RİFAMPİSİNE DİRENÇLİ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS İZOLATLARININ MIRU-VNTR (MYCOBACTERIAL INTERSPERSED

RİFAMPİSİNE DİRENÇLİ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS İZOLATLARININ MIRU-VNTR (MYCOBACTERIAL INTERSPERSED

REPETITIVE UNIT – VARIABLE NUMBER TANDEM REPEAT) YÖNTEMİYLE GENOTİPLENDİRMESİ

GENOTYPING OF RIFAMPIN-RESISTANT MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS ISOLATES BY MYCOBACTERIAL INTERSPERSED REPETITIVE

UNIT – VARIABLE NUMBER TANDEM REPEAT (MIRU-VNTR) ANALYSIS Cengiz ÇAVUŞOĞLU

, Eylem KARATAŞ

, İlknur SÖYLER

ÖZET: Moleküler tiplendirme yöntemlerindeki gelişmeler, tüberküloz epidemiyolojisinin anlaşılmasını kolaylaştırmış, salgınların tanımlanmasına ve hastalığın toplum içinde yayılımının anlaşılmasına yardımcı olmuştur. Son yıllarda, “Mycobacterial interspersed repetitive unit” (MIRU) olarak tanımlanan 12 VNTR (variable-number tandem repeat) lokusunun M.tuberculosis’in tiplendirmesinde yararlı olduğu gösterilmiştir. Bu çalışmada Ege Bölgesi’nde 26 farklı hastadan izole edilen ve IS6110-RFLP paternleri bilinen 26 rifampisine (RİF) dirençli M.tuberculosis izolatı MIRU-VNTR yöntemiyle tiplendirilmiş, elde edilen sonuçlar IS6110-RFLP sonuçları ile karşılaştırılmıştır. Çalışmada, izolatların çoğunda MIRU-VNTR yöntemiyle oluşan kümelerin IS6110-RFLP yöntemiyle oluşan kümelerle uyumlu olduğu saptanmış ve sırasıyla MIRU 16, MIRU 40, MIRU 26, MIRU 10, MIRU 04 ve MIRU 31’in allelik farklılığı ve ayrım gücü en yüksek lokuslar olduğu belirlenmiştir. Sonuç olarak, klasik 12 MIRU-VNTR lokusunun allelik farklılıkları dolayısıyla ayrım güçleri arasında değişiklikler olduğu ve ayrım gücü yüksek olarak bulunan yukarıdaki lokuslara ek olarak allelik farklılığı yüksek diğer bazı lokusların da kullanılmasıyla, bu yöntemin epidemiyolojik çalışmalarda uygulanabilir bir yöntem olabileceği düşüncesine varılmıştır.

Anahtar sözcükler: MIRU-VNTR, IS6110-RFLP, moleküler epidemiyoloji, Mycobacterium tuberculosis.

ABSTRACT: Molecular typing methods have greatly enhanced our understanding on epidemiology of tuberculosis and allowed us to identify outbreaks and intertransmission within populations. Recently, a set of 12 variable-number tandem repeat (VNTR), designated mycobacterial interspersed repetitive units (MIRU), has been described as being useful for the typing of M.tuberculosis. In this study, 26 rifampin (RIF) resistant M.tuberculosis isolates with known IS6110-RFLP patterns obtained from 26 different patients in Aegean Region were typed by MIRU-VNTR and the data were compared with IS6110-RFLP results. The results showed that in most isolates the clustering on the basis of IS6110 RFLP typing and that on the basis of MIRU-VNTR typing were in agreement. It was also determined that the loci including MIRU 16, MIRU 40, MIRU 26, MIRU 10, MIRU 04 and MIRU 31, respectively, have the highest

1

Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Bornova, İzmir.

(ilknursoyler@yahoo.com)

Geliş Tarihi: 28.12.2006 Kabul Ediliş Tarihi: 09.03.2007

allelic diversities and discriminatory power. In conclusion, since the discrimination level of conventional MIRU-VNTR including 12 loci might be variable, by the use of additional loci which present high degree of allelic differentiation, this method would be reliable for the epidemiologic studies.

