T.C.
EGE ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
GRAM NEGATİF BASİLLERDE CTX-M TİPİ BETA-LAKTAMAZLARIN GENOTİPLERİNİN
ARAŞTIRILMASI
Farmasötik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Programı Yüksek Lisans Tezi
Ecz. Ayşe Nur YURTMAN
DANIŞMAN
Yard. Doç. Dr. Hüseyin TAŞLI
İZMİR
2007
Önsöz
Yüksek Lisans eğitimimim her aşamasında benden emeğini esirgemeyen danışmanım Sayın Yard. Doç. Dr. Hüseyin TAŞLI’ya, Anabilim Dalı Başkanımız Sayın Doç. Dr. Mine HOŞGÖR LİMONCU’ya, Sayın Doç.
Dr. Şafak ERTMERTCAN’a, Sayın Prof. Dr. Güner COŞAR’a ve diğer hocalarım, iş arkadaşlarıma, ayrıca bu süre içinde her zaman yanımda olan aileme ve dostlarıma teşekkür ederim.
İzmir 2007
Ayşe Nur Yurtman .
İÇİNDEKİLER
İÇİNDEKİLER...IV ŞEKİLLER, TABLO VE RESİMLER DİZİNİ…………...VII KISALTMALAR………..…...VIII BÖLÜM I
1. GİRİŞ ve GENEL BİLGİLER..………...……….1
1.1. GİRİŞ…..……….………...……….1
1.2. GENEL BİLGİLER………..……… ……...2
1.2.1. BETA-LAKTAMAZ ENZİMLERİ………2
1.2.2. BETA-LAKTAMAZLARIN SINIFLANDIRILMASI………..4
1.2.3. BETA-LAKTAMAZ ENZİMLERİNİN İSİMLENDİRİLMESİ…...………7
1.2.4. GENİŞLEMİŞ SPEKTRUMLU BETA-LAKTAMAZLAR………..7
1.2.4.1. GSBL ÇEŞİTLERİ………..……...…...8
1.2.4.1.1. SHV………..…8
1.2.4.1.2. TEM………..…9
1.2.4.1.3. İNHİBİTÖR DİRENÇLİ BETA-LAKTAMAZLAR……….11
1.2.4.1.4. OXA………..………..11
1.2.4.1.5. CTX-M………12
1.2.4.1.6. DİĞER GSBL ENZİMLER………13
1.2.5. CTX-M tipi GSBL ENZİMLERİ………..13
1.2.5.1 CTX-M KRONOLOJİSİ………..……….13
1.2.5.2. CTX-M ENZİMLERİNİN KÖKENİ VE FİLOGENETİĞİ…………....15
1.2.5.3. GENETİK ÖZELLİKLER…..……… 18
1.2.5.4. EPİDEMİYOLOJİ…..……….18
1.2.5.5. FENOTİPİK ÖZELLİKLER………..…….23
1.2.5.6. BİYOKİMYASAL ÖZELLİKLER………....24
BÖLÜM II 2.GEREÇ VE YÖNTEM………...……….26
2.1. GEREÇ...26
2.1.1. ÇALIŞMA GRUBU………..…………..……….………26
2.1.2. AYRAÇLAR……….………...26
2.2. YÖNTEM………..……….……….….……….28
2.2.1. ANTİBİYOTİK DUYARLILIK TESTLERİ………….………..28
2.2.2. PCR YÖNTEMİYLE blaCTX-M BETA-LAKTAMAZ GENLERİNİN SAPTANMASI………..29
2.2.3. CTX-M PCR ÜRÜNLERİNİN RESTRİKSİYON (PCR-RFLP) ANALİZİ………31
BÖLÜM III 3. BULGULAR...34
3.1. ANTİBİYOTİK DUYARLILIK SONUÇLARI ……..……….34
3.2. PCR SONUÇLARI………..………...34
3.3. RESTRİKSİYON ANALİZİ SONUÇLARI……..………..………..35
3.4. PCR YÖNTEMİYLE CTX-M GRUBUNUN DOĞRULANMASI……..……36 BÖLÜM IV
4. TARTIŞMA………...40
BÖLÜM V 5. SONUÇ ve ÖNERİLER………...………..44
ÖZET……….……….46
ABSTRACT………..…………..………47
KAYNAKLAR………...………..…..48
ÖZGEÇMİ TABLO, RESİM ve ŞEKİLLER DİZİNİ Tablo 1. Beta-laktamaz enzimlerinin sınıflandırılması……….6
Tablo 2. Örneklerin türlere göre dağılımı …………..…..………...26
Tablo 3. CTX-M ortak primer seti………...30
Tablo 4. CTX-M grup spesifik primer setleri………...30
Tablo 5. CTX-M PCR ürünlerinin olası restriksiyon paternleri...32
Tablo 6. Çalışma Kökenlerinin Antibiyotik Duyarlılık, PCR ve RFLP Sonuçları….38 Resim 1. CTX-M enzimlerinin Dünya’da dağılımı ..………...22
Resim 2. PCR ürünlerinin bant görünümleri …………..…..………...35
Resim 3. CTX-M-1 grubuna özgü restriksiyon paternleri …………..…..………...36
Resim 4. CTX-M-1 grubuna spesifik PCR ürünlerinin bant görünümleri...37
Şekil 1. CTX-M enzim ailesinin filogenetik ağacı……….16
KISALTMALAR
AMP : Ampisilin
SAM : Ampisilin/sulbaktam FOX : Sefoksitin
CAZ : Seftazidim CRO : Seftriakson
CTX : Sefotaksim ATM : Aztreonam
IMP : İmipenem bp : Baz çifti
GSBL : Genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz
PCR : Polymerase chain reaction (Polimeraz zincir reaksiyonu) RFLP : Restriction fragment lenght polimorphism
BÖLÜM I
1. GİRİŞ ve GENEL BİLGİLER
1.1. GİRİŞ
Beta-laktam antibiyotikler dünyada ve ülkemizde, hastane içi ve hastane dışı enfeksiyonlarda en sık kullanılan antibiyotik grubudur. Bu antibiyotiklere karşı gelişen direnç mekanizmalarının başında beta-laktamaz enzimleri gelmektedir. Tarihi gelişimlerine bakıldığında her yeni enzimin ortaya çıkışında kullanıma giren yeni beta-laktam ajanların olduğu görülmektedir. Özellikle bu enzimlerin plazmidler gibi aktarılabilir genler aracılığıyla sentezlenmesi bu özelliklerini birbirlerine ve aile dışındaki diğer türlere de aktarabilmelerine neden olmakta, bu durum bu enzimlerin tıbbi öneminin artmasına neden olmaktadır. Genişlemiş spektrumlu beta-laktamazlar (GSBL) beta-laktamaz enzimlerinin majör grubunu oluşturur. Çoğunlukla da hastane kökenli Enterobacteriaceae üyeleri tarafından eksprese edilirler. En sık Escherichia coli ve Klebsiella pneumoniae suşlarında olmak üzere diğer Enterobacteriaceae üyelerinde saptanmaktadırlar.
GSBL meydana getiren Enterobacteriaceae’lerin artan prevalansı, klinik izolatlarda bu enzimlerin varlığını doğru olarak belirleyecek laboratuvar testlerine gereği arttırmıştır. Fenotip temeline dayalı doğrulama yöntemlerinden hiç birisi gram olumsuz klinik izolatlarda GSBL varlığını saptamada %100 duyarlı ve özgün değildir. Beta-laktamazların aşırı üretimi, bir kaç enzimin bir arada bulunması veya beta-laktamaz direncine diğer direnç mekanizmalarının eşlik etmesi de yanlış test sonuçlarına neden olmaktadır. Günümüzde spesifik enzim tipini belirlemek için
moleküler yöntemlere gerek vardır. Bu amaçla da en çok Polimerase Chain Reaction (PCR) ve Restriction Fragment Length Polimorphism (RFLP) yöntemleri kullanılarak enzim saptanması ve tiplendirmesi yapılmaktadır.
CTX-M enzimleri genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz enzimlerinin önemli ve artan bir kolunu oluşturmaktadır. Bu enzim grubu özellikle 3. kuşak sefalosporinler başta olmak üzere pek çok beta-laktam grubu antibiyotiği hidroliz edebilme özelliğine sahiptir. Fenotipik çalışmalar gösteriyor ki ülkemizde GSBL enzimleri yaygın halde bulunmaktadır. Ancak bu konuda sınırlı sayıda moleküler düzeyde çalışma vardır. Bu çalışmalara göre ülkemizde CTX-M–2, CTX-M–3 ve CTX-M–15 enzimleri bildirilmiştir.
Çalışmamızda Manisa Celal Bayar Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi Mikrobiyoloji Laboratuvarı’nda GSBL oldukları saptanan 37 klinik örnekte CTX-M enzim genlerinin saptanması amaçlanmıştır. PCR-RFLP yöntemleri kullanılarak CTX-M enzimlerinin grup düzeyinde tiplendirilmesine yönelik çalışma planlanmıştır.
1.2. GENEL BİLGİLER
1.2.1. BETA-LAKTAMAZ ENZİMLERİ
Beta-laktam grubu antibiyotikler temelde penisilinler, sefalosporinler, monobaktam, karbapenem ve beta-laktamaz inhibitörleri olmak üzere 5 sınıfta toplanırlar. Bu gruplarda yer alan antibiyotiklerin hepsi beta-laktamaz enzimleri tarafından hidrolize edilebilen beta-laktam halkası içermektedirler. Gruplar birbirlerinden sahip oldukları diğer ek halka yapılarıyla ayrılırlar (79,85).
