşması ve farklı virüslerin karışmasını hızlandırmaktadır. Bu da, hastalıklardan ari bağ yetiştiriciliğinde ciddi sorun yaratmaktadır. Günümüzde, asmada hastalık yaptığı bilinen virüsler, yeni ortaya çıkan
veya henüz bilinmeyen virüslerin potansiyel rolünü belirlemeye devam etmektedir.
Ayrıca, tek bir bitkide genetik olarak çeşitlenen virüslerin veya viroidlerin bir arada olması, bir hastalığın etiyolojisinin anlaşılmasına yeni bir bakış açısı getirmektedir.
2.3 Asma Virüs Hastalıklarının Ekonomik Etkisi
Tarım alanında, viral kökenliler de dahil ortaya çıkan bitki hastalıklarından kaynaklı ürün kayıpları, özellikle gelişmekte olan ülkelerde önemli derecede sorun yaratmaktadır (Anderson vd., 2004). Doğru kontrol önlemlerinin uygulanması için hastalığın veya hastalıklara neden olan etmenlerin ortaya çıkışının erken saptanması ve dolayısı ile bu etmenlerin hızlı ve doğru bir şekilde tanımlanması gereklidir. Bir virüsün teşhisi ve tanısı tipik olarak fiziksel, biyolojik, serolojik ve moleküler yöntemler dâhil olmak üzere birçok yöntemin uygulanmasını gerektirir. Yeni virüs hastalıklarını belirlemek ve karakterize etmek için geleneksel yöntemler elektron mikroskobu gibi tekniklerin veya biyolojik deneylerde indikatör bitkilerin kullanılmasıdır (Kreuze vd., 2009). Virüsler ve benzeri yapılar konukçunun biyolojik sistemlerini kullanarak parazitler halinde çoğaldıkları için canlı hücrenin içine girdikten sonra aktif olmaktadır (Fiore, 2015). Asmalardaki viral hastalık etkileri, viral türlere, ırklara, veya iklimsel koşullara bağlı olarak farklı şekilde ortaya çıkabilir.
Asma viral hastalıkları bitki gücünü azaltmakta ve ekonomik ömrünü kısaltmaktadır.
Ayrıca, meyve olgunlaşmasını geciktirme, danelerin şeker, pigment içeriklerini etkileme ve asitliği arttırma gibi etkilerinden dolayı asmanın genel karakterlerini değiştirmektedir (Barba vd., 2015; Basso vd., 2010). Enfekte olmuş bitkilerde, karbonhidrat metabolizmasında ve hormonal dengelerde değişikliklere sebep olmakla birlikte, fotosentez potansiyelinde azalma, solunum hızında artış, fotosistem I ve II'nin elektron taşıma aktivitesine engel olma, klorofil seviyelerinin azalması ve yapraklarda çözünebilir şeker birikimi gibi olaylara neden olmaktadır (Basso vd., 2010). Bu stresler, üzüm danesinde düzensiz olgunlaşma ve bitki gelişimini etkileyerek filizlenmenin gecikmesine, strese karşı toleransın azalmasına ve hatta kronik olarak enfekte olmuş bitkilerin ölümüne neden olur (Weber vd., 1993).
ABD’de 25 yıllık bir dönemi kapsayan sürede yapılan incelemeler sonucu asma yaprak kıvrılma virüs hastalığının (Grapevine leaf roll disease) yaygın olmadığı üzüm
işletmelerinin karının hektar başına 25.000 dolardan 40.000 dolara etkilendiğini göstermiştir (Atallah vd., 2012). Bununla birlikte, pekçok asma virüsünün yarattığı ekonomik kayıp hakıında net bilgiler henüz yoktur.
2.4 Dünyada Önemli Bazı Bağ Virüs Hastalıkları
Üzüm üretimindeki kalite ve verim, çeşitli zararlılar ve hastalıklar tarafından etkilenmektedir. Bu hastalıklar içerisinde yaprak kırılma (grapevine leafroll), infektif dejenerasyon (infectious degeneration), kıvrımlı gövde hastalıkları (rugose wood complex) ve benekli yaprak (flek complex) hastalıkları dünya çapında önemli olmuştur (Martelli, 2014). Virüs ve virüs benzeri patojenlerin neden olduğu asma hastalıkları arasında, yaprak lekesi hastalıkları bağ sağlığını önemli ölçüde etkiler. Son yıllarda Geminivirus olan ABD’de Red blotch hastalığı (Al Rwahnih vd., 2013; Krenz vd., 2014;
Poojari vd., 2013), ABD’de asma yaprak damar açılması (Grapevine vein-clearing) ile asma geriye ölüm sendromu (Zhang vd., 2011), Yunanistan’da Roditis yaprak renk değişikliği (roditis leaf discolaration) (Maliogka vd., 2015a) gibi iki Badnavirüs, ayrıca Brezilya’da meyve geriye ölüm ile ilişkili sınıflandırılmamış bir virüs (Basso vd., 2015) tanımlanmıştır.
Dünyada en yaygın olarak görülen GLRaV’ler ve GFLV hakkında kısaca aşağıda bilgi verilmiştir.
2.4.1 Asma yaprak kıvrılma hastalığı (GLRD: grapevine leafroll disease)
Dünyada bağ alanlarında enfeksiyona neden olan virüs ve virüs benzeri hastalıklar arasında, asma yaprak kıvrılma hastalığı (Grapevine leafroll diseases; GLRD) ekonomik zarara neden olan en önemli hastalıktır. GLRD asmada % 20-40'lık verim kayıpları ile ilişkilendirilmiştir (Goheen, 1988; Woodrum vd., 1984). Bu hastalık, üzümlerde meyvenin zayıf renk gelişimine ve tekdüze olgunlaşmasına neden olur (Goheen ve Cook, 1959). Ek belirtiler arasında bazal yaprakların aşağı doğru kıvrılması, ardından sürgün uçlarına yakın yaprakların kıvrılması şeklindedir. Kırmızı üzüm çeşitlerinde karışık şekilde kızarma görülürken, beyaz üzüm çeşitlerinde kloroz ve floem bozulması görülmektedir (Hoefort ve Gifford, 1967; Weber vd., 1993) (Şekil 2.2).
