Preimplantasyon HLA tiplendirmesinde 7 yıllık deneyim:327 siklusun klinik sonuçları
Semra Kahraman a, Cagri Beyazyurek b, Cumhur Gokhan Ekmekci b a In Vitro Fertilisation Unit, Istanbul Memorial Hospital
b Reproductive Genetics Laboratory, Istanbul Memorial Hospital, Reproductive BioMedicine Online (2011) 23, 363– 371
Giriş:
Tek gen bozukluğu ile giden hastalıklara karşı PGD ile birlikte HLA tiplendirmesi 2001 yılından beri uygulanan bir yöntemdir. Bu teknik çiftlerin yalnızca sağlıklı bir çocuğa sahip olmalarını sağlamakla kalmayıp kök hücre transplantasyonu için potensiyel bir donör seçimi yapmayı da sağlamaktadır.
Mutasyon analizi olmadan yapılan HLA tiplendirmesi ALL, AML gibi tedavide allogenik kemik iliği transplantasyonunun kullanıldığı genetik bozukluklar için donör seçimi için kullanılır. HLA tiplendirmesi yapılmış donörden alınan kordon kanı kök hücre transplantasyonuna alternatif donörlerden alınanlara göre daha başarılıdır.
Çiflerin çoğu fertil olduğu halde HLA tiplendirmesi yapmak için ART teknolojisine gereksinim vardır.ART'de başarı şansı kadının yaşına ve over rezervine bağlıdır. Kromozom bozukluklarında HLA tiplendirmesinin başarı şansı %25(1/4), tek gen bozukluklarında HLA tiplendirmesi ile birlikte mutasyon analizinin başarı şansı %18(3/16) dolaylarındadır.
Bu çalışmanın amacı HLA tiplendirmesi +/- mutasyon analizi yapılmış 327 siklusta maternal yaş ve ovaryan rezerv gibi parametrelerin klinik sonuçlarına etkisini araştırmaktır.
Materyal – Metod:
Çalışmaya 2003-2008 yılları arasında yapılan ART sikluslarından kromozomal bozukluklar için 35 çifte yapılan HLA tiplendirmesi, 136 çift için yapılan HLA tiplendirmesi + mutasyon analizi alındı.
ART ,için başvuran çiftlerden 166'sının 1, 5 çiftin ise 2 adet kök hücre transplantasyonu için aday hasta çocukları bulunmaktaydı. Çiflere ortalama 1-9 arasında siklus uygulandı.(171 çiftten 91'ine 1, 43'üne 2, 18'ine 3, 7'sine 4 ve 12 'sine 5'ten fazla siklus uygulandı.)
Preklinik hazırlık ve PGD çalışması
HLA tiplendirmesinden önce anne, baba, çocuk ve diğer aile biraylerinden haplotip analizi yapıldı.
Genomik DNA'dan 50 farklı marker çalışılıp, HLA A,B,C,DR,DQ(HLA sınıf 1,2,3) bölgelerinden heterozigot markerlar PGD ile çalışıldı. 7 yıllık çalışma kullanılan yöntemlere (tek hücre lizisi, mutasyon analizi, PCR, PGD) göre 2 ayrı perioda ayrıldı.
PCR reaksiyonu ve mutasyon analizi
1.periodda alkalen lizis metodu, 2. periodda protein kinaz K metodu kullanıldı. İki periodda kullanılan yöntemler farklı olmasına rağmen DNA zincir kırıcı reaksiyonlar aynı yöntemlerle yapılmıştır. İlk olarak multiplex PCR yöntemiyle simultane HLA amplifikasyonu yapılarak mutasyon markerları bakılmış, ardından single-plex PCR yöntemi uygulanmıştır. Kullanılan PCR yöntemi daha önce rapor edilmiştir.
2003-2008 yılları arasında mutasyon analizi minisequence yöntemiyle yapılmış, 2008'den sonra restriksiyon enzim reaksiyonu ve subsequent poliacrilamid jel elektroforezi kullanılmıştır. 2009'dan sonra her iki yöntem de ytgylanmıştır.
IVF ve embriyo biopsi prosedürü
GnRH analog supresyon (short-long) veya GnRH antagonist protokol ve HMG/rFSH ovaryan stimülasyon için kullanılan protokollerdi. 10000 IU hCG enjeksiyonundan 36 saat sonra TV-USG eşliğinde ovum pick -up(OPU) yapıldı. OPU'dan 3+/-1 saat sonra çevredeki kumulus hücreleri uzaklaştırıldı. Metafaz-2 oositlere ICSI uygulandı. 2003-2005 yılları arasında G1-G3 medyumu (Vitrolife) kullanılırken, 2005-2009 yılları arasında potasyumlu Life-Global medyumu kullanıldı.