Beta-laktamaz enzimleri beta-laktam antibiyotiklerin temel yapısında bulunan beta-laktam halkasını parçalayarak bu antibiyotiklerin bakteri hücre duvarında bulunan penisilin bağlayan proteinlere (PBP) ulaşmadan inaktive edilmesini sağlarlar (53). Enzimler gram pozitif bakterilerde doğrudan dış ortama salınırken gram negatif bakterilerde periplazmik aralıkta bulunurlar. Beta-laktamaz üretiminden sorumlu olan genler bakteri kromozomunda veya plazmid, transpozon, integron gibi hareketli genetik elemanlarında bulunabilirler (36).
Beta-laktamaz enzimi ilk olarak 1929’ da bazı bakterilerin penisilinler tarafından inhibe olmadığı biçiminde Fleming tarafından gözlemlenmiştir. 1940 yılında Abraham ve Chain E.coli’den elde ettikleri enzime “penisilinaz” adını vermişlerdir. Plazmid kökenli penisilinazların yaygınlaşması ve penisilin kullanımının artmasına bağlı olarak penisilinaz enzimi Stafylococcus auerus’ da da görülmüş ve diğer stafilokok türleri arasında hızla yayılmıştır (17).
Pek çok gram negatif bakteri kromozom aracılı beta-laktamaz üretir. Bu enzimlerin bazı PBP’ler ile benzer DNA dizilerine sahip olmaları bu enzimlerin PBP’ den köken alabileceğini düşündürmektedir. Gram negatif bakterilerdeki ilk plazmid aracılı beta-laktamaz olan TEM-1, 1960’lı yılların başında tanımlanmıştır.
Bu enzim Yunanistan’da Temoniera adlı bir hastanın kan kültüründen izole edilen E.coli’ de bulunmuştur. Plazmid ve transpozon aracılı olması bu enzimin diğer bakteri türlerine yayılımını kolaylaştırmıştır ve bu enzimin bulunuşundan itibaren on yıl içinde pek çok Enterobacteriaceae üyesinde dünya genelinde yayılım göstermiştir. TEM–1 benzeri bir enzim olan TEM–2 enzimi 1969 yılında Pseudomonas aeruginosa’ da saptanmıştır. Günümüzde bu enzimler Enterobacteriaceae ailesinin pek çok üyesinde, P. aeruginosa, Haemophilus influenzae ve Neisseria gonorrhoeae bakterilerinde bulunmaktadır. Diğer bir plazmid
aracılı enzim olan SHV–1 enzimi 1979 yılında E. coli ve K. pneumoniae bakterilerinde bulunmuştur. Bu enzimin K. pneumoniae izolatlarında kromozom aracılı ve E. coli izolatlarında plazmid aracılı olduğu gözlenmiştir (17).
20 yılı aşkın süredir beta-laktamazların hidrolitik etkilerine dirençli pek çok antibiyotik geliştirilmiştir. Ancak bu antibiyotiklerin yaygın biçimde kullanımı mutasyona uğramış beta-laktamaz enzimine sahip dirençli bakterilerin oluşmasına neden olmuştur (17). Beta-laktamazların ilk mutasyona uğramış formu olan SHV–2, Almanya’da 1983 yılında Klebsialle ozanae izolatında bulunmuştur (44). GSBL enzimlerinin büyük çoğunluğu TEM–1, TEM–2 ve SHV–1 enzimlerinden köken alan mutant enzimlerdir (81).
1.2.2. BETA-LAKTAMAZLARIN SINIFLANDIRILMASI
Beta-laktamaz enzimler hidroliz etme özellikleri, inhibitörlere duyarlılıkları, kromozom veya plazmid tarafından kodlanmalarına göre çeşitli şekilde sınıflandırılmışlardır. İlk sınıflandırma 1973 yılında Richmond ve Skyes tarafından, enzimlerin substrat profili, inhibitörlere duyarlılıkları izoelektrik noktaları, moleküler büyüklükleri ve immunolojik özellikleri gibi fenotipik özellikleri göz önüne alınarak yapılmıştır ve I, II, III, IV, V olmak üzere 5 temel grupta toplanmıştır (81). Ancak bu sınıflandırma GSBL enzimlerinin yaygın hale geçişinden önce gerçekleştiği için TEM ve SHV enzim türevlerinin farklılıklarını içermemektedir. 1995 yılında Bush–Jacoby–Medeiros en son sınıflandırma şeklini sunmuş ve bu sınıflandırmaya göre enzimleri 4 ana gruba ve altı alt gruba ayırmıştır. Ambler beta-laktamazları genetik özelliklerine göre sınıflandırmıştır. Bu şeklide yapılmış moleküler sınıflandırma A,
B, C ve D olmak üzere 4 sınıftan oluşmaktadır. A, C ve D sınıfları aktif bölgelerinde serin içerirler, B sınıfı Zn² içerir (81).
Bu sınıflandımalara göre (Tablo 1) :
• 1.grupta yer alan enzimler sefalosporinazları içerirler klavulonik asit tarafından inhibe olmazlar, moleküler sınıflandırmada C sınıfında yer alırlar.
• 2. grupta penisilinazlar ve sefalosporinazlar yer alır. Moleküler sınıflandırmada A ve D sınıfında bulunurlar. İlk saptanan TEM ve SHV enzimleri bu sınıfta yer alırlar. Ancak TEM ve SHV enzim türevlerinin artmasıyla 2a ve 2b ve 2c olmak üzere 3 alt sınıflandırma yapılmıştır. 2a grubu sadece penisilinazları, 2b alt grubuda penisilin ve sefalosporinleri aynı düzeyde hidroliz yeteneğine sahip enzimleri içerir. 2b alt grubunun da alt grupları oluşturulmuştur buna göre;
¾ 2be’de yer alan enzimler GSBL enzimlerini yani 3. kuşak sefalosporinleri (seftazidim, sefotaksim, sefpodoksim v.b.) ve monobaktamları inaktive edebilen enzimleri içerir.
¾ 2br enzimleri klavulonik asit ve sulbaktama zayıf bağlanan enzimleri yani inhibitör dirençli TEM türevi enzimleri içerir. Bunlar tazobaktama duyarlıdırlar.
2c alt grubunda yer alan enzimler karbenisilini benzilpenisilinlerden daha etkin şekilde inaktive eden enzimlerdir. 2d alt grubunda yer alan enzimler kloksasiline benzilpenisilinlerden daha etkin olan enzimleri içerir. 2e grubunda yer alan enzimler klavulonik asit tarafından inhibe edilen, monobaktamları hidrolize edebilen sefalosporinazları içerirler. 2f grubu sonradan oluşturulmuştur. Bu enzimler aktif bölgelerinde serin bulunan karbapenamazlardır.
• 3. grupta yer alan enzimler aktif bölgelerinde çinko taşırlar veya metallo-beta- laktamazlardır. Moleküler sınıflandırmada B sınıfında yer alırlar. Penisilinleri, sefalosporinleri ve karbapenemleri hidroliz özelliğine sahiptirler.
• 4. grupta yer alan enzimler klavulonik asit tarafından inhibe edilebilen penisilinazları içeririler. Bunlara karşılık gelen moleküler bir sınıflandırma bulunmamaktadır (81).
Tablo 1. Beta-laktamaz enzimlerinin sınıflandırılıması (22)
İnhibisyon Bush
Jacoby Medeiros
Grup
Molekül
sınıf Tercih edilen substrat
KA EDTA
Örnek enzimler
1 C Sefalosporinler - - Gram-olumsuz bakterilerin kromozomal ve plazmid kökenli AmpC enzimleri (MIR-1, BIL-1, MOX-1, CMY- 1, LAT-1, FOX-1, ACT-1)
2a A Penisilinler + - Gram-pozitif bakterilerin penisilinazları 2b A Penisilinler,
sefalosporinler + - TEM-1, TEM-2 , SHV-1, SHV-11, SHV-19, SHV-25, TLE-2, ROB-1, OHIO-1, HMS-1
2be A Penisilinler, Genişlemiş spektrumlu sefalosporinler, Monobaktamlar
+ - TEM-3-29, TEM-42,43, TEM-47-50, ...TEM-92 SHV-2-9, SHV-12-18, SHV-20-24
PER-1,2. CTX-M-1-16. GES-1,2. VEB-1,2. TOHO-1,2.
Klebsiella oxytoca K1
2br A Penisilinler ± - TEM-30-36, TEM 38-41, 44, 45, 51,59,...83 SHV-10
2c A Penisilinler,
karbenisilin + - PSE-1, PSE-3, PSE-4, CARB-3-5, BRO-1-3, SAR-1 2d D Penisilinler,
kloksasilin ± - OXA tipi enzimler (OXO-1-31)
Dar spektrum: OXA-1-10, OXA-20,27,30,31 GSBL etkili: OXA-11-19, OXO-28
Karbapenem hidrolizi yapanlar: OXA-23-27 2e A Sefalosporinler + - P. vulgaris’in İndüklenebilir sefalosporinazları 2f A Penisilinler,
sefalosporinler, karbapenemler
+ - E. cloacae’nın IMI-1 ve NMC-A enzimleri S. marcescens’in Sme-1 ve 2 enzimleri K. pneumoniae’nın KPC-1 enzimi
3 B Tüm beta-
laktamlar (monobaktamlar hariç)
- + S. maltophilia'nın L1 ve B. fragilis’in CcrA enzimi, S. marcescens, P. aeruginosa, A. Baumannii, S. flexneri, K. pneumoniae türlerinde IMP-1-8 ve P. aeruginosa’da VIM-1-3 enzimleri
4 ? Penisilinler - ? Pseudomonas cepacia’nın penisilinazları
KA: Klavulonik asit
Şu an günümüzde 150 TEM, 88 SHV, 88 OXA, 53 CTX-M, 22 IMP, 12 VIM ve bu sayılardan daha az olmak üzere diğer enzim çeşitleri tanımlanmıştır. TEM ve SHV enzim aileleri birbirleriyle yakından ilişkilidir. Diğer enzim grupları, örneğin CTX-M ve IMP biribirlerinde en az %20 farklılıkla ayrılırken OXA grubu enzimler oksasilin üzerine etkinlikleriyle sınıflandırıldıkları için diğer enzim gruplarından yaklaşık % 80 farklılık gösterir (41).
