PCR ve PRİMER TASARIMI
Prof. Dr. Hilâl Özdağ
Hafta III
PCR Temelli Genetik Analiz Yaklaşımları
Erime Sıcaklığı (Melting Temperature Tm)
13 bazdan kısa: Tm= (wA+xT) * 2 + (yG+zC) * 4
13 bazdan uzun: Tm= 64.9 +41*(yG+zC-16.4)/(wA+xT+yG+zC)
http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html
Eşleniklik
Primer Kalıp
Bağlanma/Annealing
http://bioweb.uwlax.edu/GenWeb/Molecular/Seq_Anal/Primer_Design/primer_design.htm
T
anneal= T
m_primer– 4C
Saç Tokası Oluşumu
http://bioweb.uwlax.edu/GenWeb/Molecular/Seq_Anal/Primer_Design/primer_design.htm
Oligonükleotid Dimeri
http://bioweb.uwlax.edu/GenWeb/Molecular/Seq_Anal/Primer_Design/primer_design.htm
Dejenere Primer Tasarımı
http://bioweb.uwlax.edu/GenWeb/Molecular/Seq_Anal/Primer_Design/primer_design.htm
Primer Tasarımında Dikkat Edilmesi Gereken Özellikler
• Oligonükleotidin tek bir dizilime özgül olması gerekmektedir.
Özgüllükte esas rolü oligonükleotidin 3’ucu oynar.
• Saç tokası oluşturmaması için oligonükleotid kendi içinde karşılıklı eşlenik baz dizileri içermemeli.
• Oligonükleotid çiftleri dimer oluşumuna neden olacak şekilde birbirleri ile eşlenik olmamalı.
• Oligonükleotidlerin uzunluğu 18-24 baz arasında olmalı.
• Oligonükleotid çiftlerinin Tm’leri birbirine denk veya yakın olmalı.
• Oligonükleotid dizilimleri için 3’ten fazla tekrar eden baz
olmamalı.
Primer Tasarımında Kullanılabilecek Yazılımlar
-Primer Pearl: İnternetten ücretsiz indirilebilir.
- GCG: Accelrys, ICBR
- Primer3: MIT, web uygulama
http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi - BioTools: BioTools, Inc. Lisans ICBR
- Diğerleri: GeneFisher, Primer!, Web Primer, NBI oligo program.
Tm Hesaplamaları için:
- BioMath: http://www.promega.com/biomath/calc11.htm
Örnek Çalışma
-Primer Pearl: İnternetten ücretsiz indirilebilir.
-Primer Designer
-Primer3: MIT, web uygulama
http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi
