ÖZET
Sepsis, yo¤un bak›m ünitelerinde mortalitenin en önemli nedenlerindendir. Nötrofiller, bakteriyel ajanlara karfl› do¤al immün savunmada önemlidir ve sepsis patogenezinde rol oynayan hücrelerdir. Bu çal›flmada sepsisli hastalarda nötrofil fonk- siyonlar›nda gözlenen de¤iflikliklerin belirlenmesi amaçlanm›flt›r. Bu amaçla sepsis tan›s› alm›fl 10 hastaya ait nötrofillerin fa- gositik aktivitesi ve oksidatif patlama kapasiteleri araflt›r›lm›fl ve elde edilen sonuçlar sa¤l›kl› kontrollere ait nötrofil örnekleri ile k›yaslanm›flt›r. Fagositik aktivite ve oksidatif patlama kapasiteleri flow sitometri yöntemi ile de¤erlendirilmifltir. Fagositik aktivite, sepsisli hastalarda sa¤l›kl› kontrollere göre azalm›fl olarak tespit edilirken, nötrofillerde oksidatif patlama kapasitesi sepsisli hastalarda artm›fl olarak bulunmufltur. Çal›flmam›z›n sonuçlar›na göre, sepsisli hastalarda nötrofil fonksiyonlar›nda bir bozulma olmaktad›r ve bu durumun sepsisli hastalarda prognozu ve tedaviyi etkileyebilece¤i düflünülmüfltür.
Anahtar sözcükler: bakteri, nötrofil fonksiyonu, sepsis
SUMMARY
The Effects of Bacterial Sepsis on Neutrophil Functions
Sepsis is one of the leading causes of mortality in intensive care unit. Neutrophils play an important role in the inna- te immun defense against bacterial agents and sepsis pathogenesis. The aim of this study was to evaluate the changes of neutrophil functions in patients with sepsis. Therefore, we evaluated neutrophil phagocytic activity and oxidative burst capa- city in 10 patients with sepsis and compared the results with those of healthy control group. Phagocytic activity and oxida- tive burst capacity were assessed by flow cytometry. Neutrophil phagocytic activity was decreased in patients with sepsis com- pared to control groups. Whereas oxidative burst capacity was increased in patients with sepsis. These results indicate that there is an impairment in neutrophil function in patients with sepsis and it is considered that this condition may affect the prognosis and treatment of patients with sepsis.
Keywords: bacteria, neutrophil function, sepsis
G‹R‹fi
Sepsis, infeksiyona sistemik inflamatuvar yan›t bulgular›n›n efllik etmesi, a¤›r sepsis ise organ yetmezli¤i veya fonksiyon bozuklu¤u ve- ya kayb› ile seyreden sepsis tablosu olarak ta- n›mlanmaktad›r(6,11). Yo¤un bak›m ünitelerinde bak›m ve antimikrobiyal tedavi seçeneklerinin artm›fl olmas›na ra¤men, sepsis hâlâ önemli bir mortalite nedenidir(12,13).
