ÜNÜ
2209/A
ÜNİVERSİTE ÖĞRENCİLERİ YURT İÇİ ARAŞTIRMA PROJELERİ DESTEK PROGRAMI
SONUÇ RAPORU
PROJE BAŞLIĞI: EPİGALLOKATEŞİN GALLAT (EGCG) ve PAKLİTAKSEL KOMBİNASYONU’NUN İNSAN AKCİĞER ADENOKARSİNOMA HÜCRELERİNİN (A549) CANLILIĞI
ÜZERİNDEKİ ETKİSİNİN ARAŞTIRILMASI PROJE YÜRÜTÜCÜSÜNÜN ADI: Büşra YURDAKUL
DANIŞMANININ ADI: Prof. Dr. N. Nalan İMAMOĞLU ŞİRVANLI
GENEL BİLGİLER
PROJENİN KONUSU Tıbbi Biyoloji-Farmakoloji PROJE YÜRÜTÜCÜSÜNÜN ADI Büşra YURDAKUL
DANIŞMANIN ADI Prof. Dr. Nefise Nalan İMAMOĞLU ŞİRVANLI PROJE BAŞLANGIÇ VE BİTİŞ
TARİHLERİ 10.02.2020- 10.07.2020
Sonuç Raporu Formatı:
1. Giriş
2. Rapor dönemlerinde yapılan çalışmalar 2.1. A549 Hücrelerinin Kültürü
2.2. Paklitaksel’in Hazırlanması 2.3.EGCG’ nin Hazırlanması
2.4. MTT (3-(4,5- dimetil tiazolil-2)2,5-diphenyl tetrazolyum bromit) Hücre Canlılığı Testi
2.5. İstatistiksel Analiz 3. Sonuç
4. Çıktılar
5. Proje ile ilgili harcama kalemleri
PROJE YÜRÜTÜCÜSÜNÜN ADI – SOYADI - İMZA
DANIŞMANIN ADI – SOYADI - İMZA
Büşra YURDAKUL Prof. Dr. Nefise Nalan İMAMOĞLU ŞİRVANLI
Tarih: 03.07.2020
1. GİRİŞ
Kanser insan sağlığı ve yaşamını tehdit eden önemli bir halk sağlığı sorunudur. Amerika’da kalp hastalıklarından sonra ikinci önde gelen ölüm nedenidir ve önümüzdeki yıllarda bu oranın kalp hastalıklarını aşması beklenmektedir (Siegel ve ark., 2015).
Tüm dünyada ve Türkiye’de sıklıkla görülen akciğer kanseri, önemli bir halk sağlığı sorunu olarak görülmektedir. Sağlık Bakanlığı tarafından 2005 yılında yapılan açıklamaya göre Türkiye’de akciğer kanseri insidansı 100.000'de 30.13'tür (Alkış ve ark., 2010). Aynı zamanda Türkiye Kanser İstatistikleri 2017 raporunda yer alan bilgilere göre Uluslararası Kanser Ajansı (IARC) tarafından yayınlanan Globocan 2012 verilerince ülkemizde akciğer kanseri görülme sıklığı erkeklerde daha fazladır (Hsieh ve ark., 2016; Hacıkamiloğlu ve ark.,2017).
Küçük hücreli olmayan akciğer kanseri (KHOAK), kadınlarda ve erkeklerde en sık görülen kanser tipidir (Lu ve ark., 2018). Günümüzde KHOAK tedavisinde geleneksel olarak kullanılan kemoterapi ilaçlarının ise ciddi yan etkileri bulunmakta ve tümör hücreleri bu ilaçlara karşı yüksek düzeyde direnç göstermektedir.
Paklitaksel (Taxol, TAX), en yaygın kullanılan antikanser ajanlardan biridir ve porsuk ağacı olarak bilinen Taxus brevifolia’dan elde edilmektedir. Katı tümörlerin (Meme, ovaryum, akciğer, kolon, mesane kanserleri) tedavisinde kullanılan etkili bir kemoterapötik ajandır (Li ve ark., 2018). Paklitaksel (PAC), özellikle ilerlemiş KHOAK tedavisinde kombinasyon kemoterapinin bir parçası olarak yaygın şekilde kullanılmaktadır (Huang ve ark., 2018).
Bununla birlikte, PAC temelli postoperatif kemoterapilerin klinik faydaları ilerlemiş KHOAK tedavisinde yetersiz kalmakta ve tümör hücrelerinin PAC’a dirençliliği kemoterapinin etkinliğini zayıflatmaktadır. Bu durum ise başarılı bir kanser tedavisi için büyük bir engel teşkil etmektedir (Lu ve ark., 2018). Aynı zamanda PAC’ın seçiciliği azdır ve normal hücreler üzerinde de bazı sitotoksik ciddi yan etkilere neden olmaktadır (Sheng ve ark., 2019). Diğer taraftan, PAC’ın suda çözünmemesi de PAC’ın tedavide tek başına kullanımını etkileyen önemli bir diğer faktördür (Qin ve ark., 2017). Bu olumsuz etkileri azaltmak ve etkili bir kullanım sağlamak için yeni ilaç kombinasyonlarının geliştirilmesi gerekmektedir. Bu sebeple geleneksel kemoterapide yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi gerekliliği ortaya çıkmaktadır. Bu olumsuz etkileri azaltmak ve etkili bir kullanım sağlamak için yeni ilaç kombinasyonlarının geliştirilmesi gerekmektedir.
