Ras Yolağının Kanserdeki
Yeri
Sunum Planı
• Ras Protoonkogeni Genel Özellikler
• Ras Aktivasyonu ve Etkilediği Proteinler
• Ras ve MAPK Yolağı
• Ras ve PI3K Yolağı
• Ras Mutasyonları ve Kanser İlişkisi
• Kanserde Tedavi Hedefleri
Ras Protoonkogenleri
• Yaklaşık 21 kD kütleli, GTPaz aktivitesi gösteren G proteinleridir.
• GTP bağlı veya GDP bağlı formları ile, iki konformasyon arasında gidip gelerek hücre içerisindeki çeşitli proteinleri etkiler ve onların da konformasyonlarının değişmesine ve fosforilenmelerine yol açarak hücre içi sinyal iletimini tetiklerler.
• Hücre biyolojisinin her alanında son derece kritik roller üstlenirler:
hücre içi protein trafiğini,
hücre iskeletinin organizasyonunu,
büyüme faktörü sinyal iletimini,
ve gen ifadesini düzenlerler.
• Hücre membranının iç yüzüne lokalize olmuşlardır.
• K-ras, N-ras ve H-ras olmak üzere 3 alt türü vardır.
Ras Aktivasyon Mekanizması
• Hücre zarında bulunan ve içsel tirozin kinaz aktiviteleri olan veya diğer tirozin kinazlarla etkileşimleri olan reseptörlerden gelen
sinyaller Ras proteinlerinin aktivasyonuna yol açar.
• Tirozin kinazlarla doğrudan etkileşimleri olmayan Serpentin reseptörleri ise, src- benzeri kinazları veya ligandlardan
bağımsız olarak reseptör kinazları aktive ederek Ras aktivasyonuna yol açarlar.
• SOS (son of sevenless) ve GRB2 (growth factor reseptor bound protein 2) Ras’ın aktivasyonunda rol oynayan proteinlerdir.
• Ras sinyal yolunun efektör molekülleri, SOS üzerinde negatif düzenleyici etki ile Ras aktivasyonunu sonlandırırlar.
• Ras’ın bağlanan GTP’yi hidrolizinden sonra, proteine bağlı kalan GDP’nin uzaklaştırılması için Guanin Değişim Faktörlerine (GEF; Guanine Exchange Factor) ihtiyaç vardır.
• GEF proteinleri Ras-GDP ile etkileşir ve GDP’nin proteinden uzaklaşarak, Ras’ın hücre içi derişimi daha fazla olan GTP’yi bağlayabilmesine olanak tanırlar.
• Bağlanan GTP Ras’ın içsel GTPaz aktivitesi ve Ras’a bağlanan GTPaz
Aktive edici Proteinler (GAP) ’ın etkisi
ile hidrolize uğrar.
• GTP bağlı konformasyondaki Ras ailesi proteinleri, sinyal yolağının alt basamaklarında bulunan efektör proteinlere doğrudan bağlanarak bu proteinleri aktif hale geçirirler.
• Bilinen Ras efektörleri üç gruba ayrılabilir:
1. RAF (“Ras Associated Factor”) ve MAPK/ERK (“Mitogen Activated Protein Kinase” ve
“Extracellular Signal Regulated Kinase”) kaskadındaki efektörler
2. Fosfoinozitid-3-kinaz (PI3-K) ve Ral (“Ras-like”; Ras benzeri protein) kaskadındaki efektörler 3. Çeşitli farklı fonksiyonlara sahip Ras efektörleri
RalGDS proteini,
Rgl ve Rlf,
FosfolipazC-epsilon (PLCe),
T-hücreleri invazyon ve metastaz faktörü-1 (TIAM-1),
Ras etkileşim/ girişim proteini (RIN1),
Afadin Proteini (AF-6),
Ras etkileşim bölgesi bulunan proteinler ailesi (RASSF)
Ras Aracılı MAPK Yolağı Aktivasyon Mekanizması
• Aktif GTP-Ras, bir serin/treonin kinaz olan Raf’a yüksek afinite ile bağlanıp Raf kinazların hücre membranına yerleşimini ve aktivasyonunu,
• Daha sonra sırasıyla MEK ve ERK’in aktivasyonu ile devam eden ve çekirdekteki transkripsiyon faktörlerinin aktivasyonuna yol açan sinyal yolağının aktive olmasını sağlar.
