Etkileri Retinoik

Retinoik Asidin Prenatal Donemdeki

Endokondral Kemikle$me Ozerine Etkileri

The effects of retinoic acid on endochondral ossification during prenatal development

Neriman c;olakoglu,

Assoc. Prof. MO.,

Department of Histology and Emriyology, F1rat University Medical Faculty, nerimancolakoglu@yahoo.com

Ay~e Murat Aydm,

Assist. Prof. MD.,

Department of Radiodiagnostlc F•rat University Medical Faculty, amurat@f•ratedu.tr

Hatice Banu Ozel,

Dr. MD.,

Department of Histology and Emrlyology, F1rat University Medical Faculty, bunuuysal@yahoo.com

Enver Ozan,

Prof. MD.,

Department of Histology and Emriyology, F1rat University Medical Faculty, ezon@f•rat.edu.tr

Aysel Kukner,

Prof. MO.,

Department of Histology and Emrlyology, Abant fzzet Baysal Medical Faculty, akukner@hotmall.com

This manuscript can be downloaded from the webpage:

http: //tlpd e ro Is!. erciyes. ed u. tr I down 1 o lld/2007; 29( 4) 280- 284. pdf

Submitted Revised Accepted

: November 8, 2006 : March 5, 2007 : April 5, 2007

Corresponding Author:

Neriman <;olako91u,

Departman of Histology and Emriyology, Ftrat University Medical Faculty, ElaztO, TUrkey

Telephone E·moll

280

: +91 -xxx

: nerimancolakoglu@yahoo.com

Ama~:Bu ~ah~mada yuksek doz all-trans retmoik asidin st~n fetuslerinde endokondral kemikle~me uzerine olan etk1ierintn ara~ttnlmas1 ama~land1.

Gere~ ve Yontemler:Bu ~ah~mada 9 adet gebe Wtstar-Aibtno cins1 ergtn s1~anlar kullantldl.

Gebe Sl~nlar 3 gruba aynldl. l. Grup kontrol olarak kullan1ld1. II. Grup deneklere gebellgm 12.

gunOnde nori.llasyon (prenatal 8.5-11.5 gunler aras1 norulasyonun ba~iang1~ ve b1t1~ gunlen olarak tesp1t edild1) sonras1 Ill. Grup deneklere 1se gebehg1n 8. gununde (norulasyon onces1) tek doz 60mg/kg all-trans retin01k asit gavaJ yap1larak uyguland1. Butun gebe s1~aniara gebehklennin 18. gunOnde serv1kal dislokasyon yap1ld1 ve her gruptan 6 fetus bu ~ah~ma l~in kullan1ld1. !~1k mikroskobik ve radyografik tekn1kler kullan~larak fetal vertebralardakl kem1kie~me 1ncelendi.

Bulgular:Osteoblastik akt1v1te ve kem1kle~en alaniar I. grupta belirgindi. II. grupta kemikle~me ba~lamastna ragmen III. grup vertebralarda kem1kie~me behrtlleri gozlenmedi. 11. gruptak1 kem1kle~en alanlar I. gruba gore daha az oiarak ay1rt edildi.

Sonu~:Mevcut bilgiier 1~1gmda norulasyondan once uygulanan yuksek doz all-trans retmoik as1dtn kem1k morfogenez1stni bozdu!'ju fakat nonilasyon sonras1 uygulanan all-trans retm01k as1d1n kemlk olu~umu s~ras1nda daha az yan etki gbsterd1\'j1 soyleneb1ilr.

Anahtar Kehmeler: Fetus; Kemik; Osteogenezis; Retinoik asit.

Abstract

Purpose: The a 1m of this study was to mvest1gate the effects of excess all-trans retinoic ac1d on endochondral ossification 1n fetuses of rats.

Material and Methods: Nme Wistar-Aibmo pregnant rats were used In this study. Pregnant rats were divided mto three groups. The first group of rats were used as control. The second group were fed by gavage a single dose of 60 mg/kg all-trans ret1noic ac1d on day 12 of gestation after neurulation which began 8.5 day of gestat1on and finished 11.5 day of gestation whereas thtrd group rece1ved same dose all-trans retm01c acid on day 8 of gestation (before neurulation).