Key words: MIRU-VNTR, IS6110-RFLP, molecular epidemiology, Mycobacterium tuberculosis.

GİRİŞ

Moleküler tiplendirme yöntemlerindeki gelişmeler, tüberkülozun epidemiyolojisinin anlaşılmasını kolaylaştırmış, salgınların tanımlanmasına ve hastalığın toplum içinde yayılımının anlaşılmasına yardımcı olmuştur

. Moleküler tiplendirme yöntemleri epidemiyolojik tüberküloz çalışmalarında, salgınların saptanmasında, reenfeksiyon ve reaktivasyon ayrımında, laboratuvarlardaki çapraz kontaminasyonların gösterilmesinde kullanılmaktadır. Günümüzde kullanılan yöntemler içinde en yüksek ayrım gücüne sahip olanı, IS6110-RFLP (restriction fragment length polymorphism) yöntemidir. Beş ve daha fazla sayıda IS6110 kopya sayısı içeren izolatlarda, IS6110-RFLP referans yöntemdir. Buna karşın bol miktarda genomik DNA gerektirmesi ve emek-yoğun olması, tiplendirmede gecikmelere yol açmakta ve rutin uygulamasını güçleştirmektedir. Ayrıca IS6110 kopya sayısının beşten az olduğu izolatlarda yöntemin ayrım gücü zayıftır

.

DNA amplifikasyonu temelli yöntemler için minimal bir üreme yeterli olduğundan daha kısa süre içinde sonuçlanmaktadırlar. Bu temele dayanan bir yöntem olan spoligotiplendirme ile kısa sürede sonuç alınmasına karşın ayrım gücü IS6110-RFLP’dan daha düşüktür. Bu nedenle tek başına kullanıldığı durumlarda bulaşmanın gösterilmesinde bazı sorunlar yaşanabilmektedir

.

“Variable-number tandem repeat” (VNTR) analizi, bir diğer DNA amplifikasyonu temelli yöntemdir. Son yıllarda “Mycobacterium interspersed repetitive unit”

(MIRU) olarak tanımlanan 12 VNTR lokusunun, M.tuberculosis’in tiplendirmesinde yararlı olduğu gösterilmiştir

. Bu yöntem ile genom içinde dağılmış MIRU lokusları özgül primerlerle amplifiye edilmekte ve oluşan fragmanların uzunlukları değerlendirilerek her bir lokus için ardışık tekrarların sayısı belirlenmektedir. Yapılan çeşitli çalışmalarda MIRU-VNTR’nin ayrım gücünün spoligotiplendirmeden daha iyi olduğu gösterilmiştir

.

Bu çalışmada, Ege Bölgesi’nde farklı hastalardan izole edilen ve IS6110- RFLP paternleri bilinen rifampisine dirençli 26 M.tuberculosis izolatının 12 farklı MIRU lokusundaki tekrar sayılarının değerlendirilerek tiplendirilmesi ve sonuçların IS6110-RFLP sonuçları ile karşılaştırılması amaçlanmıştır.

GEREÇ ve YÖNTEM

M.tuberculosis İzolatları: Çalışmaya alınan rifampisine dirençli 26

M.tuberculosis izolatı, 1999-2001 yılları arasında Ege Bölgesi’nde yaşayan

hastalardan izole edildi. İzolatların birinci seçenek antitüberküloz ilaçlara

duyarlılıkları, IS6110-RFLP paternleri, rifampisin (RİF) ve izoniazid (INH)

genotipleri daha önce belirlenmişti

.

MIRU-VNTR Yöntemi: Bu yöntem; DNA izolasyonu, MIRU lokuslarının amplifikasyonu ve polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile elde edilen ürünlerin agaroz jelde yürütülerek değerlendirilmesi olmak üzere üç aşamada yapıldı.

DNA izolasyonu için kaynatma ve sonikasyon yöntemi kullanıldı. PCR amplifikasyonu için MgCl

konsantrasyonlarında yapılan modifikasyonlar dışında Supply

tarafından tanımlanan protokol uygulandı. PCR amplifikasyonu için Q solüsyonlu Hotstart Taq DNA polimeraz (Qiagen) kullanıldı. Amplifikasyon döngüsü, 95°C’de 15 dakika, daha sonra 94

C’de 1 dakika, 59°C’de 1 dakika, 72°C’de 1.5 dakika, toplam 40 döngünün ardından 72°C’de 10 dakika son uzatma aşamasından oluşturuldu. PCR’da kullanılan primerler Tablo I’de, PCR protokolünün özeti ise Tablo II’de gösterildi.