Bitkiler insan diyetinde önemli bir yere sahiptir ve biyolojik olarak önemli aktivitelere sahip olan maddelerin kaynağıdırlar. Bitkiler antikarsinojen, antioksidan ve antiinflamatuar gibi sağlık açısından faydalı aktiviteler gösterebilen çeşitli biyoaktif bileşenlere sahiptirler.
Epidemiyolojik çalışmalar, bu bileşiklerce zengin yiyeceklerin tüketilmesinin bazı kanser türlerinin oluşum riskini büyük oranda azaltabildiğini ortaya çıkarmıştır (Kanadaswami ve ark., 2005; Batra ve Sharma, 2013). Ayrıca, bitkilerde bulunan bu doğal kanser baskılayıcı ya da kanser önleyici moleküllerin düşük toksisiteye sahip oldukları ve tedavi sırasında hastaların ağrılarını azaltabildikleri de belirtilmektedir (Wang ve ark., 2017; Jiang ve ark., 2017). Bu nedenle, kanser tedavisinde farklı tipteki doğal kanser baskılayıcıların uygun kombinasyonlarının keşfedilmesi büyük önem taşımaktadır.
Yeşil çay yaygın olarak tüketilen içeceklerin başında gelmektedir ve polifenol bileşenleri oksidasyona uğratılmadan Camelia sinensis (C. sinensis) bitkisinin yapraklarının dehidratasyonu ile elde edilmektedir. Yeşil çay bu sayede okside olmamış kateşinlerce
zengindir. Çayın sağlıklı bir içecek olduğu FDA tarafından da bildirilmiş olup, kullanımı önerilmektedir (Çelik, 2006; Elmas ve Gezer, 2019). Epigallokateşin-3-gallat (EGCG) yeşil çayda bulunan bir polifenoldür. Çay yaprağındaki polifenollerin ise yaklaşık %75’ini flavanoller, flavanollerin de % 60-70’ini EGCG oluşturmaktadır (Tosun ve Karadeniz, 2005).
EGCG’nin antioksidan aktivitesi üzerine çok sayıda çalışma yapılmış olmasının yanı sıra son yıllarda antikanser etkinliği de vurgulanmaktadır. Çeşitli kanser tiplerinde EGCG’nin apoptotik, antineoplastik, antimetastatik özellikler gösterdiği belirlenmiş ve bu özellikleri düzenleyen genetik ve epigenetik mekanizmalar aydınlatılmaya başlanmıştır (Ni ve ark., 2018). Bitkilerin antikarsinojen, antioksidan ve antiinflamatuar gibi sağlık açısından faydalı değişik aktiviteler gösterebilen çeşitli biyoaktif bileşenlere sahip olması, bu bileşenleri ve/veya ekstreleri içeren yeni birtakım nutrasötiklerin, bitkisel kaynaklı tedavi edici ajanların veya fonksiyonel gıda ürünlerinin geliştirilmesine yönelik çalışmaların sayısını son yıllarda oldukça arttırmıştır.
Paklitaksel (PAC)’e dirençli çeşitli kanser hücre hatları kullanılarak yapılan bazı çalışmalarda paklitaksel ve EGCG’nin birlikte kombinasyonunun antitümöral etkileri araştırılmıştır. Bu konuda yapılan bir çalışmada, PAC ve EGCG kombinasyonunun (PAC’ın 10 µM, EGCG’nin 200 µM’dan daha düşük dozlarıyla yapılan kombinasyonlar) PAC’a dirençli olan insan malign meme kanseri hücreleri üzerindeki sitotoksik etkileri araştırılmış ve bu kombinasyonun malign meme kanseri hücrelerinde apoptozu uyardığı belirlenmiştir. Aynı zamanda bu kombinasyonun meme kanseri primer hücrelerinde de 48 saatlik maruziyet sonucunda sitotoksik etki gösterdiği belirtilmiştir (Narayanan ve ark., 2015). Bir başka çalışmada ise, PAC’a duyarlı (SKOV3-ip1) ve dirençli (SKOV3TR-ip2) ovaryum kanser hücrelerinde 5, 10, 20 ve 30 µmol/L’lik EGCG konsantrasyonları ile Sülforofan’ın 7.5 ve 10.15 µmol/L’lik konsantrasyonlarının birlikte kombinasyonlarının 24, 48 ve 72 saat maruziyet sonucunda PAC’a dirençli SKOV3TR-ip2 hücrelerinde apoptozu indüklediği gösterilmiştir. Aynı çalışmada, 20 µM EGCG + 10 µM Sülforofan kombinasyonun 10 µM Sülforofan’dan daha güçlü inhibisyon etkisine sahip olduğu gösterilmiştir (Chen ve ark.,2013). Yine yapılan başka bir in vitro çalışmada, Oksaliplatinin çeşitli fitokimyasallar ile (EGCG, Andrografolit, Klorofilin, Kolşisin, Kurkumin) kombinasyonunun insan ovaryum kanseri hücre hattı (A2780 hücreleri) üzerinde sinerjik etki göstererek oksaliplatinin sitotoksik etkisinin arttığı belirlenmiştir (Yunos ve ark.,2011). Yapılan başka bir çalışmada da, T47D ve MCF-7 meme kanseri hücreleri üzerinde Taksol+Vinblastin kombinasyonuna eklenen EGCG’nin, kombinasyonun sinerjistik sitotoksik etkisini arttırdığı gözlemlenmiştir (Wang ve ark.,2009).
