FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
PCR ENHANCER OLARAK YENİ KİMYASALLARIN KULLANABİLİRLİĞİNİN ARAŞTIRILMASI
Sema BİLGİN Yüksek Lisans Tezi Kimya Anabilim Dalı Doç. Dr. İsa GÖKÇE
2008 Her hakkı saklıdır
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ KİMYA ANABİLİM DALI
YÜKSEK LİSANS TEZİ
PCR ENHANCER OLARAK YENİ KİMYASALLARIN
KULLANABİLİRLİĞİNİN ARAŞTIRILMASI
Sema BİLGİN
TOKAT 2008
Lisans tezi olarak kabul edilmiştir.
Başkan: Doç. Dr. Mahfuz ELMASTAŞ İmza: Üye : Doç. Dr. İsa GÖKÇE İmza: Üye : Yrd. Doç. Dr. İskender PARMAKSIZ İmza:
Yukarıdaki sonucu onaylarım
Prof. Dr. Metin YILDIRIM Enstitü Müdürü
Tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu tezin yazılmasında bilimsel ahlak kurallarına uyulduğunu, başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunulduğunu, tezin içerdiği yenilik ve sonuçların başka bir yerden alınmadığını, kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapılmadığını, tezin herhangi bir kısmının bu üniversite veya başka bir üniversitedeki başka bir tez çalışması olarak sunulmadığını beyan ederim.
i
Yüksek Lisans Tezi
PCR ENHANCER OLARAK YENİ KİMYASALLARIN KULLANABİLİRLİĞİNİN ARAŞTIRILMASI
Sema BİLGİN Gaziosmanpaşa Üniversitesi
Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı Danışman: Doç. Dr. İsa GÖKÇE
Moleküler biyoloji alanında önemli yer tutan ve bir in vitro DNA parçaları çoğaltma metodu olan Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) geniş uygulama alanına sahip bir tekniktir. PCR, DNA’nın istenilen bir parçasını çoğaltmada duyarlı, seçici ve son derece hızlı bir yol sağlayan çok gelişmiş bir teknik olmasına rağmen genelde düşük verim ve spesifite problemleriyle sıkça karşılaşılır. Böyle problemli PCR reaksiyonlarının optimizasyonu için yaygın bir yaklaşım, reaksiyon karışımına bazı kimyasalların küçük miktarlarının ilavesidir. Yapılan bu çalışmayla, PCR’ın verimini ve spesifitesini artırmada etkili olan PCR enhancerlarından oluşan bir enhancer kombinasyonu oluşturularak bu kombinasyonun değişik parametrelerde nasıl etkinlik gösterdiği, hangi şartlarda etkin bir PCR enhancer olarak kullanılabileceği ortaya konulmaya çalışıldı. Yapılan bu çalışmayla, son yıllarda genetik ve moleküler biyolojide en fazla kullanılan tekniklerden olan PCR’ın verimini ve spesifitesini arttırmayla, moleküler biyolojik teşhise yönelik amaçlar için ticari enhancerlara alternatif daha ekonomik enhancer kombinasyonlarının oluşturulması hedeflendi.
2008, 75 sayfa
ii Master Thesis
INVESTIGATION OF NEW CHEMICALS AS ENHANCERS OF PCR
Sema BİLGİN Gaziosmanpaşa University
Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Cemistry
Supervisor: Assoc. Prof. Dr. İsa GÖKÇE
The polymerase chain reaction (PCR) is an in vitro DNA fragment amplification method that has an important place in molecular biology and it is highly versatile process. PCR is an effective, very fast and selective method for required DNA fragment amplification but usually it encounters with low yield and specificity problems. The most common way of optimisation of these PCR reactions is to add very little amount of some chemicals into the reaction mix. In this work, effective enhancer combinations formed for increasing yield and specificity of PCR and it has been tried to reveal to fact that how efficient these combinations in different parameters and in what conditions they can be used as an effective PCR enhancer. In this study it is aimed to achieve to obtain alternative economic enhancer combinations for molecular biologic diagnosis by increasing yield and specificity of PCR that recently become one of the most commonly used technique in genetics and molecular biology.
2008, 75 pages
iii
Öncelikle her zaman her konuda yanımda olan bana güç veren sevgili aileme ve çalışmam süresince bilgi ve tecrübesiyle bana rehberlik eden saygıdeğer hocam Doç. Dr. İsa GÖKÇE’ye, deneysel çalışmalarım süresince laboratuarlarını bana açan sayın Doç. Dr. Şaban Tekin ve grubuna, Sayın Yrd. Doç. Dr. İskender Parmaksız’a, manevi desteklerinden dolayı tüm çalışma arkadaşlarıma, lisansüstü eğitimim süresince 2210-Yurt İçi Yüksek Lisans Burs Programı çerçevesinde verdiği bursla gerek bilimsel aktivitelere katılarak gerekse zengin bir kütüphane oluşturarak kendimi yetiştirmeme maddi katkılarından dolayı TÜBİTAK’a sonsuz teşekkürler.
iv
Sayfa
ÖZET……….….i
ABSTRACT………..ii
TEŞEKKÜR……….iii
SİMGE ve KISALTMALAR DİZİNİ………...vi
ŞEKİLLER DİZİNİ………viii
TABLOLAR DİZİNİ………ix
1. GİRİŞ ………1
2. KURAMSAL TEMELLER……….3
2.1. Deoksiribonükleik Asit Yapısı Ve Özellikleri………....3
2.1.1. Pürin ve Pirimidin Bazları………...3
2.1.2. Nükleositler………..4
2.1.3. Nükleotidler………..5
2.1.4. Nükleik Asitler (DNA) ……….6
2.1.5. DNA Çift Sarmal Yapıdadır……….7
2.1.6. Nükleik Asitlerin Denatürasyonu ve Renatürasyonu………...8
2.2. DNA’nın Polimeraz Zincir Reaksiyonu İle Çoğaltılması………...8
2.2.1. Polimeraz Zincir Reaksiyonunun Oluşum Mekanizması……….9
2.2.2. PCR’nın Temel Bileşenleri……….11 2.2.2.1. Kalıp DNA………...11 2.2.2.2. Polimerazlar……….12 2.2.2.3. Primerler………..14 2.2.2.4. dNTP………15 2.2.2.5. Tamponlar ve MgCl2 ………15
2.2.3. PCR Engelleyicileri (İnhibitörleri) ve Artırıcıları………..15
2.2.4. PCR’nin İşleyişi……….18
2.3. PCR Ürünlerinin Belirlenmesi Ve Analizi………...20
2.4. PCR Optimizasyonu ve PCR ile Doğru Ürünün Çoğaltılması……….21
2.4.1. Magnezyum İyonları……….22
2.4.2. Taq DNA polimeraz konsantrasyonu………23
v
2.4.6. Nested PCR………...26
2.4.7. Sillüs sayısı ve uzunluğu………...27
2.4.8. PCR katkı maddeleri………..27
3. MATERYAL ve YÖNTEM………..30
3.1. Materyal………30
3.1.1 Kullanılan Malzemeler ve Kimyasal Maddeler………..30
3.1.2. Cihazlar………..30
3.1.3. Tampon ve Çözeltilerin Hazırlanışı………...30
3.1.3.1. 0,5 M EDTA Çözeltisi………30
3.1.3.2. 50X Tris Asetat EDTA (TAE) Tamponu………...31
3.1.3.3. 1X Tris Asetat EDTA (TAE) Tamponu………..31
3.1.3.4. Etidium Bromür………..31 3.1.3.5. 6X Bromophenol Blue………31 3.1.3.6. FSB……….31 3.1.3.7. LB ve LB Agar………...32 3.1.3.8. Primerlerin Hazırlanışı………...32 3.1.3.9. 25 mM’lık dNTP Mixin Hazırlanışı………...33
3.1.3.10. Kalıp DNA’nın Hazırlanışı………...33
3.1.3.11. Enhancer Çözeltilerinin Hazırlanışı……….33
3.2. Yöntem……….34
3.2.1 Hücre kültürü ve Transformasyon……….35
3.2.2. Kalıp DNA’nın üretimi ve izolasyonu ………..36
3.2.3. Polimeraz Zincir Reaksiyonları………....37
3.2.3.1. Thermal Cycler’ın Program Ayarı……….41
3.2.4. Agaroz Jel Elektroforezi………...42
4. BULGULAR ve TARTIŞMA………...43
5. SONUÇ………...70
KAYNAKLAR………...73
vi g Gram L Litre M Molar o Derece o C Santigrat Derece s Saniye Kısaltmalar Açıklama µl Mikrolitre µM Mikromolar A Adenin
AIDS Kazanılmış immün yetmezlik sendromu
AP-PCR Arbitrarily Primed PCR
Ark. Arkadaşları
AT Adenin timin
bç Baz Çifti
BSA “Bovine” (sığır) serum albümin
C Sitozin
C-2 İkinci karbon
cDNA Komplamenter DNA
dATP Deoksiadenozin trifosfat
dCTP Deoksisitidin trifosfat
ddH2O Deiyonize destile su (ultra saf su)
dGTP Deoksiguanozin trifosfat
dk Dakika
DMSO Dimetilsülfoksit
DNA Deoksiribonükleik Asit
dNTP Deoksiribonükleosid Trifosfat
dsDNA Çift zincirli DNA
DTT Ditiotrietol
dTTP Deoksitimidin trifosfat
vii GC Guanin Sitozin kb Kilobaz mA Miliamper mg Miligram MgCl2 Magnezyum klorür ml Mililitre mm Milimetre mM Milimolar nm Nanometre nmol Nanomol
OD260 260 nm’deki optik dansite
PAGE Poliakrilamid jel elektroforezi
PCR Polimeraz Zincir Reaksiyonu
Pfu Pyroccoccus furiosus
pmol Pikomol
RAPD Random Amplified Polymorphic DNA
RNA Ribonükleik Asit
RNase Ribonükleaz
rpm Rotation Per Minute
RT-PCR Reverse Transkripsiyon Polimeraz Zincir
Reaksiyonu
SDS Sodyum dodesil sülfat
ssDNA Tek zincirli DNA
T Timin
TAE Tris-Asetat EDTA
TE Tris-EDTA
Tm Erime sıcaklığı (melting temperature)
TMAC Tetrametilamonyum klorid
UV Ultraviyole
v/v Hacim/hacim
viii
Şekil Sayfa
Şekil 2.1. Pürin ve pirimidin bazlarının kimyasal yapısı………3
Şekil 2.2. Nükleositlerin kimyasal yapısı………4
Şekil 2. 3. Nükleotitlerin kimyasal yapısı………...5
Şekil 2.4. DNA’nın kimyasal yapısı………...6
Şekil 2.5. DNA’nın yapısı………...7
Şekil 2.6. PCR’ın oluşum mekanizması………10
Şekil 2.7. PCR sıcaklık döngüleri:1.aşama:denatürasyon; 2.aşama:primerin bağlanması; 3.aşama:sentez………..19
Şekil 2.8. Q solutionın polimeraz zincir reaksiyonu üzerine etkileri………29
Şekil 4.1. Test edilen compatible solutelerin kimyasal yapıları………46
Şekil 4.2. Test edilen düşük moleküler ağırlıklı amitlerin kimyasal yapıları………...48
Şekil 4.3. Test edilen düşük moleküler ağırlıklı sülfonların kimyasal yapıları………51
Şekil 4.4. Test edilen sülfoksitlerin kimyasal yapıları………..53
Şekil.4.5. 50°C’lik annealing sıcaklığında gerçekleştirilen klasik PCR ürünlerinin agaroz jelelektroforezi sonrası UV transilüminatörden elde edilen görüntüsü………59
Şekil 4.6. 55°C’lik annealing sıcaklığında gerçekleştirilen klasik PCR ürünlerinin agaroz jel elektroforezi sonrası UV transilüminatörden elde edilen görüntüsü…………...60
Şekil 4.7. 55°C’lik annealing sıcaklığında gerçekleştirilen Touch Down PCR ürünlerinin agaroz jel elektroforezi sonrası UV transilüminatörden elde edilen görüntüsü……61
Şekil 4.8. 50°C’lik annealing sıcaklığında gerçekleştirilen klasik PCR ürünlerinin agaroz jel elektroforezi sonrası UV transilüminatörden elde edilen görüntüsü…………...62
Şekil 4.9. 55°C’lik annealing sıcaklığında gerçekleştirilen klasik PCR ürünlerinin agaroz jel elektroforezi sonrası UV transilüminatörden elde edilen görüntüsü…………...63
Şekil.4.10. 55°C’lik annealing sıcaklığında gerçekleştirilen Touch Down PCR ürünlerinin agaroz jel elektroforezi sonrası UV transilüminatörden elde edilen görüntüsü…..65
Şekil 4.11. 55°C’lik annealing sıcaklığında kalıp olarak plazmit DNA saflaştırılmaksızın doğrudan e.coli kullanılarak gerçekleştirilen Touch Down PCR ürünlerinin agaroz jel elektroforezi sonrası UV transilüminatörden elde edilen görüntüsü….66 Şekil 4.12. Çalışmamızda test edilen enhancerların kimyasal yapıları………....68
ix
Tablo Sayfa
Tablo 2.1. Termostabil DNA polimerazlar ve kaynakları………...13
Tablo 2.2. PCR’da sıklıkla kullanılan DNA polimerazların özellikleri………..13
Tablo 2.3. PCR artırıcıları………..18
Tablo 2.4. PCR optimizasyonunda önemli değişkenler……….21
Tablo 3.1. Polimeraz Zincir Reaksiyonlarında kullanılan enhancer konsantrasyonları ve hacimleri………..39
Tablo 3.2. Polimeraz Zincir Reaksiyonlarında kullanılan enhancer kombinasyonlarının bileşenleri………..40
Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR), spesifik bir DNA parçasının kopyalarının primerler tarafından yönlendirilerek, enzimatik olarak sentezlenmesi şeklinde tanımlanan in vitro bir yöntemdir. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR), DNA’nın istenilen bir dizisini çoğaltmada duyarlı, seçici ve son derece hızlı bir yol sağlar. Moleküler biyoloji alanında önemli yer tutan ve bir in vitro nükleik asit çoğaltma metodu olan Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) geniş uygulama alanı olan bir tekniktir. PCR’ın kullanım alanları, (1) orak hücre anemisi, AIDS, lösemi vb. birçok hastalığın DNA ve RNA temeline dayalı tanısı için klinik tıpta; (2) Klinik örneklerde patojen organizmaların saptanmasında; (3) Doğadaki çeşitli canlı türlerinin tanısı, türler arasındaki polimorfizmin belirlenmesinde; (4) Allelik dizi varyasyonlarının gösterilebilmesi ile doku transplantasyonu için doku tipinin belirlenmesinde; (5) Arkeolojik örnekler kullanılarak evrimin incelenmesi alanlarında; (6) Kalıtsal hastalıklarda taşıyıcının ve hastanın tanısında; (7) Adli tıp örneklerinin genetik tiplendirilmesinde; (7) Probe'ların oluşturulmasında/klonlamada/gen expresyon araştırmalarında; (8) DNA dizi analizinde, büyük miktarda DNA örneklerinin oluşturulmasında; (9) Tarımda tohum saflığının belirlenmesinde kullanılabilir. Kısacası, PCR, çok geniş kullanım alanı olan ve modern genetikte çok yönlü kullanılabilen tekniklerden biridir.
PCR çok gelişmiş bir teknik olmasına rağmen, PCR ile DNA amplifikasyonunda, özellikle hedef dizinin veya primerin GC muhtevası yüksek olduğunda düşük verim ve spesifite problemleriyle sıkça karşılaşılır ve bu durum ya PCR ürününün oluşmaması veya birden fazla fragmentin ortaya çıkmasına yol açar. Böyle reksiyonların optimizasyonu için yaygın bir yaklaşım, reaksiyon karışımına dimetilsülfoksit (DMSO), betaine, polyethylene glycol ve formamit gibi belirli organik kimyasalların küçük miktarlarının ilavesidir. Betaine, dimetil sülfoksit gibi küçük sülfoksitler, formamit gibi küçük amidler ya da β-merkaptoetanol gibi indirgeyici bileşikler son yıllarda kullanılan en önemli PCR arttırıcı katkı maddeleri (enhancerlar) olmakla beraber yüksek işlem hacimli deneyler için yeterince etkin değillerdir. Q-solution gibi ticari enhancerlar yukarıda sözü edilen enhancerlara göre daha etkin sonuçlar verirler ancak maliyetlerinin
yüksek olması, kimyasal bileşimlerinin tam olarak bilinememesi gibi başlıca iki dezavantaja sahiptirler (Ralser ve ark., 2006).
Bu çalışmada, GC’ce zengin kalıpların ya da problemli PCR ürünlerinin amplifikasyonunun optimizasyonunda etkili olan PCR arttırıcı bileşiklerin (enhancerların) değişik parametrelerde nasıl etkinlik gösterdiği, hangi şartlarda etkin bir PCR enhancer olarak kullanılabileceği ortaya konulmaya çalışıldı. Bu kapsamda, projemizde yapılan çalışmalar ile önce, literatür çalışması yapılarak enhancer olma (PCR’da amplifikasyonu etkili bir şekilde artırabilme) potansiyeline sahip olan kimyasal maddeler belirlendi ve bunlar içinden amacımıza uygun olanlar seçildikten sonra standart PCR reaksiyonları için optimum şartlarda bu kimyasalların çeşitli kombinasyonlarının enhancer olarak kullanılabilirliği araştırıldı.
Çalışmamız son yıllarda genetik ve moleküler biyolojide en fazla kullanılan tekniklerden olan PCR’ın verimini ve spesifitesini arttırmaya yönelik çalışmalara katkıda bulunacak olması ayrıca Q-çözeltisi (Q-solution) gibi ticari enhancerlara alternatif olarak kullanılabilecek daha ekonomik enhancerların tespit edilmesi yönüyle önem taşımaktadır.
2.1. Deoksiribonükleik Asit Yapısı ve Özellikleri 2.1.1. Pürin ve Pirimidin Bazları
DNA’da başlıca iki sınıf baz vardır: Pürin ve pirimidin bazları. Bütün bazlar pürin ve primidin türevleridir.
Pürin ve pirimidin bazlarının her ikisi de aromatik karakterdedir. Pürin, bir pirimidin ve ona bitişik bir imidazol halkasından oluştuğundan pirimidin türevi olarak da düşünülebilir. Nükleotitlerde en çok bulunan azotlu bazlar; urasil, timin ve sitozin pirimidinleri ile adenin ve guanin pürinleridir (Keha ve Küfrevioğlu, 2004).
N N N H N NH2 NH N N H N O NH2 N N H NH2 O NH N H O O NH N H O O Adenin Guanin
Sitosin Timin Urasil
2.1.2. Nükleositler
Pürin ve pirimidin bazlarının, bir 2-deoksi-D-riboza bağlanmasıyla nükleositler oluşur. Bir nükleositte pentozun anomerik 1 no’lu karbonu, primidinin 1 no’lu, pürinin ise 9 nolu azotuna N-glikozid bağı ile bağlanmıştır (Keha ve Küfrevioğlu, 2004).
Başlıca deoksiribonükleositler deoksiadenozin, deoksiguanozin, deoksitimidin ve deoksisitidindir. N N N N NH2 O H OH H H H H HO NH N N O N H 2 N O H OH H H H H HO Deoksiadenozin Deoksiguanozin O H OH H H H H HO N N NH2 O O H OH H H H H HO N NH O O Deoksisitidin Deoksitimidin
2.1.3. Nükleotidler
Nükleotidler, nükleositlerin fosfat esterleridir. Biyolojik sistemlerde en yaygın olan ve DNA’da bulunan esterleşme 5 nolu karbon atomu üzerindedir. Böyle bir bileşik 5’-nükleotid olarak gösterilir. Üstlü sayı pentoz şekerindeki bir karbon atomunu belirler. Üstsüz sayı ise, pürin ve pirimidin bazlarının halka atomlarından birisine işaret eder.