Çalışmada pozitif kontrol olarak M.tuberculosis H37Rv kullanıldı. Amplifiye edilen MIRU lokusları %3’lük Nu-Sieve agaroz (Sigma) jelde 120 V’da 4-5 saat yürütüldü. İzolatlardan elde edilen bant paternleri, M.tuberculosis H37Rv suşunun bant paterni ve moleküler büyüklük göstergesi ile karşılaştırılarak her bir MIRU lokusu için tekrar sayısı saptandı. Allelik farklılık; (h)=1−ΣX

{n/(n−1) [n: izolat sayısı, X

: alleldeki izolat sıklığı] formülüyle hesaplandı

.

Tablo I: Çalışmada Kullanılan MIRU-VNTR Primerleri

MIRU Lokusları “Forward” Primer “Reverse” Primer

MIRU 02 TGGACTTGCAGCAATGGACCAACT TACTCGGACGCCGGCTCAAAAT

MIRU 04 GCGCGAGAGCCCGAACTGC GCGCAGCAGAAACGCCAGC

MIRU 10 GTTCTTGACCAACTGCAGTCGTCC GCCACCTTGGTGATCAGCTACCT MIRU 16 TCGGTGATCGGGTCCAGTCCAAGTA CCCGTCGTGCAGCCCTGGTAC

MIRU 20 TCGGAGAGATGCCCTTCGAGTTAG GGAGACCGCGACCAGGTACTTGTA

MIRU 23 CTGTCGATGGCCGCAACAAAACG AGCTCAACGGGTTCGCCCTTTTGTC

MIRU 24 CGACCAAGATGTGCAGGAATACAT GGGCGAGTTGAGCTCACAGAA

MIRU 26 TAGGTCTACCGTCGAAATCTGTGAC CATAGGCGACCAGGCGAATAG

MIRU 27 TCGAAAGCCTCTGCGTGCCAGTAA GCGATGTGAGCGTGCCACTCAA

MIRU 31 ACTGATTGGCTTCATACGGCTTTA GTGCCGACGTGGTCTTGAT

MIRU 39 CGCATCGACAAACTGGAGCCAAAC CGGAAACGTCTACGCCCCACACAT

MIRU 40 GGGTTGCTGGATGACAACGTGT GGGTGATCTCGGCGAAATCAGATA

Tablo II. MIRU Lokusları İçin Kullanılan PCR Karışımları (µL)

Karışım 1 2 6 7

Lokuslar 04-26-40 10-16-31 02-23-39 20-24-27

MgCl

final kons. 3 mM 2.5 mM (2 mM*) 2.5 mM 2.5 mM (1.5 mM*)

H

0 9.1 9.3 9.3 9.3

Buffer 10x 2 2 2 2

Q solüsyonu 5x 4 4 4 4

MgCl

25 mM 1.2 0.8 0.8 0.8

dNTP 5 mM 0.8 0.8 0.8 0.8

Her bir primer 0.4 0.5 0.5 0.5

HotStart DNA polimeraz 0.08 0.08 0.08 0.08

DNA 2 2 2 2

Toplam hacim 20 20 20 20

* Standart protokolde önerilen MgCl

konsantrasyonları.

BULGULAR

Çalışmada incelenen RİF’e dirençli 26 M.tuberculosis izolatında 18 farklı MIRU paterni saptanmıştır. İzolatlar arasında kümeleşme oranı %45 (26/12), izolat başına averaj sayısı 26/18 (1.44) olarak bulunmuş ve MIRU lokuslarındaki tekrar sayıları değerlendirildiğinde, izolatların sayıları 2-5 arasında değişen dört küme (6, 9; 26, 40; 4, 34, 37; 14, 25, 29, 3, 35) oluşturdukları belirlenmiştir.

