T.C.
KASTAMONU ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
AKÇAKESME (Phillyrea latifolia) BİTKİSİNİN GÖKKUŞAĞI
ALABALIKLARININ (Oncorhynchus mykiss) BAĞIŞIKLIK
YANITI ÜZERİNE ETKİLERİNİN BELİRLENMESİ
Abobaker B. Ali BARKA
Danışman Doç. Dr. Soner BİLEN
Jüri Üyesi Prof. Dr. Sabri ÜNAL
Jüri Üyesi Prof. Dr. Derya GÜROY
Jüri Üyesi Doç. Dr. Betül GÜROY
Jüri Üyesi Dr. Öğr. Üyesi Kerim GÜNEY
DOKTORA TEZİ
ORMAN MÜHENDİSLİĞİ ANA BİLİM DALI KASTAMONU – 2019
ÖZET
Doktora Tezi
AKÇAKESME (Phillyrea latifolia) BİTKİSİNİN GÖKKUŞAĞI
ALABALIKLARININ (Oncorhynchus mykiss) BAĞIŞIKLIK YANITI ÜZERİNE ETKİLERİNİN BELİRLENMESİ
Abobaker B. Ali BARKA Kastamonu Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Orman Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Danışman: Doç. Dr. Soner BİLEN
Özet: Büyümeyi destekleyici özelliği, antioksidant ve immünostimülant aktiviteleri ile şifalı bitkiler yem katkı maddesi olarak son yıllarda kullanılmaktadır. Bu çalışmada akçakesme bitkisi (Phillyrea latifolia) sulu metanolik ekstraktının gökkuşağı alabalıklarındaki spesifik olmayan bağışıklık yanıta, hematolojik parametrelere, büyüme performansına ve antioksidan enzim aktivitelerine etkisiaraştırılmıştır. Ortalama başlangıç ağırlığı 41.71 ± 1.08 g olan balıklar 7 gruba ayrılarak (Kontrol (% 0), yaprak % 0.1 (PLY0.1), yaprak % 0.5 (PLY0.5), yaprak % 1 (PLY1), meyve 0.1 % 9 (PLM0.1), meyve% 0.5 (PLM0.5), meyve% 1 (PLM1)) 21 adet ağ kafese (1.5m X 1.5m X 1.5m),40 balık / net kafes olacak şekilde stoklanmıştır (her deneme grubu için üçlü kafes olacak şekilde). Bağışıklık yanıt ve hematolojik sonuçları belirlemek için, çalışmanın 15., 45. ve 75. gününde, süperoksit anyon üretimi (SAP), lizozim (LYS), miyeloperoksidaz aktivitesi (MPO), kırmızı kan hücreleri sayısı (RBC), hemoglobin içeriği (Hb), hematokrit değeri (Hct) ve kırmızı kan hücrelerinin endeksleri; sırasıyla ortalama hücre hacmi (MCV), ortalama hücre hemoglobini (MCH) ve ortalama hücre hemoglobin konsantrasyonu (MCHC) incelenmiştir. Çalışmanın sonunda büyüme performansı, ağırlık artışı (WG), spesifik büyüme oranı (SGR) ve yem dönüşüm oranı (FCR) yanısıra, antioksidan aktivite, süperoksit dismutaz (SOD), katalaz (CAT), glutatyon peroksidaz (GPx) ve lipid peroksidasyon seviyesi (LPO) analiz edilmiştir. Çalışmanın 15. gününde, SAP sonuçları tüm deney gruplarında kontrol grubuna göre daha yüksek bulunmuştur (P <0.05). En yüksek SAP PLM0.1 ve PLM1 gruplarında belirlenmiştir (P <0.05). Çalışmanın 75. gününde SAP PLY0.1 ve PLY0.5 gruplarında anlamlı olarak azalmıştır. Tüm deney gruplarında LYS aktivitesi, çalışmanın 75. gününde PLY0.5 grubu (P> 0.05) hariç kontrole (P <0.05) göre yükselmiştir. Çalışmanın 45. gününde MPO aktivitesi tüm deney gruplarında kontrol grubuna göre artmıştır (P <0.05). Hematolojik sonuçlar, hemen hemen tüm deney grubunda kontrol grubuna kıyasla herhangi bir zamanda yapılan örneklemede artış göstermiştir.
Çalışmanın sonunda sonuçlar, PLY0.5 ve PLM0.5 gruplarının nihai ağırlığının, WG ve SBO'sunun kontrol ve diğer deney gruplarından daha yüksek olduğunu göstermiştir (P<0.05). PLY0.1, PLM0.1, PLM0.5 ve PLM1 gruplarında FCR değerleri kontrol grubuna göre anlamlı olarak artmıştır. PLY0.1 ve PLY0.5 gruplarında kontrol grubuna
göre farklılık gözlenmemiştir (P> 0.05). SOD aktivitesi PLY1, PLM0.1 ve PLM0.5 gruplarında kontrol grubuna göre azalma göstermiştir (P <0.05). Diğer grupların SOD aktivitesinde farklılık görülmemiştir (P> 0.05). PLY0.1 ve PLM0.1 gruplarında CAT kontrol grubuna göre azalmıştır. Kontrol grubu ile PLM0.5 grubu arasında anlamlı bir fark gözlenmemiştir. PLY0.1, PLY1 ve PLM1 gruplarının CAT aktivitesi kontrole kıyasla artmıştır (P <0.05). Tüm PLM gruplarında ve aynı zamanda PLY gruplarının kontrol grubuna göre karşılaştırılması sonucunda GPx değerinin arttığı görülmüştür.
Tüm bu çalışma sonuçları hem PLY0.5, hem de PLM0.5'in büyüme destekleyici etkilerinin olduğunu göstermiştir. PLY0.5 ayrıca FCR değeriyle öne çıkmıştır. Çalışma sonuçlarından, yaprak ve meyvelerin immünostimülant ve antioksidan aktiviteye sahip olduğu sonucuna varılmıştır. Çalışmada, akçakesme (Phillyrea latifolia) sulu metanolik özütünün, O. mykiss diyetinde yem katkı maddesi olarak kullanılabileceği sonucuna varılmıştır.
Anahtar Kelimeler: Akçakesme, Gökkuşağı alabalığı, İmmün yanıt, İmmün uyarıcı
2019, 57 sayfa Bilim Kodu: 1205
ABSTRACT
Ph. D. Thesis
DETERMINATION OF IMMUNOSTIMULANT EFFECTS OF
GREEN OLIVE TREE (Phillyrea latifolia) IN RAINBOW TROUT
(Oncorhynchus mykiss) IMMUNE SYSTEM
Abobaker B. Ali BARKA Kastamonu University
Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Forest Engineering
Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Soner BİLEN
Abstract: Medicinal plants have beentaken into consideration with their growth promotor, antioxidant and immunostimulant activities as feed additive in recent years. With this purposes, in the present study, the effects of green olive tree (Phillyrea latifolia) aqueous methanolic extract non-specific immune responses,haematological parameters, on growth performance and antioxidant enzyme activity in rainbow trout were investigated.Fish with an average initial weight 41.71 ± 1.08 g,were divided into 7 groups (Control (0%), leave 0.1% (PLY0.1), leave 0.5% (PLY0.5), leave 1% (PLY1), fruit 0.1% (PLM0.1), fruit 0.5% (PLM0.5), fruit 1% (PLM1)) in 21net cages (1.5m X 1.5m X 1.5m) with stocking density of 40 fish/net cage (triplicate net cage were assigned for each experimental group). To determine immune and haematological responses, on 15th, 45th and 75th day of the study, superoxide anion production (SAP), lysozyme (LYS), myeloperoxidase activity (MPO), red blood cells (RBC) count, haemoglobin content (Hb), haematocrit value (Hct) and red blood cells indices including; the mean cell volume (MCV), mean cell haemoglobin (MCH) and mean cell haemoglobin concentration (MCHC) were examined respectively.At the end of the study to determine growth performance, weight gain (WG), specific growth rate (SGR) and feed conversion ratio (FCR), to determine antioxidant activity, superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) and lipid peroxidation level (LPO) were analysed. 15th day of the study, SAP results were found higher in all experimental groups compared to control (P<0.05). The highest SAP was determined on PLM0.1 and PLM1 groups (P<0.05). 75th day of the study, SAP was significantly decreased in PLY0.1 and PLY0.5 groups. LYS activity was elevated in all experimental groups compared to control (P<0.05) except PLY0.5 group (P>0.05) on 75th day of the study. Increased MPO activity was determined 45th day of the study in all experimental groups compared to control (P<0.05). haematological results showed an increase in almost all experimental group on any sampling time compared to control.