N N N N NH2 O H OH H H H H O P -O O -O NH N N O NH2 N O H H H H H OH O P -O O O -Deoksiadenilat Deoksiguanilat N NH2 O N O H OH H H H H O P -O O -O Deoksisitidilat NH O O N O H OH H H H H O P -O O -O Deoksitimidilat
2.1.4. Nükleik Asitler (DNA)
DNA deoksiribonükleotitlerin kovalent bağlanmış zincirlerinden meydana gelmiştir. Zincirler, bir nükleotidin 5’hidroksil grubu ile bunu takip eden nükleotidin 3’-hidroksil grubu arasında fosfodiester köprüsü ile oluşturulur. Nükleik asit zincirinde 5’ ve 3’ uçları bulunur. Bu zincirlerin baz dizlişleri verilirken 5’→3’ yönü kullanılır (Keha ve Küfrevioğlu, 2004). O H O H H H H P O O OH Baz CH2 O P O HO O H O H H H H P O O OH Baz CH2 CH2 O H O H H H H Baz DNA
2.1.5. DNA Çift Sarmal Yapıdadır
Birbirini izleyen deoksiriboz ve fosfat gruplarının hidrofilik omurgası dış yüzeyde olup, yapıyı çevreleyen suyla ilişkidedir. Her bir deoksiribozun furanoz halkası, C-2’ iç taraf yapısındadır. Her bir iplikçiğin pürin ve pirimidin bazları çift sarmalın iç tarafına yığılmıştır. Ayrıca hemen hemen düzlemsel ve hidrofobik olan halkasal yapılar birbirine çok yakın ve uzun eksene dik pozisyondadır (Nelson ve Cox, 2005).
DNA ikili sarmalı, nonpolar iç bölgedeki baz çiftlerinin etkileşimi sonucu oluşan hidrofobik ilişkilerle stabilize edilir. Hidrojen bağları, doğru baz çiftleşmesinin oluşumunun yanında DNA kararlılığına da katkıda bulunurlar. Stabilizasyonda ayrıca katyonik ilişkiler ve bazlar arasında van der Waals etkileşimleri de önemlidirler. DNA stabilitesi, sahip olduğu GC baz miktarından etkilenir. GC baz eşleşmesi, AT eşleşmelerinden farklı olarak iki yerine üç hidrojen bağı ile gerçekleştirildiğinden GC bakımından zengin bölgeler daha kararlıdır (Topçu, 2007).
DNA omurgasının fosfatları negatif yüklere sahip olduklarından birbirlerini iterler. Bu durum DNA kararlılığını azaltıcı bir olgudur. Yüksek tuz konsantrasyonu bu etkiden kaynaklanan kararsızlığı azaltır. Etidyum bromid gibi hidrofobik, planar yapıdaki moleküller DNA sarmalının merkezindeki baz çiftlerinin arasına girerek heliksin genişlemesine neden olurlar (Topçu, 2007).
Şekil 2.5. DNA’nın yapısı
2.1.6. Nükleik Asitlerin Denatürasyonu ve Renatürasyonu
İkili sarmal DNA’nın denatürasyonu sonucu H-bağları kopar, çiftli yapı çözülür ve zincirler birbirinden ayrılır. Ancak, kovalent bağlar kırılmaz. Isı ya da kimyasal yolla uyarılabilen zincirlerin ayrılması sırasında DNA’nın akışkanlığı azalır, UV absorpsiyonu ve denge yoğunluğu artar. Isı sonucu oluşan denatürasyona bazen erime (melting) denir. Isıtılan DNA çözeltisinin UV absorpsiyonundaki artış, hiperkromik kayma olarak adlandırılır ve ölçümü çok kolaydır (Klug ve Cummıngs, 2003).
G≡C baz çifti, A=T’ye göre bir fazla hidrojen bağı içeriğinden, ısıya karşı daha dayanıklıdır. Bu nedenle, A=T’ye göre daha fazla G≡C çifti içeren DNA’ların tamamen denatüre olması için daha yüksek sıcaklıklar gereklidir. Eğer erime sırasında, DNA’nın 260 nm’deki absorpsiyonu (OD260) izlenir ve sıcaklığa karşı grafiğe geçirilse, bir erime profili elde edilir. Bu profilin ya da eğrinin orta noktasına erime sıcaklığı (Tm) denir ve DNA zincirinin %50’sinin açılmış ya da denatüre olduğu noktayı gösterir. Eğrinin platosu maksimum optik yoğunluğa (O.D) ulaştığında, denatürasyon tamamlanmıştır ve ortamda sadece iki tek zincir bulunmaktadır (Klug ve Cummıngs, 2003).
Isı ile denatüre edilen DNA yavaşça soğutulursa, tamamlayıcı zincirler arasındaki rastgele çarpışmalar sonucu zincirler tekrar bir araya gelir. Uygun sıcaklıkta, zincirlerin ikili yapısını kazanmasını sağlayacak şekilde hidrojen bağları tekrar kurulur. Soğuma zamanıyla birlikte oluşan ikili sarmal sayısı artacaktır. Duruma göre, ikili sarmal oluşumu için bazlar arasında tam bir uygunluk gerekli değildir, ancak bir araya gelen zincirlerde, en azından yer yer baz eşleşmesinin olduğu bölgeler bulunmalıdır (Klug ve Cummıngs, 2003).
2.2.DNA’nın Polimeraz Zincir Reaksiyonu İle Çoğaltılması
Hücrelerde DNA doğal olarak, replikasyon ile çoğalır. DNA çift sarmalında birbirinden ayrılan ipliklerin tamamlayıcıları sentezlenerek bir DNA molekülünden onunla aynı olan iki yavru molekül meydana gelir. Buna göre de hücre bölünmesiyle yeni oluşan hücrelere tüm genler aynen geçerler. Her yeni hücre jenerasyonunda genlerin kopya sayılarının iki katına çıkması nedeniyle jenerasyonlar boyunca DNA miktarı başlangıca
göre üssel olarak artar. Örneğin 30 jenerasyon sonra hücre ve gen sayısında milyarlarca kez artış olur. In vitro koşullarda istenilen bir genin ya da özgün bir DNA dizisinin çok sayıda kopyasının elde edilmesi için rekombinant DNA yöntemleri ile DNA klonlamasına ek olarak, 1980’li yıllardan itibaren Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) da kullanılmaya başlanmıştır (Temizkan ve Arda, 2004).
PCR ilk kez Kaliforniya’da Berkeley yakınlarında, Cetus Firmasında çalışan Kary Mullis tarafından 1985 yılında icat edilmiştir. İlk PCR’da E.coli DNA polimeraz I’in Klenow fragmanı kullanılmıştır (Mullis,1990). Bu enzim, DNA dupleksinin denatüre olduğu ısıya erişmeden denatüre olup aktivitesini kaybediyordu. Bu nedenle her döngüde reaksiyon ortamına ilave ediliyordu. Ayrıca, reaksiyon ortamı, işlemler için gerekli olan farklı ısılarda su banyoları arasında dolaştırılıyordu. Bu şekilde yapılan PCR reaksiyonu son derece zahmetliydi. Daha sonra iki önemli aşama kaydedildi: 1. Isıya dayanıklı bir DNA polimeraz, Yellowstone Ulusal Parkındaki bir sıcak su kaynağından izole edilen Thermus aquaticus bakterisinden elde edildi. Bu bakteri 85°C’nin üstündeki bir sıcaklıkta kendi DNA’sını replike etmekteydi. 2. Otomatik ısı kontrollü, ısıyı çok süratle azaltıp, artırabilen cihazlar yapıldı (İşcan, 2003).
PCR ile istenilen genlerin ya da DNA dizilerinin jenerasyonlara bağlı replikasyonu, hızlandırılmış bir şekilde gerçekleştirilir. Aynen doğal hücre bölünmesinde olduğu gibi, PCR replikasyon sürecini taklit ederek yaklaşık 30 jenerasyon sonra seçilmiş bir DNA dizisinin aşağı yukarı milyar katını kopyalar (Temizkan ve Arda, 2004).
2.2.1. Polimeraz Zincir Reaksiyonunun Oluşum Mekanizması
Polimeraz zincir reaksiyonu çift iplikli bir DNA molekülünde hedef dizilere iki oligonükleotid primerin bağlanması ve uzaması esasına dayanır. Amplimer olarak da adlandırılan oligonükleotid primerler, kalıp DNA molekülü yüksek sıcaklık derecelerinde denatüre edildikten sonra, tek iplikli DNA molekülleri üzerinde kendilerine tamamlayıcı olan bölgelerle melezlenirler. Primerlerin spesifik olarak hedef dizilere bağlanması düşük sıcaklık derecelerinde gerçekleşir. DNA polimeraz enzimi, uygun tampon ve dört çeşit deoksiribonükleozid trifosfat (dNTP) varlığında primerin 3’ hidroksil ucundan uzamasını sağlar. Böylece kalıp DNA ipliğine tamamlayıcı olan yeni
DNA molekülü sentezlenmiş olur. Bir PCR döngüsü denatürasyon, primerin bağlanması (annealing) ve primerlerin uzatılması (extension) olarak adlandırılan üç aşamadan oluşur. Ardarda tekrarlanan denatürasyon, primerlerin bağlanması ve primerlerin uzaması evreleriyle DNA parçaları üssel olarak artar. Bu üssel artışın nedeni, bir döngü sonucu sentezlenen ürünün, ardışık döngüde diğer primerler için kalıp görevi yapmasıdır. Böylece her PCR döngüsü DNA molekülü üzerinde istenilen bölgenin iki katına çıkması ile sonuçlanır (Temizkan ve Arda, 2004).
Şekil 2.6. PCR’ın oluşum mekanizması
PCR: Polimeraz Zincir Reaksiyonu
1.Aşama: denatürasyon
2.Aşama: primerlerin bağlanması
3.Aşama: primerlerin uzatılması 3 aşamadan oluşan 30-40 siklüs:
94°C’de 1dakika
54°C’de 45 saniye
Sens ve Revers Primerler!!!
72°C’de 2 dk yalnızca dNTP’ler
2.2.2. PCR’nın Temel Bileşenleri
PCR’ın temel bileşenleri, kalıp olarak kullanılan DNA molekülü, DNA polimeraz enzimi, primerler, dNTP karışımı, tampon ve MgCl2’dür.
2.2.2.1. Kalıp DNA
PCR’da genomik DNA’lar, plazmid ve faj DNA’ları, çeşitli genler ve hatta herhangi bir DNA parçası kalıp olarak kullanılabilir. Bu kalıp DNA molekülleri amaca göre cDNA, genom kitaplıkları halinde, ya araştırma laboratuarları ve kliniklerden ya da ticari olarak elde edilir (Temizkan ve Arda, 2004).
Kalıp olarak kullanılacak DNA temiz olmak zorunda değildir. Kurumuş kan veya semen gibi adli tıp örnekleri, tek bir saç teli, uzun süre saklanmış tıbbi örnekler, mumya kalıntıları ve fosil gibi değişik kaynaklardan, genomik DNA elde edilebilir (İşcan, 2003).
PCR’de kalıp olarak tek ya da çift iplikli DNA’nın yanı sıra RNA’da kullanılabilir. Kalıp olarak RNA kullanılacaksa total RNA ya da poli (A)+ RNA’dan önce klasik yolla cDNA elde edilir ya da Thermus thermophilus kaynaklı rekombinant Tth DNA polimeraz enzimi kullanımıyla aynı tüpte RNA’dan DNA ürününün elde edilmesi tek kademeli olarak yapılabilir. Eğer yüksek molekül ağırlıklı genomik DNA kalıp olarak kullanılacaksa, DNA kısmi kesim yapan Notl ya da Sfil gibi restriksiyon enzimleriyle kesildikten sonra kullanılmalıdır. Genellikle kalıp DNA’da hedef dizinin konsantrasyonu bilinmediğinden, PCR’nın pozitif kontrol DNA ile optimizasyonu faydalıdır. Optimizasyon çalışmalarında normalde klonlanmış bir DNA parçası için nanogram, genomik DNA için ise mikrogram düzeyindeki miktarlar kullanılır (Temizkan ve Arda, 2004).
Eğer çoğaltılacak kalıp DNA dizisi hakkında bilgi mevcut değilse, bu durumda gelişigüzel başlatılmış (Arbitrarily Primed PCR (AP-PCR)) veya gelişigüzel çoğaltılmış polimorfik DNA (Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)) yöntemleri kullanılarak genomik parmak izleri çıkartılabilir (İşcan, 2003).
En iyi kalıplar, DNA sentezini durdurabilen ya da nükelotit bazlarının yanlış birleşmesine neden olabilen çentikler, kırıklar ve kontamine edici proteinler içermeyen kalıplardır. Yüksek GC muhtevasına ve sekonder yapıya sahip kalıpların amplifikasyonunu optimize etmek oldukça zordur (Buckingham ve Flaws, 2007).
2.2.2.2. Polimerazlar
DNA polimeraz enzimleri, kalıp ipliğe tamamlayıcı bir DNA ipliği meydana getirmek üzere, orijinal kalıp iplikteki baz bilgisini kullanarak dört çeşit deoksiribonükleozid trifosfattan uzun polinükleotid zincirin sentezini kataliz ederler. Bu enzimler, sentezi başlatmak için kalıp moleküldeki tamamlayıcı diziye bağlanan kısa DNA parçalarına (primerlere) gerek duyarlar. Sentezin yönü 5’ uçtan 3’ uca doğru olup, primerin serbest 3’ hidroksil ucuna ortamdaki dNTP’lerin nükleofilik etki yapmalarıyla, fosfodiester bağlarının katalizi ve yeni DNA ipliğinin polimerizasyonu sağlanır (Temizkan ve Arda, 2004).
Termostabil (sıcaklığa dayanıklı) DNA polimeraz enziminin PCR’de kullanılmaya başlanması araştırma ve klinik laboratuarlarında rutin olarak yapılan deneylere teknolojik olarak büyük bir avantaj sağlamıştır. Önceleri kullanılan Escherichia coli’nin DNA polimeraz I enziminin Klenow fragmenti sıcaklığa dayanıklı olmadığı için, her PCR döngüsünde denatürasyon aşamasından sonra yeniden enzim ekleme zorunluluğu duyulmaktaydı. Ancak günümüzde kullanılan termostabil DNA polimerazlarla bu sorun ortadan kalktığından enzimin amplifikasyonun başlangıcında tüplere konulması yeterli olmaktadır (Temizkan ve Arda, 2004).
Günümüzde PCR’de yaygın bir şekilde kullanılan bazı termostabil DNA polimerazların adları ve kaynakları Tablo 2.1’de, bu enzimlerin özellikleri Tablo 2.2’de verilmiştir.
Tablo 2.1 Termostabil DNA polimerazlar ve kaynakları
DNA polimeraz Doğal/Rekombinant Kaynak
Taq Amplitaq®
Amplitaq®(Stoffel fragment) Hot TubTM PyrostaseTM VentTM Deep VentTM Tth Pfu UITmaTM Doğal Rekombinant Rekombinant Doğal Doğal Rekombinant Rekombinant Rekombinant Doğal Rekombinant Thermus aquaticus T. aquaticus T. aquaticus Thermus flavis T. flavis Thermococcus litoralis Pyrococcus GB-D Thermus thermophilus Pyrococcus furiosus Thermotoga maritima
Tablo 2.2. PCR’da sıklıkla kullanılan DNA polimerazların özellikleri Taq/ Amplitaq® Stoffel fragment Vent TM Pfu Tth UITmaTM Termostabilite-95°C’deki yarılanma ömrü (dakika) 40 80 400 >120 20 >50* 5’→3’ ekzonükleaz aktivitesi
var yok yok yok var Yok
3’→5’ ekzonükleaz aktivitesi
yok yok var var yok Var
Processivity * * 50-60 5-10 7 * * * 30-40 * * * Kalıbı uzatma oranı
(Nükleotid/saniye)
75 >50 >80 60 >33 * * * Revers transkriptaz
aktivitesi
zayıf zayıf * * * * * * var * * * Oluşan DNA ucu 3’ A 3’ A >%95
küt
* * * 3’A Küt *97,5 °C’de ölçülmüştür. * * Enzimin DNA kalıbından ayrılmaksızın kalıba eklediği ortalama nükleotid sayısı. * * *Bilgi bulunmamaktadır.
2.2.2.3. Primerler
Gen çoğaltılması dâhil PCR’ın birçok uygulaması için kalıp DNA’ya tamamen tamamlayıcı olan primerlere gereksinim vardır. Genel olarak kullanılan kalıp ile yüksek oranda bağlanma sağlamak üzere primerler 20-30 nükleotid uzunluğundadır. Oligonükleotid primerler, primer sentezi yapan laboratuarlardan ya da ticari olarak elde edilebilirler. Primer tasarımı yapılırken çoğaltılması istenen DNA dizisinin iki ucundaki dizisi bilinen kısımlar dikkate alınır. Bu bölgelere tamamlayıcı olan primerler tasarlanır. Primer tasarımı yapmak için bilgisayar programları da geliştirilmiş olmakla beraber, çoğu zaman araştırıcılar ilgilendikleri genleri ya da DNA parçalarını çoğaltmak için kendileri primer tasarımı yapmak durumundadırlar. Tasarım yapılırken mümkün olduğunca dört bazın eşit sayıda kullanımına dikkat edilir. Primerin Tm değeri, amplifikasyon reaksiyonunun spesifitesi için kritik bir aşama olan optimal annealing sıcaklığının belirlenmesi için başlangıç noktası olarak kullanılabilir. Dolayısıyla forward ve revers primerler benzer Tm değerine sahip olacak şekilde tasarlanmalıdır ki her ikisi de aynı annealing sıcaklığında optimal olarak hibridize olabilsin. Tm primerlerin uzunlukları arttırılarak ya da kalıp üzerinde daha çok ya da daha az G ve C’lere sahip bölgelere yerleştirilerek ayarlanabilir (Buckingham ve Flaws,2007).
Sonucu olumsuz etkileyici istenmeyen oluşumları en aza indirgemek için önem verilmesi gereken bazı noktalar: primerlerin polipürün, poliprimidin ya da tekrarlı bölgeler içermemesi, primer çiftlerinin 3’ uçlarının birbirine ya da primer içindeki bir bölgeye tamamlayıcı olmaması (Temizkan ve Arda, 2004), primerin dimer oluşturmasını engellemek için 3’ ucunda G ve C’ler bulunmamasıdır (İşcan, 2003).
Spesifik bir primerin 5’ ucuna, genellikle primer annealinginin spesifitesini etkilemeyecek şekilde restriksiyon enzimi tarafından tanınacak bir diziden oluşan ‘tail’(kuyruk), bir capturing dizi ya da radyoaktif ya da radyoaktif olmayan bir etiket (label) ilave edilebilir (Lisby, 1998).
2.2.2.4. dNTP
Deoksiribonükleozid trifosfatlar (dATP,dGTP, dTTP, dCTP) yüksek saflıkta ya tek tek ya da dörtlü karışım halinde ticari olarak sağlanır. Taq DNA polimeraz düşük dNTP konsantrasyonlarında (10-100µM) kalıba uygun, doğru bazları seçmede daha başarılı olmakla birlikte, normal koşullarda PCR 100 µM dNTP konsantrasyonu ile gerçekleştirilir. Ayrıca optimal dNTP konsantrasyonu; (1) MgCl2 konsantrasyonuna, (2) reaksiyon koşullarına, (3) primer konsantarsyonuna, (4) çoğaltılmış ürünün boyuna, (5) PCR döngü sayısına bağlıdır. Yapılacak PCR için en uygun dNTP konsantrasyonu deneysel olarak belirlenmelidir (Temizkan ve Arda, 2004).
2.2.2.5. Tamponlar ve MgCl2
PCR tamponları enzim aktivitesi için optimal şartlar sağlar. KCl (20-100mM), amonyum sülfat (15-30 mM) ya da tek değerli katyonların diğer tuzları önemli tampon bileşenleridir. Bu tuzlar DNA’nın denatürasyon ve annealing sıcaklıklarını ve enzim aktivitesini etkiler. Tampon/tuz şartlarının etkisi farklı primerler ve kalıplar için değişiklik gösterir. PCR’da kullanılan çeşitli tamponlar arasında en çok kullanılanı Taq/Amplitaq enzimlerine özgü olan tampondur. Diğer enzimler için de benzeri tamponlar bulunmakta ve bunlar çoğunlukla satın alınan enzimle birlikte 10×konsantrasyonda sağlanabilmektedir. Mg+2 iyonları dNTP’ler ile çözünebilir kompleksler oluştururlar, polimeraz aktivitesini uyarırlar ve çift iplikli DNA’nın Tm değerini artırırlar, ayrıca primer/kalıp etkileşimini sağlarlar. Bu nedenle MgCl2’ün PCR’ın özgüllüğü ve ürün verimi üzerinde çok önemli bir etkisi vardır. Genellikle optimum MgCl2 konsantrasyonu olarak 1,0-1,5 mM’lık değerler tercih edilir. Düşük Mg+2 konsantrasyonu, enzim etkinliğini düşürerek ürün oluşumunda azalmaya, yüksek Mg+2 konsantrasyonu ise yanlış birleşmeleri destekleyerek spesifik olmayan ürün birikimine yol açar. MgCl2 içeren tamponlar kullanılıyorsa, ayrıca MgCl2 kullanımına gerek yoktur (Temizkan ve Arda, 2004).
2.2.3. PCR Engelleyicileri (İnhibitörleri) ve Artırıcıları.
PCR çeşitli maddeler ile engellenebildiği gibi aynı zamanda bu maddelerin kullanımıyla artırılabilir. Birçok faktör PCR’nin engellenmesine yol açar, burada sadece
optimizasyon çalışmaları için sıklıkla kullanılanlardan söz edilecektir. Çeşitli tipteki maddelerin engelleme için tehlike oluşturması PCR’de kullanılan biyolojik örneklerin çeşitliliğinden ve DNA izolasyonunda kullanılan yöntem ve maddelerden kaynaklanmaktadır. Çok sayıda değişik biyolojik örnek (hayvan dokuları ve vücut sıvıları, bakteri örnekleri, adli ve arkeolojik materyaller) PCR’de DNA kaynağı olarak kullanılır. Örneğin insan DNA’sı, periferal kan hücrelerinden, idrardan, feçesden, hücre döküntülerinden, saç kökünden, semenden, serebrospinal sıvıdan, biyopsi materyallerinden, amniyon sıvısından, plasenta ve koriyonik villus gibi değişik biyolojik kaynaklardan izole edilir. Bu doğal kaynaklar çok çeşitli bilinmeyen engelleyicileri içerirler. Bu nedenle inhibisyonun olmadığına ilişkin olarak PCR kontrolleri yapılmalıdır. DNA izolasyonu için en sık kullanılan materyallerden biri kandır. Kanın pıhtılaşmasını engellemek için EDTA’lı ya da heparinli tüpler kullanılır. Ancak heparin PCR için potansiyel bir inhibitördür. Bunun dışında kanda bulunan porfirin gibi diğer maddeler de PCR için kuvvetli inhibitör etki gösterirler, bu nedenle DNA izolasyonu sırasında lizis ve santrifüjleme aşamalarında uzaklaştırılırlar (Temizkan ve Arda, 2004).
Biyolojik örneklerin çeşitliliği nedeniyle, bu farklı kaynaklardan DNA izolasyonu yöntemleri de birbirlerinden oldukça farklıdır ve bu durum izolasyon işlemleri sırasında farklı inhibitörlerin uzaklaştırılmasını zorlaştırır. Farklı kaynaklardan da olsa DNA izolasyonu işlemlerinde hücre parçalanması ve denatürasyon için deterjanlar kullanılır. DNA izolasyonunda çoğunlukla kullanılan Triton X-100, Tween 20, Nonidet P40 gibi iyonik olmayan deterjanların %5’in altındaki konsantrasyonları genellikle PCR’yi engellemezler. Diğer yandan sodyum dodesil sülfat (SDS) gibi iyonik deterjanlar sadece son derece düşük konsantrasyonlarda kullanıldıklarında tolere edilebilirler. Bu nedenle PCR’den önce fenol ekstraksiyonu ve etanol çöktürmesi ile uzaklaştırılmalıdırlar. Bu deterjanlar normal olarak PCR’de tolere edilebildikleri konsantrasyondan daha yüksek konsantrasyonlarda kullanılırlar. Örneğin SDS %1-2 (w/v) konsantrasyonda kullanılır, ancak Taq DNA polimeraz %0,01 (w/v)’den yüksek konsantrasyonlarda inhibe olur. SDS’in düşük konsantrasyonlarının inhibitör etkisi iyonik olmayan belli deterjanların (%0,5 Tween 20 ve Nonidet P40 gibi) kullanımıyla ortadan kaldırılabilir (Temizkan ve Arda, 2004; Gelfand, 1989).
Deterjanların kullanıldığı izolasyon işlemlerinin çoğu, denatürasyona uğramış proteinleri parçalayan proteinaz K’nın varlığında gerçekleştirilir. Taq DNA polimeraz, protein yıkımına duyarlı olduğundan proteinaz K uzaklaştırılmalı ya da inhibe edilmelidir. 95°C’de termal denatürasyon bu inhibisyon için yeterlidir. Sıcaklık uygulamasını genellikle proteinaz K’yı da denatüre edecek fenol ekstraksiyonu izler. Ardışık olarak uygulanan santrifüjleme DNA’nın sıvı fazda kalmasını sağlarken, proteazı da fenol fazına ayırır. Fenolün çok düşük miktarları bile PCR’yi engelleyeceğinden, kalan fenol, kloroform: izoamil alkol (49:1) veya eter ekstraksiyonu ya da DNA’nın etanol ile çöktürülmesi ile uzaklaştırılabilir (Temizkan ve Arda, 2004).
Birçok araştırıcı çeşitli maddelerin eklenmesinin PCR etkinliği ya da özgünlüğünü artırdığını belirlemişlerdir. Bu maddelerin etkilerini nasıl gösterdikleri tam olarak belirlenmemiş olmasına rağmen, konu ile ilgili çeşitli açıklamalar vardır. Örneğin, Bovine serum albumin (10-100 µg/ml) inhibitörleri bağlar ve enzimi stabilize eder. Dithiothreitol (0.01 mM) enzim aktivitesini artırabilen indirgeyici şartlar sağlar. Reaksiyon karışımına ilave edilen formamit ( 1%-10%) yüksek sekonder yapıya sahip DNA’nın denatürasyon sıcaklığını düşürerek primerlerin bağlanma olasılığını artırır. 1%-10%’luk konsantrasyonlarda ilave edilen dimetil sülfoksit, gliserol ve triton X-100 gibi kaotropik ajanlar (chaotropic agents) sekonder yapıları azaltabilir böylece zor bölgeler boyunca polimerazın zinciri uzatmasına imkan verir. Bu ajanlar bir de enzim stabilitesine katkıda bulunurlar (Buckingham ve Flaws, 2007). Bu arttırıcı maddelerin kullanımındaki en önemli güçlük, başarılı bir sonuç almak için hangi maddenin hangi tip PCR’de kullanılacağının belirli olmamasıdır. Artırıcılar belirli bir konsantrasyonda kullanıldıklarında PCR’ı olumlu olarak etkilerler, ama aynı koşullar bir başka PCR’da aynı etkiyi göstermeyebilirler. Bu maddelerin bazıları Tablo 2.3’de verilmiştir. Bu PCR artırıcılarının (enhancerların) yüksek konsantrasyonlarının Taq DNA polimerazı inhibe ettiği düşünüldüğünden optimum konsantrasyonları deneysel olarak belirlenmelidir (Temizkan ve Arda, 2004).
Tablo 2.3. PCR artırıcıları
Madde Konsantrasyon
Formamid %5
Dimetil sülfoksit (DMSO) <%10 Tetrametilamonyum klorid (TMAC) 10-100µM Polietilen glikol 6000 (PEG) %5-15
Gliserol %10-15
Tween 20 %0.1-2.5
7 deaza-dGTP Kullanılacak toplam dGTP’nin %75’i
2.2.4. PCR’nin İşleyişi
Termostabil DNA polimerazların ve farklı sıcaklık derecelerini istenilen süreler için otomatik olarak ayarlanabilen PCR aletlerinin (thermal cycler) kullanıma sunulması, PCR’nin verimi ve kullanımında önemli gelişmelere yol açmıştır. Verimli bir PCR için; (1) denatürasyon, (2) primerlerin bağlanması, (3) primerlerin uzaması, (4) döngü sayısı, (5) PCR makinesinin sıcaklık iniş ve çıkış süreleri önemlidir (Temizkan ve Arda, 2004).
Polimeraz zincir reaksiyonu mikrotüplerde gerçekleştirilir. Amaca göre farklı PCR tüpleri ve değişik sıcaklık dereceleri kullanılabilir. PCR’de bir döngüyü oluşturan aşamaların sıcaklık değerleri ile süreleri Şekil 2.7’de verilmiştir.
PCR çift zincirli DNA ile başlar. İlk aşamada (denatürasyon aşamasında) çift zincirli DNA replike edilebilmesi için iki tek zincire denatüre edilir. Bu kalıba bağlı olarak birkaç saniyeden birkaç dakikaya kadar 94-96°C’de örnek ısıtılarak gerçekleştirilir. Başlangıç denatürasyon aşaması genomik ya da diğer büyük DNA kalıp fragmentleri için uzatılabilir. Sonraki denatürasyonlar daha kısa olabilir. Bir sonraki aşama PCR’ın spesifitesi açısından çok büyük önem taşıyan annealing aşamasıdır. Annealing sıcaklığının primerler ve reaksiyon şartları ile optimize edilmesi önemlidir. Annealing sıcaklıkları 50-70°C arasında olup genellikle deneysel olarak belirlenir. Başlangıç noktası primer dizilerinin Tm’si kullanılarak belirlenebilir. Reaksiyon şartları, tuz konsantrasyonu, yanlış eşleşmeler, kalıp durumu ve sekonder yapı reaksiyondaki primerlerin gerçek Tm’sini etkileyecektir. Primerlerin Tm değerinin hesaplanması için çeşitli formüller ve bilgisayar programları kullanılmaktadır.
Çoğu zaman hesaplanan Tm değerinin 3-5°C altındaki sıcaklıklar bağlanma sıcaklığı olarak seçilir ve daha sonra optimum sıcaklık değeri denenerek saptanır (Temizkan ve Arda, 2004).