In vitro ve in vivo olarak yapılan bir çalışmada da, insan prostat tümör hücresi olan PC-3ML üzerinde EGCG ve Taksan (Paklitaksel ve Dosetaksel) kombinasyonunun sinerjistik aktivitesine bakılmış ve kombinasyon tedavinin PC-3ML hücre hattında apoptozisi arttırdığı ve aynı zamanda metastazı bloke ettiği görülmüştür. Aynı çalışmada, EGCG ve taksan kombinasyonunun PC-3ML hücreleri enjekte edilerek tümör oluşturulan CB17 SCID farelerinde de hastalıksız sağkalım oranlarını artırdığı gösterilmiştir (Stearns ve Wang,2011).
Diğer bir çalışmada, Malign mezetelyoma hücresi (MMe) üzerinde Gemsitabin ve EGCG’nin askorbatla kombinasyonunun malign mezotelyoma hücre proliferasyonunu inhibe ettiği gözlenmiştir. 24 saatlik maruziyette kombinasyon dozu EGCG+Askorbat için karşılıklı olarak, 103 µM+820 µM olarak kullanılmış olup, bu kombinasyon dozunun IC50 değeri 225 µM olarak belirlenmiştir. 48 saatlik maruziyet dozu ise EGCG+Askorbat için 30 µM+820 µM olarak belirlenmiş ve IC50 değeri 166 µM olarak bulunmuştur. (Martinotti ve ark.,2011). In vitro yapılan başka bir çalışmada, 4T1 ve MDA-MB-231 meme kanser hücrelerinde EGCG+Paklitaksel kombinasyonun apoptozu indüklediği gözlemlenmiş ve sadece PAC ile
yapılan tedaviye göre EGCG+ PAC kombinasyonunun apoptozu daha etkili şekilde arttırdığı belirlenmiştir (Luo ve ark.,2010).
Bununla birlikte, EGCG’nin PAC ile kombinasyonunun insan küçük hücreli olmayan akciğer adenokarsinoma hücre hattı (A549 hücreleri) üzerindeki in vitro sinerjik antitümoral etkisi ile ilgili literatürde herhangi bir çalışmaya rastlanılamamıştır. Bu çalışma ile, A549 hücrelerinde EGCG ve PAC’ın ayrı ayrı etkilerinin yanı sıra PAC’ın EGCG ile birlikte kombinasyonunun muhtemel sinerjik antitümoral etkisi MTT hücre canlılığı testi kullanılarak doza ve süreye bağlı olarak ilk kez araştırılmıştır. Böylece, EGCG ve PAC’ın hem tek başlarına hem de birlikte kombinasyonlarının (PAC+EGCG) karşılaştırmalı olarak A549 hücreleri üzerindeki in vitro sitotoksik etkilerinin belirlenmesi ve böylece KHOAK tedavisinde EGCG’nin PAC’a karşı kemo-hassasiyet oluşturmasındaki etkisinin ortaya çıkarılması amaçlanmıştır.
2. RAPOR DÖNEMİNDE YAPILAN ÇALIŞMALAR
Proje çalışması kapsamında, EGCG ve PAC’ın A549 hücrelerinin canlılığı üzerindeki etkileri MTT yöntemi kullanılarak doza ve süreye bağlı olarak analiz edilmiştir. Bunun için, A549 hücreleri EGCG ve PAC’ın giderek artış gösteren konsantrasyonları (EGCG için; 20 µM- 200 µM, Paklitaksel için; 2 nM -2048 nM aralığındaki konsantrasyonlar) ile 24 ve 48 saat inkübe edilmişlerdir. Böylece, EGCG ve PAC’ın A549 hücrelerinin %50 inhibisyonuna neden olan konsantrasyonları (IC50 değerleri) ve inkübasyon süreleri belirlenmiştir. Çalışmamızda ayrıca, EGCG ve PAC’ın çeşitli konsantrasyonları A549 hücrelerine eş zamanlı olarak birlikte uygulanmış ve böylece oluşturulan bu kombinasyonların A549 hücrelerinin canlılıklarına etkisi yine MTT hücre canlılığı testi ile belirlenmiştir. MTT testinden elde edilen sonuçlar istatistiksel olarak analiz edilerek sonuçların anlamlı olup olmadığı incelenmiştir. Bu kapsamda yapılan çalışmalar ve kullanılan yöntemler aşağıda detaylı olarak anlatılmıştır.