1.2.3. BETA-LAKTAMAZ ENZİMLERİNİN İSİMLENDİRİLMESİ
Beta-laktamazların isimlendirilmeleri, sınıflandırılmalarında kullanıldığı gibi substrat, biyokimyasal ve sekans özelliklerine dayanarak yapılmasının yanında;
bulunduğu bölge veya hastane, gen bölgesine, bulunduğu hastaya ya da bulan kişiye göre çeşitli adlandırmalar yapılmıştır. Örneğin CTX-M enzimleri sefotaksime etkinliklerinden dolayı, TEM enzimleri ilk olarak Temonoira adlı hastada saptandığı için, SHV enzimleri ise başlangıçta aktif bölgelerinde sulfidril grubu bulunduğu sanıldığından bu şekilde isimlendirilmiştir (41).
1.2.4. GENİŞLEMİŞ SPEKTRUMLU BETA- LAKTAMAZLAR
Genişlemiş spektrumlu beta-laktamazlar enzimleri penisilin ve sefalosporinlerin pek çoğunu hidroliz edebilme özelliğine sahip plazmid aracılı beta- laktamaz enzimlerdir. Çoğu GSBL enzimi, özellikle TEM-1, TEM-2 VE SHV-1 enzimlerinden köken alarak genetik mutasyonla oluşmuşlardır. Bu enzimler genelde
gram negatiflerde özellikle Enterobacteriaceae ailesi içinde bulunurlar. Bunlar penisilinlere ve yeni kuşak sefalosporinlere karşı aktivite gösterirler (67). GSBL enzimlerinin genişlemesini sağlayan genetik mutasyonlar 3. kuşak sefalosporinlere (sefotaksim, seftazidim, seftriakson) ve monobaktamlara (aztreonam) dirence de neden olmaktadır. GSBL üreten izolatlar sefamisinlere (sefoksitin) ve karbapenemlere duyarlıdır (40).
GSBL enzimlerinin çoğu aktif bölgelerinde serin taşırlar ve bunlar Ambler moleküler sınıflandırmasında A sınıfında yer alır. Bush, Jacoby ve Medeiros tarafından biyokimyasal özellikler göz önüne alınarak yapılan sınıflandırmada 2be fonksiyonel grubunda yer alırlar.
Şu an günümüzde 150’ den fazla GSBL bulunmaktadır. Bunlar dünyada yaygın olarak Enterobacteriaceae üyelerinde ve P. aeruginosa’ da bulunmaktadırlar (17).
1.2.4.1. GSBL ÇEŞİTLERİ 1.2.4.1.1. SHV
SHV enzim ailesinin Klebsiella türlerinden köken aldığı düşünülmektedir.
SHV sınıfı enzimlerin öncülü olan SHV–1 dünyada çoğunlukla K. pneumoniae kökenlerinde yer almaktadır. Çoğu K. pneumoniae kökeninde SHV–1 enzimini kodlayan gen veya bu enzimin öncülü olan LEN–1 kromozomda bulunmaktadır. Bu durum SHV-1 enzimi kodlayan genin kromozomdan daha sonra plazmide aktarıldığını ve Enteroacteriaceae ailesi içinde yayılmış olabileceğini göstermektedir. SHV-1 enzimi ampisilin, tikarsilin ve piperasilin gibi geniş spektrumlu penisilinlere karşı dirence neden olurken oksiimino sefalosporinlere etkisizdir (84). SHV-1 enziminin tanımlanmasından sonra 1983 yılında Almanya’da
izole edilen K. pneumoniae ve Serratia marcescens örneklerinde sefotaksim ve yeni sefalosporinlere karşı enzimatik direnç gözlenmiştir (45). Bu direcin bakteriler arası aktarılabildiği saptanmış ve bu enzim SHV-2 olarak adlandırılmıştır. Bu plazmid aracılı beta-laktamaz enzimi SHV-1’ den mutasyonla oluşmuştur. Mutasyon 238.
konumdaki glisin aminoasidinin serine dönüşmesiyle oluşmuştur. Bu durum sonucunda SHV-2 enzimi SHV-1 enzimine göre oksiimino sefalosporinlere karşı olan etkisinde artışına neden olmuştur. Sonraları aminoasit değişiklikleri içeren pek çok SHV tipi GSBL rapor edilmiştir (84).
GSBL fenotipi gösteren SHV enzim çeşitlerinin pek çoğunda, 238. pozisyonda bulunan glisinin serine dönüşümü karakteristiktir. Bunun yanında SHV-5 enzimiyle ilişkili enzim türlerinde 240. pozisyonda glutamatın lizine dönüşümü vardır.
Gly238Ser ve Glu240Lys oluşumları TEM enzimlerinde de gözlenmektedir. 238.
pozisyondaki serin, seftazidimin etkin biçimde hidrolizi için, 240. pozisyonda lizin aminoasiti ise sefotaksim hidrolizi için önem taşımaktadır (37).
Şu ana kadar mevcut SHV enzim türevlerinin çoğunluğu GSBL fenotipi göstermektedir. Ancak SHV-10 enzimi inhibitör dirençli fenotipe sahiptir. Bu enzimin SHV-5 enziminden köken aldığı ve 130. pozisyonda serin yerine glisin içerdiği gözlenmiştir (73).
Şu an 40’ dan fazla SHV tipi enzim bulunmaktadır. Pek çok örnek, aminoasit değişimlerinin, enzimlerin yeni sefalosporinleri hidrolize edebilme yeteneğindeki artışa olumlu yönde etki ettiğini göstermektedir (84).
1.2.4.1.2. TEM
TEM tipi GSBL enzimleri TEM-1ve TEM-2 enzimlerinin türevleridir ve ilk olarak 1965 yılında Yunanistan’da Temoneira adlı bir hastadan izole edilen E. coli kökeninde saptanmıştır (65). TEM-1 enzimi; karbenisilin, oksasilin veya sefalotine oranla ampisilini daha etkin şekilde hidrolize edebilir, geniş spektrumlu sefalosporinlere etki düşük düzeydedir ve klavulonik asit tarafından inhibe edilir (65). TEM-1 enziminin ilk türevi olan TEM-2 enzimi, kökeninden bir aminoasit farklılığıyla ayrılır. Bu durum izoelektrik noktanın (pI) 5.4’den 5.6’ ya değişmesine neden olmuş fakat etkinliğinde değişim yaratmamıştır (17). TEM-1 enzimi gram negatif bakterilerde en yaygın olarak karşılaşılan enzimdir. E. coli’ de bulunan ampisilin direncinden % 90 oranında TEM-1 üretimi sorumludur. Bu enzim aynı zamanda H. influenzae ve N. gonorrhoeae gözlenen penisilin ve ampisilin direncinden de sorumludur (17).
1989 yılında rapor edilen TEM-3 ilk TEM tipi GSBL enzimidir. İlk bulunuşunu takiben günümüze kadar 90’dan fazla TEM çeşidi tanımlanmıştır. Bu beta- laktamazların bir kısmı inhibitör dirençli enzimler olmakla beraber büyük çoğunluğu GSBL ezimleridir. TEM enzimlerinde aminoasit değişimi kısıtlı sayıdaki pozisyonlarda meydana gelir. Bu aminoasit değişimleri GSBL fenotiplerinde çeşitli değişimlere neden olur. Örneğin oksiimino sefalosporinleden sefotaksim ve seftazidimi hidroliz özellikleri veya pI 5.2’ den 6.5’e kadar değişebilen izoelektrik nokta değişimlerine neden olurlar. GSBL fenotipi göstermeleri için aminoasit değişimlerinin belirli noktalarda olması önemlidir. Bunlar 104 numaralı pozisyonda lisin yerine glutamat, 164 no’ lu pozisyonda arjinin yerine serin veya histidin, 238.
pozisyonda serin yerine glisin ve 240. pozisyonda glutamat yerine lizin içerirler (17).
TEM tipi beta- laktamazlar en sık E. coli ve K. pneumoniae bulunmasına karşın diğer gram negatif bakterilerde de artan sıklıkta bulunmaktadır. TEM tipi beta- laktamazlar Enterobacter aerogenes, Morganella morganii, Proteus mirabilis, Proteus rettgeri, ve Salmonella spp. gibi Enterobacteriaceae üyelerinde bulunmaktadır (17).
1.2.4.1.3. İNHİBİTÖR DİRENÇLİ BETA-LAKTAMAZLAR
Bunlar GSBL olmamalarına rağmen klasik SHV ve TEM tipi enzim türevleri olduklarından GSBL enzimleri ile birlikte anılmaktadırlar (17). İnhibitör dirençli fenotiplerin oluşmasına neden olan nokta mutasyonları TEM enzimleri genleri yapısındaki belirli aminoasit değişimleriyle meydana gelir. Met-69, Arg-244, Arg- 275, ve Asn-276 bu aminoasit değişimleri GSBL fenotipine neden olan bölgelerdir (17). İnhibitör dirençli enzimlerin çoğu TEM kökenli olmakla birlikte SHV türevi olanlar da bulunmaktadır ve bunlardan SHV-10 ve SHV-25 aynı zamanda GSBL niteliği taşımaktadır (36). Fenotipik olarak bu enzimler beta-laktam klavulonat kombinasyonlarına dirençlidir, buna rağmen yüksek penisilinaz aktivitesi gözlenmemektedir (27). Bu enzimler çoğunlukla E. coli’ de bunun yanında K.pneumoniae, K. oxytoca, P. mirabilis, ve Citrobacter freundii örneklerinde de bulunabilirler (17,19).