Primerlerin uzaması aşamasında genellikle Taq/Amplitaq DNA polimerazların polimerizasyon aktivitesi için en uygun sıcaklık derecesi olan 72°C kullanılır. Uzama aşaması için çoğu zaman iki dakika yeterli olmakla birlikte, eğer uzun amplikonlar (PCR ile çoğaltılan DNA parçası) çoğaltılıyorsa süre artırılır. PCR ürünü olan tüm moleküllerde reaksiyonun tamamlanmasını garanti altına almak için son döngünün uzama süresi çoğunlukla uzun (10-15 dakika) tutulur (Temizkan ve Arda, 2004).
Toplam döngü sayısı genellikle 25-35 arasındadır. Döngü sayısının artırılması halinde istenmeyen ürünler fazlalaşırken, istenen ürünlerde herhangi bir artış meydana gelmez. Bu yüzden 40’dan fazla sayıda döngüden oluşan PCR reaksiyonları genellikle başarılı sonuçlar vermez (Temizkan ve Arda, 2004).
Şekil 2.7. PCR sıcaklık döngüleri:1. aşama: denatürasyon; 2. aşama: primerin bağlanması; 3. aşama: sentez
2.3. PCR Ürünlerinin Belirlenmesi ve Analizi
PCR ürünleri (amplikonlar) boyları primerlerle sınırlandırılmış DNA parçası ya da parçaları’dır. PCR ürünlerinin analizi ile genellikle üç çeşit bilgi edinilebilir:
(1) Hedef DNA dizisinin varlığının ve taşıdığı varyasyonun belirlenmesi
(2) Başlangıç materyali olarak kullanılan DNA ya da RNA’nın kabaca ya da kesin miktarının belirlenmesi için çoğaltılmış PCR ürününün miktarının ölçülmesi
(3) Dizi analizi
PCR tamamlandıktan sonra ürünler başka bir aşamada kullanılmadan önce, ürün kalitesi kontrol edilmelidir. Çünkü PCR bazen çeşitli nedenlerden dolayı başarılı olmayabilir. Örneğin, kullanılan DNA kaliteli değildir, seçilen primerler uygun değildir veya birden fazla tanıma dizisi vardır. Ürün doğru boyutlarda değildir. Bazen ürün oluşmuştur ancak çoğaltılacak gen uzunluğunda değildir. Bu durumda primerlerden birisi diğer primere yakın bir bölgeye yerleşmiştir ya da primerler yanlışlıkla tamamen farklı bir geni tanımıştır. Jelde birden fazla bant gözlemlenebilir, bu durumda primerlerin bazısı doğru yerlere yerleşmiştir, ancak bazıları yanlış yerleşerek, farklı dizilerin çoğaltılmasına neden olmuştur (İşcan, 2003).
Fragmante edilmiş DNA moleküllerinin ayrıştırılmasında, tanımlanmasında ve saflaştırılmasında yaygın olarak kullanılan yöntemler poliakrilamid (PAGE) ve agaroz jel elektroforezleridir (Sambrook, 1989). Bu metodların ilkesi; yapısındaki fosfat grubu nedeniyle negatif yüklere sahip olan DNA moleküllerinin elektriksel alanda pozitif elektroda doğru hareket etmesidir. Bu işlemde jel porları nedeniyle küçük DNA molekülleri daha hızlı hareket ederler. Yöntem basit olması, kısa zamanda yapılabilmesi ve yoğunluk gradienti gibi diğer yöntemlerle ayrıştırılamayan fragmanların analizine olanak sağlaması bakımından moleküler biyolojide sıklıkla kullanılmaktadır. Standart agaroz jeller genellikle PCR ürünlerinin (200 bç-50 kb büyüklüğündeki DNA moleküllerinin) analizi için yeterli ayırma gücüne sahiptir. Poliakrilamid jeller ise daha çok 5-500 bç büyüklüğündeki DNA moleküllerinin analizlerinde kullanılmaktadır (Topçu, 2007). Agaroz ya da poliakrilamid jellerde, bir flouresan boya olan ve DNA zincirlerinin arasına giren, etidyum bromür (EtBr) boyaması ile ürünler görülür. Boyamadan sonra DNA, jelde bir UV transilüminatörden yararlanılarak görülebilir hale gelir. Jelin kalıcı görünümü fotograflanarak elde edilir. Boyutu bilinen işaret DNA’lar
ve kontrol PCR ürünleri de aynı elektroforez jeline uygulanır, böylece çoğaltılmış ürünün boyutu hakkında fikir edinilir (Temizkan ve Arda, 2004).
2.4. PCR Optimizasyonu ve PCR ile Doğru Ürünün Çoğaltılması
PCR’nin etkinliği ve özgünlüğünde etkili olan çeşitli faktörler vardır. Bunlardan kalıp DNA’nın kalitesi, primer tasarımı, MgCl2 konsantrasyonu, DNA polimeraz ve tampon koşulları özellikle önemli olanlardır (Grunewald, 2003). Bu faktörlerin hepsi Tablo 2.4.’de verilmiştir.
Tablo 2.4. PCR optimizasyonunda önemli değişkenler
PCR amplifikasyonunun başarısına bağlı olarak optimize şartlara ihtiyaç duyulabilir. Test örnekleri ile paralel kontrol reaksiyonları gerçekleştirmek, herhangi bir spesifite ya da kontaminasyon problemlerinin olup olmadığını göstermek için önemlidir (McPherson and Moller, 2007). Bu nedenle her PCR uygulamasına uygun kontroller dahil edilmelidir. Pozitif kontroller enzimin aktif olduğundan, tamponun optimal olduğundan, primerlerin doğru dizilere bağlandığından ve termal cyclerın (PCR aletinin) uygun biçimde çalıştığından emin olmak için yapılmalıdır. DNA’sız bir negatif kontrol (kontaminasyon kontrolü ve reagent blank olarak da adlandırılır), reaksiyon karışımının kalıp DNA ya da önceki uygulamadan kaynaklı amplifiye edilmiş ürünlerle kontamine edilmediğinden emin olmak için kullanılmalıdır. Hedef dizinin bulunmadığı DNA kullanılarak gerçekleştirilen negatif bir kontrol (negative template control)
1. PCR’de sıcaklık profili (primerlerin bağlanması, uzama, denatürasyon, bir evreden diğerine geçiş zamanı, döngü sayısı)
2. Magnezyum iyonunun konsantrasyonu 3. Primer tasarımı ve konsantrasyonu 4. Kalıp kalitesi ve konsantrasyonu 5. PCR tamponu
6. dNTP konsantrasyonu 7. PCR arttırıcı eklenmesi 8. PCR inhibitörleri
9. “Nested” primerlerle sekonder PCR 10. “Hot-start”PCR
primerlerin DNA’nın istenmeyen dizilere bağlanmadığından emin olmak için gerçekleştirilir. Bazı PCR uygulamalarında internal kontrol gerçekleştirilir. Kontrolün bu türünde (amplifikasyon kontrolünde) primerlerin ikinci bir seti ve ilgisiz bir hedef (unrelated target), test örneği amplifiye edilmese bile reaksiyonun çalıştığını göstermek için reaksiyon karışımına ilave edilir. Özdeş bir örnek üzerinde amplifikasyon kontrolünü gerçekleştirmek kabul edilebilir olmasına rağmen, amplifikasyon kontrolleri tercihen test reaksiyonu ile aynı tüpte gerçekleştirilir. Bu tür kontrol PCR sonuçları pozitif ya da negatif olarak rapor edildiğinde ki “negatif” hedef dizilerin mevcut olmadığı anlamına gelir, çok önemlidir. Amplifikasyon kontrolü, örnek için doğru negatif ve amplifikasyon başarısızlığı (false-negatif) arasında ayrım yapmak için önemlidir (Buckingham ve Flaws, 2007).
2.4.1. Magnezyum İyonları
Magnezyum iyon konsantrasyonu PCR spesifitesi açısından önemlidir. dNTP-Mg2+ kompleksleri nükleik asitlerin şeker-fosfat omurgası ile etkileşir ve Taq DNA polimeraz aktivitesini etkiler. Bu yüzden MgCl2 konsantrasyonunun değişimi aynı şartlar altında bir diğerinden önemli ölçüde farklı davranan bir primer/template çiftine yol açabilir. Mg2+ iyon konsantrasyonunun etkisini analiz etmek için genel strateji, standart tamponu ayarlamaktır ki MgCl2 konsantrasyonu genellikle 0.5 ya da 1mM’lık aşamalarla 0.5 ve 5mM arasında değişir. Genelde konsantrasyonlardan biri, önemli ölçüde artmış PCR ürün örneği gösterecektir. Reaksiyonda dNTP’lerin konsantrasyonu değiştirildiğinde Mg2+ konsantrasyonunun değiştirilmesi gerektiği hatırlanmalıdır (McPherson ve Moller, 2007). Ayrıca enzimatik DNA sentezi için optimal Mg+2 konsantrasyonu kullanılan DNA polimerazın özellikleri tarafından belirlenir. Örneğin Taq ve Klentaq DNA polimerazlar için optimal Mg+2 konsantrasyonu sırasıyla 1,5-2 ve 3-4 mM’dır. Bu nedenle kullanılan DNA polimeraza bağlı olarak PCR karışımında doğru Mg+2 konsantrasyonunun kullanıldığından emin olmak gerekir. Çok yüksek Mg2+ konsantrasyonu, DNA polimerazın aktivitesini artırarak DNA sentezinin verimini artırırken non-spesifik ürünlerin amplifikasyonuna yol açabilir. Çok düşük Mg2+ konsantrasyonu ise PCR spesifitesini artırırken amplifikasyon veriminin düşmesine neden olacaktır (Ignatov ve ark., 2002).
2.4.2. Taq DNA polimeraz konsantrasyonu
Eğer hiç ürün bandı elde edilemediyse ya da zayıf bandlar elde edildiyse çok az Taq DNA polimeraz kullanılmış olabilir. Taq DNA polimerazın farklı versiyonları çeşitli spesifik aktivite ve konsantrasyonlarda sağlanabilir. Termostabil proofreading DNA polimerazlar Taq DNA polimerazdan daha düşük processivitye sahip olabilir ve bu nedenle başarılı amplifikasyon için daha fazla enzime ihtiyaç duyulabilir. Termostabil polimerazların yüksek sıcaklıklarda inaktive olacağını hatırlamak da önemlidir çünkü polimerazların inaktivasyonu ürün miktarının azalmasına yol açabilir. Mümkün olduğunca düşük denatürasyon sıcaklığı kullanarak 90°C’nin üzerinde enzimin geçireceği zamanı sınırlandırmaya çalışmak önemlidir. Örneğin birçok protokolde tavsiye edilen 94°C’den ziyade 90°C ya da 92°C’lik bir sıcaklıkda çalışmak ve/ya da denatürasyon aşaması için süreyi kısaltmak önemlidir (McPherson ve Moller, 2007).