Klivajdaki embriyolardan 1 blastomer alınarak lazer ile açıldı. Embriyolara zarar vermemek için başka blastomer biopsisi yapılmadı. Embriyo transferi 4. veya 5. gün yapıldı. 2009'dan sonra ayrıca trofoektoderm doku biopsisi yapıldı. 3. günde zona pellucida'ya delik açılarak yapılan biopsi alındı.
Fertilizasyonun 5. gününde inner hücre tabakasına zarar vermeden 2-5 hücre alınıp tanı
konulduktan sonra embriyolar 5.-6. günde yeniden yerleştirildi. 12. günde bhCG bakıldı ve USG ile klinik gebelik tanısı konuldu.
Sonuçlar:
Çalışmada 136 çifte mutasyon analizi + HLA tiplendirilmesi yapılmış 262 siklus, 36 çifte yalnızca HLA tiplendirilmesi yapılmış 65 siklus dahil edildi. 1.gruptaki 262 siklusa yapılan 166 embriyo transferinden(%63.4), 60 klinik gebelik(%36.1),51 canlı doğum oldu. Bu bebeklerin kordon kanlarından kök hücre transplantasyonu ile 19 hasta çocuk tedavi edildi.(Tablo 1)
2.gruptaki sikluslardan %78'ine embriyo transferi yapıldı. %30.4 oranındaki klinik gebelikten 10 tane canlı doğum gerçekleşti. Bunlardan yapılan kök hücre transplantasyonunu 2 hasta çocuk için kür oldu.
Totalde 2989 blastomere biopsi yapıldı ve 2741'ine(%92) tanı konuldu. 1. grupta %17.9
embriyonun HLA tiplendirmesi bozuk bulundu. Bunların %4.6'sında serbest mutasyon saptandı,
%7.9'u taşıyıcı, %4.9'u hasta olarak bulundu.(Tablo 2) 2. grupta %16.3 embriyo HLA'sı bozuk bulundu.(Tablo 2)
212 siklusun 74'ünde klinik gebelik oldu.(%34.9)(6 gebelik halen devam ediyor.) 52 doğumdan HLA uyumlu 59 sağlıklı bebek dünyaya geldi. Kemik iliği transplantasyonu ve kordon kanından kök hücre nakli ile 21 hasta çocuk tedavi oldu, 23 hasta çocuk donörlerinin uygun kiloya gelmesi ve kök hücrelerin olgunlaşmasını bekliyor.
Maternal yaş ve over rezervinin klinik sonuçlara etkisini değerlendirmek için hastalar <38 yaş ve
>38 yaş olarak iki gruba ayrıldı. 1. grupta beklendiği gibi toplanan oosit sayısı, matür oosit sayısı ve klinik gebelik oranları <38 yaş grubunda anlamlı olarak fazlaydı. ET yapılan siklus sayısı ve
gebelik kaybı oranları ise 2. grupta fazlaydı.(Tablo 3)
Ayrıca gruplar sikluslarda alınan kumulus oosit komplexi(COC) sayısına göre 4 ayrı alt gruba ayrıldı.(<5, 5-10, 10-20, >20) Maternal yaş, biopsi yapılan embriyo sayısı, ET yapılan siklus ve ET sayısında anlamlı fark bulunurken, klinik gebelik ve implantasyon oranlarında fark bulunmamıştır.
(Tablo 3)
Tartışma:
Tek gen bozukluğu ile giden hastalıklara karşı PGD ile birlikte HLA tiplendirmesi 2001 yılından beri uygulanan bir yöntemdir. Bu teknik çiftlerin yalnızca sağlıklı bir çocuğa sahip olmalarını sağlamakla kalmayıp kök hücre transplantasyonu için potensiyel bir donör seçimi yapmayı da sağlamaktadır.
Mutasyon analizi olmadan yapılan HLA tiplendirmesi ALL, AML gibi tedavide allogenik kemik iliği transplantasyonunun kullanıldığı genetik bozukluklar için donör seçimi için kullanılır. HLA tiplendirmesi yapılmış donörden alınan kordon kanı kök hücre transplantasyonuna alternatif donörlerden alınanlara göre daha başarılıdır.
Verilere göre bir kez mutasyonsuz ve HLA tiplendirmesine göre normal embriyo bulunduğu zaman maternal yaş ve over rezervi uygunsa anlamlı klinik gebelik oranları beklenebilir. Sonuçlar
preeimplantasyon HLA tiplendirmesinin prognozu kötü genetik hastalıklara sahip çocuklar için kullanılabilecek efektif bir yöntem olduğunu göstermiştir.