• Tüm ökaryotik hücrelerin sitoplazmasında bulunan MAPK proteinleri, hücre zarından çekirdeğe bilgi aktarılmasında önem taşır.
• MAPK ailesi MAPK, MAPK kinaz (MAP2K) ve MAPK kinaz kinaz (MAP3K) olmak üzere üç kinazdan oluştuğu gözlenmiştir. Her bir MAPK kaskadı bu üç kinaz ile çalışır.
• MAPK ailesi; gen ekspresyonu, hücre bölünmesi, hücre canlılığı, apopitoz, metabolizma, farklılaşma ve motilite ile ilişkili süreçlerin kontrolündeki sinyal iletimi yolaklarını oluştururlar.
• Hormonlar, büyüme faktörleri, diferansiyasyon faktörleri, tümör promotör faktörler bu yolağı kullanır.
Ras Aracılı PI-3K Yolağı Aktivasyon Mekanizması
• Fosfoinozitid-3 kinaz (PI-3K) ailesi, büyüme ve yaşama sinyallerinin iletiminden sorumlu proteinlerdir.
• PI-3 kinaz, düzenleyici rol oynayan p85 ve katalitik aktiviteye sahip olan p110 proteinlerinden oluşan bir heterodimer olarak görev yapar.
• GTP-Ras, doğrudan p110’a bağlanarak heterodimeri etkinleştirir.
• Aktif PI-3K, hücre membranında inozitol fosfolipidlerin fosforilasyonunu katalizler.
Fosfotidilinozitol trifosfat (PIP3), bu yolla oluşan bir lipid mediatördür.
• PIP3, PIP3 bağımlı kinazlar (PDK) ve protein kinaz B (PKB)’nin aktivasyonundan sorumludur.
• Protein kinaz B, Akt1 ve Akt2 genleri tarafından kodlanan bir proteindir.
• Tümör baskılayıcı proteinlerden PTEN ise, PIP3 oluşumunu inhibe ederek negatif düzenleyici rol oynar.
Ras Mutasyonları ve Kanser İlişkisi
• Ras proteinleri büyüyen hücrenin proliferatif ve değişim sinyallerinde aktif rol aldığı için tüm kanserlerde somatik kazanılmış fonksiyonel mutasyonlara çok açıktır.
• Ras genlerindeki aktivasyona yol açan mutasyonlar insanlarda tüm kanserlerin %30’unda görülmektedir.
• Bazı tümörler üzerinde yapılan çalışmalar, RAS gen ailesinde nokta mutasyonlara yatkın olan bazı ‘hot spot’ları göstermiştir. Sık mutasyonlar kodon 12’de glisinin valine, kodon 13’te glisinin sisteine ve kodon 61’de glutaminin arginin/lizin/lösine değişimi şeklinde olmaktadır.
• Hotspot kodonlar olarak bilinen ekzon 12, 13 (segment 1) ve 61 (segment 2)’deki
mutasyonlar spesifik aminoasit değişimlerine neden olur. Bu değişimler, GTPaz aktivitesini bozmakta ve GAP’lara karşı direnç gelişimine yol açarak GTP-bağlı formda kalan mutant Ras proteinlerinin hücrede birikimine yol açar ve hücre kontrolsüz bir şekilde uyarılmaya başlar.
• Kanser hücrelerinin kontrolsüz hücre büyümesi, kontrolsüz farklılaşma ve apoptoza direnç gibi özellikler kazanmalarına yol açarlar.
• GEF ve GAP proteinlerinde ifade veya protein aktivitesi düzeylerinde oluşabilecek düzenlenme bozuklukları da Ras ailesi G-proteinlerinin aktivitelerini farklı şekillerde bozarak farklı dokularda kanser oluşumunu ve metastazı tetikleyebilir ve/veya hızlandırabilirler.