All pregnant rats were sacnficed at day 18 of gestatiOn. S1x fetuses from each group were used.

OSSificatiOn of fetal vertebrates was light microscopically and rad1ographycally determmed.

Results: OsteoblastiC activity and ossified areas were Significant m group-!. Ossification signs were not ev1dent m group-III whereas oSSification 1n vertebrates begun m group-II . However, ossified areas of group-II were less than those of group-!.

Conclusion: In view of present fmdings, we suggest that administration of excess all-trans retinoic acid prior to neurulation disrupted bone morphogenesis. However, 1ts administration following neurulation had less adverse effect on bone formation.

Key Words: Bone; Fetus; Osteogenesis; Retinoic acid.

Erciyes T1p Dergisi (Erciyes Medical Journal) 2007;29(4):280-284

Neriman <;:olakoglu, Ay~e Murat Aydm, Hatice Banu Ozel, Enver Ozan, Aysel Killmer

Giri~

Kemigin fetal geli~imi iki ~ekilde olmaktadu. Her iki

~ekilde de primitif kollagenoz destek dokusunun yerini kemik dokusuna brrak:mast soz konusudur. Uzun kemikler, vertebra, pelvis ve kafatas1 kemiginin tabanmt olu~turan

kemikler ir,;in sfuekli bi.iyiiyen bir klklrdak model olu~ur

ve bu ktktrdak daha sonra yerini kemige btraktr. Bu

geli~im sfueci endokondral kemikle~me olarak bilinir.

Kafatasmm yasst kemikleri, maxilla, mandibulanm biiyiik klsmt ise primitif mezen~im dokusunun direkt kemik dokusuna donii~iimu ile ~ekillenir. Bu tip kemikle~me ise intramembranoz kemikle~me olarak bilinir (1 ).

Endokondral kemikle~me suasmda kondrositler proliferasyon, olgunla~ma, hipertrofi, matriks vezikiil biyogenezisi ve apoptozisi ir,;eren ~amalardan ger,;mektedir.

Bu olaylar dizisi ktktrdak dokusunun yerini kemik dokusuna btrakmastyla sonlamr. <;ogalan kondrositler r,;ogunlukla proteoglikan ve tip II kollagenden olu~an

ekstraselliiler matriksi sentezlerler (2). Kondrositlerin olgunla~mast; hucresel biiyiikliikteki arti~ (hipertrofi), ve alkalin fosfataz aktivitesi ve tip X kollagen gibi hipertrofinin fenotipik belirter,;lerinin ekspresyonu ile birlikte seyreder (2-7). Alkalin fosfataz aktivitesi ve tip X kollagen ekspresyonu matriks mineralizasyonunu diizenler (3-7). Kondrosit olgunla~mast ba~ta bone morfogenetik protein (BMP) ve paratiroid hormonu ile

ili~kili proteinler olmak iizere birr,;ok otokrin ve parakrin faktor tarafmdan duzenlenmektedir (2). Endokondral

kemikle~me srrasrnda kondrositlerin r,;ogunlugu apoptozis ile olmekte, mineralize matriks osteoklastlar tarafindan sindirilmekte ve kondrositlerin bir kismi fenotipik kemik hiicrelerine (osteoblast benzeri hiicreler) farklanabilmektedir (8). invivo kemik geli~imi oldukr,;a kompleks bir fenomendir. Osteogenezis; osteoblastlann

mezen~imal prekiirsorlerinin r,;oga!Jp strastyla preosteoblastlara ( osteoprogenitor hiicrelere ), osteoblastlara ve olgun osteoblastlara farkltla~tp ekstraseliiler matriksin birikip mineralize olmastyla sonur,;lanu (9).

Retinoidler olarak adlandmlan A vitamini ve metebolitleri fizyolojik konsantrasyonlarda biiyiime, hiicresel

farkhla~ma, iireme (10, 11) gibi organizmamn normal fonksiyonlannm diizenlenmesinde rol oynamaktadtrlar.