At the end of the study, the results showed that final weight, WG and SBO of the PLY 0.5 and PLM 0.5 groups were higher than the control and other experimental groups (P <0.05). FCR was significantly increased on PLY0.1, PLM0.1, PLM0.5 and PLM1 groups compared to control. No differences were observed on PLY0.1 and PLY0.5 group compared with the control (P>0.05). SOD activity was decreased in PLY1,
PLM0.1 and PLM0.5 groups compared to control (P<0.05). Other group’s SOD activity showed no differences (P>0.05). CAT was decreased in PLY0.1 and PLM0.1 groups compared to control. There is not any significant differences wereobserved between control and PLM0.5 group. PLY0.1, PLY1 and PLM1 groups’ CAT activity was increased compare to control (P<0.05). GPx as increased in all PLM groups and also PLY groups compared to control.
All these study results showed that both PLY0.5 and PLM0.5 have growth promoter effects. PLY0.5 also come forward with its FCR value. From the study results, it n also conclude that leaves and fruits have immunostimulant and antioxidant activity. As a conclusion green olive tree (Phillyrea latifolia) aqueous methanolic extract can be used as a feed additive in O. mykiss diet.
Key Words: Green olive tree, Rainbow trout, Immune response, Immunostimulant 2019, 57 pages
TEŞEKKÜR
Tez çalışması boyunca yardımlarını esirgemeyen danışmanım Doç. Dr. Soner BİLEN’e, saha ve laboratuvar çalışmalarındaki katkılarından dolayı özellikle Dr. Öğr. Üyesi Keriman YÜRÜTEN ÖZDEMİR ve son olarak da bu süreçte manevi desteğini hiç eksik etmeyen sevgili aileme teşekkürü borç bilirim.
Abobaker B. Ali BARKA Kastamonu, Ağustos, 2019
İÇİNDEKİLER
Sayfa TEZ ONAYI...
... Hata! Yer işareti tanımlanmamış. TAAHHÜTNAME ... ... Hata! Yer işareti tanımlanmamış.
ÖZET... iii ABSTRACT ... v TEŞEKKÜR ... vii İÇİNDEKİLER ... viii SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ ... x ŞEKİLLER DİZİNİ ... xii TABLOLAR DİZİNİ ... xi GRAFİKLER DİZİNİ ... xii FOTOĞRAFLAR DİZİNİ ... xii 1. GİRİŞ ... 1
1.1. Gökkuşağı Alabalığının (Oncorhynchus mykiss Walbaum, 1972) Biyolojik Özellikleri ve Yetiştiricilik Koşulları ... 2
1.2. Akça Kesme (Phillyrea latifolia) ... 4
1.3. Balıklarda Bağışıklık Sistemi ... 5
1.3.1. Doğal bağışıklık (Spesifik olmayan savunma) ... 5
1.3.2. Kazanılmış bağışıklık (Spesifik savunma) ... 6
1.3.1.1. Humoral bağışıklık ... 6
1.3.1.2. Selüler bağışıklık ... 7
1.4. Balıklarda Antioksidan Enzim Sistemi ... 7
1.4.1. Süperoksit dismutaz (SOD) ... 8
1.4.2. Katalaz (CAT) ... 8
1.4.3. Glutatyon peroksidaz (GSH-Px) ... 9
1.4.4. Lipid peroksidaz (LPO) ... 10
2. YAPILAN ÇALIŞMALAR ... 11
2.1. Tıbbi Bitkilerin Balıkların Büyüme Performansı ve Bağışıklık Sistemi Üzerine Etkileri ... 11
2.2. Tıbbi Bitkilerin Balıkların Antioksidan Sistemine Etkileri ... 15
3. YÖNTEM ... 19
3.1. Materyal ... 19
3.1.1. Deneme Yeri ve Süresi ... 19
3.1.2. Deneme Balıkları ... 19
3.1.3. Denemede Kullanılan Su Kaynağı ... 20
3.1.4. Denemede Kullanılan Tıbbi Bitki ... 20
3.1.5. Deneme Yemleri ... 20
3.2.1. Denemenin Yürütülmesi ve Yemleme Programının Düzenlenmesi 21
3.2.2. Tıbbi Bitkinin Sulu Metanolik Ekstraklarının çıkarılması ... 21
3.2.3. Balıklardaki Büyüme Performansının Hesaplanması ... 22
3.2.4. İmmunolojik Analizler... 24
3.2.4.1. Kan ve Plazma Toplanması ... 24
3.2.4.2. NBT Aktivitesi ... 24
3.2.4.3. Lizozim Aktivitesi Tespiti ... 24
3.2.4.4. Myeloperoksidaz (MPO) Aktivitesi ... 25
3.2.5. Hematolojik Analizler ... 25
3.2.5.1. Eritrosit Sayımı ... 26
3.2.5.2. Hematokrit Seviyesinin Tespit Edilmesi ... 26
3.2.5.3. Hemoglobin Miktarının Tayini ... 26
3.2.5.4. Eritrosit indeksleri ... 26
3.2.5.4.1 Ortalama Eritrosit Hacmi (MCV) ... 26
3.2.5.4.2. Eritrosit Başına Düşen Ortalama Hemoglobin (MCH) ... 26
3.2.5.4.3. Eritrosit Başına Düşen Ortalama Hemoglobin Konsantrasyonu (MCHC) ... 27
3.2.6. Antioksidan Enzim Aktiviteleri ... 27
3.2.6.1. Süperoksit Dismutaz (SOD) Aktivitesi ... 27
3.2.6.2. Katalaz (CAT) Aktivitesi ... 28
3.2.6.3. Glutatyon Peroksidaz (GSH-Px) Aktivitesi ... 28
3.2.6.4. Lipit Peroksidasyonu ... 29
3.2.7. İstatistiksel Analizler ... 29
4. BULGULAR ... 30
4.1. Büyüme Performansında Meydana Gelen Değişimler ... 30
4.2. İmmun Yanıtlarda Meydana Gelen Değişimler ... 31
4.2.1. Süperoksit Anyon Üretimi (NBT) ... 31
4.2.2. Lizozim Aktivitelerinde Meydana Gelen Değişimler... 31
4.2.3. Myeloperoksidaz Aktivitelerinde Meydana Gelen Değişimler ... 32
4.3. Kan Parametrelerinde Meydana Gelen Değişimler ... 33
4.4. Antioksidan Yanıtlar ... 34
4.4.1. Süperoksit Dismutaz (SOD) Aktivitesinde Meydana Gelen Değişimler... 34
4.4.2. Katalaz (CAT) Aktivitesinde Meydana Gelen Değişimler ... 36
4.4.3. Glutatyon Peroksidaz (GPx) Aktivitesinde Meydana Gelen Değişimler... 37
5. SONUÇ VE ÖNERİLER ... 41
KAYNAKLAR ... 47
SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ Simgeler U Unite µl Mikrolitre µg Mikrogram o Derece % Yüzde Kısaltmalar C Santigrat CAT Katalaz Dk Dakika DNA Deoksiribonükleikasit EDTA Etilen-diamin-tetra-asetat
FAO Food and Agriculture Organization g Gram
Gr + Gram Pozitif
G6PDH Glukoz 6-Fostat Dehidrogenaz GR Glutatyon Redüktaz GPX Glutatyon Peroksidaz GSH Glutatyon GST Glutatyon S Transferaz HCT Hematokrit HGB Hemoglobin H2O2 Hidrojen Peroksit kg Kilogram l Litre
MCH Eritrosit başına düşen ortalama hemoglobin
MCHC Eritrosit başına düşen ortalama hemoglobin konsantrasyonu MCV Ortalama eritrosit hacmi
MDA Malondialdehit mg Miligram ml Mililitre POD Peroksidaz OH Hidroksil O2 Oksijen OH- Hidroksit RBC Kırmızı Kan Hücresi ROS Reaktif Oksijen Türleri SOD Süperoksit Dismutaz
TOS Toplam Oksidan Durum TUİK Türkiye İstatistik Kurumu
ŞEKİLLER DİZİNİ
Sayfa Şekil 1.1. SOD enziminin dönüşüm reaksiyonu ... 8 Şekil 1.2. CAT enzimi dönüşüm reaksiyonu ... 9 Şekil 1.3. GSH-Px enziminin dönüşüm reaksiyonu ... 9
TABLOLAR DİZİNİ
Sayfa Tablo 1.1. Türkiye’deki gökkuşağı alabalığı yetiştiriciliği miktarları
(TÜİK,2019) ... 3 Tablo 3.1. Ticari Deney Yemlerinin Bileşenleri ... 21 Tablo 4.1 Akça kesme (Phillyrea latifolia) yaprak ve meyvelerinin methanolik
özütü ile 75 gün boyunca beslenen gökkuşağı alabalıklarının büyüme performanslarında meydana gelen değişimler ... 30 Tablo 4.2.Akça kesme (Phillyrea latifolia) yaprak ve meyvelerinin methanolik
özütü ile 75 gün boyunca beslenen gökkuşağı alabalıklarının kan parametrelerinde meydana gelen değişimler ... 33
GRAFİKLER DİZİNİ
