Girifl
Böceklerde büyüme ve geliflmeyi kontrol eden mekanizman›n aç›kl›¤a kavuflturulmas›nda beyin nöroksekresyon hücreleri üzerindeki araflt›rmalar büyük önem tafl›maktad›r. Böceklerde metamorfoz olay›
nöroksekresyon hücrelerine ba¤l› olarak endokrin sis-
temin kontrolü alt›nda de¤iflik yollar izleyerek gerçekleflir.
Bu yol; beyin-korpora kardiaka - korpora allata’y› takip ederek protorasik beze ulafl›r (fiekil 1). Nöroksekresy- onun kendi hücre aksonlar› ile ayn› yolu takip ederek pro- torasik bezi uyard›¤› Morohoshi (1); Akai (2, 3, 4);
Mizoguchi (5); Sakurai (6, 7); taraf›ndan belirtilmifltir.
‹pekböce¤i Bombyx mori (Lepidoptera: Bombycidae) Beyin Nörosekresyon Hücrelerinde Beflinci Larval Evre Süresince Hemo-
lenf Ekdisteroid De¤iflmelerine Ba¤l› Farkl›l›klar›n Araflt›r›lmas›
Osman PARLAK
Ege Üniversitesi, Fen Fakültesi, Biyoloji Bölümü, Bornova, ‹zmir - TÜRK‹YE Güler ÜNAL
100. Y›l Üniversitesi, Fen-Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü, Van - TÜRK‹YE
Gelifl Tarihi: 05.12.1996
Özet : Bu çal›flmada, ipekböce¤i hemolenfinde radioimmunoassay (RIA) ile belirlenen ekdisteroid miktar› de¤iflmelerine ba¤l› olarak beyin pars interserebralis (PIC) bölgesinin lateral nörosekresyon hücrelerinde meydana gelen de¤ifliklikler paraldehid fuksin (PAF) boyama yöntemi kullan›larak ›fl›k mikroskobunda incelenmifltir.
Beflinci larval safhada ipekböce¤i beyinleri hemolenf de¤erinin düflük ve yüksek oldu¤u günlerde (5, 6, 7. gün) tesbit solüsyonuna (Bouin) al›nm›fl ve dehidratasyondan sonra al›nan kesitler PAF ile boyanm›flt›r.
Sonuçta, hemolenfteki ekdisteroid seviyesi yükselmeden önce, nörosekresyon hücrelerinin sitoplazmalar›nda yo¤unlu¤un artt›¤› ve ince salg› granülleri ile kapland›¤›, salg›n›n bofllamas›n› takip eden günde ise hemolenfteki ekdisteroid seviyesinin yükseldi¤i tesbit edilmifltir.
Anahtar Sözcükler : Bombyx mori, Radioimmunoassey, Ekdisteroid, pars interserebralis.
Differentiation of Brain Neurosecrotory Cells Depending on Ecdysteroid Content of Haemolymph During 5 th. Instar Larval Stage of Silkworm, Bombyx mori
Abstract : In this study, the differentiation in the lateral neurosecretion cells of pars intercerebralis of brain, depending on the different ecdysteroid contents which was determined in the hemolymph of silkworm by radioimmunoassay has been studied using light microscopy.
The brains of silkworms in the time of low and high hemolymph ecdysteroid content were fixed in Bouin solution, and the cross sec- tions were stained with PAF after dehidratation.
Results shown that the density of fine secretion granulles increased in the cytoplasm of neurosecration cells just before the increase of ecdysteroid content in hemolymph. It was also observed that the ecdysteroid content in hemolynph increased in the following day of excretion.
Key Words : Bombyx mori, Radioimmunoassay, Ecdysteroid, pars intercerebralis.
Protorasik bezi uyaran prothorasikotropuk hormon (PTTH) peptid yap›s›nda bir nörosekresyondur ve bezi uyararak ekdizon sal›nmas›n› teflvik eder (8). Ekdizon hormanu ise deri de¤iflimi ve metamorfozu kontrol eder (9).
Böceklerde larval ve pupal metamorfozun gerçekleflmesinde ekdizon kadar korpora allata taraf›ndan sal›nan juvenil hormonun da rolü vard›r. Bu bezin aktivite- si beyin hücreleri taraf›ndan kontrol edilmektedir (7), Juvenil hormonunun miktar› ise protorasik bez ile karfl›l›kl› etkileflimi sonucu ayarlanmaktad›r (10). Ayn›
etkileflim protein metabolizmas›n› da ayarlamaktad›r (1).