GLRaV'ler, Closteroviridae ailesine aittir (Martelli vd., 2002) ve 3 farklı cinste yer alır:
(a) Closterovirüs, örn., GLRaV-2 (b) Ampelovirüs, örn., GLRaV-1, -3 ve -4 ve (c) Velarivirus örn., GLRaV-7 (Martelli ve Saldarelli, 2015) (Çizelge 2.4). Tipik simptomlar damarların yeşil kalması, damar aralarının kızarması veya sararması ve yaprak kenarlarının aşağıya doğru kıvrılmasıdır. Asimptomatik yapraklar veya daha hafif simptomlar da görülebilir (GLRaV-4 ve -7) (Maliogka vd., 2015a). Çeşitli yumuşak kabuklular ve unlu bit türleri ampelovirüslerin semi persitent şeklinde vektörleridir.
Bununla birlikte, GLRaV-2 ve GRLaV -7 için henüz hiçbir vektör tanımlanmamıştır.
Şekil 2.2. Grapevine leafroll disease (GLRD) yaprak simptomu (URL 2, 10 Aralık 2018).
Çizelge 2.2. GLRaVs’nin (Grapevine leafroll-associated viruses) ırkları (Martelli, 2015)
Virüs Cins Irk Genom büyüklüğü (nt) ORF Vektörler
GLRaV-1 Ampelovirüs 18,659 9 Unlu bit
GLRaV-2 Closterovirüs 16,494 8 Bilinmiyor
GLRaV-3 Ampelovirüs 18,494 12 Unlu bit
GLRaV-4 Ampelovirüs
GLRaV-4 13,830 6 Unlu bit
GLRaV-5 13,384 6 Unlu bit
GLRaV-6 13,807 6 Unlu bit
GLRaV-9 12,588 6 Unlu bit
GLRaV-Pr 13,696 6 Unlu bit
GLRaV-Car 13,626 6 Bilinmiyor
GLRaV-7 Velarivirus 16,494 10 Unlu bit
2.4.2 Kısa boğum hastalığı (GFLV: grapevine fanleaf virus disease)
GFLV’nün neden olduğu kısa boğum hastalığı 1950’li yıllarda keşfedilen ve asmanın bilinen en eski virüs hastalıklarından birisidir. Tüm Dünya’da asma yetiştiriciliğinin yapıldığı her yerde görülebilmekle beraber Asya, Afrika, Avrupa, Yeni Zelanda, Avustralya, Kuzey ve Güney Amerika’da bu hastalığın varlığı bildirilmiştir. GFLV, toprak kökenli nematod türü Xiphinema index tarafından asmadan asmaya taşınmak suretiyle bu kültür bitkisinin dejenerasyonunda önemli bir patojendir (Demangeat vd., 2010). Bu virüsün varlığının bilinmesi birçok virüs ve nematod ilişkisinin açığa çıkmasına önderlik etmiştir. Coğrafi dağılımı ve ekonomik önemi dikkate alındığında GFLV, V. vinifera ve hibrit asma anaçları üzerinde yaygın ve sıklıkla görülen bir virüsdür.
Şekil 2.3. Kısa boğum hastalığı (GFLV: grapevine fanleaf virus disease) yaprak simptomu (URL 3, 12 Aralık 2018)
Çizelge 2.3. GLRaVs’nin (Grapevine leafroll-associated viruses) ırkları (Martelli, 2015) Virüs Cins Irk Genom büyüklüğü (nt) ORF Vektörler
GLRaV-1 Ampelovirüs 18,659 9 Unlu bit
GLRaV-2 Closterovirüs 16,494 8 Bilinmiyor
GLRaV-3 Ampelovirüs 18,494 12 Unlu bit
GLRaV-4 Ampelovirüs
GLRaV-4 13,830 6 Unlu bit
GLRaV-5 13,384 6 Unlu bit
GLRaV-6 13,807 6 Unlu bit
GLRaV-9 12,588 6 Unlu bit
GLRaV-Pr 13,696 6 Unlu bit
GLRaV-Car 13,626 6 Bilinmiyor
GLRaV-7 Velarivirus 16,494 10 Unlu bit
2.5 Asma Virüs Hastalıkları ile ilgili Ulusal Çalışmalar
Türkiye bağlarında asmalarda önemli görülen ve önlem alınması gereken virüs ve virüs benzeri önemli hastalıklar bulunmaktadır. Bu hastalıklar ve sebep olan etmenleri; GFLV, GLRaVs, Grapevine fleck virus (GFkV), Arabis mosaic virus (ArMV), Strawberry latent ringspot virus (SLRSV), Tomato ringspot virus (ToRSV), Raspberry ringspot virus (RpRSV), Grapevine virus A (GVA), Grapevine virus B (GVB), Grapevine deformation virus (GDefV), Grapevine rupestris stem pitting-associated virus (GRSPaV) saptanmış;
son zamanlarda ise Grapevine Pinot gris virus (GPGV) ve Grapevine Syrah virus-1 (GSYV) gibi yeni virüsler asmalarda karakterize edilmiştir (Buzkan vd., 2010; Çağlayan ve Gazel, 1998; Gazel vd., 2016; Köklü ve Baloğlu, 2000; Tülek, 2014).
Türkiye'de Syrah, Palieri ve Antep karası asma çeşitleri toplanarak, GSyV-1, GPGV, GVA ve Grapevine rupestris kök çukuruna bağlı virüs (GRSPaV) infeksiyonu açısından RT-PCR ile test edilmiştir. Toplam 302 asma örenğinden (Cvs. Syrah ve Antep karası) GSyV-1 ile enfekte olduğu bulunmuştur. Bilindiği kadarıyla Türkiye' de GSyV-1 'in varlığını ortaya koyan ilk çalışmadır (Caglayan vd., 2017).
Ulubaş Serçe vd. (2018), yaptıkları çalışmada ülkemizdeki asmalarda GPGV' nın (%
9,08), GSyV-1 (% 5,17)' e göre daha yaygın olduğunu belirlemişlerdir. Ege, Akdeniz, Doğu Anadolu ve Güney Doğu Anadolu' dan farklı sayıda izolatlar taranmış ve analiz edilmiş, GPGV' nin belirgin şekilde iki gruba ayrıldığı saptanmıştır. GSyV-1 izolatlarının ise coat protein açısından üç gruba, poli protein açısından iki gruba ayrıldığı saptanmıştır.