Sayfa Grafik 4.1.Akça kesme (Phillyrea latifolia) yaral ve meyvelerinin methanolik
özütü ile yetmiş beş gün boyunca beslenen gökkuşağı alabalıklarında süperoksit anyon üretimlerinde meydana gelen değişimler (mg/ml). Küçük üstel ifadeler grupların aynı örnekleme günündeki kendi aralarındaki farklılığı ifade eder (n=3) ... 31 Grafik 4.2.Akça kesme (Phillyrea latifolia) yaral ve meyvelerinin methanolik
özütü ile yetmiş beş gün boyunca beslenen gökkuşağı alabalıklarında lizozim aktivitelerinde meydana gelen değişimler (U/ml). Küçük üstel ifadeler grupların aynı örnekleme günündeki kendi aralarındaki farklılığı ifade eder (n=3) ... 32 Grafik 4.3. Akça kesme (Phillyrea latifolia) yaral ve meyvelerinin methanolik
özütü ile yetmiş beş gün boyunca beslenen gökkuşağı alabalıklarında myeloperoksidaz aktivitelerinde meydana gelen değişimler (O.D. 540). Küçük üstel ifadeler grupların aynı örnekleme günündeki kendi aralarındaki farklılığı ifade eder (n=3). ... 33 Grafik 4.4. Akça kesme (Phillyrea latifolia) yaral ve meyvelerinin methanolik
özütü ile yetmiş beş gün boyunca beslenen gökkuşağı alabalıklarının karaciğer dokularında süperoksit dismutaz aktivitelerinde meydana gelen değişimler (% inhibisyon). (Tüm verilerin ortalamaları ve standart sapmaları verilmiştir (n= 3). Küçük üst harfler grupların aynı örnekleme günü kendi aralarındaki farklılığı ifade eder. ... 35 Grafik 4.5. Akça kesme (Phillyrea latifolia) yaral ve meyvelerinin methanolik
özütü ile yetmiş beş gün boyunca beslenen gökkuşağı alabalıklarının karaciğer dokularında relativ süperoksit dismutaz aktivitesi ... 35 Grafik 4.6. Akça kesme (Phillyrea latifolia) yaral ve meyvelerinin methanolik
özütü ile yetmiş beş gün boyunca beslenen gökkuşağı alabalıklarının karaciğer dokularında katalaz aktivitelerinde meydana gelen değişimler (nmol/min/ml). (Tüm verilerin ortalamaları ve standart sapmaları verilmiştir (n= 3). Küçük üst harfler grupların aynı örnekleme günü kendi aralarındaki farklılığı ifade eder. ... 36 Grafik 4.7. Akça kesme (Phillyrea latifolia) yaral ve meyvelerinin methanolik
özütü ile yetmiş beş gün boyunca beslenen gökkuşağı alabalıklarının karaciğer dokularında relativ katalaz aktivitesi ... 37 Grafik 4.8. Akça kesme (Phillyrea latifolia) yaral ve meyvelerinin methanolik
özütü ile yetmiş beş gün boyunca beslenen gökkuşağı alabalıklarının karaciğer dokularında glutatyon peroksidaz aktivitelerinde meydana gelen değişimler (nmol/min/ml). (Tüm verilerin ortalamaları ve standart sapmaları verilmiştir (n= 3). Küçük üst harfler grupların aynı örnekleme günü kendi aralarındaki farklılığı ifade eder. ... 38 Grafik 4.9. Akça kesme (Phillyrea latifolia) yaral ve meyvelerinin methanolik
özütü ile yetmiş beş gün boyunca beslenen gökkuşağı alabalıklarının karaciğer dokularında relativ glutatyon peroksidaz aktivitesi ... 38 Grafik 4.10. Akça kesme (Phillyrea latifolia) yaprak ve meyvelerinin
alabalıklarının kas dokularında Lipid Peroksidasyonu aktivitelerinde meydana gelen değişimler (µM MDA). ... 39 Grafik 4.11. Akça kesme (Phillyrea latifolia) yaprak ve meyvelerinin
methanolik özütü ile yetmiş beş gün boyunca beslenen gökkuşağı alabalıklarının karaciğer dokularında relativ LPO aktivitesi. ... 40
FOTOĞRAFLAR DİZİNİ
Sayfa Fotoğraf 1.1. Akça kesme (Phillyrea latifolia) (Özgün) ... 5 Fotoğraf 3.1. Deneme kafesleri (Özgün)... 19 Fotoğraf 3.2. Evaparatör yardımıyla bitkilerden özüt elde edilmesi (Özgün) .... 22 Fotoğraf 3.3. Hemogram Cihazı BC-3000Plus (Özgün) ... 25
1. GİRİŞ
Dünya nüfusun giderek artmasıyla ortaya çıkan gıda yetersizliği, insanların ekonomik, kültürel ve sosyal yaşam düzeylerinin yükselmesiyle birlikte daha kaliteli beslenme bilincinin ortaya çıkmasıyla su ürünleri yetiştiriciliği her geçen yıl daha da önem kazanmaktadır. FAO (2017) verilerine göre dünya genelinde 2030 yılında hayvansal protein tüketiminin 40 kg’a ulaşacağı tahmin edilmektedir. Bu bağlamda özellikle 2050’li yıllardan sonra insanların hayvansal protein ihtiyaçlarının %60 oranında su ürünlerinden temin edilecek olması su ürünleri üretimi üzerine dikkat çekmektedir. Denizde avcılık yolu ile elde edilen su ürünlerinin kısıtlı olması da yetiştiricilik koşulları üretilen ürünlere daha büyük önem verileceğini göstermektedir (Bilen, Bilen ve Önal, 2015; FAO, 2017).
Gelişen su ürünleri yetiştiriciliğine paralel olarak üretimi yapılan türler üzerindeki stres ve yaşamsal fonksiyonların ve aynı zamanda hayvan refahının azalması, çevresel baskıların oluşması üretimi kısıtlayıcı olarak göze çarpmaktadır. Su ürünleri yetiştiriciliğinde farklı dönemlerde meydana gelen ani su sıcaklığı değişimi, balıkların nakil ve aşılama veya çevresel etkilerden meydana gelen stres üretim ayağının önemli sorunu oluşturmaktadır. Bununla birlikte stok yoğunluğunun yüksek oranda olması ve üretimin farklı dönemlerinde balıkların maruz kaldığı uygulamalar bakteriyel hastalıkların yaygın olarak görülmesine neden olmaktadır. Ayrıca balıkların büyüme performanslarında düşüş ve balık ölümlerinin yaşanması da çiftliklerde büyük ekonomik kayıplar meydana getirmektedir (Arda, Seçer ve Sarıeyyüpoğlu, 2002; Can, 2006; Altun, Danabaş, Çelik ve Öz, 2007). Bu nedenlerle de su ürünleri yetiştiriciliğinde hastalıklara karşı etkin tedavi yöntemlerinin belirlenmesi önem arz etmektedir.
Balık sağlığını korumada bağışıklık uyarıcılar bir alternatif olarak sunulabilmektedir (Bilen, Altunoğlu, Ulu ve Biswas, 2016). Tıbbi bitkilerin bu alanlardaki kullanımları geniş çalışma alanı bulmakta aynı zamanda antioksidan etkileri üzerine de dikkatleri çekmektedir (Çek, Turan ve Atik, 2007; Keser ve Bilal, 2008; Sönmez, Bilen, Alak, Hisar, Yanık, ve Biswas, 2015). Tıbbi bitkilerin çevre için güvenli, maliyet
bakımından uygun olması da avantaj yaratmaktadır. Organik balık yetiştiriciliğinin gündeme gelmesiyle birlikte tıbbi bitkilerin immunostimulant olarak kullanımı daha çok dikkat çekmiştir.
Bu bağlamda çalışmamızda, doğada doğal olarak bol bulunan akça kesme (Phillyrea latifolia) bitkisinin yaprak ve meyvelerinden elde edilen sulu methanolik özütün gökkuşağı alabalıklarının (Onchorhynchus mykiss) antioksidan sistemine, bağışıklık yanıtlarına, hematoloji ve büyüme performansına etkileri incelenmiştir. Çalışmadaki temel amaç, balık üretiminde kullanılabilecek, temini ve işlenmesi kolay ve aynı zamanda antioksidan özellik gösteren yeni ürünlerin ortaya çıkarılması ve su ürünleri sektörü içeresinde kullanılmasının sağlanmasıdır.