Aktif A vitamini meteboliti olan all-trans retirloik asit (atRA) omurgahlann embriyonik geli~imleri srrasmda hiicresel farkbla~mada, morfogenezisde retinolden r,;ok daha aktiftir ( 12). Genetik analizler retinoik as it reseptorlerinin (RAR) yoklugunda kiklrdak olu~umunda

ciddi yetersizlik oldugunu gostermi~tir. Transgenik farelerin

geli~en ekstrernitelerinde aktifRAR'lar negatif veya zaytf

Erciyes Tip Dergisi (Erciyes Medical Journal) 2007;29(4):280-284

olarak eksprese olduklannda kondrogeneziste problem olmakta ve iskelet malformasyonlan olu~maktadtr. Bu sonur,;lar RAR ile ilgili sinyallerin iskelet geli~iminde onernli rol oynadJ.gmm gostergesidir. RAR'lar kondroblast

farkhla~masmt diizenlemekte ve retinoik asit (RA) sinyaline i~tirak ederek iskelet taslagmm apozisyonel biiyi.imesinde rol oynamaktadtrlar (13).

Prenatal geli~im Slfasmda bir morfogen olarak hareket eden retinoik asit, gebeligin erken donemlerinde yiiksek dozda uygulanmasma bagh olarak teratojenik etki de gostermektedir. Maternal yiiksek doz RA omfalosel, ekzensefali, ekzoftalmus ve ekstremite ktsahgt gibi defektlere yol ar,;maktadtr (14).

Bu r,;ah~mada prenatal geli~imin farkh iki doneminde uygulanan atRA'in endokondral kemikle~me iizerine olan etkilerinin 1~1k mikroskobik ve radyolojik olarak belirlenmesi amar,;land1.

Yontem ve Gere~;Ier:

Ara~ttrma, agtrhklan 250-270 gr olan 9 adet Wistar- Albino cinsi ergin (3 ayhk) di~i str,;anlar iizerinde

gerr,;ekle~tirildi.

22 ± 2

°c

oda tstsmda 12 saat

1~1k

(7:00- 19:00) ve 12 saat karanhkta (19:00-7:00) tutulan str,;anlar, ozel olarak yaptmlan kafeslerde beslendi.

Maternal All-trans Retinoik Asit Uygulanmast

<;ah~mada kullarulan str,;anlara her giin 8.00- 9.30 saatleri arasmda vajinal smear yaplldJ.. Proostriis evresinde oldugu tespit edilen str,;anlar, aynt giiniin ak~amt erkek styanlarla 1: 1 ~ekilde e~lenip ayru kafese konuldu. Ertesi giin sabah saat 7.00'da erkek ve di~i str,;anlar ayrtldL Yaptlan vajinal smear sonrast sperm ( +) olarak tespit edilen str,;anlann gebeligin 0. giiniinde olduklan kabul edildi. Gebe oldugu saptanan 9 adet str,;an 3 ana gruba aynld1.

I.Grup: Kontrol grubu normal beslenen gebe str,;anlara (n=3) gebeliklerinin 18. giiniinde servikal dislokasyon uyguland1. Midsaggital insizyonla fetusleri almd1. Bu fetuslerden rastgele ser,;ilen 6 adeti l.grubu olu~turdu.

II.Grup: Gebeliklerinin 12. giiniinde (GD 12) gavajla 60 mg/kg dozda atRA (15) verilen str,;anlara (n=3) gebeliklerinin 18. giiniinde servikal dislokasyon uygularup, midsaggital insizyon1a fetusleri ahnd1. Bu fetuslerden ozellikle geli~im geriligi olanlar ser,;ilip (n= 6) II.grup

olu~turuldu.

III. Grup: Gebeliklerinin 8. giiniinde (GD 8) gavajla 60 mg/kg dozda atRA (15) verilen str,;anlara (n=3)

281

Prenatal Donemde Endokondral Kermkle~me Dzerme Retmmk As1dm Etkilen

gebelik:lerinin 18. gi.iniinde servikal dislokasyon uygularup, midsaggital insizyonla fetusleri ahnd1. Bu fetuslerden ozellikle geli~im geriligi olanlar ser,:ilip (n= 6) III.grup

olu~turuldu.