Türkiye izolatları yerel izolatlarla aynı kümede yer almıştır. Hem GPGV hem GSyV-1 için Türkiye viral izolatları açısından farklılık gözlemlenmemiştir.
2.6 Asmada Yeni Ortaya Çıkan DNA Virüs Hastalıkları
2.6.1 Asma kırmızı leke ile ilişkili virüs (GRBaV: grapevine red blotch disease)
İlk olarak 2008 yılında Kaliforniya (ABD) 'da bildirilen Geminiviridae familyasından bir virüsdür (Calvi, 2011). Kırmızı meyveli asma çeşitlerinde yaprak simptomları, erken dönemlerde asma yapraklarının çoğunda genişleyelen ve sürgünlerin orta yapraklarına kadar uzayan bazal yaprakların kırmızı lekelenmesi şeklindedir. Aksine, beyaz meyveli
çeşitlerde simptomlar daha belirsiz ve genellikle nekrotik hale gelebilecek düzensiz klorotik bölge oluşturmaktadır (Sudarshana vd., 2015). Hastalıklı asma danelerinde, toplam çözünebilir katı madde, meyve kalitesinde düşme ve gecikmiş olgunlaşma simptomu görülür. Son zamanlarda yapılan çalışmalarda, hastalığa sebep olan etmen, infektif klon olarak asma içine inoküle edildiğinde bu simptomların asma kırmızı leke ile ilişkili virüs (Grapevine Red blotch disease; GRBaV) olduğu tespit edilmiştir (Al Rwahnih vd., 2013; Poojari vd., 2013).
Şekil 2.4. Grapevine kırmızı leke ile ilişkili virüs (GRBaV) yaprak simptomu (Gohil, 2016)
2.6.2 Damar açılması ve asma geriye ölüm hastalığı (GVCV: vein-clearing and vine decline syndrome)
2004 yılında Missouri'de (ABD) ticari bir bağda ortaya çıkmıştır (Qiu vd., 2007).
Badnaviridae familyası üyesidir. Grapevine damar açıklığı virüsü (Grapevine vein clearing virus; GVCV), damar açıklığı simptomu, internodların kısalması, kırışık yapraklar, şekilsiz ve küçük üzüm meyveleri ile düzensiz şekil ve anormal doku ile ilişkili bulunmuştur (Guo vd., 2014; Zhang vd., 2011). GVCV'nin bilinen bir böcek vektörü yoktur ve ekonomik önemi açıkça tanımlanmamıştır. Bununla birlikte, bazı badnavirüslerin unlu bitler tarafından taşındığına dikkat edilmelidir (Martelli ve Saldarelli, 2015).
Şekil 2.5. (GVCV) Damar açıklığı ve üzüm azalması hastalığı yaprak simptomu (R.
Keith Striegle, 2011)
2.6.3 Roditis yaprak renk değişikliği hastalığı (GRLDaV: roditis leaf discoloration- associated virus disease)
Asma bağlarında görülen hastalıklardan Roditis yaprak renk değişikliği hastalığı (Roditis leaf discoloration disease) ilk kez 1980’li yıllarda Yunanistan asma bağlarında bildirilmiştir (Rumbos ve Avgelis, 1989). Son yıllarda bu hastalıkla ilişkili, Asma Roditis yaprak renk değişikliği-ilişkili virus (Grapevine roditis leaf discoloration-associated virus; GRLDaV) asmalarda genç yapraklarda sarı veya kızıl renk değişiklikleri ve deformasyon, asma danelerinde küçülme ve sayısında azalma, düşük şeker içeriği simptomları ile ilişkili bulunmuştur (Maliogka vd., 2015b). Bu DNA virüsü dünya genelinde şimdiye kadar sadece Yunanistan, İtalya, Türkiye ve Hırvatistan’da rapor edilmiştir. Maliogka vd. (2015b) bu hastalığın bir Badnavirüs ile ilişkili olduğunu bildirmiş ve virüse Roditis yaprak renk değişikliği ile ilişkili virüs (Grapevine roditis leaf discoloration-associated virus; GRLDaV) adını vermiştir. Bu virüsün dünyada yaygınlığı bilinmemekle birlikte bir diğer kayıt İtalya’dan olmuştur (Giampetruzzi vd., 2012).
Türkiye bağlarından seçilen simptomlu örneklerin YND analizleri sonucunda bazı örneklerde bu virüsün genomu tespit edilmiştir (Ulubaş Serçe vd., 2018). Yunanistan’da yapılan çalışmada, enfekteli bir asmadan elde edilen siRNA'ların yeni nesil dizilimi ile RLD hastalığının etiyolojisini araştırılmış ve elde edilen sonuçlara göre, simptomlu örneklerin GLRDaV hastalığı ile yakından ilişkili olduğunu belirlemişlerdir. RLD simptomlarını gösteren tüm bağlarda ve 6 asimptomatik asmasının sadece 1'inde Roditis
tanımlanmıştır (Maliogka vd., 2015b). Roditis ile ilgili yapılan bir çalışmada Apulia (İtalya) 'da yerli bir asma türü olan ‘‘Bombino nero’’ dan izole edilen yeni bir Badnavirüsün tüm nükleotit sekansı ve genom organizasyonu belirlenmiştir. Bu virüsün genomu 7097 nt'den oluşur ve dört açık okuma çerçevesine (ORF) sahiptir. Nükleotid analizi, bu yeni Badnavirüs'ü GRLDaV-BN olarak adlandırılan bir GLRDaV ırkı olarak sınıflandırmıştır (Chiumenti vd., 2016).
Ayrıca, yakın zamanda İtalya’nın Apulia bölgesinde bazı simptomsuz asmalarda bu virüs tespit edilmiştir (Giampetruzzi vd., 2012). Doğal hastalık yayılımının gözlenmesi ve hastalık etmeninin bir Badnavirus olduğunun belirlenmesi ile vektörünün pseudococcid unlubitler olabileceği ve bu unlubitlerin virüs taşınmasında rol oynayabileceği düşünülmektedir (Martelli ve Saldarelli, 2015).
Şekil 2.6. Roditis çeşidinin yapraklarında (a-c) ve asma salkımlarında (d ve e) roditis yaprak lekesi (RLD) hastalığı belirtileri.