2.1.A549 Hücrelerinin Kültürü
Bu çalışmada Amerikan Tip Kültür Kolleksiyonu (ATCC)’ndan temin edilen insan küçük hücreli olmayan akciğer kanseri hücre hattı olan A549 hücreleri (ATCC®, CCL185™) kullanıldı. Çalışmalar süresince A549 hücreleri, 37˚C’de %5 CO2 ‘li inkübatörde 75 cm2’lik flaskta, %10 FBS, 2 mM L-glutamin, 100 U/ml penisilin, 100 µg/ml streptomisin içeren DMEM besiyerinde %75-80 yoğunluğa ulaşıncaya kadar kültüre edildiler. Besiyerleri iki günde bir değiştirilerek, hücrelerin çoğalma hızları, canlılıkları ve morfolojik yapıları invert mikroskop ile kontrol edildi. Yeterince çoğalan hücreler, %0.25 Tripsin/EDTA kullanılarak kültür kabı tabanından uzaklaştırıldılar. Çoğalan hücrelerin bir kısmı dondurulup -80˚ C ‘de muhafaza edildi, bir kısmı da başka bir flaska pasajlanarak kültüre devam edildi.
2.2.Paklitaksel (PAC)’in Hazırlanması
Çalışmada paklitaxel olarak, ATAXIL® (300 mg/50 mL I.V.) kullanıldı. Ataxildeki PAC etken maddesi susuz etanolde çözünmüş halde olup, konsantrasyonu 7034 µM olarak hesaplandı. Stok PAC çözeltisi ise 2048 nM/1600 µL olacak şekilde Ataxilden 0.47 µL alınarak hazırlandı. Stok PAC çözeltisinden de daha sonra seri dilüsyon yapılarak 2-2048 nM arasında on bir konsantrasyon (2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512, 1024 ve 2048 nM) hazırlandı.
2.3.EGCG’ nin Hazırlanması
Toz halindeki Epigallokateşin-3-gallat (EGCG) (Sigma, E41439)’tan 5.5 mg tartılarak 1300 µL deiyonize suda çözüldü. Böylece 9230 µM’lık stok EGCG çözeltisi elde edildi. Hazırlanan stok EGCG çözeltisi 0.22 µm’lik steril filtreden geçirilerek küçük hacimler halinde aliquatlandı ve çalışma süresince -20C’de muhafaza edildi. Daha sonra, aliquatlanan stok EGCG çözeltisinden 20- 200 µM konsantrasyon aralığında sekiz konsantrasyon (20, 40, 60, 80, 120, 160, 180 ve 200 µM) hazırlandı.
2.4.MTT (3-(4,5- dimetil tiazolil-2)2,5-diphenyl tetrazolyum bromit) Hücre Canlılığı Testi
MTT deneyi, sarı renkli tetrazolyum tuzunun (3-(4,5-dimetiltiazolil-2)-2,5-difeniltetrazolyum bromit) canlı hücrelerin mitokondrilerindeki süksinat dehidrogenaz enzimi tarafından indirgenerek mor renkli formazan kristaline dönüştürülmesi prensibine dayanmaktadır (Stockert ve ark., 2012). Bu sebeple, MTT analizi canlı hücrelerin mitokondrial aktivitesi üzerinden hücre canlılığının saptanmasında kullanılmaktadır (van Tonder ve ark., 2015).
Çalışma kapsamında etkisi araştırılacak EGCG, PAC ve EGCG+PAC kombinasyonunun A549 hücrelerinin canlılıkları üzerindeki etkileri MTT testi kullanılarak doza ve süreye bağlı olarak analiz edildi. MTT analizi için öncelikle, A549 hücreleri 96 kuyucuklu kültür kabına 100 µl fenol kırmızısı içermeyen DMEM besiyeri içerisinde her bir kuyucukta 12.500 hücre olacak şekilde ekildi ve kültür kabı tabanına tutunmaları için 37°C’de %5 CO2’li steril etüvde 24 saat inkübe edildi. İnkübasyon süresinin sonunda kuyucuklardaki besiyeri atılarak, A549 hücrelerinin canlılığına etki edeceği düşünülen EGCG ve PAC’ın artan konsantrasyonları (EGCG için 20-200 µM aralığındaki konsantrasyonlar; PAC için 2-2048 nM aralığındaki konsantrasyonlar) ile hücreler 24 ve 48 saat inkübe edildi. EGCG+PAC kombinasyonununda kullanılacak EGCG ve PAC konsantrasyonları ise, tek başına EGCG ve tek başına PAC’dan elde edilen MTT sonuçlarına göre belirlendi. Test maddelerinin her bir dozu için 3 kuyucuk kullanıldı. İçerisinde hücre bulunan fakat test maddesi içermeyen 3 kuyucuğa sadece besiyeri eklendi ve bu kuyucuklar çalışmada kontrol grubu olarak kullanıldı. Belirtilen inkübasyon süreleri sonunda tüm kuyucuklardaki besiyerleri atıldı ve hücrelere 100 µl besiyeri içerisinde 10 µl MTT reaktifi eklenerek hücreler 2 saat 37ºC’de inkübasyona bırakıldı. Daha sonra her bir kuyucuğa çözücü solüsyon olarak 100 µl DMSO eklenerek oluşan mor renkli formazan ürününün çözünmesi sağlandı. Her bir kuyucuktaki formazanın absorbans değeri 570 nm dalga boyunda mikroplate okuyucu kullanılarak ölçüldü ve ölçülen absorbans değerlerinden
% sitotoksisite hesaplandı.