• Bu nedenlerle çeşitli GEF ve GAP proteinlerinin de ilaç hedefleri olarak ele alınarak, bunların aktivitelerini modüle edici küçük moleküller aranması, yeni ilaçların keşfine yol açacak deneysel yaklaşımlar olarak ele alınmaktadır.
• Hücrelerin sinyal iletimi, proliferasyon ve malign dönüşümün aktivasyonu sadece Ras genlerindeki mutasyonlardan değil, aynı zamanda çeşitli genlerdeki mutasyonlar yoluyla da meydana gelmektedir.
Örneğin; Nörofibramin-1 (NF1) ve PTPN11 genlerinde oluşan mutasyonlar Ras yolağı aktivitesini bozar.
• Onkojenik Ras uyarısı transforme hücrelerde normal hücrelerden farklı genlerin ekspresyonunu da uyarabilir.
Ras/Raf/Mek/Erk Yolağı ve Kanser
• Kontrolsüz olarak aktif hale gelen Raf-MEK-ERK sinyal iletiminin kemirgen hücre hatlarının onkogenik
transformasyonu için yeterli olduğu ve benzer bir bozulmanın insanda kanserleşmeye yol açtığı gösterilmiştir.
• Ras ve Raf normal insanlarda birer protoonkogendir ancak mutasyonlar sonucu onkogene dönerek hücrede neoplazm oluşumunu başlatır.
• Ras ve Raf mutasyonlarının, lösemi tedavisinde direnç gelişimine yol açtığını gösteren yayınlar vardır. Bu olgularda tedavide etkin olacak Ras ve Raf kinaz inhibitörleri ile ilgili çalışmalar sürmektedir.
• RAS/RAF mutasyonlu hücre hatları normal hücrelerle kıyaslandığında in vitro olarak Cetuximaba karşı yüksek direnç gösterirler.
• Tüm insan tümörlerinin %8’inde, kolorektal tümörlerinse %5-12’sinde BRAF mutasyonu saptanmıştır.
• Malign melanomalı olguların çoğunda raf onkogeninde bir nokta mutasyonu (BRAF geni V600E) tanımlanmıştır.
• Bu mutasyon sonucu raf proteininin üç boyutlu yapısı ve buna bağlı aktivitesi değişir ve melanoma hücrelerinde MAP kinaz yolağı üzerinden hücreyi aşırı uyarır. Hücre malign transformasyona döner. Bu mutasyon tanımlanan melanoma olgularında
PLX4032(RG7204) molekülü ile hedef tedaviler denenmektedir.
• BRAF onkogeninde, glisince zengin kinaz domainini etkileyen ekzon 11 mutasyonları ile aktivasyon segmentini etkileyen ekzon 15 mutasyonları olmak üzere, iki bölgede nokta mutasyonu tanımlanmıştır.
• Son yıllarda, melanomalarda, tiroid kanserlerinde, kolorektal kanserlerde ve diğer kanser tiplerinde BRAF geninde çeşitli mutasyonlar tespit edilmiştir.
• Kolorektal karsinomların yaklaşık %10’unda BRAF mutasyonu olduğu saptanmıştır. Ayrıca, karsinoma öncüsü olarak kabul edilen bazı poliplerde de değişen oranlarda BRAF
mutasyonu saptanmıştır.
• Tüm insan tümörlerinin %17-25’inde, kolorektal tümörlerinde %30-40’ında aktive edici KRAS mutasyonu tanımlanmıştır.
• Bu mutasyonlar “missense” mutasyonu şeklinde olup, çoğunlukla mutasyonlar 2.
ekzonda kodon 12 ve 13 ile 3. ekzonda kodon 59, 61 ve 63’de yoğunlaşmaktadır.
• Kodon 12 mutasyonları, tüm KRAS gen mutasyonlarının %82’sini, kodon 13 mutasyonları ise %17’sini oluşturmaktadır.