1.2.4.1.4. OXA
OXA tip beta-laktamazlar oksasilin hidroliz yetenekleri nedeniyle bu şekilde isimlendirilmişlerdir. Bu beta-laktamazlar ampisilin ve sefalotine direnç gösterirken,
kloksasilin ve oksasilini benzilpenisilinlere göre %50 daha fazla hidroliz edebilme yeteneğine sahiptirler (17,65). OXA-18 hariç klavulonik asitten az etkilerinirler (84).
Bu enzimler moleküler sınıf D ve fonksiyonel sınıf 2d’ de yer almalarıyla SHV ve TEM enzimlerinden ayrılırlar (17). Daha çok P. aeruginosa bulunmakla birlikte pek çok gram negatif bakteride de saptanmışlardır (65).
İlk OXA tipi GSBL enzimi olan OXA-11 Hacettepe Üniversitesinde P.aeruginosa örneğinde saptanmıştır. Daha sonra dünyada ilk kez OXA-14, OXA- 15, OXA-16 ve OXA-17 beta-laktamazları Hacettepe'de izole edilen farklı P.
aeruginosa kökenlerinde tanımlanmıştır. GSBL karakterine sahip OXA tipleri daha çok OXA-2’den (OXA-15 ve OXA-32) veya OXA-10’ dan (OXA-11, OXA-13, OXA-14, OXA-17, OXA-19, OXA-28 ve OXA-35) nokta mutasyonları sonucu oluşmuştur. Çoğu oksasilinaz geninin plazmid, transpozon veya integron aracılı olması bunların dünyada geniş bir yayılım sağlamasına neden olmuştur (84).
1.2.4.1.5. CTX-M
CTX-M tipi GSBL’ler en yaygın olan enzimlerdendir. Bunlar ilk olarak 1980’lerin 2. yarısında rapor edilmiş ve dünyanın çoğu bölgesinde dağılım oranları 1995’den bu yana belirgin şekilde artmıştır (15).
Bu grupta yer alan enzimler sefotaksime karşı yüksek derecede hidrolitik aktivite göstermeleri nedeniyle bu şekilde adlandırılmışlardır. CTX-M enzimi üreten bakteriler seftazidime karşı duyarlılık gösterirken (2-8 µg/ml) sefotaksime direnç gösterirler (>64 µg/ml). Ancak bazı CTX-M çeşitleri seftazidimi hidrolize edebilme özelliği kazanmışlardır (MİK >256 µg/ml). Aztreonam MİK değerleri değişkendir.
CTX-M enzimleri sefepimi yüksek düzeyde hidrilize ederler ve sefepimin MİK değerleri CTX-M üreten organizmalarda diğer GSBL üreten enzimlere oranla daha
yüksektir (65). Türkiye’de günümüze kadar CTX-M enzimleri ile ilgili sınırlı sayıda çalışma bulunmaktadır. Bu çalışmalara göre CTX-M-2, CTX-M-3, CTX-M-15 enzimleri rapor edilmiştir (1,3,47,64). Şu ana kadar 69 CTX-M çeşidi saptanmıştır (www.lahey.org./studies/other. asp#table1).
.
1.2.4.1.6. DİĞER GSBL ENZİMLER
SHV ve TEM türevi olmayan PER-1 beta-laktamaz enzimi ilk olarak 1993 yılında Nordman ve ark. (59) tarafından Türkiye’ de P. aeruginosa izolatlarından elde edilmiştir. Türkiye’de hastane kökenli Acinetobacter, P. aeruginosa, K.
pneumoniae izolatlarında PER-1 enziminin yaygın şekilde bulunduğu saptanmıştır (86). Diğer bir GSBL enzimi olan TLA-1 enzimi 2000 yılında Meksika’ da bir hastadan izole edilen E. coli örneğinde saptanmıştır (82). GES-1 enzimi P. mirabilis’
de saptanmış diğer bir GSBL enzim çeşitidir (69). CME-1 enzimi Chryseobacterium (Flavobacterium) meningosepticum’ den elde edilmis farklı bir enzimdir ve klavulonik aside duyarlı olduğu, sefalosporinleri, penisilinleri ve monobaktamları hidroliz edebildiği; sefamisin ve karbapenemlere etki etmediği saptanmıştır (76).
1.2.5. CTX-M TİPİ GSBL ENZİMLERİ 1.2.5.1 CTX-M KRONOLOJİSİ
Japonya’da 1986 yılında Matsumoto ve ark., beta-laktam antibiyotiklerin farmakokinetik çalışmaları sırasında kullanılan labaratuvar köpeklerinin dışkılarında sefotaksime resistan E. coli’den, FEC-1 olarak adlandırdıkları, TEM ve SHV olmayan bir GSBL tanımlamışlardır. FEC-1, kromozomal E. coli sefolosiporinazlarından, geniş spektrumlu substrat profiliyle ve klavulonik asit,
sulbaktam ve imipenem tarafından kuvvetli şekilde inhibe edilmesiyle ayrılmıştır (54). 1989 yılında Almanya’da Bauernfeind ve ark. (7) CTX-M–1 olarak adlandırdıkları TEM ve SHV olmayan bir GSBL üreten sefotaksim dirençli E. coli rapor etmişlerdir. Bauernfeind ve ark. (8) 1992 yılında Salmonella typhimurium örneklerinde sefotaksime seftazidimden daha yüksek direnç gösteren enzim saptamışlar fakat izoelektrik noktasının CTX-M–1 gibi 8,9 değil 7,9 olduğunu gözlemlemişlerdir. Bu durum bu enzimin yeni bir CTX-M enzim grubu olduğu sonucunu çıkarmıştır. Eş zamanlı olarak Güney Amerika’ da sefotaksim dirençli örnek sayısında artış gözlenmiştir. Power ve ark. (74) tarafından Morgenella morganii örneklerinde seftriaksona yüksek derecede direnç gözlenmiş, polimeraz zincir reaksiyonu ve DNA-DNA hibridizasyon yöntemleriyle bu enzimin CTX-M–2 olduğu sonucuna varmışlardır. Bu farklı bölgelerde gözlenen sefotaksime dirençten sorumlu olan beta-laktamazların alkali pI değerlerine sahip oldukları, sefotaksime seftazidimden daha fazla direnç gösterdikleri ve sefotaksime büyük hidrolitik aktivite gösterirken inhitörlere duyarlı oldukları gözlenmiştir (15).
1992 yılında İtalya’da izole edilen aynı çeşit bir GSBL, klinik E. coli kökeninde saptanmış ve MEN enzimi olarak adlandırılmıştır (13). Aynı yıl Barthe´le´my ve ark. (6) MEN–1 olarak belirtilen bu enzimin DNA dizilemesini yapmış, bu enzimin K. oxytoca’da bulunan kromozom aracılı beta-laktamazla %72 benzerlik taşıdığı, TEM ve SHV enzimleriyle %39 benzerlik gösterdiğini saptamışlardır. Bu, TEM ve SHV olmayan, A sınıfı, plazmid aracılı ilk GSBL enzim geninin dizilenmesidir. Ishii ve ark. (39) 1993’de Japonya’da sefotaksim dirençli E.coli izolatlarının ürettiği enzimi Toho–1 olarak olarak adlandırmış ve bu enzimin MEN–1 enzimine benzerlik gösterdiğini (%83) saptamışlardır. 1996 yılında Bauernfeind ve ark. (9) tarafından yapılan çalışmada; CTX-M-1 ve MEN-1
enzimlerinin biribirleriyle aynı ve CTX-M-2 enzimiyle de %84 benzerliğe sahip olduğu, protein ve DNA dizi analizleri yapılarak saptanmıştır.
1996’da Polonya’da Gniadkowski ve ark. (35) C. freundii ve E. coli izolatlarının CTX-M enzim grubuna ait olan beta-laktamaz ürettiklerini bulmuşlar ve DNA dizi analizleri bu enzimin CTX-M–1 enzimine yakınlığını göstermiştir. Bu enzimin CTX-M–1 enziminden dört pozisyonda farklılığı olduğunu bulmuşlar ve CTX-M–3 olarak isimlendirmişlerdir. Bir kaç yıl sonra FEC–1 enzimini kodlayan genin dizi analizi FEC–1 enziminin CTX-M–3 enziminden iki pozisyonda farklılığı olduğunu ortaya koymuştur. Daha sonra CTX-M enzimleri geniş bir coğrafik alanda, çeşitli klinik izolatlarda ve özellikle Enterobacteriaceae ailesi üyelerinde GSBL enzimlerinin hızla büyüyen ailesi haline gelmiştir.
1.2.5.2. CTX-M ENZİMLERİNİN KÖKENİ VE FİLOGENETİĞİ
Şu anda CTX-M enzim familyası içinde 40’dan fazla enzim bulunmaktadır. Bu gruba en fazla benzerlik gösteren beta-laktamaz enzimleri (%62-75 benzerlik) Serratia fonticola, K. oxytoca, Proteus vulgaris, and Citrobacter koseri bakterilerinde bulunan kromozomal A sınıfı enzimlerdir (2,6,15). CTX-M enzimleri aminoasit benzerliklerine göre alt sınıflara ayrılırlar (6). Filogenetik çalışmalar CTX- M enzimlerinin 5 temel gruptan oluştuğunu açığa çıkarmıştır. Her grubun üyeleri kendi aralarında >%94 benzerlik, diğer gruplarla <%90 benzerlik gösterir (Şekil 1).
CTX-M enzimleri aşağıdaki gibi sınıflandırılmıştır:
• CTX-M-1 enzim grubu 6 tane plazmid aracılı enzime sahiptir. Bunlar:
CTX-M-1, CTX-M-3, CTX-M-10, CTX-M-12, CTX-M-15, ve FEC-1 (15).