2.5.İstatistiksel Analiz
In vitro deneylerdeki her bir grubun verileri, ortalama ± Standart Sapma (SS) olarak değerlendirildi. İstatistiksel analizler bilgisayar programı SPSS ver. 15.0 bilgisayar programı kullanılarak gerçekleştirildi. A549 hücrelerinde tek başına EGCG, tek başına PAC ve EGCG+PAC kombinasyonunun antitümöral etkilerini belirlemek üzere, test maddeleri uygulanan hücre gruplarının ortalamaları arasındaki farklılıklar One-way ANOVA post hoc Dunnett çoklu karşılaştırma testi kullanılarak analiz edildi. Farklılıklar, p<0.01 ve p<0.05 de önemli olarak değerlendirildi.
3. SONUÇ
Küçük hücreli olmayan akciğer kanseri (KHOAK), kadınlarda ve erkeklerde en sık görülen kanser tiplerinden biridir (Lu ve ark., 2018). Günümüzde KHOAK tedavisinde geleneksel olarak kullanılan kemoterapi ilaçlarının ise ciddi yan etkileri bulunmaktadır. Aynı zamanda tümör hücreleri bu ilaçlara karşı yüksek düzeyde direnç göstermektedir. İlerlemiş KHAOK tedavisinde Paklitaksel ile yapılmış kombinasyonlar kemoterapide yaygın şekilde kullanılmaktadır (Huang ve ark., 2018). Ancak paklitaksel temelli postoperatif kemoterapilerin klinik faydaları ilerlemiş KHOAK tedavisinde yetersiz kalmaktadır. Tümör hücrelerinin paklitaksel’e karşı olan dirençleri kemoterapinin etkinliğini zayıflatmakta ve başarılı bir kanser tedavisi uygulanmasında büyük bir engel oluşturmaktadır (Lu ve ark., 2018). Bu sebeple geleneksel kemoterapide yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi gerekliliği ortaya çıkmaktadır.
Yeşil çaydaki kateşinlerin yaklaşık %59’unu oluşturan EGCG’nin antioksidan aktivitesi üzerine çok sayıda çalışma yapılmış olmakla birlikte, antikanser etkinliği de oldukça önemli görülmektedir. Çeşitli kanser tiplerinde EGCG’nin apoptotik, antineoplastik, antimetastatik özellikler gösterdiği belirlenmiş ve bu özellikleri düzenleyen genetik ve epigenetik mekanizmalar aydınlatılmaya başlamıştır. EGCG kanser durumunda, hücre proliferasyonunu inhibe ederek kanser hücresinde apoptozu indüklemektedir. EGCG, hücre döngüsünün G1 evresinde hücre büyümesini durduran yolları tetikleyerek, yürütücü kaspazları aktive ederek ve onkojenik transkripsiyon faktörlerini baskılayarak kanser hücrelerinin çoğalmasını engelleyebilmektedir. (Chakrawarti ve ark., 2016; Ni vd., 2018).
EGCG ile bazı kemoterapötik ilaçların (Oksaliplatin, Paklitaksel, Dosetaksel, Sülforofan gibi) birlikte kombinasyonlarının tümör hücreleri üzerindeki sitotoksik etkileri üzerine çalışmalar yapılmıştır (Luo ve ark., 2010; Stearns ve Wang, 2011; Yunos ve ark., 2011; Chen ve ark., 2013). Bununla birlikte, EGCG’nin PAC ile birlikte kombinasyonunun insan küçük hücreli olmayan akciğer adenokarsinoma hücre hattı (A549 hücreleri) üzerindeki in vitro sinerjik antitümoral etkisi ile ilgili literatürde herhangi bir çalışmaya rastlanılamamıştır. Bu amaçla, A549 hücrelerinde EGCG ve PAC’ın ayrı ayrı etkilerinin yanı sıra PAC’ın EGCG ile birlikte kombinasyonunun muhtemel sinerjik antitümoral etkisi MTT hücre canlılığı testi kullanılarak doza ve süreye bağlı olarak ilk kez araştırılmıştır.
Bu amaçla, tek başına EGCG’nin A549 hücrelerinin canlılığı üzerindeki etkilerini belirlemek üzere, A549 hücreleri EGCG’nin giderek artış gösteren 20-200 µM aralığındaki konsantrasyonları ile 24 ve 48 saat inkübe edilmiş ve hücrelerin canlılığı üzerindeki etkisi doza ve süreye bağlı olarak MTT yöntemi ile analiz edilmiştir. MTT analizi sonucunda elde edilen % hücre canlılığı grafiği Şekil 3.1’de gösterilmiştir.
Şekil 3.1. EGCG’nin doza (20-200 µM) ve süreye bağlı (24-48 saat) olarak A549 hücrelerinin canlılığı (%) üzerindeki etkisi. *p<0.001 kontrol grubu ile kıyaslandığında (n=3).