2.4.3. Sıcaklık Denatürasyon
PCR için tek zincirli kalıpları sağlamak üzere kalıbın etkin olarak denatüre edilmesi önemlidir. Eğer bu aşama verimsiz olursa kısmen denatüre olmuş duplex moleküller, etkin primer bağlanmasını ve DNA’nın uzatılmasını önleyecek biçimde hızla yeniden birleşecektir. Her bir siklüsün başlangıcında kısa bir denatürasyon aşaması vardır. Birçok protokol bu aşamada 94°C’lik bir sıcaklık kullanırken GC’ce zengin olanlar daha yüksek sıcaklıklara ihtiyaç duyabilmelerine rağmen birçok kalıp için 90-92°C’lik bir sıcaklık kullanmak yeterli olabilir. Reaksiyonda en yüksek DNA polimeraz aktivitesini kaybetmemek için etkin en kısa süre ve en düşük etkin sıcaklık kullanmaya çalışmak yararlıdır (McPherson ve Moller, 2007).
Annealing
PCR’ın başarısı şiddetle spesifiteye bağlıdır ki bu, primerin yalnızca hedef dizisine bağlanması anlamına gelir bu nedenle bu moleküler etkileşimi optimize etmek önemlidir. Primerin yalnızca onun mükemmel komplementerine bağlanıp bağlanmadığı önemli ölçüde annealing sıcaklığına bağlıdır. Genellikle daha yüksek annealing
sıcaklığı primerin kalıp üzerindeki komplementer dizisine daha spesifik bağlanmasını sağlar ve böylece yalnızca hedef dizi amplifikasyonu daha büyük bir olasılıkla gerçekleşir. Daha düşük sıcaklık, kalıp ve primer arasında daha fazla yanlış eşleşmelere neden olabilir ki bu, hedef olmayan dizilerin amplifikasyonunun artmasına neden olur. Pratikte annealing aşamasına 55°C gibi bir sıcaklıkda başlamak genellikle uygundur. Eğer ürünün zayıf kazanımı ve nonspesifik ürünlerin amplifiyesi söz konusu olursa optimal annealing sıcaklığının deneysel olarak belirlenmesi gerekli olabilir ayrıca bu durum MgCI2 konsantrasyonunun optimizasyonu ile ilişkilendirilebilir. Annealing için genellikle yaklaşık 30-60s’lik bir süre önerilir ve daha kısası daha iyidir. Polimeraz, annealing sıcaklığında kısmi aktiviteye sahip olacağından bu sıcaklıkda reaksiyonun daha uzun tutulması nonspesifik ürünlerin amplifikasyon riskini artıracaktır (McPherson ve Moller, 2007).
Ayarlanan annealing sıcaklık aşaması kalıp ve primer arasındaki eşleşmenin spesifitesini değiştirebilir. Eğer hiç ürün yoksa sıcaklığın çok yüksek olduğu düşünülüp azaltılabilir, örneğin başlangıçta 55°C olan sıcaklık 50°C’ye azaltılabilir. Yeni sıcaklıkda primerler daha etkin olabilir. Eğer yalnızca bir primerin bulunduğu kontrol lane’larında ürünler varsa bu, tek primerin kalıbın bir bölgesinden daha fazlasına bağlandığını ve ürünleri ürettiğini gösterir. Bu durumda annealing sıcaklığı arttırılmalıdır. Çalışılan annealing sıcaklığı optimal değilse ne olur? Kaç sıcaklık denenmeli ve ne aşamada sıcaklık ayarlanmalıdır? Daha da önemlisi böyle bir optimizasyon deneyini gerçekleştirmek için kaç tane termal cyclera sahip olmak gerekir? Günümüzde bir reaksiyonda optimal annealing sıcaklık profillerinin eş zamanlı olarak belirlenmesi gerektiğinde, buna imkan veren bir gradient bloğa sahip olan termal cyclerlar kullanılmaktadır. Gradient bloğa sahip PCR cihazlarında PCR şartlarının optimizisyonu süresince önceden belirlenen 8 ya da 12 farklı sıcaklığı eş zamanlı test eden tek bir blok kullanılmaktadır. Böylece farklı annealing sıcaklıklarına ihtiyaç duyulan bağımsız deneylerin eş zamanlı olarak gerçekleştirilmesi mümkün olmaktadır. Ancak her laboratuvar böyle bir cihaza sahip değildir. Primer/template annealingini optimize etmek için, annealing sıcaklığını başlangıçta 2-5°C’lik ayarlamalarla test etmek uygun bir yoldur (McPherson ve Moller, 2007).
2.4.4. Touchdown PCR
Touchdown PCR, başlangıçta primerlerin Tm’sinden daha yüksek annealing sıcaklığı ile başlar ve ondan sonra PCR’ın ilk siklüsleri süresince annealing sıcaklığı Tm’nin altına kademeli olarak düşürülür. Bu, herhangi bir nonspesifik annealing olayı gerçekleşmeksizin primerlerin yalnızca doğru hedef dizilerine spesifik olarak bağlanmalarını sağlar. Böylece elde edilen ilk ürünler spesifik olduğundan PCR’ın ilk siklüslerinde doğru hedef dizilerin konsantrasyonu artar. Don ve ark. tarafından tanımlanan “thumb” kuralına göre yaklaşık 20 nükleotit uzunluğunda primerler kullanıldığında ilk 20 siklüs süresince annealing sıcaklığı 65°C’ den 55°C’ye her iki siklüsde bir 1°C düşürülürek gerçekleştirilir. Ondan sonra reaksiyon 55°C’lik bir annealing sıcaklığında bir 10 siklüs daha gerçekleştirilerek tamamlanır (McPherson ve Moller, 2007). Ya da başlangıç siklüsünde annealing sıcaklığı, primerlerin Tm değerine eşit ya da 2-5°C altında bir sıcaklığa ulaşıncaya kadar 1-2°C/siklüslük aşamalarla düşürülür. Touchdown PCR, başlangıç primer-kalıp çift zincir oluşumunun spesifitesini ve böylece final PCR ürününün spesifitesi artırır (Anonim, 2005).
2.4.5. Hot start PCR
DNA bir örnekden ekstrakte edildiğinde kaçınılmaz biçimde birkaç DNA tek zincirli formda olacaktır. PCR analizinin bileşenleri oda sıcaklığında karıştırılırsa primerler tek zincirli DNA’ya spesifik olmayacak biçimde bağlanabilirler. Taq polimeraz oda sıcaklığında bir miktar aktiviteye sahip olduğu için örnek thermal cyclera konulmadan önce spesifik olmayan DNA sentezlenebilir. Bunu engellemek için uygulanabilecek metotlardan biri, sıcaklık optimal primer annealing sıcaklığına ya da üzerine çıkıncaya kadar reaksiyonun temel bileşenlerinden birini (Taq polimeraz ya da MgCl2 gibi) reaksiyon ortamına koymamaktır-bu yöntem hot-start PCR olarak adlandırılır. Bu, spesifik olmayan primer annealing sıcaklığının üzerindeki sıcaklıklarda enzimi denatüre eden bir monoklonal antibody ile enzimatik aktivitenin inhibisyonuyla ya da birkaç dakika 90°C’nin üzerinde inkübe edilerek aktive edilebilecek inaktif bir enzim kullanılarak da gerçekleştirilebilir. Bir diğer metot PCR bileşenlerini 0°C’de karıştırmaktır. Bu sıcaklıkta DNA denatüre olmayacaktır ve Taq polimeraz aktif
değildir. Örnek önceden ısıtılmış thermal cyclera (94-96°C) doğrudan yerleştirildiğinde spesifik olmayan amplifikasyonun önüne geçilmiş olur- bu yöntem cold-start PCR olarak adlandırılır (Lisby, 1998).
Hot start PCR’ı gerçekleştirmek için çeşitli stratejiler vardır; en ucuz prosedür DNA polimeraz olmaksızın tüm reaksiyonları kurmaktır ve 90°C’den yüksek sıcaklıkda başlangıç denatürasyon aşamasını tamamlamak için termal cyclerda tüpleri inkübe etmektir. Ondan sonra tüpleri, 70°C’nin üzerinde tutarken DNA polimerazın uygun miktarı reaksiyon karışımına ilave edilir fakat mineral yağ kullanılıyorsa öncelikle pipet ucu mineral yağ tabakasının içinden geçirilerek polimeraz reaksiyon karışımına ilave edilmeli ki polimeraz yağın üstünde kalmayıp reaksiyona girebilsin. Bu yaklaşım göreceli olarak az sayıda reaksiyonun gerçekleştirildiği araştırma laboratuarında kullanılabilir. Ancak bu çok sayıda örnek prosesi için uygun değildir çünkü:
• her bir tüpe enzim ilavesi zaman alır
• bir ya da daha fazla tüpe enzim ilavesini başaramamanın yol açtığı problem olabilir.
• tüpleri açma ihtiyacından dolayı kontaminasyon riski oluşabilir.
Çeşitli ticari reagentlar günümüzde hot startı kolaylaştırmak için temin edilebilir ve böyle ürünler rutin hot start uygulamaları için tavsiye edilmektedir (McPherson ve Moller, 2007).