Bir yabani ipekböce¤i Antheraea pernyi üzerinde çal›flan Zhang (11), beyinde üç ayr› grup nöroksekresyon hücresinin bulundu¤unu ve bunlar›n aktivitelerinde geliflme safhalar›na göre de¤iflikliklerin oldu¤unu rapor etmifltir.
Bu çal›flmadaki ipekböce¤i beflinci larval evresinde oldu¤u gibi, di¤er larval evrelerin hemolenf ekdizon de¤erleri Kiuchi (1992) ve pupal evre hemolenf ekdizon de¤erleri Hanaoka (1974) taraf›ndan ele al›nm›flt›r.
Çal›flmam›zda ise, Bombyx mori ipek bezlerindeki salg›n›n h›zla artt›¤›, imajinal disklerin büyümeye bafllad›¤›
ve ekdizon de¤erinin di¤er evrelere göre çok daha fazla oldu¤u beflinci larval evre ele al›narak hemolenf ekdis- teroid de¤erleri tesbit edilmifl ve PIC hücrelerinde mey- dana gelen sitoplazmik de¤iflimler ortaya koyulmufltur.
Materyal ve Metot
‹pekböce¤inin yetifltirilmesi:
Yetifltirme odas›nda yumurtadan ç›kan ipekböce¤i lar- valar› (Japon orijin, J-85) 25±1°C ve 12 saat ayd›nl›k 12 saat karanl›k fotoperyoda, %70 nemlili¤e ayarl› sabit ›s›
odas›nda taze dut yapraklar› ile beslenmifltir.
Beflinci larval safhaya deri de¤ifltiren hayvanlar›n beyinleri 5, 6, 7. günlerde ç›kar›larak Boin solüsyonunda tesbit edilmifl ve daha sonra suyu al›nan doku parafine gömülerek parafin bloklar haz›rlanm›flt›r. 7 mikron kal›nl›¤›nda al›nan kesitler paraldehid fuxin (PAF) ile boy- anarak ›fl›k mikroskobunda incelenmifl ve nöroksekresyon hücrelerinin de¤iflik günlerdeki foto¤raflar› çekilmifltir.
Hemolenfteki Ekdisteroid de¤erlerinin belirlenmesi:
Beflinci larval safhan›n s›f›r›nc› gününden bafllayarak sekiz gün süre ile her 12 saatte bir üç ayr› hayvan kan›ndan al›nan 20 µl hemolenf 400 µl metanol ilave edil- erek 8000 devirde 10 dakika santrifüj yap›lm›flt›r. Daha sonra s›v› faz al›narak küçük cam tüplere koyulmufl ve argon gaz› geçirilerek buharlaflt›r›lm›flt›r. Radioimmuos- say (RIA) için tüplere eflit oranda Borate Buffer (pH: 8.2), 3H-ekdizon ve antiserum ilave edildikten sonra sintillasy- on sayac›nda say›m› yap›larak ekdizonun antiseruma ba¤lanma yüzdelerini gösteren standart e¤ri elde edil- mifltir. daha sonra ayn› seri, haz›rlanan deney tüplerinde- ki hemolenf ekdizonlar›na uygulanarak her gün için hemolenfin içerdi¤i ekdizon de¤erleri ng/ml olarak ortaya ç›kar›lm›flt›r (12).
Bulgular
‹pekböce¤i Beyinlerinin Total ‹ncelenmesi:
Ifl›k mikroskobunda yap›lan total incelemede beynin pars interserebralis sa¤ ve sol lateral bölgelerinde 4 er adet olmak üzere toplam 8 adet nörosekresyon hücresinin varl›¤› belirlenmifltir (fiekil 2). Hücreler, hafif köfleli yuvarlak veya oval flekilli, sitoplazmalar› beyin dokusuna göre daha aç›k renkli, birbirlerine çok yak›n konumda olup her iki tarafa da iki grup oluflturmaktad›rlar. Çaplar› yaklafl›k 20-30 µm aras›ndad›r.
Hemolenfdeki Ekdisteroid de¤erlerindeki de¤iflimler:
Beflinci larval safhan›n ilk üç günü hemolenfdeki ekdis- teroid de¤erleri çok düflük seviyelerde seyretti¤i halde (3- 5 ng/ml) 3. günden itibaren artmaya bafllad›¤› ve bu
p›c
sg cc
ca
pb
fiekil 1. ‹pekböce¤inde (B.mori) endokrin sistem flemas› PIC: pars interserebrali, B: beyin, cc: korporakardiaka, ca: korpora allata, sg: subosefagial ganglion, pb: protorasik bez.
art›fl›n alt›nc› güne kadar devam etti¤i tesbit edilmifltir (fiekil 3). Ekdisteroid de¤eri 7. günde bir miktar düflme gösterirken 8. günde ekdisteroid de¤erinin 16.5±5.3 ng/ml ye kadar ç›kt›¤› tesbit edilmifltir.