Nötrofiller, bakteriyel infeksiyonlara karfl›
geliflen akut inflamatuvar yan›ta arac›l›k eden
en önemli hücre tipidir ve bakterinin al›m›, öl- dürülmesi ve yok edilmesinden sorumludur(1). Bu fonksiyonlar›n› fagositoz ve oksidatif patla- ma s›ras›nda reaktif oksijen ürünlerinin olufltu- rulmas› arac›l›¤›yla gerçeklefltirirler(8). Nötrofil- lerin esas fonksiyonlar› fagositoz olmas›na ra¤- men, oksidatif patlama da bakterisidal aktivite ile iliflkilidir. Bu hücrelerin say›lar› normal bile olsa fonksiyonlar›nda görülen bozukluk, infek- siyonlara karfl› duyarl›l›¤›n artmas›na ve ciddi infeksiyonlar›n geliflmesine neden olur(4,12,14). Ayr›ca, nötrofil fonksiyonlar›nda oluflan gene-
BAKTER‹YEL SEPS‹S‹N NÖTROF‹L FONKS‹YONLARINA ETK‹S‹
Ifl›l F‹DAN *, Murat D‹ZBAY **, Berna ERDAL *, Emine YEfi‹LYURT *, Feryal ÇET‹N GÜREL‹K *
*Gazi Üniversitesi T›p Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dal›, ANKARA
**Gazi Üniversitesi T›p Fakültesi, Enfeksiyon Hastal›klar› Anabilim Dal›, ANKARA
Yaz›flma adresi: Ifl›l Fidan. Gazi Üniversitesi T›p Fakültesi, T›bbi Mikrobiyoloji Anabilim Dal›, 06500 Beflevler-ANKARA Tel: (0312) 202 46 26 GSM: (0532) 685 67 33
e-posta: isilfidan@yahoo.com
Al›nd›¤› tarih: 18.01.2007, revizyon kabulü: 08.05.2007
tik ve edinsel bozuklu¤un nozokomiyal infeksi- yonlar›n geliflimine zemin haz›rlad›¤› düflünül- mektedir(15).
Nötrofiller ve ürünleri sepsis patogenezin- de önemli rol oynarlar(16). Nötropeninin infeksi- yonlara ve sepsise duyarl›l›¤› artt›rd›¤› ve nöt- rofil fonksiyonlar›nda yap›lacak iyilefltirmelerin sepsisli hastalar›n tedavilerinde yarar sa¤laya- ca¤› düflünülmektedir. Nötrofiller mikroorga- nizmalarla aktive edildi¤inde proinflamatuvar sitokin üretimi, granüler enzimlerin sal›n›m›, nitrik oksit (NO) ve reaktif oksijen ürünlerinin oluflumuna neden olurlar. Nötrofiller sepsis s›- ras›nda aktive olup say›ca art›p antimikrobiyal etki olufltururken, bir yandan da oluflturduklar›
reaktif oksijen ürünleri ve NO arac›l›¤›yla ko- nakta doku hasar›na neden olabilirler(3,7). Nöt- rofillerin sepsisde yararl› ve zararl› etkileri var- d›r. Çal›flmalarda, sepsisin bafllang›ç dönemle- rinde bakteriyemiyi bask›lad›¤› ve organ fonksi- yonlar›n›n korunmas› için nötrofillerin gerekli oldu¤u, ancak sepsisin daha sonraki dönemle- rinde nötrofil fonksiyonlar› sonucu oluflan ürünlerin, organlar için zararl› etkiler olufltur- du¤u bildirilmifltir(7). Bu ikili etkinin varl›¤›, sepsis s›ras›nda uygulanacak olan tedavi yakla- fl›mlar›n›n nötrofil fonksiyonlar›na olan etkileri- nin iyi bilinmesi gerekti¤ini göstermektedir. Bu nedenle, sepsis s›ras›nda nötrofil fonksiyonla- r›nda oluflan de¤iflikliklerin tam olarak saptan- mas› gerekmektedir.
Çal›flmam›zda nötrofillerin sepsisde oyna- d›¤› rolün tam olarak tespit edilebilmesi için, nötrofil fonksiyonlar›nda sepsis s›ras›nda olu- flan de¤iflikliklerin araflt›r›lmas› amaçlanm›flt›r.
Bu nedenle, Gram negatif sepsis tan›s› konulan hastalardan izole edilen nötrofillerin fonksiyon- lar› incelenmifl ve elde edilen veriler sa¤l›kl› ki- flilerin nötrofil fonksiyonlar›ndan elde edilen de¤erlerle karfl›laflt›r›lm›flt›r.
GEREÇ VE YÖNTEM
Hasta grubu: Çal›flmam›zda CDC(5) ve 2001 uzlafl› toplant›s›(10)kriterlerine göre sepsis tan›s› konulan 10 hastaya ait heparinli kan ör- nekleri kullan›lm›flt›r. Altta yatan kronik bir
hastal›¤›, anestezi, cerrahi stres gibi faktörler bulunmayan, ilaç uygulanmam›fl, nötrofil say›- lar› normal de¤erlerde olan hastalar çal›flma kapsam›na al›nm›flt›r. Kontrol grubu olarak sa¤- l›kl› 10 gönüllüye ait periferik kan örne¤i kulla- n›lm›fl ve kanlar al›nd›ktan sonra bekletilmeden çal›flmaya geçilmifltir. Hasta ve kontrol grubu 20-55 yafl grubu olarak belirlenmifltir.