Sağ taraftaki salkım sağlıklı bir bitki (d) (Maliogka vd., 2015b)
Hırvatistanda yapılan bir çalışmada dört yerli asma türünden elde edilen toplam RNA örneklerinin yeni nesil diziliminde, iki asma örneğinde yeni bir virüsün varlığını ortaya çıkarmıştır. Yeni badnavirüsün RT / RNaz H bölgesi, Roditis yaprak renk değişikliği ile ilişkili virüs (GRLDaV) izolatı w4 (HG940503) 'ün en yüksek nt dizisi benzerliğini % 76 olarak göstermiştir (Vončina ve Almeida, 2018).
Şekil 2.7. GLRDaV’nin dünyada tespit edildiği yerler (kırmızı halka) (Bhat vd., 2016)
2.7 Asmada Yeni Ortaya Çıkan RNA Virüs Hastalıkları
2.7.1 Chlorotic mottling and leaf deformation (GPGV: grapevine pinot gris virus)
Trentino Alto Adige üzüm bağlarında (İtalya). 2003 yılından beri gözlenen simptomların yeni bir RNA virüsü olan Grapevine Pinot gris virüsü (GPGV) ile ilişkili olduğu bulunmuştur (Giampetruzzi vd., 2012). Virüsün son zamanlarda Kaliforniya'daki asmalarda, ABD ve Çin gibi birçok Avrupa ülkesinde pekçok asma çeşidini enfekte ettiği bildirilmiştir (Al Rwahnih vd., 2009; Beuve vd., 2015; Fan vd., 2016; Gazel vd., 2016;
Glasa vd., 2014; Martelli, 2014; Saldarelli vd., 2015). Farklı viral ırkların ve farklı çeşitlerin duyarlılığı nedeniyle virüsün hastalıkla olan ilişkisi açıkça belirlenememiştir (Saldarelli vd., 2015). Bununla birlikte virüs ile ilişkili hastalık, bitki canlılığını etkilediği ve verimi azalttığı için de önemli bir ekonomik etkiye sahiptir. Eriophyidae akarı Colomerus vitis, GPGV'nin bir vektörüdür (Malagnini vd., 2016) ve Chenopodium album L. (beyaz kazayağı) GPGV'nin arazide infeksiyon kaynağı olarak düşünülebilir (Gualandri vd., 2017).
Şekil 2.8. Grapevine pinot gris virus (GPGV) yaprak simptomları (Saldarelli vd., 2015)
2.7.2 Decline of syrah grapevines (GSyV-1: grapevine syrah virus-1)
Bu virüs ilk olarak Fransa'da gözlemlenmiştir (Renault-Spilmont vd., 2004). Daha sonra Kaliforniya üzüm bağlarında bildirilmiştir (Battany vd., 2004) ve çeşitli viral türlerle ilişkilendirilmiştir. Tipik hastalık belirtileri, yaprak yanması, aşı kaynağının şişmesi, yüzeysel çatlama, odunsu doku ve kök nekrozunun çukurlaşması gibi simptomlar yaşlı asmalarda görülür (Al Rwahnih vd., 2009). Bu virüs için hastalıklı üzümlerden toplanan yaprak bitlerinde (marafivirüsler için) vektör varlığı bildirilmiştir (Al Rwahnih vd., 2009).
Şekil 2.9. Grapevine syrah virus (GSyV) simptomları; yaprak kızarması ve aşı bölgesi şişmesi (Jefford, 2013)
2.8 Badnavirüsler
Badnavirüsler (Familya: Caulimoviridae; Cins: Badnavirüs), 3-7 ORFye sahip yaklaşık 7.2 ila 9.2 kb dsDNA içeren, zarfsız basil formunda DNA virüsleridir. Bu virüs cinsi, semi persistent yolla unlu bitler ve çok az sayıda yaprak biti türü tarafından aktarılır. En önemli bitki virüs gruplarından birisidir. Tropik bölgelerde özellikle muz, karabiber, kakao, turunçgil ve şekerkamışı bitkilerinde ortaya çıkan önemli hastalıklarla ilişkilidir.
Bazı badnavirüsler, konukçu genomlarına entegre olan epizomal virüsler olarak da bilinir ve bu tür episomal virüslerin birkaçı abiyotik stres yoluyla fark edilebilir. Epizomal virüs formları, konukçu genomuna bütünleşmiş olabilir ve kromozomdan ayrıldıktan sonra bağımsız olarak replike olabilir. Bu nedenle, hatasız bir teşhis, taksanomi ve hastalık yönetimi konularında yapılan çalışmalarda, endogenik badnavirüslerin bulunması yeni zorlukların ortaya çıkmasına neden olmaktadır.
Pararetrovirüslerden olan Badnavirus, çift iplikli bir DNA genomu içerir ve retrovirüsler gibi bir RNA ara ürünü ile çoğalır. Fakat pararetrovirüs genom entegrasyonu standart replikasyon döngüsünün bir parçası değildir. Bunun yerine, konukçu çekirdeğinde minikromozomlar olarak birikirler. Bitki pararetrovirüsleri olan Badnavirüsler, tüm dünyada ekonomik olarak önemli bitki bitkilerinin geniş bir yelpazesini enfekte etmektedir. Çeşitli bitkilerde farklı türlerin neden olduğu ekonomik kayıp % 10 ile % 90 arasında değişmektedir. Genom, çift iplikçikli açık dairesel DNA'nın tek dairesel bir molekülünden oluşur. En fazla üç açık okuma çerçevesi (ORF), genomdan daha uzun olan RNA transkriptinden dönüştürüldüğü düşünülen kısımları içerir. Tüm genom 7200–
9200 bp uzunluğundadır. Badnavirüslerin, bazı konukçu bitki genomlarında entegre sekanslar olarak mevcut oldukları ve daha sonra endojen badnavirüsler olarak adlandırıldığı da bilinmektedir (Hohn vd., 2008).