1.1. Gökkuşağı Alabalığının (Oncorhynchus mykiss Walbaum, 1972) Biyolojik Özellikleri ve Yetiştiricilik Koşulları
Gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss) Kuzey Amerika orijinli bir balık türü olup tüm dünyada yayılım göstermektedir. Soğuk, berrak ve yüksek oranda çözünmüş oksijen miktarına sahip sularda yaşamaktadır. Uygun olmayan çevre koşullarına karşı adaptasyon sağlayabilme özelliğine sahip bir türdür. Yüksek adaptasyon ve yemden yararlanma yeteneği, yapay yöntemlerle yumurta elde edilmesinin kolaylığı, kuluçka süresinin kısalığı ve hastalıklara karşı dirençli olması nedenlerinden dolayı yetiştiricilikte tercih edilen bir türdür (Lindhors-Emme, 1990; Emre, 2004). Avrupa’ya 1880 yılında ve Türkiye’ye 1967 yılında yetiştiriciliği yapılması amacıyla getirilmiştir. Türkiye bilimsel düzeyde gökkuşağı alabalığı yetiştiriciliğine 1971 yılında başlamıştır (FAO, 2017).
Tablo 1.1.Türkiye’deki gökkuşağı alabalığı yetiştiriciliği miktarları (TÜİK,2019)
YIL ÜRETİM MİKTARI (ton)
2008 154 907 2009 163 958 2010 174 220 2011 196 487,0 2012 215 644,0 2013 238 580,1 2014 239 945,0 2015 246 521,0 2016 258 038,0 2017 281 474,0
Gökkuşağı alabalığı, optimum büyümeyi yaklaşık olarak 18°C’deki su sıcaklıklarında gerçekleştirmektedir. 6-20°C arasındaki su sıcaklıklarında büyümeyi sürdürebilmelerine rağmen 1°C’den düşük ve 25°C den daha yüksek sıcaklıktaki sularda gökkuşağı alabalıklarında ölümlerin meydana geldiği rapor edilmiştir. Çözünmüş oksijen miktarının 6 mg/l‘den daha yüksek ve pH’nın 6-8,5 değerleri arasında olması gerektiği belirtilmiştir (Pennell ve Barton, 1996).
1.2. Akça Kesme (Phillyrea latifolia) Sınıf: Magnoliophyta Altsınıf: Magnoliidae Takım: Orobanchaceae Familya: Parentucellia Cins: Phillyrea Tür: Phillyrea latifolia
Akça kesme (Phillyrea latifolia) genellikle Akdeniz’in kıyı bölgelerinde yetişen ve morfolojik ve eko-fizyolojik özellikleri nedeniyle kuraklığa dayanıklı olarak bilinen çok yıllık bir ağaç türüdür (Oppenheimer, 1953; Pignatti, 1982; Gellini vd., 1983). Akdeniz bölgesinin tıbbi tarihinde çok önemli bir rol oynamaktadır (Pieroni ve Pachaly, 2000). Akça kesmenin yapraklarından ve meyvelerinden hazırlanan infüzyonlar kanamayı durdurucu, idrar söktürücü, ağız ülseri ve iltihaplanmasında tedavi edici olarak kullanılır (Diaz vd., 2000, 2001). Ürdün’de akça kesme sarılık hastalığının tedavisinde kullanılan en etkili tıbbi bitkidir (Janakat ve Al-Merie, 2002). Akça kesme tuzluluk stresine karşı oldukça toleranslıdır (Tattini vd., 2000; Agati vd., 2002). Çünkü yapraklarında flovonoidler özellikle de flavonoid ve glikonlar birikir ve bunlar da bitkiyi kurak veya yarı kurak bitki örtüsünden, UV radyasyonundan korumakla görevlidirler (Wollenweber ve Dietz, 1981; Gucci vd., 1997).
Fotoğraf 1.1. Akça kesme (Phillyrea latifolia) (Özgün)
1.3. Balıklarda Bağışıklık Sistemi
Bağışıklık canlılarda enfeksiyonlara karşı korunma da en önemli bir fizyolojik mekanizmadır (Ellis, 1989). Balıkların sucul ortamda zararlı mikroorganizmalardan korunmaları gerekmektedir. Bu da çeşitli savunma mekanizmalarıyla mümkün olacaktır. Balıklardaki bağışıklık mekanizması; doğal (spesifik olmayan) ve kazanılmış (spesifik) bağışıklık olarak ikiye ayrılmaktadır (Siwicki ve Anderson, 1993; Noguchi, 1998).
1.3.1. Doğal bağışıklık (Spesifik olmayan savunma)
Doğal bağışıklık, doğuştan savunma mekanizmalarına dayanır ve vücuda girebilecek çok geniş bir zarar verme mekanizmasına karşı non-spesifik olarak çalışır. Bu savunma mekanizması (spesifik olmayan bağışıklık sistemi) fagositik hücrelerin faaliyetini, interferonları ve vücutta çeşitli doğal olarak oluşan lizozim, C-reaktif protein, aglutinin ve lizin gibi maddelerin etkisini içermektedir (Busch, 1981; Ellis, 1989; Janeway ve Travers, 1996).
1.3.2. Kazanılmış bağışıklık (Spesifik savunma)
Kazanılmış bağışıklık sonradan kazanılan bir durumdur ve vücudun tepkime verme yeteneğine bağlı olarak zarar verici spesifik partiküler mikroorganizmalara karşı, spesifik reaktive lenfosit (sellüler bağışıklık) veya serum antikorlarının (humoral bağışıklık) oluşmasıdır (Busch, 1981; Ellis, 1989; Janeway ve Travers, 1996). Kazanılmış bağışıklıkta savunma mekanizmasının merkezi lenfosittir. Lenfositler kazanılmış bağışıklığın, humoral bağışıklık, hücresel bağışıklık ve bellek gibi üç safhasının başlatılmasından ve yürütülmesinden sorumludur. Humoral cevap “Homolog veya spesifik antijene karşı serum protein moleküllerinin sentezi amacıyla uyarılması” olarak tanımlanmaktadır. Bu serum protein molekülleri “antikorlar” olarak adlandırılır. Bu nedenle canlı patojenlerin hastalık oluşturmayan suşları, öldürülmüş patojenler veya bunlardan elde edilmiş antijenler, konakçının patojen tarafından hasta edilmesini önlemek için kazanılmış bağışıklık oluşturmak üzere kullanılmaktadır (Post, 1987).
1.3.1.1. Humoral bağışıklık
Antijenin vücuda ilk kez girmesi halinde T ve B lenfositleri birlikte reaksiyon verirler. B lenfositler plazma hücrelerine veya bellek hücrelerine dönüşürler (Minbay, 1988; Ellis, 1989). Plazma hücreleri kendilerinin oluşmasını uyaran antijene karşı özel antikor üretirken bellek hücrelerine ve daha sonra aynı antijenin ikinci kez vücuda girmesi halinde plazma hücrelerine dönüşebilecek özelliğe sahip hücrelerdir. T hücreleri farklı bir fonksiyona sahiptir. Başlangıçtaki T hücreleri, yardımcı hücreler olarak isimlendirilirler. Bu klon hücreleri antijenin başlangıç stimulasyonu ile çoğalırlar. Uzun süre hayatta kalabilen yardımcı bellek hücrelerine dönüşürler. Böylece ikinci bir uyarıda T hücrelerinin sayısı artar. Bunlar sayıları artan B bellek hücreleri ile işbirliği yaparlar. Böylece ikinci uyarıda kandaki antikor üretimi daha hızlı gerçekleşir ve birinci uyarıya göre daha yüksek konsantrasyona ulaşır (Ellis, 1988). Bellek hücrelerinin hızlı ve yüksek seviyede reaksiyon kabiliyeti nedeniyle patojen ve aşıların uygulanmasını takiben dikkate değer artan bir direnç oluşturur (Ellis, 1988).
1.3.1.2. Selüler bağışıklık
Timustan köken alan T lenfositleri sellüler bağışıklığın hücrelerini oluşturur. T lenfosit populasyonu T yardımcı klonlarının yanı sıra selüler bağışıklıktan sorumlu klonlara da sahiptir. Bağışıklığın bu bölümü geniş bir sahayı içine alır ve vücudu istila eden mikroorganizmaları fagosite ederek sindirmek suretiyle vücudun spesifik olmayan koruma mekanizmasını oluşturan makrofajların teminini sağlar. Primer antijen stimulasyonunda T lenfosit klonları selüler bağışıklıkta rol alan çeşitli farklı fonksiyonel hücrelere dönüşür. Bunlar arasında öldürücü hücreler, baskılayıcı hücreler ve lenfokin üreten hücreler bulunur (Ellis, 1988).