İzolatların IS6110-RFLP paternleri incelendiğinde, 6 ve 9 no’lu izolatlar ile 4, 34 ve 37 no’lu izolatların her iki yöntemle de ortak kümeleşme gösterdiği saptanmıştır. MIRU-VNTR ile aynı küme içinde yer alan 14, 25, 29, 3 ve 35 no’lu izolatların ise IS6110-RFLP sonuçları temel alındığında; 14 ve 25 no’lu izolatlar ile 29, 3 ve 35 no’lu izolatların iki ayrı küme oluşturdukları, ayrıca MIRU-VNTR yöntemiyle herhangi bir kümeye girmeyen 30 no’lu izolatın IS6110- RFLP yöntemiyle 29, 3 ve 35 no’lu izolatlar ile aynı küme içinde yer aldığı belirlenmiştir. MIRU-VNTR yöntemiyle ortak kümeyi paylaşan (6, 9; 4, 34, 37;

14, 25, 29, 3, 35) izolatların rpoB ve katG genotiplerinin de ortak olduğu, IS6110-RFLP yöntemiyle 29, 3 ve 35 no’lu izolatlar ile aynı küme içinde yer alan 30 no’lu izolatın ise rpoB genotipinin 14, 25, 29, 3 ve 35 no’lu izolatlardan farklı olduğu belirlenmiştir.

MIRU-VNTR ile aynı küme içinde olduğu belirlenen 26 ve 40 no’lu izolatların IS6110-RFLP ile kümeleşme göstermediği, 15 ve 32 no’lu izolatların ise IS6110- RFLP ile kümeleşme gösterirken MIRU-VNTR ile kümeleşme göstermediği saptanmıştır. 26 ve 40 no’lu izolatların rpoB ve katG genotiplerinin, 15 ve 32 no’lu izolatların ise rpoB genotiplerinin birbirinden farklı olduğu saptanmıştır.

Çalışmada incelenen diğer izolatlar ise hem MIRU hem de IS6110-RFLP yöntemiyle kümeleşme göstermemişlerdir. İzolatların MIRU-VNTR paternleri, rpoB ve katG genotipleri Tablo III’de, MIRU-VNTR ve/veya IS6110-RFLP yöntemi ile ortak kümeleşme gösteren izolatların IS6110-RFLP paternleri Şekil 1’de gösterilmiştir.

Çalışmamızda, allelik farklılığı ve ayrım gücü en yüksek olan lokuslar sırasıyla MIRU 16, MIRU 40, MIRU 26, MIRU 10, MIRU 04 ve MIRU 31 olarak belirlenmiştir (Tablo IV).

TARTIŞMA

Son yıllarda M.tuberculosis’in tiplendirmesinde yaygın olarak kullanılmaya

başlanılan MIRU-VNTR yönteminin rutin epidemiyolojik çalışmalarda

uygulanabileceği bildirilmektedir

. Bizim çalışmamızda RİF’e dirençli 26

M.tuberculosis izolatının 11’inin hem MIRU-VNTR hem de IS6110-RFLP

yöntemiyle kümeleşme göstermediği, beş izolatın (6 ve 9; 4, 34 ve 37) ise

her iki yöntemle de iki ayrı küme içinde yer aldığı belirlenmiş, bu 16 izolatta

MIRU-VNTR sonuçları ile IS6110-RFLP sonuçları arasında tam bir uyum

olduğu saptanmıştır. IS6110-RFLP yöntemiyle aynı küme içinde yer alan 15

ve 32 no’lu izolatların MIRU-VNTR yöntemiyle birbiriyle ilişkisiz suşlar olduğu

saptanmıştır. Ayrıca 15 no’lu izolatın rpoB geninde 526 CAC→GAC, 32 no’lu

izolatta ise 531 TCG→TGG mutasyonu saptanmıştır (Tablo III). Bu iki izolatın

Tablo III. Çalışmada İncelenen Mycobacterium tuberculosis kökenlerinin MIRU-VNTR Sonuçları (n=26)