Badnavirüslerin hem monokot hem de dikotları enfekte ettiği bilinmektedir, ancak türlerin çoğu sınırlı bir konak aralığına sahiptir. Genelde, badnavirüslerin neden olduğu simptomlar konakçıya, çeşitlerine, virüs türlerine ve çevresel koşullara bağlı olarak değişkendir. Çoğu durumda simptomlar hafif ila orta derecededir. Klorotik motifi veya nekrotik çizgileri, yaprakların deformasyonu ve bitkilerin bodurlaşmasına neden olan azalmış internod uzunluğunu içerir. Hastalıklı bitkilerin asemptomatik doğası ve belirli
dönemlerde semptomların gizlenmesi, badnavirüslerle enfekte olan çoğu bitki için yaygındır (Hohn vd., 2008).
2.9 Bitki Virüs Teşhisi
Yeni virüslerin tespiti ve tanımlanması hem geleneksel hem de modern olmak üzere çok çeşitli tekniklere dayanmaktadır. Tipik olarak süreç, serolojik (ELISA) veya moleküler yöntemlere (PCR) dayanan belirli testlerden oluşan bir panel kullanarak, şüpheli olan
"bilinen" virüslerin taranmasıyla başlar. Son zamanlarda, viral teşhiste daha esnek bir yaklaşım sunan ve aynı anda çok sayıda hedef patojenin test edilmesine imkan veren mikrodizi teknikleri geliştirilmiştir. İlk olarak, teşhis metotları ile hangi patojenlerin konukçuya bulaştığı konusunda bilgi edinilir. Ancak, pekçok virüs etmeninin özellikle yeni konukçuları hakkında bilgiler eksiktir. İkinci olarak, mikrodizileri içeren spesifik testler ile belirli bir ırkı, türleri veya küçük bir patojen grubunu kapsayan reaktifler (DNA primerleri, problar veya antikorlar) kullanır. Ancak, bu reaktifler, beklenmedik şekilde ortaya çıkabilen, yeni ırklar gibi varyantları tespit edememektedirler. Sonuç olarak, bu etmenler tespitten kaçabilir ve hızla yayılabilir. Üçüncü olarak, spesifik olmayan yöntemler (örn., konukçu bitki inokulasyonu veya elektron mikroskobu), bir viral patojenin varlığının saptanması için ait olduğu virüslerin ailesinin veya cinsinin tanımlanması için faydalı olabilir. Bununla birlikte, kesin bir tanımlamaya ulaşmak için daha fazla bilgi ve analiz gereklidir. Diğer önemli bir konu da yeni bir hastalığın tanımlanması için gereken süredir. Çoğunlukla çoklu paralel testlerin performansının gerekliliği nedeniyle, daha önce karakterize edilmiş bir virüsün yeni bir konukçuda tanımlanması bile haftalar veya aylar alabilir. Sonuç olarak yeni bir patojenin tanımlanması oldukça uzun sürebilir.
Doğru ve güvenilir tanı yöntemlerinin uygulanması, virüsden ari bitki materyali üretmeyi ve sürdürmeyi amaçlayan programlarda temel öneme sahiptir ve asma viral hastalıklarının önlenmesi ve kontrol stratejilerinin başarısı için çok önemlidir (Maliogka vd., 2015a; Roossinck vd., 2015). Asma gen kaynaklarının sağlık durumunun izlenmesi, biyolojik indeksleme, transmisyon elektron mikroskobu (TEM), serolojik ELISA tabanlı yöntemler, prob bazlı nükleik asit hibridizasyonu, PCR tabanlı moleküler yöntemler, YND teknolojisine geçiş gibi teknikler ile virüs teşhisi yıllar içinde gelişmiştir (Al Rwahnih vd., 2015; Burger ve Maree, 2015; Maliogka vd., 2015a). Bütün bu yöntemler
önemli sınırlamalar ve çeşitli avantajlar sunmaktadır (Basso vd., 2014). Bitki viral hastalıklarla mücadelede ilk adım bitkisel ürünlerde virüs sörveylerinde, karantina ve sertifikasyon sistemlerinde kullanılabilecek, doğru ve hızlı teşhis metotlarının geliştirilmesi ve geniş uygulama alanı bulmasıdır. Asma bitkilerinin vejetatif yolla üretilmeleri ve çok yıllık olmaları nedeniyle, farklı virüslerin bir arada toplanması sonucu bu bitkide hastalık yapacak yeni viral türler ve ırkların ortaya çıkması mühtemel bitki grubudur. Son yıllarda moleküler tekniklerde meydana gelen gelişmeler ile özellikle YND teknolojileri ve YHA yöntemleri ile yeni bitki virüsleri tespit edilmektedir. Genom dizileri bilinmeyen yeni virüsleri keşfetme yöntemlerinden biri, enfekte olmuş örneklerden viral RNA genomlarının replikasyonu sırasında oluşan ara RNA molekülleri olan çift zincirli RNA'ları (dsRNA'lar) çıkarmaktır. Bir dsRNA'dan elde edilmiş cDNA’nın YND ile dizilenmesi, ELISA veya RT-PCR ile tespit edilemeyen virüsleri, virüs spesifik antiserumun önceden üretimini gerektiren veya virüs türevli sekansların bilgisini gerektiren tekniklere alternatif olabilir. dsRNA kullanılarak yapılan YND yöntemi son zamanlarda bağlarda ciddi virüs benzeri hastalıklara neden olan viral patojenlerin araştırılmasında kullanılmıştır. Metagenomik, nükleotid dizi içeriğinin analiz edilerek, bir örnekte mikrobiyal popülasyonların araştırılması için bir yaklaşımdır.
Virüsler de dahil olmak üzere çok çeşitli örneklere uygulanmıştır. Tanısal bitki virolojisine yönelik bir metagenomik yaklaşım, diğer teşhis metotları ve geleneksel araştırma teknikleriyle ilişkili patojen tahmini problemlerinin üstesinden gelme imkanı sunmaktadır. RNA virüsleri, viroidler ve DNA virüslerinin aktif olarak çoğaldıkları sırada oluşturulan RNA aşamaları ile doğrudan dizilenebilir. Genomik DNA'yı değil, cDNA dizilenerek, sadece aktif konakçı genler dizilenir ve büyük miktarda eksprese olmamış genomik DNA'nın önüne geçilir. Ayrıca badnavirüsler gibi bazı bitki virüslerinin entegre genomlarından da kaçınılabilir.