• Değişik Ras genlerindeki mutasyonların farklı kanserlerde yaygın olarak ortaya çıktıkları belirlenmiştir. Örneğin;
K-Ras mutasyonları pankreas, kolorektal, endometriyal, safra yolu, akciğer ve serviks kanserlerinde daha sık görülmekteyken,
K-Ras ve N-Ras mutasyonlarına myelomalarda,
N-Ras ve H-Ras mutasyonlarına da sırası ile melanomlarda ve idrar kesesi
kanserlerinde rastlanmaktadır.
• Metastatik kolorektal kanserlerde %30-40,Non-small cell akciğer kanserlerinde (NSCLC)
%10-30, pankreas kanserlerinde %90 ve baş-boyun tümörlerinde %5 oranında
monoklonal antikor tedavilerine karşı rezistans (direnç) gelişimine neden olan somatik KRAS ve NRAS mutasyonları gözlenmektedir.
• Bu mutasyonlar; sıklıkla 12. ve 13. kodonlarda gözlenmekle birlikte daha nadiren de kodon 59, 61, 117 ve 146 bölgelerinde saptanmaktadır.
• Hastalarda en sık Gly12Ala, Gly12Asp, Gly12Arg, Gly12Cys, Gly12Ser, Gly12Val, Gly13Asp
mutasyonları gözlenir.
• KRAS protoonkogeni , EGFR sinyalinin BRAF aracılıklı MAPK sinyal mekanizmasında yer alır.
• KRAS ve BRAF mutasyonlarından herhangi birinin varlığı MAPK yolağının aktivasyonu ile tümörogenezisin başlaması için yeterlidir.
• KRAS 12. ya da 13. kodonda mutasyon olan metastatik kolorektal kanserli hastaların, EGFR’yi hedefleyen setuksimab ya da panitumumab tedavisine yanıt vermedikleri Faz III çalışmalar ile gösterilmiştir.
• KRAS mutasyonu varlığında EGFR antikoru kullanımının bir anlamı kalmamaktadır.
• Bu nedenle KRAS mutasyonunun varlığı, EGFR’yi hedefleyen antikorlar olan setuksimab (Erbitux®) ve panitumumab (Vectibix®) kullanımı için belirteç olarak kabul edilmektedir.
Böylelikle, EGFR antikoru tedavisi öncesi KRAS mutasyonunun belirlenmesi ile tedaviye dirençli grubun ortaya çıkarılması sağlanır.
PI-3K Yolağı ve Kanser
• Aynı Raf1 örneğinde olduğu gibi, PI3-K aktivitesinin de Ras’a bağlı onkogenik transformasyon için gerekli olduğu tanımlanmıştır.
• Normal koşullarda EGF ve PDGF gibi büyüme faktörlerinin fosfoinozitid-3 kinaz (PI-3K) yolunu uyarmalarında Ras'ın etkinliği çok azdır.
• Ancak Ras mutasyonlarında ortaya çıkan ras onkogeni PI-3K yolunu aktive eder, hücrede apopitozisi
baskılar, farklı genlerin ekspresyonunu aktive eder. Özellikle epitel hücrelerden köken alan kanserlerde bu yolağın aktiflendiği tanımlanmıştır.
• Bu yolağın aktiflendiği olgularda PI3K’yi normal hücrede inhibe eden arrestin molekülü gibi moleküllerin tedavide kullanılabileceği üzerinde durulmaktadır.
• Tümör supresör genlerden PTEN bu yolağın ilk adresi olan PIP-3 oluşumunu inhibe ederek düzenleyici bir görev yapar. PTEN mutasyonu sonucu proteinin tümör baskılayıcı etkisinin ortadan kalkması ile hücrede neoplazi gelişir.
• PI-3 kinaz/Protein kinaz B sinyal iletim yolu da kanserlerde etkindir. Bu yolakta fosfo inozitol-3-fosfat (PIP-3) membran fosfolipidlerinin hücreye gelen uyarı sonucunda PI-3K aracılığıyla fosforlanması ile aktive olur. Bu aktiflenme protein kinaz B (Akt proteini)’yi aktifler.