1 4 2 2 5 4 2 5 1 5 3 3 2 3 526 CAC → CGC 315 AGC → ACC 34 2 2 5 4 2 5 1 5 3 3 2 3 526 CAC → CGC 315 AGC → ACC 37 2 2 5 4 2 5 1 5 3 3 2 3 526 CAC → CGC 31 5 A GC → ACC 2 6 2 2 3 1 2 5 1 4 3 3 2 5 531 TCG → TGG WT 9 2 2 3 1 2 5 1 4 3 3 2 5 531 TCG → TGG WT 3 15 3 3 3 2 1 5 1 5 3 2 2 1 526 CAC → GAC 315 AGC → ACC 4 32 2 2 5 1 2 5 1 1 3 3 2 1 531 TCG → TGG 315 AGC → ACC 5 14 2 1 5 1 2 5 1 1 3 3 2 2 531 TCG → T TG 315 AGC → ACC 25 2 1 5 1 2 5 1 1 3 3 2 2 531 TCG → T TG 315 AGC → ACC 3 2 1 5 1 2 5 1 1 3 3 2 2 531 TCG → T TG 315 AGC → ACC 29 2 1 5 1 2 5 1 1 3 3 2 2 531 TCG → T TG 315 AGC → ACC 35 2 1 5 1 2 5 1 1 3 3 2 2 531 TCG → T TG 315 AGC → ACC 6 30 2 1 5 1 2 5 1 1 3 3 2 3 522 TCG → T TG 315 AGC → ACC 7 26 2 2 4 1 2 5 1 1 3 3 2 2 526 CAC → TAC 315 AGC → ACC 40 2 2 4 1 2 5 1 1 3 3 2 2 531 TCG → T TG WT 8 43 3 2 3 1 2 5 1 5 3 3 2 2 516 GAC → TAC 315 AGC → ACC 9 19 1 1 3 3 2 5 1 4 3 3 2 3 513 CAA → CCA WT 10 50 2 2 3 1 2 5 1 4 3 3 2 3 531 TCG → T TG 315 AGC → ACC 11 7 1 2 4 3 2 5 1 5 3 2 2 3 531 TCG → T TG 315 AGC → ACC 12 24 2 2 5 2 2 5 1 1 3 2 2 2 531 TCG → T TG 315 AGC → ACA 13 8 2 2 4 3 2 5 1 5 3 3 2 2 531 TCG → T TG WT 14 28 2 2 3 0 2 5 1 6 3 3 2 5 533 CTG → CCG WT 15 44 2 2 4 3 2 3 1 5 3 4 2 3 531 TCG → T TG 315 AGC → ACC 16 27 2 2 4 0 2 5 1 5 3 3 1 3 526 CAC → TGC WT 17 45 2 2 3 0 2 5 1 4 3 2 2 4 516 GAC → GTC WT 18 31 2 2 3 0 2 5 1 4 3 2 2 2 531 TCG → T TG 315 AGC → ACC

Tablo IV. M.tuberculosis İzolatlarının MIRU-VNTR Lokuslarındaki Tekrar Sayıları ve Lokusların Ayrım Güçlerine Göre Sıralanması

Sıra MIRU No.

Tekrar Sayısı

h*

0 1 2 3 4 5 6

1 MIRU 16 4 13 2 4 3 – – 0.671

2 MIRU 40 – 2 11 9 1 3 – 0,668

3 MIRU 26 – 10 – – 6 9 1 0.664

4 MIRU 10 – – – 9 6 11 – 0.634

5 MIRU 04 – 7 18 1 – – – 0.425

6 MIRU 31 – – 5 20 1 – – 0.345

7 MIRU 02 – 2 22 2 – – – 0.244

8 MIRU 20 – 1 25 – – – – 0.037

MIRU 23 – – – 1 – 25 – 0.037

MIRU 39 – 1 25 – – – – 0.037

11 MIRU 24 – 26 – – – – – 0.000

MIRU 27 – – – 26 – – – 0.000

* Allelik farklılık.

Şekil 1. MIRU-VNTR ve/veya IS6110-RFLP yöntemi ile ortak kümeleşme gösteren

izolatların IS6110-RFLP paternleri.