2.9.1 Biyolojik indeksleme
Geleneksel yöntemler günümüzde bitki virüslerini testlemede çoğu laboratuvar çalışmalarında yaygın şekilde kullanılmaktadır (Hohn vd., 2008). Biyolojik indeksleme bitki virüs teşhisinde en çok uygulanan ve en eski yöntemdir. Mekanik, aşılama ve vektör ile biyolojik indeksleme de indikatör bitkilere virüs taşıması yapılmaktadır. İndikatör olarak kullanılan bitkiler üzerinde gözlemlenen simptomlar birçok virüsün tespit edilmesinde ve tanımlanmasında etkili olmaktadır. Bu tür testler, virüslerin sürekli olarak
teşhisi için kullanılmasına rağmen, virüs tespitini kesin olarak yapmamakla birlikte, hem zaman hem de materyal kaybına neden olmaktadır.
2.9.2 Nükleik asit temelli moleküler tanılama metotları
Moleküler tanılama tekniklerine her geçen gün yenisinin eklenmesiyle birlikte yapılan bilimsel çalışmalara olumlu katkı sağlamaktadır. Nükleik asit temelli metotlar bitki virüslerinin tespit ve teşhisinde polimeraz zincir reaksiyonunun (PCR) ortaya çıkmasıyla birlikte yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır (Saiki vd., 1988). Nükleik asit temelli teşhis yöntemlerinde virüsün genomun herhangi bir bölgesi hedeflenerek teşhisi yapılabilir. Bu alanda her bir bitki de farklı özellik göstermekte ve türler içinde, organlarda veya bitki dokusunda moleküler olarak kullanılmak için bitkinin DNA veya RNA izolasyonu işleminde de farklı davranabilmektedirler. Bundan dolayı çeşitli izolasyon yöntemleri de geliştirilmiştir. Ayrıca bu yöntemler sırasında bazı sorunlarla karşılaşılmaktadır. Karşılaşılan sorunların başında fazla miktarda polisakarit varlığının olması, yüksek RNaz seviyesi ve farklı fenolikler bileşikler, düşük konsantrasyonda nükleik asitler gibi yapıların ayrışmasında zorluklar yaşanmaktadır. Bitki nükleik asit ekstraksiyonunda genel olarak, biyoteknolojik ürünlerin satışını sağlayan şirketlerden alınan kitler nükleik asit izolasyonu için yeterli olabilir, ancak bazı durumlarda önceden RNA veya DNA izole edilmemiş bir bitki veya bitki dokusu kullanıldığında, kit içerisindeki malzemelerin özelliklerine göre uyum sağlaması ve iyi bir nükleik asit elde etmek için bazı yöntemlerin değiştirilmesi gerekebilir. Özellikle PCR çalışmalarında kaliteli bir ürün elde etmek için nükleik asit izolasyonu için kullanılan yöntem ve izolasyon sonucunda elde edilen viral RNA veya DNA’nın kalitesi önemlidir (Boston ve Haliloğlu, 2010). PCR çalışmalarındaki başarılardan bir diğeri de doğrudan bitki öz suyunu kullanmak yerine saflaştırılmış şekilde RNA veya DNA’nın kullanılması daha etkili olmaktadır.
2.9.2.1 Polimeraz zincir reaksiyonu
Polimeraz zincir reaksiyonu; bakteri, virüs, fungus, gibi hastalık etkenlerine ait hedef bölgeye göre nükleik asit zincirlerinin, spesifik primerler kullanılarak, ısıya dayanıklı DNA polimeraz enzimi kullanarak laboratuvar ortamında çoğaltılmasıdır (Gould ve Symons, 1983; López vd., 2003). Üzerinde çalışılan genetik materyal, çok az sayıda olsa
bile çoğaltılabilir ve tanımlanabilir (Arda, 1995; Schochetman ve Jones, 1988). DNA dizileri çoğaltılırken istenmeyen dizilerin baskılanması mümkün olabilir. Böylelikle DNAdizisinin tanımlanması daha kolaylaşmaktadır (Saiki vd., 1988; Walker ve Dougan, 1989). PCR sırasında üç aşamalı döngü şeklinde gerçekleşip, sırasıyla; denatürasyon, primer bağlanması ve primer uzaması şeklindedir (Şekil 2.10.).
Kalıp DNA: Başlangıç olarak çoğaltılacak olan, baz dizisine sahip genetik material kalıp DNAdır. Eğer genetik materyal için DNA yerine RNA kullanılacaksa reaksiyondan önce ters transkriptaz kullanılarak RNA, komplementer DNA’ya (cDNA) çevrilir ve cDNA için kalıp olarak kullanılarak PCR işlemi yapılır (Arda, 1995; Miwa vd., 1997; Rodriguez, 1997). Denatürasyon: Çift iplikli kalıp DNA yüksek sıcaklıkta denatüre edilir. Primer bağlanması: Çift ipliğin açılmasıyla tek iplikli hale gelen DNA dizilerinden her birinin, 3’ ucundaki nükleotitlere uygun sıcaklıkta olan primerler bağlanır. Uzama: Yüksek ısıya dayanıklı polimeraz enzimi, primerler ve kalıp DNA’yı kullanarak çift iplikli DNA sentezler ve çoğaltma işlemi gerçekleşir (Türkyılmaz ve Esendal, 2002).
Şekil 2.10. Polimeraz zincir reaksiyonu aşamaları (Andy,1999)
2.9.2.2 Yuvarlanan halka amplifikasyonu (RCA: rolling circle amplification)
YHA metodu asma bitkilerinde virüs amplifikasyonu ve teşhisi amacıyla başarılı bir şekilde kullanılmaktadır (Basso vd., 2015; Krenz vd., 2012). Bakteriyofaj Phi29 DNA polimeraz kullanan YHA, halkasal DNA genomlarının amplikasyonunda kullanılabilen, nükleik asit dizisine bağımsız bir yöntemdir. Bu açıdan klasik PCR sistemlerinde gerekli olan hedefe spesifik primer bilgisi gerektirmemektedir (Dean vd., 2001; James vd., 2011;
Reagin vd., 2003; Rector vd., 2004). YHA metodu şimdiye kadar Geminiviridae, Nanoviridae ve Caulimoviridae familyalarında başarılı bir şekilde uygulanmıştır (Homs vd., 2008; James vd., 2011; Laney vd., 2012; Paprotka vd., 2010). Tek bir primer kullanıldığında bu metod ile genotipleme ve mutasyon analizi yapılabilir. Komplementer kolda bağlanma noktaları olan ek primerlerin eklenmesi ile daha etkili bir amplifikasyon her iki kolda da gerçekleşir. Bu durumda amplifikasyon ürünler dsDNA içerir. Spesifik primer çiftlerinin kullanılması durumunda şablon dizinin iyi bir amplifikasyonu gerçekleşebilir (Johne vd., 2009). Çok primerli YHA metotları, tesadüfi veya spesifik primerlerin şablon molekülünün pek çok bölgesine bağlanması ve amplifikasyon ürünlerinin miktarının artmasını sağlamaktadır. Halkasal şablonların çok primerli YHA metodu yuvarlanan amplifikasyon etkisinden dolayı daha güçlüdür.
