Eş Zamanlı RT-PCR (qRT-PCR)

(1)

Eş Zamanlı RT-PCR (qRT-PCR)

Bâlâ GÜR DEDEOĞLU

Ankara Üniversitesi Biyoteknoloji Enstitüsü

(2)

(3)

qRT-PCR için tespit bölgesi

Klasik PCR için tespit bölgesi

(4)

0 200000000 400000000 600000000 800000000 1000000000 1200000000 1400000000 1600000000

0 5 10 15 20 25 30 35

PCR CYCLE NUMBER

AMOUNT OF DNA

1 10 100 1000 10000 100000 1000000 10000000 100000000 1000000000 10000000000

0 5 10 15 20 25 30 35

AMOUNT OF DNA

CYCLE NUMBER AMOUNT OF DNA

0 1

1 2

2 4

3 8

4 16

5 32

6 64

7 128

8 256

9 512

10 1,024

11 2,048

12 4,096

13 8,192

14 16,384

15 32,768

16 65,536

17 131,072

18 262,144

19 524,288

20 1,048,576

21 2,097,152

22 4,194,304

23 8,388,608

24 16,777,216

25 33,554,432

26 67,108,864

27 134,217,728

28 268,435,456

29 536,870,912

30 1,073,741,824

31 1,400,000,000

32 1,500,000,000

33 1,550,000,000

34 1,580,000,000

(5)

5-kat dilüsyon serisi ile hazırlanmış örneklerin PCR sonuçları (logaritmik)

(6)

Eş Zamanlı RT-PCR ve Geleneksel PCR Karşılaştırması

• PCR çoğalması erken evrelerde saptanabilir

• Klasik PCR’de çoğalma ancak son ürün alınarak (30-40 döngünün sonunda) agaroz jelde görüntülenerek

saptanabilir.

• Eş zamanlı PCR ile 2 kat gibi küçük ifade farklılıları

saptanabilirken, agaroz jelin rezolusyonu düşük olduğu için geleneksel PCR ile ancak 10 kat gibi farklılılar

belirlenebilir.

(7)

Neden Eş Zamanlı RT-PCR?

• mRNA ifadeleri arasındaki farkların tayini

• Çok az miktarda örnek sağlanabilmesi

– Lazer yakalama yöntemi (lazer capture microdissection)

– Az miktarda doku – Primer hücreler

– Değerli materyal (kanser dokusu, hasta doku)

(8)

• Eş zamanlı RT-PCR, kalıp DNA’nın başlangıç miktarını spesifik, hassas ve tekrarlanabilir şekilde tespit eder, tüm bunlardan dolayı son-noktada DNA miktarı saptanabilen klasik PCR’ye göre daha fazla tercih edilmektedir.

•Her bir döngüde açığa çıkan floresan miktarını kaydedilir ve PCR ürünündeki ilk anlamlı artışın gözlendiği eksponensiyal faz görüntülenir. PCR ürününün

exponensiyel artış gösterdiği ilk döngü baslangıç materyalinin miktarı ile doğru orantılıdır.

(9)

• Başlangıçtaki hedef DNA miktarı ne kadar fazla ise ilk anlamlı artış o kadar erken olacaktır. PCR ürünleri eksponensiyal faza o kadar erken girecektir.

•Eş zamanlı PCR’nin dinamik dağılımı 10^7-kat kadar olabilirken klsik PCR’de bu dağılım 1000-kat civarında seyretmektedir.

(10)

• DNA çoğalmasını görüntüleyebilmek için iki ana floresan sistem vardır.

(1) DNA’ya bağlanan ajanlar (SYBR green) (2) Taqman probları

(11)

SYBR green çift sarmal DNA’ya bağlanabilen ancak tek zincirli DNA’ya bağlanamayan bir boyadır. Eş zamanlı PCR

reaksiyonlarında ucuzluğu ve hassasiyeti sebebi ile çok tercih edilen bir boyadır.

Cift sarmal DNA’ya bağlandıı zaman floresan ışıması yapmaya başlar ve bu ışıma etidyum bromitten çok daha güçlüdür.

