• Sonuç bulunamadı

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2021

Share ""

Copied!
13
0
0

Yükleniyor.... (view fulltext now)

Tam metin

(1)

Moleküler Hücre Biyolojisi I

Hafta 10: Protein DNA ve RNA’nın

manipülasyonu

(2)

•  Hücrelerin eldesi ve kültürde büyütülmesi •  Proteinlerin saflaştırılması ve analizi

•  DNAnın analizi ve manipülasyonu

(3)

Hücre çözeltisinden ayrıştırılan hücrelerden değişik hücre türleri ayrılabilir:

Floresanla etkinleşmiş hücre tasnifleyici Lazer yakalamalı mikrokesim

Hücreler kültür kabında çoğaltılabilir

Ökaryotik hücre hatları yaygın bir homojen hücre kaynağıdır Embriyonik kök hücre kültürleri tıbbi öneme sahiptir

Somatik hücre çekirdek transplantasyonu (SCNT) kişisel kök hücre oluşturma yoludur

Hibridoma hücre hatları sürekli bir monoklonal antikor kaynağıdır

(4)

Organeller ve makromoleküller ultrasantrifüj ile ayrılabilir

Hız(A) ve denge(B) santrifüjlerinde sırası ile sukroz veya cesyum klorür gibi yoğun gradyentler kullanılar

Proteinler kromatografi ile ayrılabilir Farklı kromatografi tipleri:

Uygun matris seçilerek proteinler yüklerine (iyon değiştirici kromatografi),

büyüklüklerine (jel-filtrasyon kromatografisi), belirli küçük molekül ya da

makromoleküllere bağlanma yeteneklerine göre (ilginlik kromatografisi) ayrılabilir.

Epitop etiketleme proteinlerin saflaştırılması ve lokalizasyonunun belirlenmesinde kullanılır

(5)

Bir proteinin büyüklüğü ve altbirimlerinin niteliği SDS poliakrilamid elektroforezi ile belirlenebilir (SDS-PAGE)

SDS-PAGE’i takiben coomassie blue boyaması ile saflaştırılan proteinin analizi gerçekleştirilebilir

Western emdirimi (immün emdirim) ile spesifik proteinler tayin edilir

Kütle spektroskopisi peptid parçacıklarının dizisini belirlemek ve proteinleri tanımlamak amacı ile kullanılabilir:MALDI-TOF

Matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight spectrometry Matriks destekli lazer çözünümlü iyonlaşma-uçuş süresi spektrometrisi 2 boyutlu jeller ile yüksek ayrıştırma gücü elde edilir

Maya ikili hibrid sistemi ile protein protein interaksiyonları tanımlanabilir

(6)

SPR (surface plasmon resonance) tekniği ile proteinin bağlanma dinamikleri gerçek zamanlı gözlenebilir

FRET (Fluorescence resonance energy transfer) tekniğinde farklı florokromlarla işaretli proteinlerin mikroskopi ile

takibinde hücre içi lokalizasyonları da belirlenir

Protein fonksiyonları küçük moleküller ile engellenebilir X-ray kristalografi ile atomik rezolüsyonla protein yapıları

tanımlanabilir

NMR (Nuclear Magnetic Resonance) spektroskopi ile solüsyon içindeki proteinlerin yapısı tanımlanabilir

(7)

BLAST ile homolog proteinler tanımlanabilir

Büyük DNA molekülleri restriksiyon nükleazları ile parçalara ayrılabilir

Restriksiyon nükleazları birbirine kolayca eklenen DNA parçacıkları oluşturur

Farklı büyüklükteki DNA molekülleri jel elektroforezi ile ayrılır DNA molekülleri in vitro işaretlenerek DNA probları

oluşturulur

Nükleik asit hibridizasyon tepkimeleri özel nükleotid dizilerini belirlemek için duyarlı bir yöntemdir

Nükleik asit hibridizasyon yöntemi ile klonlanmış bir DNA parçacığının mRNA molekülündeki karşılığı bulunabilir

(8)

Northern ve Southern emdirimi elektroforezle ayrılan

nükleik asit moleküllerinin hibridizasyonunu sağlar

Genler DNA kütüphanesinden klonlanabilir:

DNA parçacığı DNA ligaz yardımı ile plazmide yerleştirilir Bakteride belirli bir DNA dizisi saflaştırılıp çoğaltılabilir Maya yapay kromozomları daha büyük DNA parçaları taşırlar

İki değişik gen kütüphanesi (genomik ve cDNA) farklı amaçlara hizmet eder

Seçilen DNA parçaları test tüpünde hızla çoğaltılabilir:

PCR

(9)

PCR adli tıpta kullanılmaktadır (VNTR: değişik sayıda ardışık tekrarlar)

İstenen proteinlerin hücrede çoğaltılması için ifade taşıtlarına klonlanmaları gerekmektedir

(memeli, bakteri, maya veya böcek hücresi)

Enzimatik (dideoksi) yöntemi ile DNA dizi analizi yapılır Nükleotid dizileri proteinlerin amino asit dizisini tahmin

amacıyla kullanılabilir

Gen ifadesinin ve işlevinin incelenmesi:

Klasik genetik çalışmaları gelişigüzel mutagenez çalışmaları ile başlar.