• CTX-M-2 enzim grubu 8 adet plazmid aracılı enzime sahiptir. Bunlar:
CTX-M-2, CTX-M-4, CTX-M-4L, CTXM-5, CTX-M-6, CTX-M-7, CTX-
M-20, ve Toho-1 (15).
• CTX-M-8 enzim grubu 1 üyeye sahiptir (15).
• CTX-M-9 enzim grubu 9 plazmid aracılı enzime sahiptir. Bunlar: CTX-M- 9, CTX-M-13, CTX-M-14, CTX-M-16, CTX-M-17, CTX-M-19, CTX-M- 21, CTX-M-27, ve Toho-2 (15).
• CTX-M-25 grubu
Şekil 1. CTX-M enzim ailesinin filogenetik ağacı (15)
Kluc-1 grubu
CTX-M-1 grubu
>97% benzerlik
CTX-M-9 grubu
>98% benzerlik
CTX-M-8 grubu
CTX-M-2 grubu (%94 benzerlik) CTX-M-25grubu
Kluyvera ascorbata’da bulunan doğal CTX-M enzimi olan KLUA-2, CTX-M- 2 enzim grubuna dahildir (45). K. ascorbata’nın IP15.79 no’lu kökenindeki KLUA-2 enzimi Salmonella enterica serovar Typhimurium kökenindeki CTX-M-5 ile benzerdir. 2002 yılında Poirel ve ark. (72) yaptıkları çalışmada Kluyvera georgiana’nın CUETM4246-74 no’lu kökeninde bulunan doğal KLUG-1 beta- laktamazının CTX-M-8 enzimiyle %99 aminoasit benzerliğine sahip olduğu saptanmış; bu durum CTX-M enziminlerinin Kluyvera spp.’lerinden köken alabileceğine kanıt oluşturmuştur.
Kluyvera kökenlerinde bulunan doğal enzimler ile CTX-M enzimleri arasındaki aminoasit-dizi ilişkisi, K. ascorbata ve K. georgiana bakterilerinin sahip olduğu doğal beta-laktamazların CTX-M–2 ve CTX-M–8 enzim gruplarının öncülü olabileceği sonucunu çıkarmaktadır. Bunun dışında Kluyvera cryocrescens’da KLUC-1 olarak adlandırılan doğal bir CTX-M enzimi saptanmıştır. Bu enzimin CTX-M-1 grubuyla %86, K. ascorbata’ da bulunan KLUA-1 enzimiyle %77 amino asit benzerliğine sahip olduğu bulunmıştur. Bu durum bu enzimin CTX-M–1 enzim sınıfına dahil edilmesini sağlamıştır (29). KLUC–1 enziminin 6. bir CTX-M grubu oluşturabileceği düşünülmüş ancak klinik izolatlarda tekrar rastlanmamıştır (15).
1.2.5.3. GENETİK ÖZELLİKLER
Doğal kromozomal blaCTX-M genleri, K. cryocrescens (blaKLUC-1), K. ascorbata (blaKLUA), ve K. georgiana (blaKLUG-1) olarak tanımlanmıştır. Bu beta-laktamazların DNA dizilerinde benzerlikler gözlenmiştir (29, 38, 72).
Klinik örneklerde CTX-M kodlayan genler 7kb ile 160 kb büyüklüktedirler ve daha cok plazmidlerde yerleşim göstermektedirler. Bu plazmidler birden fazla antibiyotiğe direnç geni taşıyabilmektedirler ( blaTEM-1, blaTEM-2, blaOXA, blaSHV).
CTX-M geni taşıyan plazmidler in vitro ortamda konjugasyon yoluyla aktarılabilmektedir. Bu özellikleri blaCTX-M genlerinin kolay yayılımını açıklamaktadır.
Genetik araştırmalar K. ascorbata ve K. georgiana’ da yer alan doğal blaCTX-M
genlerinin plazmidlere aktarılmış olabileceğini göstermiştir. blaCTX-M-8 enziminin DNA dizi analizleri K. georgiana kromozomunda yer alan blaKLUG-1 enzim genleriyle
%95 benzerlik göstermiştir (72). Benzer sekilde; CTX-M–2 grubuna ait plazmid aracılı beta-laktamaz genlerinin K. ascorbata kromozomunda yer alan blaKLUA
genlerine %80–100 benzemektedirler (38).
1.2.5.4. EPİDEMİYOLOJİ
Türkiye’de CTX-M enzimleri üzerine sınırlı sayıda çalışma vardır. İlk CTX-M enzimi İstanbul Tıp Fakültesi Hastanesinde izole edilen bir K. pneumoniae örneğinde 2003 yılında rapor edilmiştir. Yine aynı yıl içinde Ankara’da Açıkgöz ve ark. (1) tarafından sefotaksim ve aztreonama dirençli bulunan Salmonella sonnei örneğinin CTX-M-3 enzimi taşıdığını saptamışlardır. Paterson ve ark. (64) yedi ülkeyi kapsayan çalışmalarında CTX-M-2 enzimini Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi
Hastanesi’nden izole edilen K. pneumoniae örneğinde saptamışlardır. Bahar ve ark.
(3) 2006 yılında sefotaksim, aztreonam, sefepime dirençli S. enterica serovar Virchow örneğinde CTX-M-3 enzimini saptamışlardır.
Güney Amerika’da 1989 başlarında sefotaksime dirençli tifoid olmayan Salmonella kökenlerinde artış gözlenmiş ve bu direncin yayılımda artış saptanmıştır (7, 66, 74, 75). Bu artış sırasında Bauernfeind ve ark. (9) tarafından yapılan çalışmada blaCTX-M-2 geni, Salmonella enterica serovar Typhimurium kökeninin CAS-5’inin konjugatif plazmidinden elde edilmiştir. Genin yayılımı E. coli, Shigella sonnei, P. mirabilis, M. morganii, C. freundii, S. marcescens ve Enterobacter aerogenes gibi Enterobacteriaceae üyeleri yanında; Vibrio cholerae ve Aeromonas hydrophila gibi çeşitli bakterilerde gözlenmiştir (15). 1998-1999 yıllarında GSBL üreten Enterobacteriaceae ailesi üyelerinde CTX-M enzimlerinin SHV beta- laktamazlarıdan sonra en sık karşılaşılan enzim olduğu gözlenmiştir. P. mirabilis’de CTX-M-2, E. coli’de CTX-M-9 ve CTX-M-16, Citrobacter amalonaticus, E.
cloacae ve Enterobacter aerogenes’de CTX-M-8 varlığı saptanmıştır (11,12,13).
Uzak Doğu’ya bakıldığında CTX-M enzimi üreten ilk klinik örnek, 1993 yılında Japonya’da TOHO-1 enzimi üreten bir E. coli kökenidir (39). Bundan sonra 1995 ve 2000 yılları arasında bu ülkede beş farklı CTX-M beta-laktamazı E. coli kökenlerinden izole edilmiştir. Bu enzimler CTX-M-2, CTX-M-3, CTX-M-15, TOHO-2 ve CTX-M-14 enzimleridir. Çin’de CTX-M-3, CTX-M-9, CTX-M-13 ve CTX-M-14 enzimleri E. coli, K. pneumoniae, ve E. cloacae kökenlerinde rapor edilmiştir. Çin’de 1999 yılında yapılan bir çalışmada, K. pneumoniae ve E. coli kökenlerinde CTX-M enzimleri saptanmıştır ve bu enzimlerin SHV enzimlerinden sonra en sık karşılaşılan ikinci GSBL enzim ailesini oluşturduğu gözlenmiştir (89).
1997–98 yıllarında Çin’in güney bölgesinde CTX-M enzimleri Enterobacteriaceae
familyası üyelerine en sık kaşılaşılan GSBL’ler olarak saptanmıştır (15). Tayvan’ da 1998–2000 yılları arasında yapılan bir çalışmada CTX-M-3 ve CTX-M-14 üreten K.
pneumoniae kökenlerinin hastane içi ve hastaneler arası yayılım gösterdiği saptanmıştır (90).
Kore’nin çeşitli bölgelerinde 1995 ve 1996 yıllarında klinik E. coli ve K.
pneumoniae kökenlerinde ve 2000 yılında gerçekleşen gastroenterit artışı sırasında izole edilen S. sonnei kökenlerinde CTX-M–14 enzimi saptanmıştır (52,61).
Vietnam’da 1996 yılından bu yana E. coli ve K. pneumoniae kökenlerinde CTX-M–
14 ve CTX-M–17 enzimi gözlenmiştir (25,26).
Hindistan’da CTX-M-3 enziminin türevi olan CTX-M-15 enzimi, 2000 yılında yapılan bir çalışmada birbirinden bağımsız 6 Enterobacteriaceae ailesi üyelerinde rapor edilmiştir (43).
Doğu Avrupa CTX-M enzimlerinden etkilenen diğer bir bölgedir. Polonya’ da 1996 yılında CTX-M–3 enzimi C. freundii kökenlerinde saptanmıştır (35).
Polonya’da 1996 yılında yapılan bir çalışmada Enterobacteriaceae üyelerinin CTX- M–3 benzeri enzim ürettikleri saptanmıştır (63). Yine 1998 yılında Polonya yürütülen çalışmada SHV üreten izolatların oranı %60, TEM enzimi üretenler %20,8 ve CTX-M enzimi üretenler %18,8 sıklıkta gözlenmiştir. Polonya’da 1998–2000 yılları arasında 10 farklı şehir ve 15 farklı hastanede yapılan çalışmada CTX-M–3 enziminin ülkede yayılım gösterdiği gözlenmiştir. E. coli, K. pneumoniae, K.
oxytoca, C. freundii, S. marcescens, E. cloacae ve M. morganii. S. enterica serovar Typhimurium örneklerinde saptanan CTX-M–3 kodlayan plazmidlerin diğer bir çok bakteriye de yayıldığı (4). CTX-M–3 enzimi saptanan diğer bir ülke Yunanistan’dır ve E. coli örneklerinden izole edilmiştir (55).