Fagositik aktivite: Nötrofillerin fagositik aktivitesi flow sitometri (FC 500, Coulter, ‹ngil- tere) yöntemi ile ölçülmüfltür. Heparinize tam kan örnekleri iki ayr› tüpe konduktan sonra, 1:1 oran›nda Ficoll (Sigma, ABD) ile kar›flt›r›l›p, 45 dk. oda ›s›s›nda bekletilmifltir. Lökositlerin bu- lundu¤u üst tabaka al›narak trypan blue (Sig- ma, ABD) boyas› ile lökosit canl›l›¤› % 98 olarak belirlenmifltir. Lökositler 2 ayr› tüpe konularak kontrol ve test tüpleri haz›rlanm›flt›r. Lökositle- rin bulundu¤u test ve kontrol tüplerine fosfat tamponlu tuzlu su (PBS, Gibco, Almanya) ve dihydrorhodamine-123 (Biochemika, ABD) ek- lenip, tüpler 5 dk. 37°C’de su banyosunda bek- letilmifltir. Daha sonra test tüpüne Escherichia coli (5x109E.coli/ml), kontrol tüpüne PBS eklenmifl, 0. dk.’da flow sitometri cihaz›nda granülosit ka- p›s› al›narak FL1’deki ortalama floresan kanal say›s›nda oluflan de¤ifliklikler de¤erlendirilmifl- tir. Örnekler tekrar su banyosuna kald›r›l›p 20 dk. sonra flow sitometri cihaz›nda yeniden FL1’deki ortalama floresan kanal say›s›nda olu- flan de¤ifliklikler incelenmifl ve 0. dk.’da elde edilen de¤erlere bölünerek fagositik aktivite de-
¤erlendirilmifltir(6).
Oksidatif patlama: Oksidatif patlama ka- pasitesi de flow sitometri yöntemi ile ölçülmüfl- tür. Heparinize tam kan örnekleri iki ayr› tüpe al›nm›fl, PBS ile dilüe edildikten sonra dihydro- rhodamine123 eklenmifl ve tüplerden biri uya- r›lmam›fl kontrol tüpü olarak, biri de uyar›lm›fl test tüpü olarak kullan›lm›flt›r. Tüpler 15 dk.
37°C’de su banyosunda bekletildikten sonra test tüpüne phorbolmyristate acetate (PMA, Bioche- mika, ABD) eklenmifltir. Kontrol ve test tüpleri tekrar 15 dk. 37°C’de su banyosunda inkübe edildikten sonra tüpler 400xg’de 5 dk. santrifüj edilmifl, süpernatan uzaklaflt›r›lm›fl ve flow sito-
metri cihaz›nda granülosit kap›s› al›narak oksi- datif indeks hesaplanm›flt›r(8):
Oksidatif indeks: Test tüpündeki hücrele- rin ortalama floresan kanal say›s›/kontrol tüpün- deki hücrelerin ortalama floresan kanal say›s›.
‹statistiksel analiz: Sonuçlar›n analiz edil- mesinde MannWhitney U testi ve Wilcoxon Sig- net Ranks kullan›lm›flt›r. p < 0.05 de¤erleri an- laml› olarak kabul edilmifltir.
BULGULAR
Mikroorganizmalar: BACT/ALERT 3D (bioMerieux, ABD) otomatize kan kültür siste- mi ile sepsis tan›s› konulan 10 hastan›n üçünden metisiline dirençli Staphylococcus aureus (MRSA), beflinden Acinetobacter baumannii, iki- sinden Klebsiella spp. izole edilmifltir.