Yapılan MTT analizi ve istatistiksel değerlendirme sonucunda, EGCG’nin A549 hücrelerinin canlılığını doza ve süreye bağlı olarak azalttığı ve 24 saatlik inkübasyonda 40 µM’lık konsantrasyondan itibaren, 48 saatlik inkübasyonda ise 20 µM’lık konsantrasyondan itibaren A549 hücrelerinin canlılığını kontrol grubuna göre anlamlı şekilde (p<0.001) azalttığı belirlenmiştir. Analiz sonucunda, 24 saatlik inkübasyonda A549 hücrelerinin canlılığını
%50’ye indiren konsantrasyon değeri (IC50 değeri) 63.10 µM olarak bulunmuştur (Şekil 3.1).
Tek başına paklitaksel (PAC)’in A549 hücrelerinin canlılığı üzerindeki etkisini belirlemek için ise, A549 hücreleri PAC’ın seri olarak artış gösteren 2-2048 nM aralığındaki konsantrasyonları ile 24 ve 48 saat inkübe edilmiş ve hücrelerin canlılığı üzerindeki etkisi doza ve süreye bağlı olarak MTT yöntemi ile analiz edilmiştir. MTT analizi sonucunda elde edilen % hücre canlılığı grafiği Şekil 3.2’de gösterilmiştir.
Şekil 3.2. Paklitaksel (PAC)’in doza (2 nM- 2048 nM) ve süreye bağlı (24-48 saat) olarak A549 hücrelerinin canlılığı (%) üzerindeki etkisi. *p<0.001 kontrol grubu ile kıyaslandığında (n=3).
Yapılan MTT analizi ve istatistiksel değerlendirme sonucunda, PAC’ın A549 hücrelerinin canlılığını doza ve süreye bağımlı şekilde kontrol grubuna göre anlamlı şekilde azalttığı belirlenmiştir (p<0.001). Yapılan çalışmalar sonucunda 24 saatlik inkübasyon sonucunda A549 hücrelerinin canlılığını yaklaşık %50’ ye indiren Paklitaksel konsantrasyonunun 16 nM olduğu bulunmuştur (hücre canlılığı %50.34) (Şekil 3.2).
Tek başına EGCG ve tek başına PAC’ın MTT analizinden elde edilen bulgular sonucunda, EGCG+PAC kombinasyonunda kullanılacak olan konsantrasyonlar belirlenmiştir. Yapılan MTT analizi sonucunda EGCG+PAC kombinasyonu için 24 saatlik inkübasyonda hem EGCG’nin hem de PAC’ın A549 hücre canlılığının %50’den daha yüksek olduğu IC50
değerinden daha düşük konsantrasyonları seçilmiştir. Buna göre, EGCG için kombinasyon dozları olarak; IC50 değerinden (63.10 µM) daha yüksek hücre canlılığına sahip olan; 20, 30, 40, 50 ve 60 µM’lık beş konsantrasyon, PAC için ise yine IC50 değerinden (16 nM) daha yüksek hücre canlılığına sahip olan 2, 4 ve 8 nM’lık üç konsantrasyon seçilmiştir. Daha sonra, seçilen bu beş farklı EGCG ve üç farklı PAC konsantrasyonları ile 15 farklı kombinasyon oluşturularak çalışmada kullanılacak kombinasyon grupları belirlenmiştir. Ardından, seçilen EGCG (20, 30, 40, 50 ve 60 µM) ve PAC (2, 4 ve 8 nM) konsantrasyonlarının hem tek başlarına hem de birlikte kombinasyonlarının 24 saatlik inkübasyonda A549 hücrelerinin canlılığı üzerindeki etkileri MTT yöntemi ile karşılaştırmalı olarak analiz edilmiştir. MTT analizi sonucunda elde edilen % hücre canlılığı grafiği Şekil 3.3’de gösterilmiştir.
Şekil 3.3. EGCG ve PAC’ın tek başlarına ve birlikte kombinasyonlarının A549 hücreleri ile 24 saatlik inkübasyonları sonucunda elde edilen hücre canlılığı (%) grafiği. *p<0.05 ve
**p<0.001 kontrol grubu ile kıyaslandığında (n=3).
Yapılan MTT analizi sonucunda, 24 saatlik inkübasyonda tek başına 20, 30, 40, 50 ve 60 µM’lık EGCG konsantrasyonlarındaki A549 hücre canlılıklarının sırasıyla; %97.26, %99.02,
%96.66, %95.46 ve %84.08 olduğu, tek başına 2, 4 ve 8 nM’lık PAC konsantrasyonlarındaki A549 hücre canlılıklarının ise sırasıyla; %82.55, %74.14 ve %57.96 olduğu görülmüştür (Şekil 3.3).
PAC’ın 2 nM konsantrasyonu ile EGCG’nin 20 µM, 30 µM, 40 µM, 50 µM ve 60 µM konsantrasyonlarıyla yapılan kombinasyonlardaki A549 hücre canlılıklarının sırasıyla;
%79.75, %85.81, %83.71, %80.71, %84.20 olduğu görülmüştür (Şekil 3.3).
PAC’ın 4 nM konsantrasyonu ile EGCG’nin 20 µM, 30 µM, 40 µM, 50 µM ve 60 µM konsantrasyonlarıyla yapılan kombinasyonlardaki A549 hücre canlılıklarının sırasıyla;
%74.74, %76.13, %78.42, %77.36, %72 olduğu görülmüştür (Şekil 3.3).