1.4. Balıklarda Antioksidan Enzim Sistemi
Balıklarda da diğer omurgalılarda olduğu gibi reaktif oksijen türlerinin (ROS) olumsuz etkilerini azaltmak için bir antioksidan savunma sistemi bulunmaktadır. Suda çözünen süperoksit dismutaz (SOD), katalaz (CAT),glutatyon peroksidaz (GSH-Px), glutatyon redüktaz (GR), glukoz-6-fosfat dehidrogenaz (G6PDH) ve glutatyon-S-transferaz, antioksidan sisteminde yer alan başlıca enzimleridir (Filho, 1996; Orbea vd., 2000; Abele ve Puntarulo, 2004; Öğüt, 2005; Piner, 2005; Borazan-Özkurt, 2006). Özellikle vücutta antioksidan sistem içerisinde SOD, CAT ve glutatyon enzimlerine bağlı (GSH-Px ve GR) bir savunma mekanizması söz konusudur (Leggatt ve Iwama, 2009). Bu enzimler oksidatif radikallerin yıkımında görev alırlar. Bu enzimlere ek olarak bazı enzim olmayan küçük moleküller de, örneğin, E,K ve C vitaminleri, alfa karoten, beta karoten, flavonoitler, izoflavonlar, karotenoitler, kateşin, kriptoksantin, kuversetin, likopen, lutein, resveratrol ve antosiyaninler bitkilerden temin edilerek antioksidatif işlemlerde görev alabilmektedirler (Lee ve Dabrowski, 2003; Gao vd., 2014).
1.4.1. Süperoksit dismutaz (SOD)
Süperoksit dismutaz (SOD), süperoksit serbest radikalinin hidrojen peroksit ve moleküler oksijene dönüşümünü katalizleyen antioksidan enzimdir (Altınışık, 2006).
Şekil 1.1. SOD enziminin dönüşüm reaksiyonu
Balıklarda SOD’un Cu-Zn SOD ve Mn SOD olmak üzere iki izomer tipi bulunmaktadır. Cu-Zn SOD sitozelde bulunur ve hücrede en bol bulunan izomerdir. Cu ve Zn içerir, dimerik yapıdadır, siyanidle inhibe edilir. Mn SOD mitokondride bulunur, Mn içerir, tetramerik yapıdadır, siyanidle inhibe olmaz (Yıldız, 2001).
SOD fizyolojik fonksiyonu oksijeni metabolize eden hücreleri süperoksit serbest radikalinin lipid peroksidasyonu gibi zararlı etkilerine karşı korumaktır. SOD, fagosite edilmiş bakterilerin intrasellüler öldürülmesinde de rol oynar. SOD aktivitesi, yüksek oksijen kullanımı olan dokularda fazladır. SOD’un hücre dışı aktivitesi çok düşüktür (Ihara vd., 2005; Lushchak&Bagnyukova, 2006).
Soğuk bölgelerde yaşayan balıklarda SOD aktivitesi sıcak bölgelerde yaşayan balıklara oranla daha fazladır (Abele ve Puntarulo, 2004). Bakır sülfat ile muamele görmüş balıklarda toplam SOD ve Mn SOD aktivitesinde azalma görülür (Borazan-Özkurt, 2006). Oreochromis niloticus‘un böbreklerindeki SOD aktivitesi 8 U/ mg protein iken sazanların karaciğerindekiSOD aktivitesi 0,17–0,23 U/mg proteindir (Üner vd., 2004; Yılmaz vd. 2006).
1.4.2. Katalaz (CAT)
Katalaz (H2O2:H2O2 oksidoredüktaz, CAT) yapısında dört tane “hem” grubu bulunan
bir hemoproteindir. CAT esas olarak peroksizomlarda, sitozolde ve mikrozomal fraksiyonda bulunur. CAT hidrojen peroksidi (H2O2) suya ve oksijene parçalar
Şekil 1.2. CAT enzimi dönüşüm reaksiyonu
Granulomatöz hücrelerde CAT, hücreyi kendi solunumsal patlamasına karşı koruma işlevini de görür. Hücrede oluşan H2O2’i hidroksil serbest radikali oluşumunu önlemek
için ortadan kaldırır (Atif vd., 2006). CAT sucul organizmaların antioksidan enzim çalışmalarında çok önemli bir yere sahiptir. Avcı vd., (2005)’e göre petrol kirliliği sonucu balıkların kas dokusundaki CAT aktivitesi 5 U/mg protein, karaciğer dokusu katalaz aktivitesi ise 34 U/mg protein olarak tespit edilmiştir. Sazanlarda ise CAT aktivitesi 0,1325–0,1713 k/ mg protein arasında değiştiği bildirilmiştir (Yılmaz vd., 2006).
1.4.3. Glutatyon peroksidaz (GSH-Px)
Sitozelde bulunan glutatyon peroksidaz (GSH-Px) dört selenyum atomu içerir, tetramerik yapıdadır ve hidroperoksitlerin indirgenmesinden sorumlu enzimdir (Altınışık, 2006).
Şekil 1.3. GSH-Px enziminin dönüşüm reaksiyonu
Fosfolipit hidroperoksit GSH-Px membrana bağlı en önemli antioksidan olan E vitamini yetersiz olduğunda membranı peroksidasyona karşı korur. GSH-Px fagositik hücrelerde de önemli fonksiyonları vardır. Diğer antioksidanlarla birlikte GSH-Px, solunum patlaması sırasında serbest radikal peroksidasyonu sonucu fagositik hücrelerin zarar görmesini önler. GSH-Px eritrositlerde oksidatif strese karşı en etkili antioksidandır (Gökhan, 2007).
Oreochromis niloticus’da glutatyon peroksidaz aktivitesi solungaçta 1,6 U/mg protein,böbrekte 1,2 U/mg protein, karaciğer dokusunda 0,17 U/mg protein, kas dokusunda 0,4 U/mg protein’dir (Oruç ve Üner 2000; Üner vd., 2004).
1.4.4. Lipid peroksidaz (LPO)
Hücrelerdeki lipidlerde meydana gelen ROS tepkimesi hücrenin en genel mekanizmalarından birisi olarak değerlendirilmektedir (Gravato ve Guilhermino, 2009). Lipid peroksidaz (LPO), lipid oksidizasyonunun peroksitlerin oluşumuyla gerçekleşmesinden oluşan bir reaksiyondur ve lipid tabakasına ROS tarafından verilmiş olabilecek hasaron derecesini belirlemek amacıyla ölçümü yapılmaktadır (Lushchak, 2011). LPO, balıkların karaciğerindeki antioksidan enzim aktivitelerin izlenmesi ve genel antioksidan durumun değerlendirilmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Hücre içerisinde meydan gelen lipit peroksidasyonu malondialdehit mikatarlarının ölçülmesi ile belirlenir.
2. YAPILAN ÇALIŞMALAR
2.1. Tıbbi Bitkilerin Balıkların Büyüme Performansı ve Bağışıklık Sistemi Üzerine Etkileri
Su ürünleri yetiştiriciliğinde ortaya çıkan hastalık etkenlerine karşı antibiyotiklerin kullanımının sınırlandırılması ya da yasaklanması nedeniyle antibiyotiklerin yerine kullanılabilecek alternatif immunostimulant olabilecek tıbbi bitkilerin araştırılmasına yönelik çalışmalar önem kazanmaya başlamıştır. Çalışmamızla ilgili olarak yapılmış benzer çalışmalar aşağıda özetlenmiştir.
Sarımsağın (Allium sativum) Nil tilapialarında (Oreochromis niloticus) büyüme performansı, yaşama oranı, spesifik olmayan bağışıklık sistemi ve hastalıklara karşı direnci üzerindeki etkisini araştırılmıştır. Çalışma sonucunda büyüme performansı, spesifik olmayan bağışıklık sistemi ve hastalıklara karşı direnç üzerine 30 g kg-1 sarımsak ilave edilmiş yemle beslenen Nil tilapialarında etkili olduğu tespit edilmiştir (Shalaby vd., 2006).
Christybapita vd., (2007) Eclipta alba bitkisinin sulu ekstraktının tilapya (Oreochromis mossambicus) balıklarının spesifik olmayan bağışıklık sistemine (lizozim, antiproteaz, miyeloperoksidaz) etkileri incelemişlerdir. Bu amaçla %0 (kontrol), %0,01, %0,1 ve %1 oranlarında Eclipta alba bitkisinin sulu özütü yeme ilave edilmiş ve balıklar 3 hafta süresince bu yemlerle beslenmişlerdir. Çalışma sonunda deneme gruplarının lizozim aktivitelerinin kontrol grubuyla karşılaştırıldığında önemli ölçüde arttığı tespit edilmiştir.
Bir başka çalışmada, Astragalus membranaceus ve Lonicera japonica bitkilerinin Nil tilapia (Oreochromis niloticus) balıklarında spesifik olmayan bağışıklık sistemi ve Aeromonas hydrophila bakterisine direnci üzerine etkilerini incelenmiştir. Her iki bitkinin de %0,05 ve %0,1 oranlarında kullanıldığı diyetlerle 4 hafta boyunca beslenen balıkların çalışma sonunda fagositik kan hücrelerinin, NBT ve lizozim aktivitelerinin üzerine bitkilerin herhangi bir etkisinin olmadığını tespit etmişlerdir. Fakat her iki bitkinin karışım olarak kullanıldığı grupta A.hydrophila bakterisine karşı direnç
gösterdiği ve ölüm oranlarının diğer gruplara göre daha düşük olduğunu belirtmişlerdir (Ardó vd., 2008).