CTX-M-3’den köken alan CTX-M–15 enzimi daha önceleri Hindistan’da gözlenmiş daha sonrada Polonya (5), Bulgaristan, Romanya, Türkiye’de gözlenmiştir. Litvanya’da 1990 yılında CTX-M üreten S. enterica serovar Typhimurium kökenleri gastroenterit vakalarında saptanmıştır. CTX-M araştırması sırasında bu örneklerden birinde CTX-M–2 enziminin bir türevi olan CTX-M–5 açığa çıkmıştır (16). 1996 yılında Rusya’da CTX-M-4 üreten S. enterica serovar Typhimurium saptanmıştır (33,34). Bu veriler CTX-M üreten S. enterica serovar Typhimurium örneklerinin en az üç Avrupa ülkesinde klonal yayılış gösterdiğini göstermektedir.
Batı Avrupa’da CTX-M enzimleri ilk olarak 1989 yılında Almanya’da iki E.
coli kökeninde (7) ve Fransa’da bir İtalyan hastada saptanmıştır (10). 1989 yılına kadar 11 farklı CTX-M enzimi Fransa’da rapor edilmiştir. Bunlar E. Coli’den; CTX- M–1, CTX-M–2, CTX-M–9, CTX-M–14, CTX-M–21, CTX-M–27, P. mirabilis’
den; CTX-M–1, CTX-M–2, CTX-M–20 ve E. cloacae’ den; CTX-M–1, CTX-M–3 enzimleridir. Ancak Fransa’da CTX-M üreten kökenler 1998 yılına kadar bir daha saptanmamıştır.
İspanya’da 1989–2000 tarihleri arasındaki 12 yıllık sürede GSBL üreten Enterobacter kökenlerinde CTX-M–10 gözlenmiştir (23,28,60). Barselona’da 1994–
1996 tarihleri arasında GSBL üreten Enterobacteriaceae üyelerinin çoğunluğunda CTX-M–9 bulunmuştur (77,78). Aynı bölgede 1997–1998 tarihleri arasında üç S.
enterica serovar Virchow kökeninde CTX-M–9 benzeri enzim gözlenmiştir (83).
Yine İspanya’da yürütülen bir çalışmada 2001 yılında izole edilen GSBL üreten Enterobacteriaceae ailesi üyelerinin %50’sinin CTX-M–14 ürettiği bulunmuş ve bununda plazmid aktarımıyla gerçekleştiği düşünülmüştür (18). İngiltere’de 2000
yılında K. oxytoca kökenlerinde ve 2001-2002 tarihleri arasında ise K. pneumoniae kökenlerinde farklı CTX-M enzim çeşitleri gözlenmiştir (15,18).
İlk CTX-M enzimi 1989 tarihinde saptansa da yayılımı 1995’den sonra olmuştur. CTX-M ezimleri şu anda Latin Amerika, Uzak Doğu, Avrupa ve yakın Doğu, Kuzey Amerika, ve Afrika gibi geniş bir coğrafik alana yayılmış durumdadır (Resim 1).
CTX-M-14, CTX-M-3, CTX-M-2 en yaygın olan enzimlerdir. Bu enzimler insan veya taşıyıcı olabilecek sağlıklı hayvanlarda bulunan bakterilerden izole edilmiştir. CTX-M üreten çoğu köken genelde hastane enfeksiyonlarda gözlenir.
Ancak SHV ve TEM enzimlerinin aksine CTX-M enzimleri V. cholerae, tifoid olmayan Salmonella, Shigella sp. gibi toplum kökenli bakterilerde ortaya çıkabilmektedir (15).
Resim 1. CTX-M enzimlerinin Dünya’da dağılımı
1.2.5.5. FENOTİPİK ÖZELLİKLER
Kluyvera türleri haricinde, CTX-M kodlayan genlerin ekspresyon düzeyinin zayıf olduğu durumlar da dahil olmak üzere, laboratuvar ve doğal E. coli kökenlerinin CTX-M beta-laktamazları aminopenisilin (ampisilin veya amoksisilin), karboksipenisilin (karpenisilin veya tikarsilin), üreidopenisilin (piperasilin), dar spektrumlu sefalosporinlere yüksek düzeyde direnç oluşumuna neden olur. Bu enzimler 7-alfa-metoksisefolosporinler (sefoksitin) ve karbepenemlere (imipenem, meropenem)’e karşı duyarlıdırlar (15).
Çoğu enzim oksiiminosefalosporinlerden sefotaksim ve seftriaksona karşı yüksek direnç gösterirken, sefepim ve sefpiroma karşı farklı seviyerde direnç gösterirler. Aztreonamın MİK düzeyleri genelde yüksektir. Seftazidim MİK düzeylerinde artış gözlenmekle beraber çoğunlukla duyarlıdırlar. Asp240Gly değişimiyle oluşmuş üç CTX-M enzimi; CTX-M-15, CTX-M-16, CTX-M-27 köken aldıkları CTX-M-3, CTX-M-9, CTX-M-14 enzimlerine göre seftazidime 8 kat daha fazla direnç gösterirler (70).
Beta-laktamaz inhibitör kombinasyonlarına karşı gelişen direnç düzeyi üretilen enzim düzeyine bağlıdır. Amoksisilin ve tikarsilinin, klavulonatla kombinasyonlarının MİK değerleri değişkendir ve çoğu örnekte duyarlı veya düşük derecede direnç gözlenmiştir. Piperasilin/tazobaktam kombinasyonuna duyarlıdırlar ve antibiyotik inhibisyonu gerçekleşmez. Bu durum sefotaksimin tazobaktam ve klavulonat ile kombinasyonlarında da gözlenir.
Seftazidim sıklıkla GSBL saptamasında kullanılır ve TEM, SHV tipi GSBL’
leri saptamada genelde en uygun substrattır. Tek başına kullanıldığında seftazidime
duyarlı CTX-M üreten örnekleri saptamada başarısızdır. GSBL üreten çoğu örnek inokulum etkisi gösterir ve geniş spekrtumlu sefalosporinlerin MİK değerleri inokulum arttıkça artar (12).
İn vitro ortamda CLSI rehberine (58) göre seftazidime dirençli olmayan CTX- M üreten izolatlar in vivo ortamda seftazidime direnç gösterebilirler. Bu nedenle CTX-M üreten örneklerle oluşmuş enfeksiyonların tedavisinde seftazidim kullanımı sağaltımda başarısızlığa ve CTX-M enzimlerinin hidrolitik aktivitelerinin artmasına neden olabilir.
Sonuç olarak seftazidim ve sefotaksim duyarlılığı, CTX-M üretimini gözden kaçırma riskini azaltmak için test edilmelidir (15,18).
1.2.5.6. BİYOKİMYASAL ÖZELLİKLER
Toho-2 enzimi haricinde doğal CTX-M enzimleri yaklaşık 291 aminoaside ve yaklaşık 28 kDa ağırlığa sahiptir (46,52). Bu enzimlerin izoelektrik noktaları 7.4-9 arasında değişmektedir. CTX-M beta-laktamazları, TEM ve SHV penisilinazlarına göre penisiline karşı daha az etkilidir. En yüksek hidrolitik aktiviteyi dar spektrumlu sefalosporinlere karşı gösterirler.
Seftazidime karşı olan zayıf enzimatik etkinlik çoğu CTX-M enzimini SHV ve TEM sefotaksimazlarından (Ör: TEM–3, TEM–4, SHV–2, SHV–3) ayırır.
CTX-M enzimleri sefepim ve sefpirama karşı belirgin hidrolitik aktivite gösterirler. Çoğu A sınıfı GSBL’lerde olduğu gibi 7-alfa- sübstitüe beta-laktamlar (sefoksitin) ve imipeneme karşı hidrolitik aktivite göstermezler.
240 ve 167 pozisyonundaki aminoasitler CTX-M enzimlerinin evriminde önemli yere sahiptir. 2001 yılında Bonnet ve ark. (13) tarafından Brezilya’ da yapılan bir çalışmada E. coli’de saptanan CTX-M–16 enziminin CTX-M–9 enziminden
Asp240Gly farklılığıyla ayrıldığını bulmuşlar ve enzimatik çalışmalar sonucunda CTX-M–16 enziminin sefotaksime karşı CTX-M-9 ile aynı hidrolitik etki gösterdiği ancak seftazidime daha yüksek etki ettiği saptamışlardır.
Benzer bir durum yine Bonnet ve ark. (14) tarafından 2003 yılında Fransa’da gözlenmiştir. Klinik E. coli örneğinde saptanan CTX-M–27 olarak isimlendirdikleri enzimin CTX-M–14 enziminden 240. pozisyonunda tek bir aminoasit değişimiyle oluştuğu ve seftazidime daha etkin olduğunu saptamışlardır. Gly240Asp değişimi sayesinde CTX-M-3’den köken alan CTX-M–15 enzimi seftazidime karşı köken aldığı enzimden daha yüksek hidrolitik aktivite gösterir (71).
Bu çalışmalar 240. pozisyondaki aminoasitlerin enzimatik özellikleri belirlemede rol aldığı sonucunu çıkarmaktadır.
CTX-M-18’den Pro167Ser değişimiyle türeyen CTX-M–19 enzimi atipik bir CTX-M enzimidir çünkü seftazidime karşı sefotaksimden daha düşük etkinliğe sahiptir (70).