SYBR GREEN

(12)

SYBR® green I

• Spesifik değil

SYBR green herhangi bir çift sarmallı DNA’ya bağlanabilir (PCR ürünü, primer dimerleri, spesifik olmayan PCR ürünü)

DNA zincirlerinin arasına girmesi sadece yapısaldır, sekansa bağımlı değildir.

• Kantifikasyon ve karakterizasyon erime eğrileri ile saptanabilir.

• Primer dimerlerinin engellenebilmesi icin dikkatli primer tasarımı yapılmalıdır.

SPESİFİK DEĞİLDİR ANCAK HASSASTIR!!!

(13)

Taqman ® probes

• Spesifik

• Sadece spesifik hedeflere bağlanır

• Öncelikle Taqman problar bağlanır, sonra PCR evrelerinden biri olan

bağlanma (annealing) evresinde primerler bağlanır ve Taq polimeraz ile uzama gerçekleşir. Taq polimerazın 5’Exonucleaz aktivitesi sayesinde proba bağlı florofor kesilir ve floresan açığa çıkar.

• En yüksek sinyali veren prob sistemidir

• Kantifikasyon ve alelik ayrım yapılabilir (SNP tespiti )

• Tasarlaması PrimerExpress™ ve BeaconDesigner gibi hazır bilgisayar programları ile cok kolaydır.

SPESİFİKTİR AMA HASSAS DEĞİLDİR!!!

(14)

(15)

LightCycler Hybridisation Probes

FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)

(16)

Molecular Beacons

(17)

Universal Probe Library

http://www.roche-applied-science.com/

(18)

Ct (Treshold Cycle) ya da

Cp (Crossing Point)

Nedir ?

(19)

Floresan değerlerinin eşik değerini geçtiği noktaya eşik döngüsü (Ct, Cp) denir.

Ct değeri, sistemin floresan miktarındaki artışı farketmeye başladığı ve PCR ürününün log-lineer fazda eksponensiyal olarak artmaya başladığı zamandır.

40 döngünün üzerindeki bir Ct değeri çoğalma olarak adlandırılamaz ve hesaplara katılamaz.

(20)

Erime Sıcaklığı Eğrileri

Bir primer seti ya da prob seti için bütün PCR ürünlerinin aynı erime sıcaklığına sahip olması beklenir.

Kontaminasyon, spesifik olmayan bir çoğalma ve primer dimer oluşumu gibi kalıntılar farklı erime sıcaklığına sahiptirler.

Eş zamanlı PCR ile ürünleri agaroz jelde koşturmadan, erime sıcaklığı grafiklerinden

faydalanarak spesifik olmayan bağlanmaları ve primer dimerleri saptamak mümkündür.

(21)

(22)

• Primer Tasarımı

• Çoğalma verimi

SYBR Green kullanılarak yapılan eş zamanlı PCR’de en yüksek verimin elde edilmesi için hedef ürün uzunluğu 100–200 bç

civarında olmalıdır.

• Referans Gen Seçimi (GAPDH, ACTB)

Eş Zamanlı PCR’de Önemli Noktalar

(23)

Primerlerin Önemi

• Spesifik

• Yüksek verimli

• Primer dimer olmamalı

• DNA kontaminasyonunu bertaraf edebilecek primerler tasarlanmalı.

– exon/exon sınırlarından

– Araya uzun bir intron koyarak

(24)

Eş Zamanlı PCR’de Önemli Noktalar

• Primer Tasarımı

• Çoğalma verimi

• Referans Gen Seçimi (GAPDH, ACTB)

(25)

1 döngü sonunda

100% = 2.00x

90% = 1.90x

80% = 1.80x 70% = 1.70x

CYCLE AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA 100% EFFICIENCY 90% EFFICIENCY 80% EFFICIENCY 70% EFFICIENCY