Nörosekresyon hücre sitoplazmalar›nda meydana gelen de¤iflimler:
Beflinci larval safha süresince hemolenfdeki ekdis- teroid miktar›n›n art›fl›na ve azal›fl›na paralel olarak beyin- deki nöroksekresyon hücrelerinin sekresyon yo¤unlu¤u bak›m›ndan de¤iflikli¤e u¤rad›¤› belirlenmifltir. Yap›lan ›fl›k mikroskobu incelemelerinde, bu evrenin beflinci gününden itibaren hücre sitoplazmalar›nda ince granüllerin h›zl› bir flekilde birikmeye bafllad›¤› tesbit edilmifltir (fiekil 4).
Alt›nc› günde bu art›fl›n iyice h›zland›¤› ve hücre sito- plazmalar›n›n ince granüllerle yo¤un olarak kapland›¤›
görülmüfltür (fiekil 5). Hemolenfdeki ekdisteroid mik- tar›n›n düflmeye bafllad›¤› 7. günde ise; nörosekresyon hücrelerindeki salg› yo¤unlu¤unun azald›¤› ve adeta hücre sitoplazmas›n›n boflalarak önceki yo¤unlu¤unu tamamen kaybetti¤i saptanm›flt›r (fiekil 6).
fiekil 2. ‹pekböce¤inde (B. mori) beynin total görünüflü
O: pars interserebralis bölgesi, cc: korpora kardiaca, ca:
korpora allata, skala: —— 100 µm
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Günler I*
10
8
6
4
2
0
Hemolent ekdisteroidleri (ng/ml —o—)
fiekil 3. ‹pekböce¤inde (B. mori) 5. larval safha süresince hemolen- fteki ekdisteroid de¤iflim grafi¤i. Sekizinci gün (fotofaz) hemolenf ekdisteroid miktar› 16.5 ± 5.3 ng/ml *: ipek salg›lama evresi, (10). Her nokta 5 ayr› ölçümün ortala- mas›d›r. ± SD.
fiekil 4. ‹pekböce¤inde (B. mori) 5. larval evre beflinci gün nörosekresyon hücreleri. X200
fiekil 5. ‹pek böce¤inde (B. mori) 5. larval evre alt›nc› gün nörosekresyon hücreleri. X200
Tart›flma
B. mori beyninde de di¤er ipekböceklerinde oldu¤u gibi lateral konumda iki grup halinde nörosekresyon hücreleri bulunmaktad›r. Bu hücrelerin akson uzant›lar› ve ba¤lant› halinde oldu¤u endokrin bezlerdeki salg› granül- leri Morohoshi (1), Akai (2), Zhang (11) taraf›ndan ipekböce¤inde gösterilmifltir. Nörosekresyon hücrelerinde belirledi¤imiz sitoplazmik yo¤unluk sal¤› granüllerinin art›fl›ndan ileri gelmektedir.
Beynin protorasik bez üzerindeki direk etkisi ise Saku- rai (6, 7) taraf›ndan yap›lan organ kültürü çal›flmalar› ile
aç›k olarak ortaya koyulmufltur. Çal›flmam›z›n birinci bölümünde de; 5. larval safha süresince beynin etkisi alt›ndaki protorasik bez taraf›ndan hemolenfe sal›nan ekdizon düzeyi tesbit edilerek protorasik bezin aktif oldu¤u dönemler belirlenmifltir. ‹kinci bölümünde ise, protorasik bezin beynin etkisi alt›nda kal›p kalmay›fl›na göre nörosekresyon hücrelerindeki de¤iflimler gözlemlen- mifltir. Sonuçlar, Sakurai (6) in de çal›flmalar›nda belirtti¤i gibi, beynin protorasik bez üzerinde etkili oldu¤unu ortaya ç›karmaktad›r. Çünkü, nörosekresyon hücrelerindeki salg›n›n artmas›ndan sonra protorastik bez uyar›lmakta ve hemolenfe ekdisteroid verilmektedir.
Sonuçlar›m›z, bu bulgular›n radioimmunoassey verilerine göre do¤rulad›¤› gibi histolojik olarak da teyit etmektedir.