Fetuslar Bouin tespit soliisyonuna at1ld1, anomaliler ar,:lSlndan incelenip, radyografileri r,:ekildikten sonra midsaggital olarak diseke edildi. Bouin soliisyonunda 24 saatlik tespitten sonra dereceli alkollerle (50, 60, 70, 80, 90, 96, 100° ) y1kand1. Xylol serilerinden ger,:irildi. IslSl 54°C olan etiivde xylol-parafin, yumu~ak parafin ve sert parafin ile muamele edilip bloklar haztrland1. Parafin bloklardan 5 llm'lik kesitler almtp Hematoksilen- Eozin teknigi ile boyand1. Kesitler BH2 Olympus fotomikroskopla incelenip fotografland1.

Bulgular

Kontrol grubuna ait kesitlerde endokondral kemikle~me

belirgin olarak izlendi. Bu grup vertebralarda hipertrofik klk1rdak zonu, kemikle~en alanlar ve yiiksek osteoblastik aktivite saptand1 (Resim 1). Norulasyon sonras1 (GD12) atRA'e maruz kalan fetuslann (grup II) vertebralannda kontrol grubu ile benzer ~ekilde hipertrofik ktkrrdak zonu,

kemikle~menin olu~tugu alanlar ve osteoblastik aktivite gozlenmekle birlikte, vertebralar kontrolden daha kiir,:iik r,:aph olarak ay1rt edildi (Resim 2). Norulasyon oncesi (GD8) atRA'e maruz kalan fetuslarda (grup III) vertebra r,:aplannm kontrole ve grup Il'ye gore oldukr,:a kiir,:iik oldugu ve herhangi bir kemikle~me belirtisine sahip olmadtklan tespit edildi. Bu grup fetuslarda perivertebral bolgelerde belirgin vaskiilarizasyon gozlendi ve vertebralann heniiz ktkrrdak yapllarm1 korudugu saptand1 (Resim 3).

Yap1lan radyografik r,:ah~malar da 1~1k mikroskobik bulgulan desteklemekte idi. Kontrol grubuna ait radyografide kemik yap1lan ossifiye idi; vertebra, kafatas1, ekstremite ve yiiz kemikleri belirgin olarak ay1rt edildi (Resim 4a). II. Grup deneklerdeki ossifikasyonun kontrol grubundaki kadar geni~ r,:aph ve belirgin olmadr8J gozlendi.

Vertebralar ktsmen ossifiye idi (Resim 4b ). III. Grup deneklerdeki kemiklerin ossifikasyonu belirgin olmay1p klkirdagimsJ olarak gozlendi. Kafatasr, yiiz kernikleri ve ekstrernite kemiklerinin geli~imi yetersiz ve kiir,:iik boyutlu olarak aytrt edildi (Resirn 4c). Grup II ve III 'teki fetuslarm tepe-oturma nokta uzunluklan kontrol grubuna gore daha k1sa olarak tespit edildi.

282

Resim I. Grup I. Hipertrofik kik1rdak zonu (h), osteoblastik aktivite ( oklar), kemikle~en alanlar (*) belirgin olarak gozlenmekte. Hematoksilen Eozin x 120

Resim 2. Grup II. Hipertrofik k1kirdak zonu (h), osteoblastik aktivite (ok) ve kemikle~en alanlar (*).Vertebra c,;apmm Grup I' den daha kiic,;iik oldugu belirgin. Hematoksilen Eozin x 120

· --

Resim 3. Grup III. Vertebra c,;apmm Grup I ve II'ye gore anlamh derecede kiic,;iik oldugu, ve rtebramn kikirdak yap1smda oldugu (*) ve perivertebral bolgenin oldukc,;a vaskiilarize oldugu ay1rt edilmekte.

Hematoksilen Eozin x 120

Erciyes Tip Dergisi (Erciyes Medical Journal) 2007;29(4):280·284

Neriman <;:olakoglu, Ay$e Murat Aydm, Hatice Banu Ozel, Enver Ozan, Aysel Kukner

$ekil 4: Fetuslerin lateral radyografileri. a: Grup l . Kemik yaptlar belirgin ~ekilde ossifiye izlenmektedir.

Vertebralar (kalm ok), kafatast ( ince ok) ve yiiz kemikleri (ok ba~t) net izlenrnektedir. b: Grup IL Vertebralar lasmen ossifiye izlenmektedir (kalm ok).c:Grup III. Genet olarak kemiklerin ossifik.asyonu yetersJzdir (kalm_ ok).