9 kopya sayılı IS6110-RFLP paternleri tekrar incelendiğinde bazı bantların net olmadığı ve yapılan değerlendirmenin kuşkulu olduğu sonucuna varılmıştır (Şekil 1). IS6110-RFLP yönteminde bazen değerlendirmede güçlükler olduğu bildirilmektedir

. Bu bulgular, iki izolatın küme oluşturmadığını, MIRU-VNTR yönteminin sonucunun doğru olduğunu düşündürmektedir.

MIRU-VNTR yöntemiyle aynı küme içinde yer alan 14, 25, 29, 3 ve 35 no’lu izolatların IS6110-RFLP paternleri incelendiğinde 14 ve 25 no’lu suşların 4 kopya sayılı bir küme oluşturduğu, 29, 3, 35 no’lu suşların ise 30 no’lu suşla birlikte 2 kopya sayılı bir küme oluşturduğu belirlenmiştir. 14, 25, 29, 3 ve 35 no’lu izolatlarda rpoB geninde 531 TCG→TTG mutasyonu saptanırken, 30 no’lu izolatta 522 TCG→TTG mutasyonu saptanmıştır. Bu bulgular 14, 25, 29, 3 ve 35 no’lu izolatların iki ayrı küme (14 ve 25; 3, 29 ve 35) oluşturduklarını desteklemektedir. Bu altı izolat değerlendirildiğinde; IS6110-RFLP yönteminin 30 no’lu izolatı yanlış olarak 29, 3 ve 35 no’lu izolatlar ile aynı küme içinde gösterdiği, MIRU-VNTR yönteminin ise 14 ve 25 no’lu izolatların 29, 3 ve 35 no’lu izolatlardan ayrımında yetersiz kaldığı sonucuna varılmıştır. IS6110- RFLP’nin M.tuberculosis’in genotiplendirmesinde altın standart olmasına karşın kopya sayısının beşten az olduğu durumlarda ayrım gücünün yeterli olmadığı bilinmektedir

. Bizim çalışmamızda da IS6110-RFLP yöntemiyle ayrımı yapılmayan izolatın IS6110 kopya sayısının iki olduğu saptanmıştır.

MIRU-VNTR yöntemiyle aynı küme içinde değerlendirilen 26 ve 40 no’lu suşların IS6110-RFLP paternlerinin farklı olduğu saptanmıştır. Bu iki izolatın ayrıca rpoB (526 CAC→TAC ve 531 TCG→TTG) ve katG (315 AGC→ACC ve WT) genotiplerinin de farklı olması, bu izolatların epidemiyolojik olarak ilişkili olmadıklarını göstermektedir.

Yapılan çalışmalarda klasik 12 MIRU-VNTR lokusunun allelik farklılıkları dolayısıyla ayrım güçleri arasında önemli farklılıklar olduğu saptanmıştır

. Belirli bir bölgeden izole edilen kısıtlı sayıda ve yalnız RİF’e dirençli izolatların incelenmesine karşın, çalışmamızda da MIRU-VNTR lokuslarının ayrım güçleri arasında diğer çalışmalarla benzer farklılıklar saptanmış, allelik farklılığı ve ayrım gücü en yüksek olan lokuslar sırasıyla MIRU 16, MIRU 40, MIRU 26, MIRU 10, MIRU 04 ve MIRU 31 olarak belirlenmiştir (Tablo IV ve V). Supply ve arkadaşları

tarafından yapılan çalışmada, klasik olarak kullanılan MIRU 04, MIRU 26, MIRU 40, MIRU 10, MIRU 16, MIRU 31 lokuslarına Mtub04, ETR C, ETR A, Mtub30, Mtub39, QUB-4156, QUB-11b, Mtub21 ve QUB-26 lokuslarının eklenmesiyle oluşan 15 lokusun kullanılmasının MIRU-VNTR’nin ayrım gücünde önemli artışlar sağladığı, bu lokusların epidemiyolojik çalışmalar için yeterli olduğu bildirilmekte, sözü edilen 15 lokusa ek olarak MIRU 2, MIRU 23, MIRU 39, MIRU 20, MIRU 24, MIRU 27 ve Mtub29 lokuslarının kullanılmasıyla elde edilen toplam 24 lokusun ise filogenetik çalışmalar için kullanılması önerilmektedir.