PAC’ın 8 nM konsantrasyonu ile EGCG’nin 20 µM, 30 µM, 40 µM, 50 µM ve 60 µM konsantrasyonlarıyla yapılan kombinasyonlardaki A549 hücre canlılıklarının sırasıyla;
%59.63, %59.70, %61.08, %62.02, %60.43 olduğu görülmüştür (Şekil 3.3).
Tüm sonuçlar birlikte değerlendirildiğinde, 2-8 nM aralığındaki PAC konsantrasyonları ve 20-60 µM aralığındaki EGCG konsantrasyonları ile oluşturulan PAC+EGCG kombinasyonlarından hiçbirinin, tek başına PAC’a göre A549 hücrelerinin canlılığını daha etkili şekilde azaltamadığı görülmüş ve A549 hücrelerinin canlılığını yaklaşık %50’ye indiren hiçbir kombinasyon dozu elde edilememiştir. Böylece, 24 saatlik inkübasyonda EGCG+PAC kombinasyonunun birlikte sinerjistik etki göstererek A549 hücrelerinin canlılığını yeteri kadar inhibe edemediği görülmüştür.
Sonuç olarak çalışmamızda, EGCG ve Paklitaksel kombinasyonunun A549 hücreleri üzerindeki olası sitotoksik etkileri ilk kez çalışılmış olup, elde edilen bu sonuçların literatüre katkı sağlayacağı düşünülmektedir.
4. ÇIKTILAR
Bu çalışma, Erciyes Üniversitesi Eczacılık Fakültesi 2019-2020 Eğitim-Öğretim dönemi 5.
sınıf bitirme projesi olarak hazırlanmıştır. Ayrıca, çalışmadan elde edilen sonuçlar Erciyes Üniversitesi Sağlık Bilimleri Dergisinde yayımlanmak üzere makale olarak hazırlanmaktadır.
5.PROJE İLE İLGİLİ HARCAMA KALEMLERİ Projede kullanılan malzemelerin detaylı faturaları ekte sunulmuştur.
Ek 1. Faturalar
KAYNAKÇA
Alkış N,Arpacı E, Yalçıntaş Aslan Ü, Targeted Therapies in Non-Small Cell Lung Cancer:
Review. Türkiye Klinikleri Arch Lung, 2010; 11(1): 20-25.
Batra P, Sharma AK, Anti-cancer potential of flavonoids: Recent trends and future perspectives. Biotech, 2013; (3): 439-459.
Chakrawarti L, Agrawal R, Dang S, et. al. Therapeutic effects of EGCG: a patent review.
Expert Opinion on Therapeutic Patents,2016; 26(8): 907–916.
Chen H, Landen CN, Li Y, et.al. Epigallocatechin Gallate and Sulforaphane Combination Treatment Induce Apoptosis in Paclitaxel-Resistant Ovarian Cancer Cells through hTERT and Bcl-2 Down-regulation. HHS Author Manuscripts. 2013;5: 697-706.
Çelik F, Çay (Camellia sinensis); İçeriği, Sağlık Üzerindeki Koruyucu Etkisi ve Önerilen Tüketimi. Türkiye Klinikleri Tıp Billimleri Dergisi,2006; 26: 642-648.
Elmas C, Gezer C, Çay Bitkisinin (Camellia sinensis) Bileşimi ve Sağlık Etkileri. Akademik Gıda, 2019; 17(3): 417-428.
Hacıkamiloğlu E, Gültekin M, Boztaş G ve ark. Halk Sağlığı Genel Müdürlüğü Kanser Daire Başkanlığı, ‘‘Türkiye Kanser İstatistikleri’’, T.C. Sağlık Bakanlığı Türkiye Halk Sağlığı Kurumu, Ankara, 2017: 44-46.
Hsieh YJ, Huang HS, Leu YL, et. al. Anticancer Activity of Kalanchoe tubiflora Extract Against Human Lung Cancer Cells In Vitro and In Vivo. Environ Toxicol, 2016; 31(11):
1663-1673.
Huang H, Tong TT, Yau LF, et. al. LC-MS based sphingolipidomic study on A549 human lung adenocarcinoma cell line and its taxol-resistant strain. BMC Cancer, 2018; 18(1): 799.
Jiang Q, Yang M, Zhan Q, et. al. Resveratrol Enhances Anticancer Effects of Paclitaxel in Hepg2 Human Liver Cancer Cells, BMC Complement Altern Med, 2017; (17): 477.
Kanadaswami C, Lee LT, Lee PP, et. al. The antitumor activities of flavonoids. in vivo”, 2005; (19): 895-910.
Li B, Zhao S, Geng R, et. al. The Sineoculis Homeobox Homolog 1 (SIX1) Gene Regulates Paclitaxel Resistance by Affecting Reactive Oxygen Species and Autophagy in Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2, Med Sci Monit, 2018; (24), 2271- 2279.
Lu X, Zhou D, Hou B, et.al. Dichloroacetate enhances the antitumor efficacy of chemotherapeutic agents via inhibiting autophagy in non-small-cell lung cancer. Cancer Management and Research, 2018; 10: 1231-1241.