Çoğu A sınıfı GSBL’de gözlendiği gibi CTX-M enzimleri beta-laktamaz inhibitörlerine karşı duyarlılık gösterir. Bu inhibitörlerin arasında tazobaktam en aktif olandır, sulbaktam tazobaktama göre daha az etkinlik gösterir (6,11,13,14, ,16,30,51,68,71).
BÖLÜM II
2. GEREÇ VE YÖNTEM
2.1. GEREÇ
2.1.1 ÇALIŞMA GRUBU
Celal Bayar Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesinde 2005 yılında izole edilen GSBL pozitif 37 gram negatif köken tez kapsamına alındı. Bakteriler -80°C’ de çalışma zamanına kadar %10 gliserinli buyyon besiyerinde stoklandı.
Tablo 2. Örneklerin türlere göre dağılımı
Bakteri Örnek sayısı %
Klebsiella pneumoniae 11 29,72
Escherichia coli 26 70,27
2.1.2. AYRAÇLAR
1- TBE (10X)Tris base 108g Borik asit 55g
0,5 M EDTA 40 ml
Distile su 1000 ml’ye tamamlandı Otoklavlandı. Oda ısısında 1 ay stabildir.
2- EDTA (ethylenediaminetetraacetate) (Sigma E5134)
Na2EDTA 18.6 g
Distile H2O 100 ml
EDTA pH=8’de stabildir.1-2 g NaOH pelleti ile istenen pH elde edildi otoklavlandı.
3- Agaroz (Sigma A9539)
4- Etidyum bromid (1000X, 5mg/ml) (Sigma E8751) Etidyum bromid 0,5g
Distile su 100ml
Işıktan korumak için aliminyum folyo ile kaplandı. +4°C’ de saklandı.
5- dNTP karışımı (25µmol her biri) (Fermentas R0181) (2,5 mM/herbiri, toplam 10mM)
dATP (100 mM) 25 µl dCTP (100 mM) 25 µl dGTP (100 mM) 25 µl dTTP (100 mM) 25 µl
Distile su 900 µl
-20°C’ de saklandı.
6- Marker’lar
Gene Ruler 100bp DNA Ladder Plus (Fermentas SM0323) Gene Ruler 50bp DNA Ladder (Fermentas SM0323)
7- Restriksiyon enzimleri
Pst I, restriksiyon enzimi (Fermantas ER0611) Pvu II, restriksiyon enzimi (Fermantas ER0631)
8- Taq DNA polimeraz, (Fermantas EP0402) 5U/ µl İçeriği:
10X PCR tampon çözelti 25 mM MgCl2
2.2. YÖNTEM
2.2.1. ANTİBİYOTİK DUYARLILIK TESTLERİ
Çalışma kökenlerinin minimal inhibitör konsantrasyonları (MİK), mikrodilüsyon yötemi ile CLSI önerilerine uyularak belirlendi (58). Bu test için U tabanlı 96 kuyucuklu mikrodilüsyon plakları kullanıldı.
Antibiyotikler: Ampisilin, ampisilin/sulbaktam (2:1), sefoksitin, seftazidim, sefotaksim, aztreonam, imipenem. Antibiyotiklerin 1024 µg/mL olacak şekilde stok sulandırımları hazırlanarak –40 oC’de saklandı.
Besiyeri: Mueller Hinton Broth
Kalite kontrol suşu: E. coli ATCC 25922
Yirmidört saatlik bakteri kültüründen 0.5 McFarland bulanıklığına eşit olacak şekilde direkt koloni süspansiyonu yöntemiyle inokülum hazırlanıp, mikrodilüsyon plağındaki son inokülum konsantrasyonu 5 x 105 koloni/mL olacak şekilde sulandırım yapıldı. Steril plaklara 50 µL Mueller-Hinton sıvı besiyeri dağıtıldı.
Birinci kuyulara 50 µL antibiyotik solüsyonları (ampisilin 1024 µg/mL;
ampisilin/sulbaktam, 3. kuşak sefalosporinler, aztreonam ve sefoksitin 512 µg/mL;
imipenem 256 µg/mL) eklenip 10. kuyuya kadar seri dilüsyonlar yapılıp 10. kuyudan 50 µL dışarı atıldı. 11 (bakteri üremesinin kontrolü) ve 12. (besiyeri kontrolü) kuyular kontrol amacıyla kullanıldı. Bakteri süspansiyonundan 12. kuyu hariç tüm kuyulara 50 µL dağıtıldı. Plaklar 35 oC’de 16-20 saat inkübe edildi. Bu süre sonunda üreme görülmeyen en düşük antibiyotik konsantrasyonu MİK değeri olarak kabul edildi.
2.2.2. PCR İLE bla
CTX-MGENLERİNİN SAPTANMASI
DNA ekstraksiyonu:
• Ependorflara 200 µl distile su kondu.
• 24 saatlik bakteri kültüründen iki koloni alınarak ependorflarda bulunan distile sularla süspansiyonu yapıldı. Vortekslendi.
• 950C’ de 10dk. İnkübasyona bırakılarak DNA denatürasyonu sağlandı.
• Örnekler 3dk. 4°C’ de 12000 devirde sanrtifüjlendi.
• Santrifüj sonrası oluşan süpernatantlar ayrı ependorflara aktarıldı.
Primer setlerinin belirlenmesi:
GenBank’tan alınan tüm CTX-M gruplarını temsil eden referans diziler
“BioEdit 7.0.1 Sequence Aligment Editor” (Hall TA. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT.
Nucl Acids Symp Ser 1999;41:95-98.) bilgisayar programı kullanılarak hizalandı.
CTX-M enzimlerinin tamamını yakalayabilen bir primer seti belirlendi (Tablo 3).
Grup spesifik primer setleri (42) ise Tablo 4’te gösterilmiştir.
CTX-M genlerinin varlığı, CTX-M içeren bir pozitif kontrol, CTX-M içermeyen bir negatif kontrol eşliğinde CTX-M ortak primer seti kullanılarak PCR ile araştırıldı. PCR aşğıda belitilen koşullarda Techne (Barloworld Scientific Ltd., İngiltere) cihazında gerçekleştirildi.
Aşağıda belirtilen CTX-M PCR ürünlerinin restriksiyon analizi sonrasında gruba özgü primer setleri (Tablo 4) kullanılarak yapılan PCR çalışmaları ile gruba ait olma veya olmama durumları doğrulandı.
Tablo 3. CTX-M ortak primer seti
Primer Dizi (5’ → 3’)
Ürün uzunluğu CTX-MU1
CTX-MU2
ATGTGCAGYACCAGTAARGT
TGGGTRAARTARGTSACCAGA 593-bp
Y(C/T), R(A/G), S(G/C)
Tablo 4. CTX-M grup spesifik primer setleri
Primer Dizi (5’ → 3’) Ürün
uzunluğu CTX-1F
CTX-1R
CCCATGGTTAAAAAATCACTG
CCGTTTCCGCTATTACAAAC 891-bp
CTX-2F CTX-2R
ATGATGACTCAGAGCATTCGC
TCGCTCCATTTATTGCATCA 893-bp
CTX-8F CTX-8R
ATGTTAATGACGACAGCCTGTG
CCGGTTTTATCCCCGACA 689-bp
CTX-9F CTX-9R
ATGGTGACAAAGAGAGTGCA
CCCTTCGGCGATGATTCTC 864-bp
1. Reaksiyon karışımı: Her bir örnek için ependorf tüpüne, buz üzerinde toplam hacim 50µl olacak şekilde aşağıdakiler konuldu;
Steril distile su 33,8 µl 10X Taq buffer 5 µl
25 mM MgCl2 3 µl (1,5 mM/final) dNTP (5 mM/herbiri) 2 µl (200 µM/final) Primer F (50 pmol/µl) 0,6 µl (30 pmol/final) Primer R (50 pmol/µl) 0,6 µl (30 pmol/final) Taq polimeraz (5U/µl) 0.25 µl (1,25 U/final)
Ekstraksiyon ürünü 5 µl
2. Isı döngü programı: Ependorflar ısı döngü cihazına yerleştirilerek aşağıda sıcaklıklarda 35 döngü gerçekleştirildi.
94°C’ de 7 dakika ön denatürasyon 94°C’de 50 saniye denatürasyon
50°C’de 40 saniye birleşme 35 Döngü 72°C’de 1 dakika uzama
72 °C’de 5 dakika son uzatma
3. Elektroforez: sonuçların değerlendirilmesi için, 1X TBE içinde % 1,5 agaroz jel hazırlandı ve mikrodalga fırında eritildi. 50 ml eriyik içine 5 mg/ml etidyum bromid çözeltisinden 5 µl eklendi ve jel kasetine döküldü, taraklar yerleştirilerek donmaya bırakıldı. PCR ürünleri jel yükleme tamponu ile 1/6 oranında (2 µl jel yükleme tampon çözeltisi + 10 µl çoğaltılmış ürün ) karıştırılarak her bir kuyuya 12 µl, bir kuyuyada GeneRuler 100 bp DNA Ladder Plus marker olacak şekilde jele aktarıldı. Jel 1X TBE içinde 100 V uygulanarak 60-90 dakika yürütüldü.
Sonuçlar ultraviyole transilüminatörde 280-340 nm dalga boyunda incelendi. Bant büyüklükleri marker ile karşılaştırıldı ve 593 bp büyüklüğünde bant izlenmesi CTX- M olumlu olarak değerlendirildi.