Harikrishnan vd. (2009) Azadirachta indica, Ocimumm sanctum ve Curcuma longa bitkilerinin karışımından oluşan sulu, metanolik ve etanolik özütlerinin intraperitonal olarak japon balıklarında (Carassius auratus) fagositik aktivite, NBT, lizozim ve alternatif komploment aktivitelerine etkilerini incelemişlerdir. Methanol ve etanol ile çıkarılan özütlerde beslenen balıklarda ikinci haftadan sonra lizozim ve NBT aktivitelerinde artış belirlenirken, sulu özütlerin dördüncü haftadan sonra artış olduğunu ve bu üç bitki karışımının japon balıklarının bağışıklık sistemine olumlu etki ettiğini tespit etmişlerdir.
45 Gün süren çalışmada Immanuel vd. (2009), bermuda çimeni (Cynodon dactylon), kış kirazı (Withania somnifera), bel meyvesi (Aegle marmelos) ve zencefilin (Zingiber officimale) aseton ile muamele edilmiş ekstraktlarının Tilapya (Oreochromis mossambicus) balıklarının büyüme performansına, spesifik olmayan bağışıklık sistemine ve yaşama oranlarına etkisini incelemişlerdir. Çalışma sonunda dört bitki ekstraktıyla beslenen balıkların kontrol grubuna göre daha yüksek spesifik büyüme oranına, kan değerlerine (protein, albümin, globülin, cholesterol ve trigliserid) ve lizozim aktivitesine sahip olduğunu tespit etmişlerdir. Ayrıca Vibrio spp. türü ile enfekte edilen deney balıklarının kontrol grubuna göre yaşama oranlarının yüksek olduğunu bildirmişlerdir.
Abdel-Tawwab vd. (2010), yaptıkları çalışmada yeşil çayın (Camellia sinensis) nil tilapialarında büyüme ve balık sağlığı üzerindeki etkisini araştırmışlardır. Yeşil çayın yapraklarını öğüterek 0,0 (kontrol), 0.125, 0.25, 0.50, 1 ve 2 g kg-1 oranında yeme ilave
etmişler ve balıkları 12 hafta boyunca bu yemlerle beslemişlerdir. Çalışma sonunda yeşil çayın büyüme performansını destekleyici etkileri olduğunu gözlemlemişler ve optimum büyüme ve yem kullanımının 0.5 g/kg oranında yeşil çay ilave edilmiş yemle beslenen balıklarda artış gösterdiğini bildirmişlerdir.
Başka bir çalışmada, gökkuşağı alabalığı yemlerine %1 ve %2 oranlarında lupin (Lupinus perennis), mango (Mangifera sp.) ve ısırgan otu (Urtica dioica) ilave
edilerek balıkların ağırlık artışı, boy ve spesifik büyüme oranlarındaki değişim araştırılmıştır. Çalışma sonunda kontrol grubuna göre deneme gruplarının büyüme performansında olumlu yönde bir farklılık olduğunu tespit edilmiştir. Ayrıca balık etinin proximate analizlerinde %1 ve %2 lupin, mango ve ısırgan otu verildikten sonra ham protein, ham yağ, nem ve kül seviyelerinde önemli bir farklılık olmadığı da belirtilmiştir (Awad vd., 2012).
Bilen ve Bilen (2012), tetra (Cotinus coggygria) ve defne (Laurus nobilis) bitkilerinin gökkuşağı alabalığında (Oncorhynchus mykiss) spesifik büyüme oranı (SBO), yem değerlendirme oranı (YDO) ve yaşama oranları üzerine etkilerini araştırmışlardır. Gökkuşağı alabalıkları kontrol grubu dahil olmak üzere kontrol, %1 ve %1,5 tetra ile %1 ve %1,5 defne içeren beş farklı deneme yemi ile 8 hafta boyunca beslenmiştir. Çalışma sonunda balıkların ortalama ağırlıkları, yaşama oranları, spesifik büyüme oranları ve yem değerlendirme oranları arasında kontrol grubuyla istatistiksel olarak önemli farklılık olmadığını bildirerek, tetra ve defnenin alabalıkların büyüme performansı ve yemden yararlanma üzerine etkisinin önemsiz olduğunu saptamışlardır.
Gökkuşağı alabalığının bağışıklık yanıtı üzerine yapılan bir çalışmada, %0,1, %0,5 ve %1 oranlarında ısırgan otu (Quercetin) ve %1, %2 ve %3 oranlarında siyah kimyon tohumunu (Nigella sativa) ticari yemin içine ilave edilerek balıkların antiproteaz, lizozim, miyeloperoksidaz ve bakteriyel aktiviteleri incelenmiştir. Çalışma sonunda deney grubu balıklarının tüm aktivitelerinde kontrol grubuna oranla bir artış olduğu bildirilmiştir. Özellikle siyah kimyon tohumunun %3 oranında ilave edildiği grupta lizozim aktivitesinin diğer gruplara oranla anlamlı bir fark gösterdiği tespit edilmiştir (Awad vd., 2013).
Binaii vd. (2014) farklı oranlarda (%0, %3, %6 ve %12) yeme eklenen ısırgan otunun (Urtica dioica) Avrupa mersin balığında (Huso huso) kan değerlerinde ve immun sisteminde meydana getirdiği değişimleri incelemişlerdir. 8 hafta süren çalışma sonunda %3 oranında ısırgan otuyla beslenen grupta diğer gruplara oranla lizozim aktivitelerinin ve kırmızı kan hücrelerinin (RBC) arttığı bildirilmiştir. %12 ve %6 oranında ısırgan otu ile beslenen gruplarda kontrol grubuna göre daha iyi kan
parametrelerine sahip olduğu tespit edilmiştir. Çalışmanın sonuçlarına göre ısırgan otu Avrupa Mersin balıklarının bağışık sisteminde iyileştirici bir etki göstermiştir.
Rutilus frisii kutum balıklarının diyetlerine nane (Mentha piperita L.) bitkisinin %0, %1, %2 ve %3 oranlarında eklenmesinin büyüme performansına, vücut kompozisyonuna, kan parametrelerine ve immun sistemine etkisi incelenmiştir. Nane bitkisiyle zenginleştirilmiş yemlerle beslenen balıkların kontrol grubuna göre büyüme performansının arttığı tespit edilmiştir. Ayrıca balıkların immun sistemi ve kan parametreleri de kontrol grubundan daha iyi sonuçlar göstererek, nane bitkisinin kullanımının teşvik edilmesi gerektiğini bildirmişlerdir (Adel vd., 2015).
Bahi vd. (2017) çipura (Sparus aurata) yemlerine çemen otunun hem tek hem de probiyotiklerle beraber kullanımının büyüme performansına, bağışıklık sistemine ve gen ekspresyonlarına etkilerini incelemişlerdir. Çalışma sonuçlarına göre çemen otu ilave edilmiş yemlerle beslenen çipura balıklarının büyüme performansının ve bağışıklık yanıtlarının kontrol grubuna göre daha iyi olduğunu bildirmişlerdir.
Çemen otunun %0,5 ve %1 oranlarda kedi balıklarının (Pangaisus hypophthalmus) diyetlerine eklendiği bir araştırmada balıkların büyüme performansı ve vücut kompozisyonuna etkileri incelenmiştir. Araştırma sonuçlarına göre çemen otu eklenen gruplarda kontrol grubuna göre büyüme performansının ve yemden yararlanma oranın arttığı tespit edilmiştir. Ayrıca balıkların vücut kompozisyonları incelendiğinde ham protein oranlarının da kontrol grubundan yüksek olduğu bildirilmiştir. Sonuç olarak balık yemlerinde çemen ilavesinin büyümeyi teşvik edici etkisi olduğu sonucuna varılmıştır (Mehboob vd., 2017).
Tan vd. (2018) ginkgo biloba yaprağı (GBE) ekstraktının hibrid grouper (Epinephelus lanceolatus x Epinephelus fuscoguttatus) balıklarında büyüme performansı, kan parametreleri, vücut kompozisyonu, immun yanıtı ve karaciğer histolojisine etkilerini incelemişlerdir. 8 hafta süre araştırma sonunda GBE eklenmiş yemlerle beslenen balıkların büyüme performansının ve yem kullanımının arttığını ancak vücut kompozisyonunda ham yağ oranının azaldığını tespit etmişlerdir. Ayrıca kontrol
grubuyla karşılaştırıldığında GBE eklenmiş grupların immun yanıtlarının da daha iyi olduğunu bildirmişlerdir.