Phi29 polimerazın çok primerli YHA metodu kullanılarak, suni halkasal 150 bp bir DNA molekülünün 107-kat amplifiye edildiği tespit edilmiştir (Nelson vd., 2002). Viral genomların YHA metodu ile ilk kez 2004 yılında phi29 DNA polimeraz kullanılarak yapılmıştır. Rector vd. (2004) dsDNA genomu içeren papillomavirus genomunu bu yöntem ile bitki doku örneklerinden amplifiye etmiştir. Aynı dönemde Inoue-Nagata vd.
(2004) geminivirus halkasal ssDNA genomunu klonlamak amacıyla kullanmıştır.
Brezilya’da asma bağları ile, armut ve elma bahçelerinde viral kökenli olabileceği düşünülen simptomlu ağaçlardaki etmen virüslerin DNA virüsleri olan ilişkisini belirlemek için, simptomlu bitkilerden alınan örneklerde YHA metodu uygulanmış ve sonuçta halkasal ssDNA virüsü olan Ilıman meyve çürüme ile ilişkili virüs (Temperate fruit decay associated virus; TFDaV) bulunmuştur (Basso vd., 2015). Sonuç olarak halkasal DNA genomu taşıyan viral etmenlerin, primer bilgisi gerektirmeden teşhisinin yapılması, belirlenen virüsün tüm genomunun elde edilmesi amaçlarına en iyi hizmet eden yöntem YHA yöntemidir.
YHA'da, bir DNA çemberi, kısa bir DNA primeri (çemberin bir kısmına tamamlayıcı) ve bir enzim katalizörü, dNTP'leri, çemberin ardışık olarak tekrarlanan binlerce kopyasından oluşan tek iplikçikli bir eş zamanlı DNA molekülüne dönüştürür (Nallur vd., 2001).
Yuvarlanan halka amplifikasyonu iki eşzamanlı işlemi içerir: (1) DNA polimerazı, dairesel bir şablona tamamlayıcı dizileri sentezlemelidir. (2) Bu çoğaltma ilerledikçe, bazı mekanizmalar polimerazın ilerlemesine izin vermek için ana ve babaya ait ikiliyi açmalıdır. Fizyolojik yuvarlanan halka replikasyonu için modeller genellikle, çoğalmanın devam etmesine izin vermek için polimerazdan önce gelen bir helikaz veya tek iplikli DNA bağlama aktivitesi ile baskın olarak çift şeritli bir şablon içerir. Karakterize edilmiş yuvarlanan halka amplifikasyon mekanizmalarının, kilobazlar ve daha büyük dizideki şablonlar üzerinde çalıştığı bulunmuştur (Fire ve Xu, 1995).
Şekil 2.11. Mikro-diziler üzerinde RCA (Rolling circle amplification)™ 'nın kimyasal yapısı
YHA primer 5′ ucundan sabitlenmiştir ve çemberin hibritleştiği 3′ ucunu içerir. Daire sekansına tamamlayıcı bir sekansın tekrarlayan ünitelerini içeren lineer eş zamanlı YHA ürünü, floresan etiketler içeren kısa oligonükleotidlerin hibridizasyonu ile tespit edilir (Şekil 2.11).
YHA 1989 yılında farklı DNA polimerazlar ve farklı halkasal DNA şablonları kullanılarak in vitro’da kullanılmaya başlanmıştır (Fire ve Xu, 1995). Tek kollu şablon moleküle primer bağlanmasından sonra polimeraz nükleotidlerle temasa geçer ve 5′-‘den- 3′ yönüne şablonun komplementerini yapar. Doğrusal şablon molekülü durumunda sentez şablonun sonunda tamamlanır. Halkasal şablon durumunda polimeraz primer bağlanma noktasına ulaşsa dahi yeni sentezlenen kolu kaldırır ve DNA sentezine birkaç döngü şablon uzunluğuna bağlı olarak devam eder. Bu mekanizma ile şablon dizinin tekrarlı kopyalarını içeren büyük bir DNA molekülü üretilir. Tek bir primer kullanıldığında bu metot genotipleme ve mutasyon analizi yapılabilir. Komplementer kolda bağlanma noktaları olan ek primerlerin eklenmesi ile daha etkili bir amplifikasyon her iki kolda da
gerçekleşir. Bu durumda apmlifikasyon ürünleri dsDNA içerir. Spesifik primer çiftlerinin kullanılması durumunda şablon dizinin iyi bir amplifikasyonu gerçekleşebilir (Johne vd., 2009).
Şekil 2.12. Yuvarlanan-halka amplifikasyonunun genel prensibi
Mavi çizgiler hedef DNA, yeşil çizgiler oligonükleotid primerler ve kırmızı çizgiler yeni sentezlenen DNA’dır. Oklar 3′ uca uzayan DNA koludur.
doğrusal şablon ve tek primer (a), halkasal şablon ve tek primer (b), halkasal şablon ve çok tesadüfi primerli (c) (Johne vd., 2009).
Çok primerli YHA metotları, tesadüfi veya spesifik primerlerin şablon molekülünün pek çok bölgesine bağlanması ve amplifikasyon ürünlerinin miktarının atmasını sağlamaktadır. Halkasal şablonların çok primerli YHA metodu yuvarlanan amplifikasyon etkisinden dolayı daha güçlüdür. Phi29 polimerazın çok primerli YHA metodu kullanılarak, suni halkasal 150 bp bir DNA molekülünün 107-kat amplifiye edildiği tespit edilmiştir (Nelson vd., 2002).