2.2.3. CTX-M PCR ÜRÜNLERİNİN RESTRİKSİYON (PCR- RFLP) ANALİZİ
CTX-M enzimlerini grup düzeyinde tiplendirmek için CTX-M pozitif PCR ürünleri aşağıda belirtilen koşullarda PstI ve PvuII restriksiyon enzimleri ile kesildi
(32). Uygulamadan önce “BioEdit 7.0.1 Sequence Aligment Editor” programı ile hizalanan CTX-M referans dizileri üzerinde PstI kesim noktaları (5'-C T G C A^G- 3', 3'-G^A C G T C-5') ve PvuII kesim noktaları (5'-C A G^C T G-3', 3'-G T C^G A C-5') araştırıldı ve gruba özgü olası kesim ürünleri belirlendi (Tablo 5).
Restriksiyon analizi sonrasında elde edilen kesim ürünleri Tablo 5’daki restriksiyon paternleri ile karşılaştırılarak grup tayini yapıldı.
Tablo 5. CTX-M PCR ürünlerinin olası restriksiyon paternleri Kesim Sayısı
CTX-M grup
PstI PvuII
Kesim Ürünleri (bp)
CTX-M-1 0 2 260, 176, 156
CTX-M-2 1 0 412, 181
CTX-M-8 0 1 417, 176
CTX-M-9 1 1 427, 101, 65
1. Reaksiyon karışımı: Her bir örnek için ependorf tüpüne toplam hacim 20µl olacak şekilde aşağıdakiler konuldu;
Stok çözelti Final konst. miktar
10x buffer G (1x) 2µL
Pst I enzimi 5U 0.5µL
Pvu II enzimi 2.5U 0.25µL
Kalıp DNA 10µL
ddH2O ile 20 µL’ye tamamlandı.
2. Reaksiyon ısısı ve süresi: 37 °C’ de 2 saat.
3. Elektroforez: Sonuçların değerlendirilmesi için, 1X TBE içinde % 3 agaroz jel hazırlandı ve mikrodalga fırında eritildi. 50 ml eriyik içine 5 mg/ml etidyum bromid çözeltisinden 5 µl eklendi ve jel kasetine döküldü, taraklar yerleştirilerek donmaya bırakıldı. PCR ürünleri jel yükleme tampon çözeltisi ile 1/6 (2 µl jel yükleme tampon çözeltisi + 10 µl çoğaltılmış ürün) oranında karıştırılarak her bir kuyuya 12 µl, bir kuyuyada GeneRuler 50 bp DNA Ladder marker olacak şekilde jele aktarıldı. Jel 1X TBE içinde 100 V uygulanarak 60-90 dakika yürütüldü.
Sonuçlar ultraviyole transilüminatörde 280-340 nm dalga boyunda incelendi. Tablo 5’da belirtilen ürün uzunluklarına göre CTX-M grubu belirlendi.
BÖLÜM III
3. BULGULAR
3.1. ANTİBİYOTİK DUYARLILIK SONUÇLARI
Çalışmaya alınan 37 örneğin ampisiline dirençli olduğu (≥256 µg/ml) saptanmıştır. 30 no’lu örnek dışında imipeneme direnç gözlenmemiş, ampisilin/sulbaktam, sefoksitin, seftazidim, seftriakson, sefotaksim, aztreonam diğer antibiyotiklere duyarlılık sonuçları Tablo 6’da gösterilmiştir.
CTX-M pozitif örneklerin %84’ü seftazidim (MİK≥32µg/ml), %100’ü seftriakson(MİK≥64µg/ml), %89,28’i sefotaksim(MİK≥64µg/ml), %64’ü aztreonam’a (MİK≥32µg/ml) direnç göstermiştir (Tablo 6).
3.2. PCR SONUÇLARI
37 örneğin DNA ekstreleri CTX-M genlerinin varlığı açısından değerlendirilmiştir. PCR sonuçlarına göre örneklerin %75,76’ sının CTX-M geni taşıdığı saptanmıştır. Türlerine göre CTX-M geni varlığı; E. coli örneklerinde
%96,15 ve K. pneumonia örneklerinde %27,27 olarak saptanmıştır. Resim 2’de PCR ürünlerinin bant görüntüleri gösterilmiştir.
Resim 2. PCR ürünlerinin bant görünümleri
NK: Negatif kontrol; PK: Pozitif kontrol; M: Marker; 1-3, 5-8: Pozitif çalışma örnekleri; 4: Negatif çalışma örneği
3.3. RESTRİKSİYON ANALİZİ SONUÇLARI
CTX-M tipi enzimlerin grubunu belirlemek için CTX-M PCR ürünlerinin PstI ve PvuII enzimleri ile restriksiyonu sonrasında 28 CTX-M örneğinin tamamı CTX- M-1 grubu ile uyumlu (Tablo 5) 260, 176 ve 156 bp’lik restriksiyon profili sergilemiştir. Restriksiyon kesimi sonucu oluşan bant görünümleri Resim 3’de gösterilmiştir.
593 bp
1000 900 800 700 600 500 400 300 250 200 150 100 50
M
NK PK 1 2 3 4 5 6 7 8
Resim 3. CTX-M-1 grubuna özgü restriksiyon paterleri
M: Marker; PK: Pozitif kontrol; 1-8: CTX-M-1 grubu çalışma örnekleri
3.4. PCR YÖNTEMİYLE CTX-M GRUBUNUN DOĞRULANMASI
Tablo 4’de yer alan grup spesifik primerler kullanılarak yapılan PCR çalışmalarıyla örneklerin CTX-M-1 grubuna ait oldukları ve diğer gruplara ait olmadıkları doğrulanmıştır.
600500 400300 250200 150 100 50
261 bp 176 bp 156 bp
M PK 1 2 3 4 5 6 7 8
Resim 4. CTX-M-1 grubuna spesifik PCR ürünlerinin bant görünümleri M: Marker; PK: Pozitif kontrol; NK: Negatif kontrol; 1-5, 8: CTX-M-1 pozitif örnekler;
6: CTX-M taşımayan negatif örnek
1031 900 800 700 600 500 1200 1500 2000 3000
891 bp
M
PK NK 1 2 3 4 5 6 7 8NO Köken AMP SAM FOX CAZ CRO CTX ATM IMP PCR-CTX-M RFLP
1 K. pneumoniae >256 64 1 2 >128 32 8 0.125 + CTX-M-1 Grup
5 K. pneumoniae >256 >128 1 0.5 0.25 0.25 0.25 0.25 -
9 K. pneumoniae >256 2 128 0.25 0.25 0.25 0.25 1 -
12 K. pneumoniae >256 >128 8 >128 128 64 >128 0.125 -
13 K. pneumoniae >256 8 4 0.25 0.25 0.25 0.25 0.125 -
14 K. pneumoniae >256 128 32 128 32 16 128 0.25 -
15 K. pneumoniae >256 64 128 128 >128 >128 128 0.5 + CTX-M-1 Grup
16 K. pneumoniae >256 128 1 0.25 0.25 0.25 0.25 0.125 -
17 K. pneumoniae >256 8 2 16 128 64 8 0.25 + CTX-M-1 Grup
18 K. pneumoniae >256 2 2 16 1 0.5 8 0.125 -
19 K. pneumoniae >256 64 1 64 8 4 32 0.125 -
20 E. coli >256 32 4 64 >128 16 2 0.125 + CTX-M-1 Grup
21 E. coli >256 8 2 32 64 32 32 0.125 + CTX-M-1 Grup
22 E. coli >256 128 2 2 >128 64 4 0.125 + CTX-M-1 Grup
23 E. coli >256 64 2 64 >128 >128 128 0.125 + CTX-M-1 Grup
24 E. coli >256 16 8 64 >128 >128 128 0.125 + CTX-M-1 Grup
25 E. coli >256 8 2 2 >128 128 8 0.125 + CTX-M-1 Grup
26 E. coli >256 64 4 128 >128 >128 128 0.125 + CTX-M-1 Grup
27 E. coli >256 32 2 32 >128 >128 32 0.125 + CTX-M-1 Grup
28 E. coli >256 16 2 32 >128 >128 64 0.125 + CTX-M-1 Grup
Tablo 6’nın devamı
MİK
NO Köken AMP SAM FOX CAZ CRO CTX ATM IMP PCR-CTX-M RFLP
29 E. coli >256 64 4 128 >128 >128 >128 0.125 + CTX-M-1 Grup
30 E. coli >256 64-128 128 32 128 128 64 >64 + CTX-M-1 Grup
31 E. coli >256 32 2 2 >128 128 8 0.125 + CTX-M-1 Grup
32 E. coli >256 32 2 32 >128 128 32 0.125 + CTX-M-1 Grup
34 E. coli >256 32 2 0.25 0.25 0.25 0.25 0.125 -
35 E. coli >256 64 4 128 >128 64 128 0.125 + CTX-M-1 Grup
36 E. coli >256 >128 64 >128 >128 128 128 0.25 + CTX-M-1 Grup
38 E. coli >256 32 8 64 128 64 64 0.125 + CTX-M-1 Grup
44 E. coli 256 16 2 2 >128 128 4 0.125 + CTX-M-1 Grup
46 E. coli >256 >128 8 128 >128 >128 128 0.125 + CTX-M-1 Grup
51 E. coli >256 32 4 16 128 >128 128 0.125 + CTX-M-1 Grup
53 E. coli >256 64 8 128 >128 >128 >128 0.125 + CTX-M-1 Grup
58 E. coli >256 16 2 64 >128 128 128 0.125 + CTX-M-1 Grup
61 E. coli >256 64 4 64 >128 >128 64 0.125 + CTX-M-1 Grup
62 E. coli >256 16 8 32 >128 >128 64 0.125 + CTX-M-1 Grup
63 E. coli >256 64 16 64 >128 >128 >128 0.125 + CTX-M-1 Grup
66 E. coli >256 32 4 64 128 64 64 0.125 + CTX-M-1 Grup
Amp: ampisilin, SAM: ampisilin/sulbaktam, FOX: sefoksitin, CAZ: seftazidim, CTX: sefotaksim, ATM: aztreonam, IMP: imipenem