Luo T, Wang J, Yin Y, et.al. (-)-Epigallocatechin gallate sensitizes breast cancer cells to paclitaxel in a murine model of breast carcinoma. Breast Cancer Research. 2010; 12(1): 1-10.
Martinotti S, Ranzato E, Burlando B. In vitro screening of synergistic ascorbate-drug combinations for the treatment of malignant mesothelioma. Toxicology In Vitro. 2011; 25:
1568-1574.
Narayanan S, Mony U, Vijaykumar DK, et.al. Sequential release of epigallocatechin gallate and paclitaxel from PLGA-casein core/shell nanoparticles sensitizes drug-resistant breast cancer cells. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 2015; 6: 1399-406.
Ni J, Guo X, Wang H, et.al. Differences in the Effects of EGCG on Chromosomal Stability and Cell Growth between Normal and Colon Cancer Cells. Molecules, 2018; 23(4): 788.
Qin J, Manyi Y, Zhan Q, et. al. Resveratrol enhances anticancer effects of paclitaxel in HepG2 human liver cancer cells, BMC Complementary and Alternative Medicine, 2017; (17), 477.
Sheng, C, Yanfei W, Zhang T, et. al. Redox-Responsive Disulfide Bond-Bridged mPEG- PBLA Prodrug Micelles for Enhanced Paclitaxel Biosafety and Antitumor Efficacy, Front Oncol, 2019; 9(27), 823.
Siegel RL, Kimberly DM, Jemal A, Cancer Statistics, 2015. Ca Cancer J Clin. 2015; 65: 5-29.
Stockert JC, Blázquez CA, Cañete M, et. al. MTT assay for cell viability: Intracellular localization of the formazan product is in lipid droplets. Acta Histochemica, 2012; 114: 785- 796.
Stearns ME, Wang M, Synergistic Effects of the Green Tea Extract Epigallocatechin-3-gallate and Taxane in Eradication of Malignant Human Prostate Tumors. Translational Oncology.
2011; 4: 147-156.
Tosun İ, Karadeniz B, Çay ve Çay Fenoliklerinin Antioksidan Aktivitesi. OMÜ Ziraat Fakültesi Dergisi. 2005; 20: 78-83.
van Tonder A, Joubert AM, Cromarty AD, Limitations of the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell anumeration assays. BMC Research Notes, 2015; 8(47): 1-10.
Yunos NM, Beale P, Yu JQ, et.al. Synergism from the Combination of Oxaliplatin with Selected Phytochemicals in Human Ovarian Cancer Cell Lines. Anticancer Research. 2011;
31: 4283-4289.
Wang B, Xu J, Wang H, et. al. Effect and Mechanism of Sophoridine to suppress Hepatocellular carcinoma in vitro and vivo. Biomed Pharmacother, 2017; 95: 324–330.
Wang J, Yin Y, Hua H, et.al. Blockade of GRP78 sensitizes breast cancer cells to microtubules-interfering agents that induce the unfolded protein response. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 2009; 13: 3888–3897.
Ek 1. Faturalar
FATURA
Sayın
Büşra YURDAKUL
Erciyes Üniversitesi Eczacılık Fakültesi,
CHROMASCIENCE KİMYA e-Arşiv 38039 Melikgazi, Kayseri – Türkiye TEKNOLOJİLERİ SAN.TİC.LTD.ŞTİ.
Vergi No
Halil Rıfat Paşa Mh. Yüzer Havuz Sok. Perpa 44284847012
Tic. Merkezi A-Blok Kat:10 No: 1610 PK:
34360
Şişli, İstanbul – Türkiye Fatura Numarası
Telefon CS02020000000062
0 (212) 221 28 34 Fatura Tarihi Ödeme Tarihi
Vergi No 12.05.2020 – 13:45:37 12.05.2020
2091271596 (ŞİŞLİ) Ticaret Sicil No 200156-5 Mersis No
2091 2771 5960 0001
No Hizmet / Ürün Adı Miktar Birim Birim Fiyat Toplam
1 Aisimo Steril Syringe Filter, 13,0mm, -
1.0 338,9831 TL 338,98 TL
0,45um
Senaryo Mal Hizmet Toplam Tutarı 338,98 TL
EARSIVFATURA
Fatura Tipi Toplam İndirim 0,00 TL
SATIS
Hesaplanan KDV GERÇEK (%18.0) 61,02 TL Özelleştirme No
TR1.2 Vergiler Dahil Toplam Tutar 400,00 TL
ETTN
Ödenecek Tutar 400,00 TL 04e0ef05-dca9-4905-913c-09bcaa8c2c95
Fatura Notu
Yazıyla Toplam Tutar: DörtYüzTürkLirasıSıfırKuruş
Türkiye İş Bankası / Perpa Şubesi (1188) TR IBAN NO : TR39 0006 4000 0011 1880 6315 24 USD IBAN NO : TR09 0006 4000 0021 1880 3430 96 EURO IBAN NO : TR46 0006 4000 0021 1880 3431 09 SWIFT CODE : ISBKTRISXXX İLETİŞİM : YÜCEL YILDIRIM 0505 790 86 94 / yucel@chromascience.com
Bu fatura e-Arşiv izni kapsamında elektronik ortamda oluşturulmuş ve iletilmiştir.