Kafatast ve yiiz kemiklerinin geli~imi yetersizdir ve bu kemikler kii<;:iik boyutlardadrr. Ekstrenuteler belrrgm derecede las a ve ince olarak gozlenmektectir (ince ok). b ve c 'deki fetuslerin boyutlanl a ile kar~tla~tmld.tgmda ku<;:iiktiir.

Tartt~ rna

Fizyolojik ko~ullarda retinoik asit kondrojenik farkl!la~ma

ve mineralizasyonu aktive eden A vitamini metabolitlerindendir ( 16, 17). Memeli ekstremite

geli~iminde RA kondrojenik hiicreleri de kapsayan bin;ok hiicre tiiriiniin farkl!la~masmi etki1emektedir (13). Bin;:ok deneysel 9alt~ma endojen retinoidlerin ve A vitamini metabolitlerinin vertebra ve ekstremite geli~iminde onemli rol oynadtgmt gostermi~tir (18). Teratolojik 9ah~malar

retinoidlerin gerek fazlahgmm gerekse yetersizliginin ekstremite geli~iminde bozukluga yo! a9t1gtn1 ortaya

koymu~tur ( 18-20).

Yapllan bu 9ah~mada da morfolojik ve radyolojik incelemeler atRA fazlaltgmm ekstremite ve fetal tepe - oturma noktas1 uzunlugunda onemli derecede ktsahga yo! a9ttgmt gosterdi. Yine fetal vertebralardan ahnan kesitlerde geli~imin erken doneminde atRA uygulanan deneklerde osteogenezisin geciktigi gozlendi. Radyografi.k incelemelerimizde bu bulgumuzu destekler nitelikte olup bu grup vertebralarm kemikten daha 90k ktlardagtmst bir taslaktan ibaret oldugunu gosteriyordu.

Erciyes T1p Dergisi (Erciyes Medical Journal) 2007;29(4):280-284

Yu veXing RA'in iskelet geli~iminin erken safhalarmda (kondrogenezis) etkili oldugunu bildirmektedirler.

Yapttklan 9ah~mada RA'in ktlardak fark!Il~masmt i.nhibe ederek iskelet malformasyonlanna yo! a9ttgm1 tespit

etmi~lerdir (21 ). Biz de yaptJgtmtz 9ah~mada k1k1rdak taslagm yerini kemik dokuya birakmamasmt kondrogenezis a~amasmdaki bir inhibisyondan kaynaklandtgm1 dii~iinmekteyiz. Yapllan iki farkh

9ah~mada atRA'in embriyonik mezen~imal hiicrelerin kondrojenik farkltla~masm1 inhibe ettigi, farkhla~an

kondrositlerde ise fenotipik kaybm meydana geldigi

saptanmt~trr (22, 23).

Bu 9ah~mamn sonucunda prenatal donemde teratojenik dozda maternal atRA'e maruz kalan fetuslerde vertebra ve ekstremite geli~iminde bozukluk ve ossifikasyonda gecikme saptanmt~hr. Bu durum ozellikle noriilasyon oncesinde atRA'e maruz kalan fetuslarda daha belirgin olarak gozlendi. iskelet geli~iminde ve kemikle~mede bir9ok sinyal molekiiliiniin birbiriyle etkile~tigi ve koordineli hareket ettigi bilinmektedir. Biz yiiksek doz atRA'in sinyal molekiilleri arasmdaki etkile~imi bozup hiicresel proliferasyonu ve farkhla~may1 inhibe ederek ekstremite ve vertebralarda geli~im bozukluklanna yo!

a9t1grru dii~iinmekteyiz.

283

Prenatal Donemde Endokondral Kerrukle~me Dzenne Retmotk As1dm Etlalen

Kaynaklar

1. Young B, Heath JW, eds. Wheater 's Functional Histology.

Sydney: Churchill Livingstone; 2000.

2. Garimella R, Bi X, Cmacho N, Sipe JB, Anderson HC.

Primary culture of rat growth plate chondrocytes: an in vitro model of growth plate histotype, matrix vesicle biogenesis and mineralization. Bone 2004; 34: 961-970.