2.2. Tıbbi Bitkilerin Balıkların Antioksidan Sistemine Etkileri
Su ürünleri yetiştiriciliğinin yoğun olarak yapıldığı işletmelerde balıkların maruz kaldığı fizyolojik ve biyokimyasal koşulların önemli değişikliklere yol açması ve farklı stress faktörlerine maruz kalmaları gibi nedenlerden dolayı hastalıklar meydana gelmektedir. Bu durumda balıkların savunma mekanizmaları devreye girmekte ve kendilerine bir antioksidan sistem oluşturmaktadırlar. Tıbbi bitkiler de yapısında bulundurduğu kimyasal bileşiklerle, organizmaların serbest radikal hasarının neden olduğu oksidatif stresle başa çıkmayalarına yardımcı olmakta ve balığın genel fizyolojik durumunu iyileştiren antioksidatif sisteme katkıda bulunmaktadır. Fakat, tıbbi bitkilerin balıkların antioksidan enzim aktivitelerine etkisinin denendiği çalışmalar oldukça sınırlıdır.
Thirunavukkarasu, Ramkumar, Ramanathan ve Silambarasan (2010), yapmış oldukları çalışmada, Citrullus colocynthis, Suaeda monica, Suaeda maritime, Ipomea pes caprae ve Sesuvium portulcasturm olarak beş farklı kıyı bitkisinin ethanol özütlerinin antioksidan aktivitelerini araştırmışlardır. Çalışma sonunda elde edilen verilere göre SOD aktivitesinin Suaeda maritime’den elde dilen özütlerde azalma gösterdiğini ve bundan farklı olarak Citrullus colcynthis türünden elde edilen özütlerle beslenen balıklarda artış gösterdiğini tespit etmişlerdir.
Kızak ve Çelik (2012), farklı sürelerde (2 ay ve 3 ay) Çoruh alabalığı (Salmo coruhensis) üzerinde farklı oranlarda dozlarda (0, 10, 20 ve 40 g/kg yem) kefir ile beslendikleri çalışmalarında kan ve karaciğer dokularındaki antioksidan aktivitelerde meydana gelen değişimleri incelemişlerdir. Çalışma sonunda, balıkların yaşama oranları gruplar arasında farklılık göstermiştir. Spesifik büyüme oranı ve yem değerlendirme oranı ve kondisyon faktörü değerlendirildiğinde doza bağlı olarak gruplara arasında bir farklılık olmadığını bildirmişlerdir. Bunula birlikte 30. Gün verileri değerlendirildiğinde 20 ve 40 gr gruplarında özellikle toplam antioksidan durumun azaldığını tespit etmişlerdir. Deney gruplarının karaciğer MDA seviyeleri
kontrol grubuyla karşılaştırıldığında azalma olduğunu belirlemişlerdir. GPX enzim aktivitesi tüm gruplarda artış gösterirken CAT aktivitesinın azaldığını bildirmişlerdir. Ayrıca, GSH (Glutatyon) düzeyi 2 aylık gruplarda değişiklik göstermezken, 3 aylık gruplarda artış gösterdiğini tespit etmişlerdir.
Karvakrol ve timol açısından zengin içeriklerle beslenen gökkuşağı alabalıklarının büyüme performansı, bağırsak mikrobiotası ve antioksidan sisteminde meydan getirdiği değişimler incelenmiştir. Bu amaçla kavrakrol ve timol, gökkuşağı alabalığı yemlerine 1 g/kg olacak şekilde eklenmiş ve balıklar bu yemlerle 8 hafta boyunca beslenmişlerdir. Çalışma sonunda yem dönüşüm oranlarında bir azalma olduğu belirtilirken büyüme performanslarında kayda değer bir değişim olmadığı bildirilmiştir. Toplam aneorob sayısı tüm denem gruplarında kontrol grubuyla karşılaştırıldığında kayda değer düşüş göstermiş, bununla birlikte en düşük oran timol içeren yemlerle beslenen balıklarda gözlemlenmiştir. Her iki grup içinde glutatyon tabanlı enzimlerde artış tespit edilmiştir. Malondialtehit formasyonu gruplarda düşüş göstermiştir (Giannenasa, Triantafilloub, Stavrakakisa, Margaronic, Mavridisd vd., 2012).
Sönmez vd. (2015), adaçayı, nane ve kekik bitkilerinin yağlarını 500, 1000 ve 1500 mg/kg içeren yemlerle gökkuşağı alabalığı yavrularını 60 gün boyunca besledikleri çalışmalarında antioksidan sistemde meydan gelen değişimleri tespit etmişlerdir. Çalışma sonunda SOD, G6PDH ve GPX aktiviteleri tüm deneme gruplarında kontrol grubuna göre artış göstermiştir. Bundan farklı olarak, CAT, GST ve GR enzim aktiviteleri kontrol grubuna göre azalmıştır. Lipit peroksidasyonunda ise azalma olduğu tespit edilmiştir. 500 mg/kg oranlarında kullanılan adaçayı ve kekik yağlarının hem büyüme açısından hem de antioksidan sistemi açısından verimli olacağı bildirilmiştir. Çalışma verilerine göre balıkların büyüme performansları adaçayı ve kekik yağı içeren yemlerle beslenen gruplarda yükselirken nane yağı ile beslenen gruplarda ise azalma olduğu belirtilmiştir.
Elgaml, Khalil, Hashish ve El-Murr (2015), yapmış oldukları çalışmada, 10 hafta süresince nil tilapia balıklarını (Oreochromis niloticus) selenyum (4 mg/kg yem) ve E
vitamini (200 mg/kg yem) içeren yemlerle beslenen balıkların SOD, GSH ve MAD seviyesinde meydana gelen değişimleri incelemişlerdir. Çalışma sonunda SOD ve GCH seviyeleri azalırken MDA seviyelerinin arttığını bildirmişlerdir.
Triklorfon (11, 22 mg/l) ve propolis (10 mg/kg canlı ağırlık) ile simultane muameleye tabi tuttukları sazan balıklarının antioksidan sisteminde oluşturduğu etkilerin incelendiği çalışmada, balıkların solungaç, karaciğer ve böbreklerinden alınan örneklerle MDA, GSH, SOD, CAT ve GPX aktivitelerinde meydana gelen değişimler incelenmiştir. Çalışma sonunda triklorform uygulamasının sazan balıklarında MDA seviyelerinde azalmaya neden olduğunu, bundan farklı olarak, GSH, SOD, CAT ve GPX aktivitelerinde artışlar meydana geldiği bildirilmiştir (Yonar, Yonar, Pala, Silici ve Sağlam, 2015).
Özlüer-Hunt, Yılmaz, Berköz, Engin, Gündüz vd. (2016), %20, %40 ve %60 oranında maya nükleotidi proteini ile hazırladıkları yemlerle gökkuşağı alabalıklarını beslemişler ve bağışıklık yanıtı, kan parametreleri ve antioksidan sistem üzerindeki değişimleriincelemişlerdir. Çalışma sonuçlarına göre SOD ve CAT aktivitelerinde herhangi bir değişim meydana gelmemiştir. MDA sevileri uygulama yapılan tüm gruplarda azalma göstermiştir. Lizozim, myeloperoksidaz ve nitrit oksit seviyeleri kayda değer oranda arttığını bildirmişlerdir.
90 gün süresince %0,1; %0,5; %1,0 oranlarında yeme ekledikleri zencefille (Zingiber officinale) beslenen tilapya (Oreochromis niloticus) balıklarının büyüme parametreleri ve oksidatif stres üzerine olan etkileri incelenmiştir. Balıkların karaciğer, solungaç ve bağırsak dokularındaki SOD ve CAT enzim aktviteleri kontrol grubuyla karşılaştırıldığında %0,5 ve %1,0’lık zencefil gruplarında artış gösterdiği bildirilmiştir. Büyüme performansı açısından gruplar arasında önemli bir farklılık gözlenmediğini de rapor edilmiştir (Şahan, Özütok ve Kurutaş, 2016).
Amer (2016), tilapia balıklarını (Oreochromis niloticus), %0, %0,5, %1 ve %1,5 oranında Spirulina platensis içeren yemlerle 75 gün boyunca beslediği çalışmasında balıkların büyüme performansları ve antioksidan aktivitelerini incelemiştir. Çalışma sonunda elde ettiği verilere göre, %1 S. platensis ile beslenen balıkların FCR
değerlerinde azalma gözlenirken, ağırlık kazanımları artmıştır. Kontrol grubuna kıyasla S. platensis ile beslenen gruplarda, GR artarken MDA seviyelerinde azalma meydana gelmiştir. Benzer şekilde deneme gruplarının CAT aktivitelerinde de artış olduğunu bildirmiştir.
Şahan, Duman, Çolak, Çınar ve Bilgin (2017), gökkuşağı alabalıklarını %10, %20 ve %30 oranında kuşburnu içeren yemlerle günde iki kere elli gün boyunca beslemişlerdir. Çalışma sonunda balıkların karaciğer antioksidan enzim aktivitelerinde meydana gelen değişimleri incelenmiştir. %20 ve %30 kuşburnu uygulanan grupların SOD ve CAT değerlerinde artış gözlenirken MDA seviyelerinde bir değişiklik tespit edilememiştir.