Ayr›ca, beflinci larval evreye ait histolojik bulgular›n di¤er larval evreler ve pupal evre için de geçerli oldu¤u ortaya ç›kmaktad›r. Burada elde etti¤imiz sonuçlar do¤rultusun- da bir noktay› önemle belirtmek gerekmektedir;
nörosekresyonun ancak bir gün sonra protorasik bezi etkisi alt›na alarak uyard›¤› kritik peryot olarak ortaya ç›kmaktad›r. Zira, nörosekresyondaki yo¤unlu¤un çok fazla oldu¤u dönemde henüz protorasik bez uyar›lmad›¤›
için hemolenfdeki ekdisteroid seviyesinin düflük kald›¤›
ancak ertesi gün protorasik bezin uyar›lmas› nedeniyle hemolenfdeki ekdisteroid miktar›n›n yükseldi¤i görülmek- tedir.
fiekil 6. ‹pekböce¤i (B. mori) 5. larval evre yedinci gün nöroksekresyon hücreleri X200.
Kaynaklar
1. Morohoshi., Control in Bombyx mori of the hormonal antagonistic balance regulating development by the brain hormone. The ultra- structure and Functioning of insect cells. (Ed. H. Akai et al.), pp.
109-112, 1982.
2. Akai, H., Hormonal regulation of larval development and its utiliza- tion in silk prodaction by Bombyx silkmoth. Tropical Agriculture Research Center. Reprinted from JARQ Vol. 22, No. 2, pp, 128- 134, 1988,
3. Akai, H., Changes of ecdysteroid levels of Bombyx larvae after JH and ecdysterone treatments. The journal of sericultural science of Japan. Vol: 58, No: 5, pp, 436-438, 1989.
4. Akai, H., Endocrine system of insects. In atlas of endocrine organs, in vertebrates and invertebrates. Ed. Kobayashi, E., Kodansha, Tokyo, pp, 132-145, 1987.
5. Mizoguchi, A., Oka, T., Kataoka, H., Nagasawa, H., Suzuki, A., Ishizaki, H., Immunohistochemical localization of prothoracicotrop- ic hormone-producing neurosecretory cells in the brain of Bombyx mori. Develop. Growth and Differ., 32 (6), pp, 591-598, 1990.
6. Sakurai, S., Imokawa, H., Developmental Arrest Induced by Juve- nile Hormone in Larvale of Bombyx mori. Archives of Insect Bio- chemistry and phsiology, (8), pp, 219-228, 1988.
7. Sakurai, S., Okuda, M., Ohtaki, T., Juvenil hormone inhibits ecdysone secretion and responsiveness to prothoracicotropic hor- mone in prohoraric glands of Bombyx mori. Gen. Comp. Endocr., vol. 75. pp, 220-230, 1989.
8. Ishizaki, H., Suzuki, A., Moriya, I., Mizoguchi, A., Fujishita, M., O’oka, H., Kataoka, H., Isogai, A., Nagasawa, H. and Suzuki, A., Prothoracicotropic hormone bioassay: pupal adult Bombyx assay.
Develop. Growth & Differ., vol. 25, pp. 585-592, 1983.
9. Truman, J. W., Neuroendocrine Control of Ecdysis. Molting and Metamorphosis (Ed. E. Ohnishi and H. Is›zaki). pp. 67-82, Japan sci. soc. press. Tokyo. 1990.
10. Nijhout, J. F., Williams, C. M., Control of molting and metamor- phosis in the tobacco hornworm, Manduca sexta (L.): cessazion of juvenil hormone secretion as a trigger for pupation. J. Exp. Biol, 61, 493. 1974.
11. Zhang, Y., Lu, M., Xu, Q., Studies on neurosecretory cells of the brain and suboesophageal ganglion of the oak silkworm, Antheraea pernyi. International Society for Wild Silmoths, Ed. H. Akai and M.
Kiuchi., WILD SILKMOTHS ‘89, 90’ pp, 23-34, 1991.
12. Kiuchi, M., Changes in the Hemolymph Ecdysteroid Titres During the Larval Development in Antheraea yamamai and Bombyx mori.
International Society for Wild Silmoth, Ed. H. Akai and M. Kiuchi., WILD SILKMOTH ‘91’, pp. 83-90, 1992.
13. Hanaoka, K., Ohnishi, E., Change in ecdysone titre during pupal- adult development in the silkworm, Bombyx mori. J. Insect Physi- ol. 20, 2374, 1974.
14. Parlak, O., Sakurai, S., Kaya, M., Ohtaki, T., Content and possible role of ecdysteroids in the larval ovary of the silkworm, Bombyx mori. Invertebrate Reproduction and Development, 21: 1, pp, 1-6 1992