• Protein kinaz B uyarısı hücre içinde çeşitli proteinlerin aktivitelerinin etkiler. Bunlardan biri “mammalian target of rapamycin (m TOR)” proteinidir.
• m TOR proteini kinaz aktivitesine sahip olup, rapamisin tarafından inhibe edilir. Rapamisin, mTOR sentez artışı görülen tümörlerde tedavide kullanılmaktadır.
• Protein kinaz B aktivasyonunun hücre döngüsü üzerindeki etkileri de karsinogenez sürecinde önem taşır.
• p21 proteini hücre döngüsünün erken G1 fazında siklin D ve siklin bağımlı kinaz 4/6
(cdk4/6) kompleksi üzerinde pozitif uyarıcı etki yapmaktadır. Protein kinaz B, p21'in stabil formunun oluşumunu tetikler ve hücre döngüsünün ilerlemesine uyarıcı yönde etki eder.
• Buna ek olarak protein kinaz B p21'in degradasyonunu uyaran proteini de inhibe eder.
• Protein kinaz B uyarısının doğrudan etkili olduğu hücresel işlevlerden biri de apoptozistir.
Protein kinaz B, proapoptotik BAD proteini ile kaspaz 9 üzerinde inhibitör etki gösterirken, NFκB uyarısı ile de antiapoptotik cevabı desteklemektedir.
• BAD proteinleri antiapopitotik BCL2 ve BCL-x(L) proteinlerinin antiapopitotik
fonksiyonlarını antagonize ederler. Protein kinaz B uyarısında değişiklik apopitoz
mekanizmasını bozarak karsinogenezisi başlatır. Hücre immortalizasyona(ölümsüzlük) gider.
• Farklı kanser türlerinde asıl sorun hangi olguda hangi mekanizmaların bozulduğunun ortaya konmasıdır. Ancak bundan sonra hedef moleküller ile tedavi şansı
arttırılabilir.
• APC gen mutasyonu içeren poliplerdeki ikinci mutasyon, ras proto-
onkogeninde gerçekleşir. APC ve ras gen mutasyonları birlikte ara
adenomaların gelişimini tetikler.
Onkogenik Ras Yolağı Üzerindeki Hedefe Yönelik Tedaviler
• Ras protoonkogeninde işlenme (post translasyonal modifikasyon), sinyal yolağı, reseptörler, yukarı yön yolak(upstream) aktivasyonu ve inaktivasyonu, aşağı yön yolak(downstream) gibi hedefler seçilebilir.
• Üzerinde çalışmalar yapılan ras sinyal ileti inhibitörleri arasında;
protein ekspresyonu inhibitörleri (gen tedavisi, antisens oligdeoksinükleotidler, intrasellüler antikorlar),
ras-hücre membranı ilişkisini bozan ajanlar (farnesil transferaz inhibitörleri, GGT-I, CAAX inhibitörleri, metiltransferaz inhibitörleri),
ras trafiği inhibitörleri (17AAG), aşağı yön yolak inhibitörleri (raf kinaz inhibitörleri, MEK inhibitörleri (CCI-779) sayılabilir.
• İleride ras transformasyonu etkisini kontrol edebilen ve normal ras fonksiyonunu koruyabilen ajanların geliştirilmesinin, kanserin tedavi şansını arttıracağını düşündürmektedir.
• KRAS geni tarafından üretilen protein, PI3K/PTEN/AKT ve RAF/MEK/ERK olmak üzere iki farklı sinyal yolunu regüle eder. Geliştirilmekte olan yeni kanser ilaçları bu iki yolu hedef alırlar.
• İnvitro ve invivo çalışmalar göstermiştir ki, EGFR blokajı ile “downstream” sinyalin
kesilmesi,tümör hücrelerinde büyümenin inhibisyonuna neden olabilmekte ve böylece kanserli hastalarda potansiyel iyileşme sağlanabilmektedir.