Genetik tarama ile hücresel işlevlerde yetmezliğe neden olan mutantlar saptanabilir: C.elegans örneği

(10)

Gen ifadesinin ve işlevinin incelenmesi:

Sıcaklığa duyarlı bakteri veya maya mutantlarının taranması

Gen mutasyonları protein ürünlerini farklı şekilde etkilerler:

Fonksiyon kaybı mutasyonu, fonksiyon kazanımı mutasyonu

Genetik, genlerin işlev sırasını belirlemek amacı ile kullanılabilir

Genlerin yeri bağlantı analizi ile saptanabilir

İnsan genleri haplotip blokları halinde kalıtlandığından hastalığa yol açan mutasyonları tanımlamaya imkan sağlar

(11)

İşlev kazanımı mutasyonları genlerin hücrede ya da organizmadaki rolü hakkında bilgi verirler

(wnt ektopik yanlış ifadesi sonucu Xenopus embriyosunda ikinci bir vücut ekseni gelişir)

Laboratuvarda hazırlanmış genler aracılığı ile diploid organizmalarda eksi yönde baskın özel mutasyonlar

oluşturulabilir

(Büyük protein kompleksleri inaktif hale getirilebilir)

Gende protein kodlayan bölgenin yere yönlendirilmiş mutagenez ile değiştirilmesinde sentetik oligonükleotidler kullanılmaktadır

Gen hedefleme belirli genleri değiştirilmiş gen aktarımlı fareler hazırlanmasına olanak verir:

Transkripsiyon ve DNA onarımında rol alan DNA helikaz enzimi mutant fare erken yaşlanma fenotipi göstermektedir

(12)

Gen aktarımlı bitki elde edilmesi için kullanılan başlıca yöntemde Agrobacterium aracılı aktarım yapılır

RNA interferans gen fonksiyonunu anlamak için kullanılan hızlı ve basit bir yöntemdir

Bildirici genler bir genin nerede ve ne zaman ifade edildiğini gösterir

In situ hibridizasyon bir genin nerede ve ne zaman ifade

edildiğini gösterir

Gen ifade seviyeleri kantitatif QRT-PCR ile belirlenebilir Mikrodizinlerle binlerce genin ifadesi aynı anda

(13)

Eşgüdüm içinde düzenlenen gen gruplarını saptamak için küme incelemesi gerçekleştirilir

Referanslar

Benzer Belgeler

Bilişim-Biyoinformatik başlı- ğıyla üç, Doku Mühendisliği başlığıyla bir, Hematolo- ji-Onkoloji başlığıyla üç, Hüc- resel Tedavi ve Rejeneratif Tıp başlığıyla on

Notch sinyal iletimi pek çok farklı dokudaki farklılaşmış hücre tiplerinin ince örüntüsünü. düzenler: Xenopus embriyosunda notch sinyal iletisi engellendiğinde tüm

Bazal katmanda hem kök hücreler hem de geçici amplifiye olan hücreler bulunur.. Geçici amplifiye

 ‘’ Uluslararası Hücre Tedavileri Topluluğu ( ISCT )’’ tarafından mezenkimal kök hücrelerin tanımlanması için 3 önemli özellik belirlenmiştir.. Standart

A: Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM: Scanning Electron Microscope), B: Geçirimli Elektron Mikroskobu (TEM: Transmission Electron Microscope) (Foto.:

deri kök hücreleri deriyi oluşturan de ğ i ş ik deri hücrelerine dönüşebilirler.. Elde Edildikleri Yere Göre.. 1) Embriyonel Kök Hücre Blastosist adı verilen

9.Hafta o Sitokinler 10.Hafta o Kordon Kanı 11.Hafta o Mikroenjeksiyon 12.Hafta. o Epigenetik, Otoimmun Hastalıklar Ve Kök Hücre Tedavisi,

Schleiden' in hücre çoğalmasında çekirdeğin merkez rolünü oynadığını söylemesi Schwann tarafından da kabul edilmiş ve çekirdekli hücrenin canlı maddenin yapısal