3. Kirsch T, von der Mark K. Remodelling of collagen types I, II and X and calcification of human fetal cartilage.

Bone Miner 1992; 18: 107-117.

4. Kirsch T, Nah HD, Shapiro IM, Pacifici M Regulated production of mineralizastion competent matrix vesicles in hypertrophic condrocytes. J Cell Biol1997; 137: 1149- 1160.

5. Kirsch T, Harrison G, Golub EE, Nah HD. The roles of annexins and types II and X collagen in matrix vesicles - mediated mineralization of growth plate cartilage. J Biol Chem 2000; 275: 35577- 35583.

6. Leboy PS, Shapiro IM, Uschmann BD, Oshima 0, Lin D. Gene expression in mineralizing chick epiphyseal cartilage. J Bioi Chem 1988; 263: 8515-8520.

7. Schmid TM, Bonen DK, Luchene L, Linsenmayer TF Late event in chondrocytes differentiation: hypertrophy, type X collagen synthesis and matrix calcification. In vivo 1991; 5: 533-540.

8. Cancedda FD, Gentili C, Manduca P, Cancedda R.

Hypertrophic chondrocytes undergo forther differentiation in culture.] Cell Biol1992; 117: 427- 435

9. Raouf A, Seth A. Ets transcription factors and targets in osteogenesis. Oncogene, 2000; 19:6455-6463.

10. Noy N Retinoid binding proteins: Mediators of retinoid action. Biochem J 2000; 348: 481-495

11. Pauken CM, LaBorde JB, Bolon B. Retinoic acid acts during periimplantational development to alter axial and brain formation. Anat Embryo/ 1999; 200: 645-655 12. Nau H. Retinoid teratogenesis: Toxicokinetics and structure-specificity. Arc Toxicol 1993; 16: 118-127.

13. Underhill TM, Sampaio A

V:

Weston AD. Retinoid

284

signaling and skeletal development. Novartis Found Symp.

2001; 232: 171-185

14. Colakoglu N, Kukner A. Teratogenicity of retinoic acid and its effects on TGF-a2 expression in the developing cerebral cortex of the rat. J Mol Histol 2004; 35: 823- 827

15. Yasuda Y, Konishi H, Kihara T, Tanimura T.

Developmental anomalies induced by all-trans retinoic acid in fetal mice: II. Induction of abnormal neuroepithelium. Teratology 1987; 35: 355-366

16.Koyama E, Golden EB, Kirsch T, et al. Retinoid signaling is required chondrocytes maturation and endochondral bone formation during limb skelotogenesis.

Dev Biol1999; 208: 375-391

17. Wu LN, Ishikawa Y, Nie D, Genge BR, Wuthier RE.

Retinoic acid stimulates matrix calcification and initiates type I collagen synthesis in primary cultures of avian weigth-bearing growth plate chondrocytes. J Cell Biochem 1997; 65: 209-230.

18.Means AL, Gudas LJ. The roles of retinoids in vertebrate development. Annu Rev Biochem 1995; 64:

201-233

19.Lee GS, Kochhar DM, Collins MD. Retinoid-induced limb malformations. Curr Pharm Des 2004; 10 (22) : 2657-2699.

20.Zhou J, Kochhar DM. Cellular anomalies underlying retinoid-induced phocomelia. Reprod Toxicol 2004; 19:

103-110

21.Yu Z, Xing Y. All-trans retinoic acid inhibited chondrogenesis of Mouse embryonic palate mesenchymal cells by down-regulation of TGF-a/Smad signaling.

Biochem Biophys Res Commun 2006; 340: 929-934.

22. Cho SH, Oh CD, Kim JS, Kim IC, Chun JS. Retinoic acid inhibits chondrogenesis of mesenchymal cell by sustaining expression of N-cadherin and its associated proteins. J Cell Biochem 2003; 89: 837-847 23. Bhasin N, Kernick E, Luo X, Seidel HE, WeissER, Lauder JM. Differential regulation of chondrogenic differentiation by the serotonin 2B receptor and retinoic acid in the embryonic mouse hindlimb. Dev Dyn 2004 ; 230: 201-209.

Erciyes T1p Dergisi (Erciyes Medical Journal) 2007;29(4):280-284