Fagositik aktivite: E.coli ile uyar›lan sep- sisli hasta nötrofillerinin fagositik aktivitesinin sa¤l›kl› kontrollere göre istatistiksel olarak an- laml› bir azalma gösterdi¤i saptanm›flt›r (p<0.05). Gram negatif ve Gram pozitif bakteri ile infekte hasta gruplar›n›n nötrofillerinin fago- sitik aktivitesi aras›nda bir fark görülmemifltir (p=0.304).
Oksidatif patlama: Oksidatif patlama s›- ras›nda oluflan reaktif oksijen ürünlerinin üreti- minin PMA ile stimülasyonu sonras›, sa¤l›kl›
kontrollere göre sepsisli hasta nötrofillerinin ok- sidatif patlama kapasitelerinin istatistiksel ola-
rak anlaml› düzeyde bir art›fl gösterdi¤i tespit edilmifltir (p<0.05). Bu art›fl›n sepsisde izole edi- len bakteri türünden ba¤›ms›z oldu¤u ve Gram negatif veya Gram pozitif bakteriyel sepsisleri- nin her iki grubunda da oksidatif patlaman›n artt›¤›, iki grup aras›nda anlaml› bir fark gözlen- medi¤i tespit edilmifltir (p=0.425) (fiekil).
TARTIfiMA
Nötrofiller, do¤al ba¤›fl›kl›¤›n önemli hücresel efektörleridir. Nötrofillerin antimikrobiyal et- kinliklerinde; oksijenin, reaktif oksijen ürünleri- ne dönüfltü¤ü oksijene ba¤›ml› mekanizmalar önemli yer tutmaktad›r(11). Bu hücrelerin say›
veya fonksiyonlar›nda oluflacak bozukluklar›n infeksiyon hastal›klar›na yatk›nl›¤› artt›rd›¤› ve yay›l›m›n› kolaylaflt›rd›¤› düflünülmektedir(12). Ayr›ca nötrofillerin hücre içi öldürme aktivite- sindeki bozukluklar veya yetersizlikler özellikle yo¤un bak›m ünitelerinde yatan immün sistemi bask›lanm›fl ve sepsis tan›s› konulmufl hastalar- da mortaliteyi artt›rmaktad›r.
Sepsisli hastalarda nötrofil fonksiyonlar›n- da görülen de¤ifliklikleri belirlemek için yapt›-
¤›m›z çal›flmada, sepsisli hasta nötrofillerinin fagositik aktivitesi istatistiksel olarak anlaml›
derecede azalm›flt›r (p<0.05). Martins ve ark.(12) S.aureus ile yapt›klar› fagositik aktivite deneyin- de sepsisli hasta nötrofillerinde fagositik aktivi- tenin artt›¤›n›, Wenisch ve ark.(18) ise E.coli’nin kullan›ld›¤› durumda nötrofillerin fagositik ak- tivitesinde azalma oldu¤unu bildirmifllerdir.
Wenisch ve ark.(17)flow sitometri yöntemi ile septik flok tablosu bulunan hasta nötrofilleri- nin fagositik aktivitesinin azald›¤›n› bildirmifl- lerdir. Barrio ve ark.(2) özellikle slime üreten S.aureus sufllar›n›n üretmeyen sufllara göre nöt- rofillerin fagositik aktivitesini azaltt›¤›n› sapta- m›fllard›r.
Oksidatif patlama, nötrofillerin bakteriyel infeksiyonlar› kontrol etmede kulland›¤› en önemli savunma mekanizmas›d›r. Çal›flmam›z- da sepsisli hasta nötrofillerinin oksidatif patla- ma kapasitesinde art›fl saptanm›flt›r (p<0.05).
Sepsisli hasta grubu nötrofillerinde oksidatif patlama s›ras›nda oluflan reaktif oksijen ürünle-
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Fagositik aktivite Hücre içi öldürme aktivitesi Oksidatif patlama
Ortalamafloresankanalsay›s›
Sepsis Kontrol
Fagositik aktivite Hücre içi öldürme aktivitesi Oksidatif patlama
Ortalamafloresankanalsay›s›
fiekil: Sepsis ve kontrol grubu nötrofillerinin fagositoz ve oksi- datif patlama sonuçlar›n›n karfl›laflt›r›lmas› (ortalama ± ortala- man›n standart hatas›).
rinin sa¤l›kl› kontrollerin nötrofillerine göre ar- t›fl›, sepsis s›ras›nda nötrofillerde bir aktivasyon olabilece¤ini düflündürmüfltür. Ancak önemli bir savunma mekanizmas› olan reaktif oksijen ürünlerinin artm›fl olmas›, sepsisli hasta nötro- fillerinde hücre içi öldürme aktivitesini olumlu yönde etkilerken, bu etkinin yüksek dozda ol- mas› durumunda doku hasar› oluflturarak has- tada yarar d›fl›nda zararl› etki de oluflturabilece-
¤i düflünülmektedir. Bu durum çeflitli çal›flma- larda da bildirilmifltir(12). Hoesel ve ark.(7)nöt- rofillerin sepsisin bafllang›ç dönemlerinde bak- teriyemi seviyelerini düzenlemede önemli oldu-
¤unu, ancak daha sonraki dönemde nötrofille- rin reaktif oksijen türevlerinin doku ve organ harabiyetine neden olabilece¤ini bildirmifller- dir. Ayn› grup, sepsisde nötrofillerin zararl› ve koruyucu rollerinin olabilece¤ini saptam›fllar- d›r. Trautinger ve ark.(16) sepsis geliflen hasta- larda sa¤l›kl› gruba göre oksidatif patlama ka- pasitesinde bir art›fl görüldü¤ünü ve bu aktive ol- mufl nötrofillerin sepsis sendromu patogenezinde önemli rol oynayabilece¤ini bildirmifllerdir.
Martins ve ark.(12)sepsisli hastalar›n nötro- fillerinin fagositik aktivite ve reaktif oksijen ürün oluflumunda ve nötrofillerin erken apoptozisin- de art›fl görüldü¤ünü saptam›fllard›r. Bu duru- mun inflamatuvar cevab›n regülasyon mekaniz- malar›na ba¤l› olabilece¤ini bildirmifllerdir.
Muller Kobold ve ark.(13)sepsisde nötrofil ve monositlerin aktive oldu¤unu ve aktivasyon mark›rlar›ndaki düflüklü¤ünün sepsisin kötü prognozu ile iliflkili oldu¤unu bildirmifllerdir . Kaufmann ve ark.(9) sepsisin kötü seyretti¤i hastalarda nötrofil fonksiyon bozukluklar›na ba¤l› sendromlar›n geliflti¤ini bildirmifllerdir.
Sonuç olarak; çal›flmam›zda rutin flow si- tometri yöntemi ile sepsisli hastalar›n nötrofil fonksiyonlar› belirlenmifltir. Sepsisli hasta nöt- rofillerinin fagositik fonksiyonlar›nda istatistik- sel olarak anlaml› bir azalma ve hücre içi öldürme aktivitesinde de anlaml› bir art›fl saptanm›flt›r.
Sepsisli hastalar›n nötrofillerinden serbest oksijen ürünlerinin afl›r› art›fl› hastal›¤›n prog- nozunu daha da olumsuz yönde etkileyebilir.
Bunun sonucunda hastalarda a¤›r doku ve or- gan hasar› artabilir. Bu nedenle sepsisli hastala- r›n nötrofil fonksiyonlar›n›n tedavi s›ras›nda iz-
lenmesi önem kazanmaktad›r. Nötrofillerde afl›- r› oksijen türevlerinin oluflumunu engelleyen yeni tedavi seçenekleri uygulanmas› ile bu has- talar›n tedavilerinden daha olumlu sonuçlar al›- nabilece¤i düflünülebilir.
KAYNAKLAR
1. Abbas AK, Lichtman AH: Innate immunology,
“Malley J (ed): Cellular and Molecular Immuno- logy, 5. bask›’’ kitab›nda s. 275-97, Elsevier Scien- ce, Philadelphia (2003).