2.4.6. Nested PCR
PCR spesifitesi çok çok düşük olduğunda bir nested PCR metodu PCR ürün verimini artırabilir. Nested PCR iki aşamalı amplifikasyon reaksiyonları gerektirir. Birinci-aşama PCR, standart PCR protokolüne göre gerçekleştirilir. Sonradan birinci-aşama PCR ürününün bir aliquatı, örneğin 103-104’de bir’lik bir dilüsyonun (1/103-1/104’lik bir dilüsyon) 1µl’si ikinci aşama PCR’da amplifiye edilir. İkinci-aşama PCR, birinci-aşama primer-kalıp dizilerinin içindeki dizilere hibridize olan iki yeni pirimerlerle gerçekleştirilir (Anonim, 2005). Böylece eğer birinci PCR döngüsünde yanlış bir dizi kopyalandı ise (primerler DNA’da birden fazla diziyi tanıyabilir), bu ürünün, ikinci set
primerler tarafından tanınma olasılığı düşük olacaktır ve yalnızca spesifik birinci-aşama PCR ürünleri ikinci aşamada amplifiye olacaktır (İşcan, 2003).
2.4.7. Siklüs sayısı ve uzunluğu
Genelde PCR’ın cycle (siklus) sayısı sonraki analizler ya da DNA manipülasyonlarında kullanılmak üzere yeterli ürün elde etmek için ihtiyaç duyulan minumum düzeyde tutulmalıdır. Bu, nonspesifik ürünlerin birikme ve hataların ortaya çıkma olasılığını azaltır. Temel protokol, yeterli ürün vermezse başlangıçta kalıp miktarını artırmak denenebilir. Alternatif olarak PCR’ın cycle (siklus) sayısı arttırılabilir. 40 siklüslük bir reaksiyon süresince her 5 siklüsde bir yani 25., 30. ve 35. siklüsde 0.1’lik hacimde (50µl’lik hacmin 5 µl’si gibi) bir aliquatı alarak PCR’ları örneklemek mümkündür. Ondan sonra örnekler uygun sayıda siklusu belirleyebilmek için agaroz jel elektroforezi ile analiz edilebilir. Bu sayı, tek bir ürünün yüksek verimle eldesi için gerekli olan minimum sayıdır (McPherson ve Moller, 2007).
PCR spesifitesini etkileyebilen bir diğer husus PCR süresince sıcaklıklar arası geçiş zamanıdır. Genellikle sıcaklık artışı ne kadar kısa sürede gerçekleşirse (faster ramping rates) spesifite o denli yüksek olur (McPherson ve Moller, 2007).
2.4.8. PCR katkı maddeleri
Çeşitli ‘enhancer’ bileşiklerin PCR’ın spesifitesini ve etkinliğini artırdığı bilinmektedir. Bunlar reaksiyonun etkin annealing sıcaklığını artıran kimyasalları, DNA bağlayıcı proteinleri ve ticari olarak elde edilebilir reagentları içerir. Böyle katkı maddeleri, primer annealing spesifitesini artırmak, primerlerin bağlanma olasılığını artırmak, özellikle GC’ce zengin diziler gibi zor kalıplar söz konusu olduğunda PCR verimini artırmak, ürün uzunluğunu artırmak, ürün spesifitesini artırmak, enzim stabilitesine katkıda bulunmak için PCR’lara ilave edilebilir. Ayrıca enhancerlar sıklıkla PCR’ın ticari optimizasyon ve enhancer kitlerinin bileşenleri olarak kullanılırlar. Baz eşleşmesinin destabilizasyonuna yol açan katkı maddeleri özellikle GC’ce zengin diziler gibi zor kalıplar söz konusu olduğunda PCR’ı artırabilir ve yanlış eşleşen primer-kalıp komplekslerinin göreceli olarak daha fazla destabilize olmasını sağlayarak
spesifiteyi de artırabilir. Bu bileşikler optimal olmayan PCR şartlarını iyileştirmek için bazı durumlarda yararlı olabilmesine rağmen bazıları, kalıpların ve primer kombinasyonlarının geniş bir aralığına uygulanamaz. Her PCR’da başarıyı kesinleştirecek olan ‘büyülü’ bir katkı maddesi yoktur ve annealing sıcaklığı gibi farklı şartlar altında farklı katkı maddelerini test etmek gerekli olabilir. Farklı annealing sıcaklıklarının otomatik testine izin veren bir gradient termal cycler kullanımı ile böyle bir test kolaylaştırılır (McPherson ve Moller, 2007).
Enhancerlar kullanıldığında, herbir PCR analizine bağlı olarak aşağıdaki etkiler gözlemlenebilir; (1) Enhancer önceden başarısız olan bir reaksiyonu amplifiye edebilir; (2) Enhancer belirli primer kalıp sistemlerinde PCR spesifitesini artırabilir; (3) Enhancer PCR performansı üzerine etki etmez; (4) Enhancer önceden başarıyla gerçekleştirilmiş amplifikasyon reaksiyonunun verimini düşürebilir ya da onu başarısız kılabilir. Enhancerlar kullanıldığında yukarıda belirtilen dört durumla da karşılaşılabileceğinden belirli bir primer-kalıp çifti için ilk kez bir enhancer kullanıldığında her zaman enhancerlı ve onsuz paralel reaksiyonlar gerçekleştirilmelidir. Enhancerların polimeraz zincir reaksiyonu üzerine etkileri, enhancer olarak Q-çözeltisi kullanılarak ve kullanılmayarak gerçekleştirilen reaksiyon ürünlerine ait aşağıda yer alan jel fotograflarında görülmektedir.
Şekil 2.8. Q çözeltinin (solution) polimeraz zincir reaksiyonu üzerine etkileri Durum A: Q-çözeltisi önceden başarısız olan bir reaksiyonu amplifiye edebilir. Durum B: Q-çözeltisi belirli primer kalıp sistemlerinde PCR spesifitesini artırabilir. Durum C: Q-çözeltisi PCR performansı üzerine etki etmez
Durum D: Q-çözeltisi önceden başarıyla gerçekleştirilmiş amplifikasyon reaksiyonunun verimini düşürebilir ya da onu başarısız kılabilir. Bu durumda Q çözelti ilavesi önceki optimal primer-kalıp annealingini bozmuş olabilir (Anonim, 2005).
-: Q-çözeltili +: Q-çözeltisiz M: Markör
3.1. Materyal
3.1.1 Kullanılan Malzemeler ve Kimyasal Maddeler
Agaroz (amResco), Etidium bromür (amResco), Bromfenol blue (Panreac), Gliserol (EUROMEDEX), Ksilen siyanol (Sigma), dNTP (BIORON), Template DNA, Primer (Iontek), GoTaq® DNA polimeraz (Promega), MgCl2 çözeltisi (Promega), GoTaq® Flexi Buffer (Promega), Betaine monohidrat (Fluka), Sülfolane (Fluka), Dimetil sülfoksit (DMSO) (Merc), Dimetil formamit (DMF) (Fluka), 2-Pirolidon (Fluka), Tween 20 (Merc), BSA (Promega), Triton X-100 (Sigma Aldrich), SDS (Merck), KCl (Sigma), CaCl2.2H2O (Merck), KCH3COO (Merck), InvitrogenTM LB Broth Base (Lennoxl Broth Base), Agar (BactoTM Agar, BD), Na2EDTA.2H2O (amResco); Trisma base (Sigma), NaOH (Aldrich), Kanamycin (Sigma), Falkon Tüpü, Erlen, Beher, Cam Şişeler (100 ml, 250ml, 500 ml, 1000 ml’ lik), Mezür, Petri kapları (Isolab), Pipet uçları (Isolab, Gilson), Mikrosantrifüj (CLP) ve PCR tüpleri (BBI) ile diğer laboratuvar malzemeleri kullanıldı.
3.1.2. Cihazlar
Thermal cycler (BioRad), UV transillüminatör (Syngene and Kodak), Yatay elektroforez (BIORAD), Güç kaynağı (BIORAD Power PAC 300), Hassas terazi (VİBRA), pH metre (Sartorius Professional meter pp 15), Otomatik pipetler (Gilson, ependorf), Manyetik karıştırıcı (IKA® RH basic 2), Vorteks (FALC), Buz makinesi (Scotsman), Otoklav (Hiclave), Etüv (TERMAL® Laboratuar ALETLERİ), Mikrodalga fırın (Arçelik), 4 -20 ve -80 oC’deki buzdolapları (Arçelik, Arçelik, Hettich), Saf su cihazları (YOUNGLIN INSTRUMENT), Santrifüj (MIKRO22R Hettich), Shaker-İnkübatör (BIOSAN) kullanıldı.
3.1.3. Tampon ve Çözeltilerin Hazırlanışı 3.1.3.1. 0,5 M EDTA Çözeltisi
18,61 g Na2EDTA.2H2O’nun 70 ml deiyonize suda manyetik karıştırıcı yardımı ile karıştırılarak ve pH metre ile pH kontrolü yapılarak 10 M NaOH ilavesiyle tamamen
çözünmesi sağlandı. Ardından 10 M NaOH ile pH:8.0’e ayarlandıktan sonra toplam hacim deiyonize suyla 100 ml’ye tamamlandı.
3.1.3.2. 50X Tris Asetat EDTA (TAE) Tamponu
242 g Trisma-base, 57,1 ml Glasiyel asetik asit ve 100 ml 0,5 M EDTA (pH:8) ilave edilerek manyetik karıştırıcı yardımıyla tamamen çözününceye kadar karıştırıldı. Hazırlanan çözeltinin pH’ı glasiyal asetik asitle 8,5’e ayarlandı ve toplam hacim deiyonize su ile 1 L’ye tamamlandı.
3.1.3.3. 1X Tris Asetat EDTA (TAE) Tamponu
10 ml 50X TAE Tamponu alındı toplam hacim deiyonize suyla 500 ml’ye tamamlandı.
3.1.3.4. Etidium Bromür
10 mg Etidium bromür, 10 ml deiyonize su içerinde çözüldü ve +4oC’de muhafaza edildi.
3.1.3.5. 6X Bromophenol Blue
15 ml gliserol, 0,25 g bromophenol blue ile 0,25 g Xylene cyanol, 100 ml deiyonize su içerisinde tamamen çözününceye kadar karıştırılarak hazırlandı.
3.1.3.6. FSB
100 mM KCl (3,7250 g/0,5 L), 50 mM CaCl2 (2,7750 g/0,5 L), 10% (w/v) gliserol (50 g), 10 mM KCH3COO (pH’sı 7,5 olan 1 M’lık çözeltisinin 5 ml’si) bir miktar suda çözüldü, pH, 1M HCl ile 6,2’ye ayarlandı ve toplam hacim deiyonize su ile 500 ml’ye tamamlanarak otoklavlandı.
