Nötralizasyon Testi

Nötralizasyon Testi

Bir Virus Enfeksiyonunun Teşhisi

Direkt

Antijen tespiti (EM) Genom tespiti

İ

ndirekt

VİROLOJİK

SEROLOJİK

• Nötralizasyon: Enfeksiyon meydana getirme gücüne sahip olan bir virusun, in vivo ve in vitro sistemlerde HOMOLOĞU OLAN antikorlar (Ab) tarafından enfeksiyözitesinin bloke edilmesidir.

Pozitif serum: Belirli bir ajana (belirli bir virusa örneğin; BVDV) karşı antikor (Ab) taşıdığı bilinen serumdur. Pozitif serum bu virusa karşı Ab’la birlikte başka ajanlara karşı da Ab taşıyabilir.

Negatif Serum: Belirli bir ajana (belirli bir virusa örneğin; BVDV) karşı Ab taşımadığı bilinen serumdur. Başka ajanlara karşı Ab taşıyabilir ya da taşımayabilir.

Hiperimmnun serum: Belirli bir etkenin duyarlı bir konakçıya belli bir protokol kapsamında verilmesiyle elde edilen ve bu etkene karşı yüksek titrede Ab taşıyan serumdur.

Tip spesifik serum: Belirli bir ajanın serotipleri veya alttiplerinden birine karşı Ab içeren pozitif

serumdur. Örneğin; şap hastalığı virusunun serotiplerinden (A, O, C, SAT1, SAT2, SA3, Asya1) birine karşı Ab içeren pozitif serum.

Poliklonal Antikor: Bir virusun birden fazla (genelli,kle tüm) antijenik determinantlarına karşı Ab içeren serumdur.

Monoklonal Antikor: Bir virusun TEK BİR antijenik determinantlarına SPESİFİTE gösteren antikordur.

Nötralizasyonun Kullanım Alanları

• Epidemiyolojik kontrollerde

• Klinik enfeksiyonun teşhisinde

• Sürü bazında belirli hastalıkların kontrol, takip ve eradikasyonu

• Karantina merkezlerinde

• Aşılama öncesi ve sonrası antikor tespitinde

• Virus izolatlarının identifiye edilmesinde

Nötralizasyo n

Hücre Kültürü

ETY

Deney Hayvanları

İn vitro

İn vivo

Makronötralizasyon Mikronötralizasyon

Uygulama tekniğine göre

Nötralizasyon

Serum sulandırma metodu (Şüpheli

serum)

Antikor aranması

Virus sulandırma metodu (Şüpheli

virus)

Virus

identifikasyonu

Mikronötralizasyon

1. Serum sulandırma metodu. (şüpheli serum, bilinen virus)

Antikor aranması

2. Virus sulandırma metodu. (Şüpheli virus, bilinen serum)

Virus identifikasyonu

• Şüpheli serumda Ab var mı yok mu?

1. Serum Nötralizasyon 2. SN50 Testi

• Pozitif serumdaki Ab miktarı ne kadar?

1. Serum sulandırma metodu (şüpheli serum, bilinen virus)

• Amaç: Antikor var mı yok mu onu

bulmak!!!

1

1/2 Şüpheli

serum

1 ml şüpheli serum+1 ml PBS

1/2

0.05 ml

100DKID₅₀ oranında sulandırılan virus (100DKID₅₀ si bilinen virus) tüm gözlere 0.05 ml konur.

VK: Virus Kontrol

 0.05 ml VİRUS

 0.05 ml Serumsuz Earle

HK: Hücre Kontrol

 0.1 ml Serumlu Earle

HK VK

½ serum + 100DKID₅₀ si bilinen virus

• 1 sa 37 de ℃ inkübasyon

37℃ ve %5 CO2 etüv

HK VK

Son olarak, TÜM GÖZLERE 0.05 ml (1 DAMLA) hücre süspansiyonu (DAMLALIKLA!)

½

• Test bitti

Her gün mikroskopta bakıyoruz!

37℃ ve %5 CO2 etüv

CPE

Şüpheli serum CPE Nötralizasyon Çalışılan virusa karşı

(homolog) Ab varsa (-) (+)

Çalışılan virusa karşı

(homolog) Ab yoksa (+) (-)

CPE(+) Nötralizasyon(-) CPE(-) Nötralizasyon(+)

Pozitif serumda SN

Tespiti

SN

100DKID₅₀ oranında sulandırılmış virusla enfekte edilen hücre

kültürlerinin yarısında virus üremesini bloke eden serum sulandırmasıdır.

• Pozitif serumdaki Ab miktarı ne kadar?

½

Ya da

tüm gözlere 0.05 ml PBS koyduktan (DAMLALIKLA) sonra ilk 4 göze 0.05 ml serum konur.

1/2

• İlk gözden sulandırıcı (diluter) yardımıyla alınan 0.05 ml oranındaki serum diğer gözlere aktarılarak serumun log₂ tabanına göre

sulandırılması gerçekleştirilir.

1/2 1/4 1/8 1/16

1/64 1/32

• 100DKID₅₀ oranında sulandırılan virus (100DKID₅₀ si bilinen virus) tüm gözlere 0.05 ml konur.

1/2 1/4 1/8 1/16

1/64 1/32

VK: Virus Kontrol

 0.05 ml VİRUS

 0.05 ml Serumsuz Earle

HK: Hücre Kontrol

 0.1 ml Serumlu Earle

HK VK

• 1 sa 37 de ℃ inkübasyon

37℃ ve %5 CO2 etüv

HK VK

Son olarak, TÜM GÖZLERE 0.05 ml (1 DAMLA) hücre süspansiyonu (DAMLALIKLA!)

1/2 1/4 1/8 1/16

1/64 1/32

• Test bitti

Her gün mikroskopta bakıyoruz!

37℃ ve %5 CO2 etüv

CPE

Testin Değerlendirilmesi

1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 Hücre Kontrol

CPE artar !!!!!!

1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 Hücre Kontrol