0 1 1 1 1

1 2 2 2 2

2 4 4 3 3

3 8 7 6 5

4 16 13 10 8

5 32 25 19 14

6 64 47 34 24

7 128 89 61 41

8 256 170 110 70

9 512 323 198 119

10 1,024 613 357 202

11 2,048 1,165 643 343

12 4,096 2,213 1,157 583

13 8,192 4,205 2,082 990

14 16,384 7,990 3,748 1,684

15 32,768 15,181 6,747 2,862

16 65,536 28,844 12,144 4,866

17 131,072 54,804 21,859 8,272

18 262,144 104,127 39,346 14,063

19 524,288 197,842 70,824 23,907

20 1,048,576 375,900 127,482 40,642

21 2,097,152 714,209 229,468 69,092

22 4,194,304 1,356,998 413,043 117,456

23 8,388,608 2,578,296 743,477 199,676

24 16,777,216 4,898,763 1,338,259 339,449

25 33,554,432 9,307,650 2,408,866 577,063

26 67,108,864 17,684,534 4,335,959 981,007

27 134,217,728 33,600,615 7,804,726 1,667,711

28 268,435,456 63,841,168 14,048,506 2,835,109

29 536,870,912 121,298,220 25,287,311 4,819,686

30 1,073,741,824 230,466,618 45,517,160 8,193,466

0 200,000,000 400,000,000 600,000,000 800,000,000 1,000,000,000 1,200,000,000

0 10 20 30

AMOUNT OF DNA

100% EFF 90% EFF 80% EFF 70% EFF

(26)

(27)

Verimlilik Hesaplanması

• Verimlilik aşağıdaki formül ile hesalanabilir:

Eff = 10(-1/eğim) – 1

• Bir PCR çoğalmasının verimi 90 - 100% (– 3.6 > slope > 3.1) arasında olmalıdır.

10^-(1/-3.4)= 1.96

(1.96-1)*100= %96 verimli

(28)

Primer Tasarımı Verimlilik

Farkını Yaratır

(29)

Eş Zamanlı PCR’de Önemli Noktalar

• Primer Tasarımı

• Çoğalma verimi

• Referans Gen Seçimi (GAPDH, ACTB)

(30)

Normalizasyon İçin Doğru Referans Genin Seçilmesi

•Referans gen araştırılan dokularda ya da hücrelerde değişiklik göstermemeli (kararlılık).

•En stabil olan minimum sayıda gen kullanılmalı.

•Kullanılan referans gen sayısı birden fazla ise ortalama değer almak yerine geometrik ortalama değer

kullanılmalıdır.

(31)

Normalizasyon İçin Doğru Referans Genin Seçilmesi

http://medgen.ugent.be/~jvdesomp/genorm/

(32)

Normalizasyon İçin Doğru Referans Genin Seçilmesi

http://www.mdl.dk/publicationsnormfinder.htm

(33)

Normalizasyon İçin Doğru Referans Genin Seçilmesi

http://www.mdl.dk/publicationsnormfinder.htm

(34)

Kantifikasyon Metodunun Seçilmesi

(Veri Analiz Metodu)

(35)

mRNA seviyesinin qRT-PCR ile ölçümü

• STANDART EĞRİ METODU

• Delta-Delta CT METODU (yaklaşım metodu)

• PFAFFL METOD

(36)

Standart Eğri Metodu

(37)

Hedef genin dilüsyon eğrisi

‘kopya sayısı’ hedef gen

‘kopya sayısı’ kontrol

Hedef gendeki kat- değişim=

Deney örneğinin kopya sayısı

Kontrol kopya sayısı

(38)

Standart Eğri Metodu

(39)

• Delta-Delta Ct METODU (Yaklaşım metodu)

• PFAFFL METHOD

2^-(Ct)

Ct:[(Ct_tumor-Cthousekeeping)-(Ct_normal-Cthousekeeping)]

mRNA seviyesinin qRT-PCR ile ölçümü

(40)

Kıyaslamalı Ct Metodu

(41)

cDNA miktarı 2 kat arttırılırsa?

(42)

Kıyaslamalı Ct Metodu

(43)

İfade Seviyelerinin Hesaplanması

(44)

• Delta-Delta Ct METODU (Yaklaşım metodu)

• PFAFFL METHOD

mRNA seviyesinin qRT-PCR ile ölçümü

(45)

Verimliliklerin Karşılaştırılması

(46)

Eğimler eşit değilse?

(47)

Verimlilik (Efficiency) Metodu

(48)

Hedef gen

Referans gen (internal kontrol) actin, GAPDH, RPLP0 etc

Hedef gen/ kontrol gen = hedef gendeki kat değişm

control expt

Normalize edilmiş kat artış = 10/2 = 5

(49)

www.biorad.com