Toplam DNA örnekten ekstrakte edilir, tesadüfi primerler veya spesifik primerler eklenir.
Isı ile denatürasyondan sonra, phi29 polimeraz ve dNTPs eklenerek 30˚C’de reaksiyon tüm gece gerçekleştirilir. Büyük moleküllü YHA ürünleri restriksiyon enzim kesim analizleri ile incelenir. Tek kesim bölgesine sahip enzim kullanılarak genom büyüklüğünde oluşan ürünler daha sonra klonlanır ve dizilenir. Gen bankası verileri ile dizi karşılaştırmaları yapılır (Johne vd., 2009).
Şekil 2.13. Halkasal viral DNA genomuna çok primerli YHA uygulaması aşamaları.
Mavi çizgiler; hedef DNA, yeşil çizgiler; oligonükleotid primerler, kırmızı çizgiler; yeni sentezlenen DNA’dır. Oklar 3′ uca uzayan DNA koludur.
örnekten izole edilen toplam DNA (a), çok primerli YHA uygulaması (b), tek kesim bölgeli enzim ile kesilen YHA ürünü(c), klonlanmış DNA fragmentleri ve elde edilen
dizileri (d) (Johne vd., 2009).
3 BÖLÜM III
3 MATERYAL VE METOT
3.1 Grapevine Roditis Leaf Discolaration-associated Virus (GRLDaV) İzolatları
Araştırmada tüm genom elde etmek amacıyla Ulubaş Serçe vd. (2018) tarafından tespit edilen GRLDaV izolatlarından biri (izolat no: B42) kullanılmıştır. İzolat 2015 yılı ilkbahar ve sonbahar aylarında toplanarak, sıvı azot ile ezilmiş ve –80°C’de muhafaza edilmiştir. Ayrıca, tez kapsamında bu izolatın temin edildiği bahçeden farklı asma örnekleri toplanmış, GRLDaV teşhisi ve test bitkilerine inokulasyon çalışmaları yapılmıştır. Tez kapsamında toplanan asma örnekleri de –80°C’de muhafaza edilmiştir.
3.2 GRLDaV Teşhisi Amacıyla Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)
3.2.1 Nükleik asit izolasyonu
Bitki materyallerinden nükleik asit izolasyonu amacıyla DNA ve RNA ekstraksiyon kitleri kullanılmıştır. Bu amaçla, DNeasy Mini Kit (Qiagen) ve RNeasy Mini Kit (Qiagen) kitleri temin edilen firmanın önerilerine göre kullanılarak nükleik asit izolasyonları gerçekleştirilmiştir.
3.2.2 Reverse transcription (RT) – komplementer DNA (cDNA) eldesi
Hedef viral etmen her ne kadar DNA genomuna sahipse de, replikasyon sırasında mRNA ürettikleri ve hedef viral konsantrasyonunun artmasını sağladığı için test öncesi revers transkripsiyon ile komplementer DNA (cDNA) elde edilmiştir. Bu amaçla, kullanılan reverse transcriptase enziminin temin edildiği firmanın önerdiği yönteme göre son hacim 20 µl olacak şekilde, ilk olarak RNA, random hexamer (Thermo Fisher Scientific) ve RNase ari su (d2H2O) karışımı, 65°C’de 5 dakika denature edilmiş ve sonrasında hemen buz üzerinde 2 dakika bekletilmiştir. Daha sonra karışıma 4 µl 5X RT buffer (250 mM Tris-HCl (pH 8,3 at 25 °C), 250 mM KCl, 20 mM MgCl2, 50 mM DTT), 1 µl dNTPs (10 mM), 0,5 µl RNase inhibitör (Thermo Fisher Scientific), 1 µl M-MuLV Revers Transcriptase (Thermo Fisher Scientific) eklenerek cDNA sentezi için reaksiyon 25ºC’de
10 dakika ile başlatılmış, 42ºC’de 45 dakika ve son aşamada tüpler 70ºC’de 10 dakika tutularak enzim in-aktive edilmiştir (Çizelge 3.1).
Çizelge 3.1. Komplelementer DNA (cDNA) reaksiyon karışımı
Malzemeler 1 reaksiyon için gerekli karışım (µl)
RNase ari su (d2H2O) 5
Random Hexamer 1
RNA 4
65ºC’de 5 dakika, 2 dakika buzda inkübasyon RNase ari su (d2H2O) 3,5
5X RT Buffer 4
dNTPs(10 mM) 1
RNase inhibitör 0,5
Reverse Transcriptase 1
Toplam 20
3.2.3 Polimeraz zincir reaksiyonu
Bitki örneklerinden GRLDaV teşhisi için PCR çalışmasında daha önceki çalışamalarda en iyi sonuç veren ve 495 bp ürün sonuçlayan BadnUp-6262/BadnDo-6757 (Maliogka vd., 2015a) primer çifti (Çizelge 3.2) kullanılmıştır. PCR karışımının son hacmi 20 µl olacak şekilde 2 µl cDNA veya bitkiden izole edilen DNA, 2 µl reaksiyon buffer (100 mM Tris-HCl (pH 8,8 25°C), 500 mM KCl, 0.8% (v/v) Nonidet P40), 0,5 µl dNTP’ler (10 mM), 0,5 µl BadnUp-6262 ve BadnDo-6757 primerler (10 µM), 0,2 µl Taq DNA polimeraz (Thermo Fisher Scientific) içermiştir. Amplifikasyon koşulları Sensoquest (Qiagen) thermo cyclerda, 94°C’de 10 dakika ön denatürasyondan sonra 40 döngü 94C’de 30 saniye, 60 C’de 30 saniye, 72 C’de 45 saniye, son extention 72C’de 10 dakika uygulanmıştır. Amplifikasyon sonrası elde edilen PCR ürünleri TAE (2 M Tris- Base, 50 mM EDTA pH 8,0, 1 M glacial acetic acide) buffer ile % 1,5 agaroz jelde 100 voltta 30 dakika doğrusal hareketi elektroforez cihazı ile sağlanmıştır. Jel etidyum bromid ile boyanarak ilgili Roditis virüsü için spesifik fragment oluşumlarının değerlendirilmesi yapılmıştır.