IS6110-RFLP’nin halen M.tuberculosis’in genotiplendirmesinde altın standart

olmasına karşın, yeni tanımlanan 15 lokusun kullanılmasıyla MIRU-VNTR

yönteminin IS6110-RFLP düzeyinde ayrım gücüne ulaştığı bildirilmektedir

.

Isı döngü cihazının bulunduğu moleküler tekniklerin uygulanması için minimal koşulların bulunduğu laboratuvarlarda uygulanabilmesi, çalışma için az miktarda DNA’nın yeterli olması, kopya sayısının beşten daha az olduğu durumlarda ayrım gücünün IS6110-RFLP’den daha iyi olması ve sonuçların rakamsal olarak ifade edilmesi MIRU-VNTR’nin IS6110-RFLP’ye üstünlükleridir

. Ayrıca sonuçlar rakamsal olarak ifade edilebildiğinden MIRU-VNTR yöntemi, verilerin merkezi bir veritabanında saklanmasına ve web sitesi aracığıyla paylaşılabilmesine olanak tanımaktadır

.

Tablo V. 12 MIRU-VNTR Lokusunun Allelik Farklılıkları ve Ayrım Güçlerinin Karşılaştırılması

MIRU No.

Allelik farklılık (h) Chin ve

Jou¹⁴ (n:502)

Mazars ve ark¹⁵ (n:53)

Sola ve ark¹⁶ (n:116)

Sun ve ark¹⁷ (n:293)

Supply ve ark¹⁸ (n:90)

Supply ve ark¹⁸ (n:494)

çalışmaBu (n:26)

MIRU 02 0.084 0.02 0.241 0.20 0.1 0.16 0.244

MIRU 04 0.316 0.35 0.479 0.50 0.55 0.38 0.425

MIRU 10 0.659 0.69 0.617 0.71 0.79 0.74 0.634

MIRU 16 0.309 0.52 0.526 0.31 0.48 0.53 0.671

MIRU 20 0.058 0.29 0.205 0.03 0.2 0.30 0.037

MIRU 23 0.343 0.58 0.656 0.42 0.68 0.65 0.037

MIRU 24 0.199 0.24 0.445 0.35 0.39 0.35 0.000

MIRU 26 0.770 0.67 0.688 0.73 0.72 0.75 0.664

MIRU 27 0.166 0.19 0.124 0.21 0.2 0.25 0.000

MIRU 31 0.702 0.37 0.647 0.64 0.7 0.72 0.345

MIRU 39 0.541 0.34 0.394 0.60 0.41 0.45 0.037

MIRU 40 0.475 0.74 0.797 0.54 0.71 0.73 0.668

Sonuç olarak 15 lokusun kullanıldığı MIRU-VNTR yöntemi epidemiyolojik çalışmalarda kullanılabilir. Bununla birlikte genotiplendirmenin moleküler epidemiyolojinin bileşenlerinden sadece biri olduğu unutulmamalı, epidemiyolojik çalışmalar planlanırken yanıtı aranılan soru iyi sorulmalı, olgu bilgileri ve diğer veriler kaliteli ve standart bir şekilde tutulmalıdır. Ayrıca epidemiyolojik çalışmalardan elde edilen verilerin iyi hazırlanmış bir ulusal veritabanında toplanması çalışma sonuçlarının ülke yararına somut uygulamalara dönüştürülmesi açısından yarar sağlayabilir.

KAYNAKLAR

1. Alland D, Kalkut GE, Moss AR, et al. Transmission of tuberculosis in New York City. An analysis by DNA fingerprinting and conventional epidemiologic methods. N Engl J Med 1994;

330: 1710-6.

2. Benjamin WH Jr, Lok KH, Harris R, et al. Identification of a contaminating Mycobacterium tuberculosis strain with a transposition of an IS6110 insertion element resulting in an altered spoligotype. J Clin Microbiol 2001; 37: 1092-6.

3. van Soolingen D. Molecular epidemiology of tuberculosis and other mycobacterial infections:

main methodologies and achievements. J Intern Med 2001; 249: 1-26.