2. Barrio B, Vangroenweghe F, Dosogne H, Burv- nich C: Decreased neutrophil bactericidal activity during phagocytosis of a slimeproducing Staphy- lococcus aureus strain, Vet Res 2000;31(6):603-9.
3. Brown KA, Brain SD, Pearson JD, Edgeworth JD, Lewis SM, Treacher DF: Neutrophils in develop- ment of multiple organ failure in sepsis, Lancet 2006;368(9530):157-69.
4. Dziarski R, Platt KA, Gelius E, Steiner H, Gupta D: Defect in neutrophil killing and increased sus- ceptibility to infection with nonpathognic gram- positive bacteria in peptidoglycan recognition protein S (PGRPS) deficient mice, Blood 2003;102(2):689-97.
5. Garner JS, Jarvis WR, Emori TG, Horan TC, Hug- hes JM: CDC definitions for nosocomial infecti- ons, Am J Infect Control 1988;16(3):128-40.
6. Gazio¤lu SB: Flow sitometri ile fagosit fonksiyon- lar›, “Deniz G, Y›lmaz MT, Y›llar G (editörler):
Flow Sitometri ve T›pta Kullan›m›” kitab›nda s.79-85, ‹stanbul Üniversitesi DETAE yay›n›, ‹s- tanbul (2004).
7. Hoesel LM, Neff TA, Neff SB et al: Harmful and protective roles of neutrophils in sepsis, Shock 2005;24(1):40-7.
8. Fiorenza G, Bottasso OA, Rateni L, Farroni MA, Dlugovitzky D: Impaired neutrophil function in patients with pulmonary tuberculosis and its nor- malization in those undergoing specific treat- ment, except the HIV coinfected cases, FEMS Im- munol Med Microbiol 2003;35(2):159-64.
9. Kaufmann I, Hoelzl A, Schliephake F et al: Poly- morphonuclear leukocyte dysfunction syndrome in patients with increasing sepsis severity, Shock 2006;26(3):254-61.
10. Levy MM, Fink MP, Marshall JC: 2001 SCC/ESICM/ACCP/ATS/SIS International Sep- sis Definitions Conference, Crit Care Med 2003;31(4):1250-6.
11. Marshall JC: Neutrophils in the pathogenesis of
sepsis, Crit Care Med 2005;33(12 Suppl):S502-5.
12. Martins PS, Kallas EG, Neto MC, Dalboni MA, Blecher S, Salomao R: Upregulation of reactiva oxygen species generation and phagocytosis, and increased apoptosis in human neutrophils during severe sepsis and septic shock, Shock 2003;20(3):208-12.
13. Mueller Kobold AC, Tulleken JE, Zijlstra JG et al:
Leukocyte activation in sepsis; correlations with disease state and mortality, Intensive Care Med 2000;26(7):883-92.
14. Roitt I, Brostoff J, Male D: Cells invoved in the im- mune response, “Cook L (ed): Immunology, 4.bask›” kitab›nda s. 2.12.18, Mosby Co., London (1996).
15. Stephan F, Yang K, Tankovic J et al: Impairment of polymorphonuclear neutrophil functions pre-
cedes nosocomial infections in critically ill pati- ents, Crit Care Med 2002;30(2):315-22.
16. Trautinger F, Hammerle AF, Pöschl G, Micksche M: Respiratory burst capability of polymorpho- nuclear neutrophils and TNF-alpha serum levels in relationship to the development of septic syndrome in critically ill patients, J Leuco Biol 1991;49(5):449-54.
17. Wenisch C, Fladerer P, Patruta S, Krause R, Hörl W: Assessment of neutrophil function in patients with septic shock: Comparison of methods, Clin Diagn Lab Immunol 2001;8(1):178-80.
18. Wenisch C, Parschalk B, Patruta S, Brustbauer R, Graninger W: Effect of polyclonal immunoglobu- lins on neutrophil phagocytic capacity and reacti- ve oxygen production in patients with gram-ne- gative septicemia, Infection 1999;27(3):183-6.