• Anti-EGFR monoklonal antikorları (cetuximab ve panitumumab) ve EGFR tirozin kinaz aktivitesini inhibe eden küçük moleküller (erlotinib ve gefitinib) farklı epitelyal kanserlerin, metastatik
küçük hücreli olmayan akciğer kanserlerinin, kolorektal kanserlerin, baş boyun bölgesinin yassı hücreli kanserlerinin ve pankreas kanserlerinin tedavisinde kullanılmaktadır.
• Sunitinib ve sorefenib tirozin kinazı inhibe eden moleküllerdir. Her iki ilaç da VEGFR, PDGFR, kök hücre faktör reseptörü ve “colony stimulating factor-1 receptor” üzerine etkindir. Günümüzde her iki ilaç da renal hücreli kanserlerde kullanılmaktadır.
• Gastrointestinal stromal tümörlerde (GIST) aktivite artışı genellikle c-kit protoonkogenindeki
mutasyona bağlıdır. Kötü prognoza sahip bu tümörlerde tedavide tirozin kinaz inhibitörü imatinib, dirençli olgularda sunitinib önerilir.
Sonuç
• Her kanser olgusunda etkilenen yolaklarda etkilenen moleküllerin bulunması
önemlidir. Her hasta için kanser oluşma mekanizmasının ortaya konması uygun tedavi protokollerinin kullanılmasını sağlayacaktır. Bu nedenle son günlerde her hastada
hangi mekanizmalar ile kanser olduğunun ortaya konmasını sağlayacak “kinase assay” yöntemleri uygulama alanına girmektedir.
• Tüm bulunanlara rağmen hücre içi sinyal iletim yolaklarının kanserle ilgisi, halen birçok bilinmeyenleri barındırmaktadır. Kanser tanısı, prognozun belirlenmesi ve yeni
tedavilerin uygulanması özellikle hücre içi sinyal iletimi ile ilgili bilgilerimizin artması ile mümkündür.
• Sinyal iletiminde bozulan hedef molekülleri ortaya konmalıdır. Yeni tedavi protokolleri için
hedefe yönelik moleküller bulunmalı ve bunlar tedavide kullanılmalıdır.
KAYNAKÇA
1. Ras Protein Ailesi: Hücresel İşlevi, Moleküler Kontrolü, Onkogenezdeki Rolü Türk Biyokimya Dergisi [Turkish Journal of Biochemistry–Turk J Biochem] 2011; 36 (4) ; 367–373
2. Mesane kanseri ve RAS proto-onkogenleri Yeni Üroloji Dergisi - The New Journal of Urology 2012;
7 (1): 55-58
3. Mitojenle etkinleşen protein kinazların heterotrimerik G proteinleri ile düzenlenmesi Türk Biyokimya Dergisi [Turkish Journal of Biochemistry–Turk J Biochem] 2012; 37 (2) ; 218–228.
4. Sinyal iletimi mekanizmaları ve kanser Hacettepe Tıp Dergisi 2004; 35:34-42
5. Kolorektal kanser: Genetik ve moleküler biyoloji araştırmaları hasta tedavisine yeterince yansıyor mu? Emel Canbay1, Dursun Buğra2 Sayı: 2011, Cilt 27, Sayı 4 Sayfa: 198-205 DOI: 10.5097/1300- 0705.UCD.1256-11.01 Ulusal Cerrahi Dergisi
6. The role of signal transducing mechanisms in cancer diagnosis and treatment Zehra Dilşad Çoban*, Şefik Güran Cumhuriyet Med J 2013; 35: 302-310
7. KOLOREKTAL KANSER VE ÖNCÜ LEZYONLARINDA KRAS VE BRAF MUTASYON ANALİZLERİ YOLUYLA TANISAL YAKLAŞIM VE HEDEFE YÖNELİK TEDAVİ SEÇİMİ ÖZNUR ERDOĞAN TEMEL BİYOTEKNOLOJİ YÜKSEK LİSANS TEZİ