4. Goyal M, Saunders NA, van Embden JDA, Young DB, Shaw RJ. Differentiation of Mycobacterium tuberculosis isolates by spoligotyping and IS6110 restriction fragment length polymorphism.

J Clin Microbiol 1997; 35: 647-51.

5. Kamerbeek J, Schouls L, Kolk A, et al. Simultaneous detection and strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology. J Clin Microbiol 1997; 35: 907-14.

6. Goguet de la Salmoniere Y, Li HM, Torrea G, Bunschoten A, Van Embden J, Gicquel B.

Evaluation of spoligotyping in a study of the transmission of Mycobacterium tuberculosis.

J Clin Microbiol 1997; 35: 2210-4.

7. Barlow REL, Gascoyne-Binzi DM, Gillespie SH, Dickens A, Qamer S, Hawkey PM. Comparison of variable number tandem repeat and IS6110-restriction fragment length polymorphism analyses for discrimination of high- and low-copy-number IS6110 Mycobacterium tuberculosis isolates.

J Clin Microbiol 2001; 39: 2453-7.

8. Filliol I, Ferdinand S, Negroni L, Sola C, Rastogi N. Molecular typing of Mycobacterium tuberculosis based on variable number of tandem DNA repeats used alone and in association with spoligotyping. J Clin Microbiol 2000; 38: 2520-4.

9. Gopaul KK, Brown TJ, Gibson AL, Yates MD, Drobniewski FA. Progression toward an improved DNA amplification-based typing technique in the study of Mycobacterium tuberculosis epidemiology. J Clin Microbiol 2006; 44: 2492-8.

10. Cavusoglu C, Hilmioglu S, Guneri S, Bilgic A. Characterization of rpoB mutations in rifampin- resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis from Turkey by DNA sequencing and line probe assay. J Clin Microbiol 2002; 40: 4435-8.

11. Cavusoglu C, Durmaz R, Bilgic A, Gunal S: Genotyping of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from western Turkey. Ann Saudi Med 2004; 24: 102-5.

12. Cavusoglu C, Turhan A, Akinci P, Soyler I. Evaluation of the genotype MTBDR assay for rapid detection of rifampin and isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates. J Clin Microbiol 2006; 44: 2338-42.

13. Supply P. Multilocus variable number tandem repeat genotyping of Mycobacterium tuberculosis.

Technical Guide. Institut de Biologie/Institut Pasteur de Lille, 2005.

14. Chin PJ, Jou R. A modified automated high-throughput mycobacterial interspersed repetitive unit method for genotyping Mycobacterium tuberculosis. Diagn Microbiol Infect Dis 2005; 53: 325-7.

15. Mazars E, Lesjean S, Banuls A, et al. High-resolution minisatellitebased typing as a portable approach to global analysis of Mycobacterium tuberculosis molecular epidemiology. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 1901-6.

16. Sola C, Filliol I, Legrand E, et al. Genotyping of the Mycobacterium tuberculosis complex using MIRUs: association with VNTR and spoligotyping for molecular epidemiology and evolutionary genetics. Infect Genet Evol 2003; 3: 125-33.

17. Sun YJ, Bellamy R, Lee ASG, et al. Use of mycobacterial interspersed repetitive unit-variable- number tandem repeat typing to examine genetic diversity of Mycobacterium tuberculosis in Singapore. J Clin Microbiol 2004; 42: 1986-93.

18. Supply P, Allix C, Lesjean S, et al. Proposal for standardization of optimized mycobacterial interspersed repetitive unit–variable-number tandem repeat typing of Mycobacterium tuberculosis.

J Clin Microbiol 2006; 44: 4498-510.

19. Kremer K, Arnold C, Cataldi A, et al. Discriminatory power and reproducibility of novel DNA typing methods for Mycobacterium tuberculosis complex strains. J Clin Microbiol 2005;

43: 5628-38.

20. van Deutekom H, Supply P, de Haas PEW, et al. Molecular typing of Mycobacterium tuberculosis

by mycobacterial interspersed repetitive unit–variable-number tandem repeat analysis, a more

accurate method for identifying epidemiological links between patients with tuberculosis. J Clin

Microbiol 2005; 43: 4473-9.