3. YÖNTEM
3.1. Materyal
3.1.1. Deneme Yeri ve Süresi
Denemenin yemleme süreci Kastamonu Üniversitesi Su Ürünleri Fakültesi Germeçtepe İç Su ve Deniz Balıkları Üretim, Uygulama ve Araştırma Merkezi’nde gerçekleştirilmiştir. Deneme 12.10.2015 - 25.12.2015 tarihleri arasında ve toplam 75 günde tamamlanmıştır.
Fotoğraf 3.1. Deneme kafesleri (Özgün) 3.1.2. Deneme Balıkları
Denemede, 2015 yılında Germeçtepe İç Su ve Deniz Balıkları Üretim, Uygulama ve Araştırma Merkezi’nde üretimi yapılan ve ortalama ağırlıkları 41,71±1,08 g olan toplam 1050 adet gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss W., 1792) kullanılmıştır. Araştırma Birimi’nin yavru büyütme kafeslerinden rastgele seçilen balıklardan 21 adet 1,5x1,5x1,5 ebatlarında ağ kafeslere 50’şer adet yerleştirilmiştir. Kontrol ve 6 adet deneme grubu olarak düzenlenen deneme üç tekerrürlü olarak yürütülmüştür.
3.1.3. Denemede Kullanılan Su Kaynağı
Araştırma süresince denemenin gerçekleştirildiği Germeçtepe Barajı suyunun pH, çözünmüş O2 (mg/l) ve sıcaklık (°C) değerleri günlük olarak yapılan ölçümlerle elde
edilmiştir.
3.1.4. Denemede Kullanılan Tıbbi Bitki
Çalışmada, gökkuşağı alabalıklarının karaciğer antioksidan aktivitesi üzerindeki etkilerinin belirlenmesi için akça kesme (Phillyrea latifolia) yaprak ve meyveleri kullanılmıştır. Bitki yaprak ve meyveleri Kastamonu İli içerisinde yer alan aktarlardan temin edilmiş ve Su Ürünleri Fakültesi Araştırma Laboratuvarı’na getirilerek gölge ortamda tüm nemini kaybetmesi için kurutulmuştur. Kurutulan bitki sapları yüksek hızlı bitki değirmeninde öğütülerek toz haline getirilmiştir. Toz aline getirilen bitki saplarının sulu methanolik özütü Bilen vd. (2016) metoduna göre çıkarılmıştır.
3.1.5. Deneme Yemleri
Deneme yemi olarak ticari satılan yemler kullanılmıştır. Yem bileşenleri Tablo 3.1’de gösterilmiştir. Ticari yemin içerisine çıkarılan akça kesme (Phillyrea latifolia) yaprak ve meyvelerinin sulu metanolik ekstraktları 0,1, 0,5 ve 1 mg kg-1 oranında sprey
yöntemiyle ilave edilerek deneme yemleri hazırlanmıştır. Deneme yemleri; kontrol (K), %0,1 akça kesme yaprak içeren yem (AKY0,1), %0,5 akça kesme yaprak içeren yem (AKY0,5), %1 akça kesme yaprak içeren yem (AKY1), %0,1 akça kesme meyvesi içeren yem (AKM0,1), %0,5 akça kesme meyvesi içeren yem (AKM0,5) ve %1 akça kesme meyvesi içeren yem (AKM1) şeklinde oluşturulmuştur.
Tablo 3.1. Ticari Deney Yemlerinin Bileşenleri Yemin Bileşenleri (%) Ham Protein 44 Ham Yağ 23 Ham Kül 10,5 Ham Selüloz 1,6 Kalsiyum 2,4 Fosofr 1,2 Sodyum 0,2 Diğer 17,1 3.2. Yöntem
3.2.1. Denemenin Yürütülmesi ve Yemleme Programının Düzenlenmesi
Balıklara verilen günlük yem miktarı balığın büyüklüğüne ve deneme tanklarında kullanılan su sıcaklığına göre düzenlenmiştir. Balıklara günlük olarak canlı ağırlıklarının %2 ve %2,5 oranları esas alınarak yem verilmiştir. Balıklar yemleme deneyleri süresince sabah saat 9:00 ve akşam saat 16:00’da olmak üzere günde iki kez elle yemlenmişlerdir. Yemleme sırasında verilen yemin tamamının balıklar tarafından alınmasına özen gösterilmiştir. Deneme süresince tartımların ve analizlerin yapıldığı günlerden iki gün önce balıklara yem verilme kesilmiştir.
3.2.2. Tıbbi Bitkinin Sulu Metanolik Ekstraklarının çıkarılması
Bu çalışmada kullanılan akça kesme (Phillyrea latifolia) yaprak ve meyvesi daha önce belirtildiği üzere Kastamonu İli içerisinde yer alan aktarlardan temin edilmiştir. Toz haline getirilmiş ve bitkilerin sulu methanolik özütleri çıkarılma işleminde (Bilen, vd.,
2016) kısaca,%40‘lık methanol hazırlanmış ve 1 L karışım içerisine 100 g bitki tozu eklenmiş ve güneş görmeyen yerde günde iki defa ters yüz edilerek üç gün boyunca bekletilmiştir. Daha sonra bu örnekler Whatman filtre kâğıdından (47 mm) geçirilerek iri partiküller ayrılmıştır. Süzülmüş sıvı kısım vakum evaporatöre transfer edilmiş ve burada tüm sıvı kısım giderilinceye kadar 75 C°’de bekletilmiştir. Çalışma sonunda özüt miktarını net olarak belirlemek için 50 g saf su 50 C°’de ısıtılmış, evaporatör balonu içinde yer alan özüte eklenmiş ve çıkan örnek tartılarak toplam özüt miktarı belirlenmiştir. Daha sonra bu özütler kullanılacak doza göre PBS içerisinde hazırlanmış ve çalışmada kullanılıncaya kadar –20 C°’de saklanmış, çalışma müddetince de +4 C°’de tutulmuştur.
Fotoğraf 3.2. Evaparatör yardımıyla bitkilerden özüt elde edilmesi (Özgün)
3.2.3. Balıklardaki Büyüme Performansının Hesaplanması
Balıkların canlı ağırlıkları, deneme başlangıcında ve 15 günlük periyotlarla tanklardaki bütün balıklara anestezi (karanfil yağı) uygulanarak 0,1 g’a duyarlı hassas terazi ile bireysel ağırlıkları tartılmış ve balık ölçüm tahtası kullanılarak boyları ölçülmüştür (Lindsay ve Barbara, 1984). Tartımlarda her grup için iki tankın ağırlıklarının ortalaması esas alınmıştır.
Bireysel canlı ağırlık artışı (CAA) (3.1); periyot sonundaki canlı ağırlık değerinden (A2) periyot başlangıcındaki canlı ağırlık değeri (A1) çıkartılarak hesaplanmıştır
(Ricker, 1979).
CAA= A2 - A1 (3.1)
CAA : Canlı ağırlık artışı
A2 : Periyot sonundaki ortalama bireysel ağırlık (g)
A1 : Periyot başındaki ortalama bireysel ağırlık (g)
Spesifik büyüme oranı (3.2);
SBO= 100 x (Ln Wf – Ln Wi / t) (3.2)
SBO : Spesifik büyüme oranı
Wf : Periyot sonundaki bireysel ağırlık Wi : Periyot başındaki bireysel ağırlık t : Zaman (gün olarak)
formülleri ile hesaplanmıştır (Ricker, 1979).
Deneme grupları için periyodik olarak tüketilen yem miktarları ayrı ayrı hesaplanarak bulunmuştur. Her periyotta tüketilen toplam yem miktarı tanktaki balık sayısına bölünerek ortalama bireysel yem tüketim miktarı hesaplanmıştır. Yemden yararlanma oranı (3.3);
YYO = Periyot süresince tüketilen yem miktarı (g) / Periyottaki CAA (g) (3.3)
YYO : Yemden yararlanma oranı CAA : Canlı ağırlık artışı
3.2.4. İmmunolojik Analizler
3.2.4.1. Kan ve Plazma Toplanması
Balıklardan insulin şırıngası ile ventral aorta girilerek kan alınmış ve K3 EDTA’lı tüplere aktarılmıştır. Balıkta stresi minimize etmek için karanfil yağı ile anestezi uygulanmıştır. Kan örnekleri ay da bir olmak şartıyla her gruptan üçer balıktan alınmıştır. Alınan kan örneklerinden hematolojik incelemeler, NBT, Lizozim ve MPO analizleri yapılmıştır.
3.2.4.2. NBT Aktivitesi
Süperoksit radikal salınımları (3.4) NBT yöntemi kullanılarak tespit edilmiştir (Siwicki ve Anderson, 1993). Kısaca, balıklardan alınan kan örneklerinden 0,1 ml örnek %0,2 NBT içeren 0,1 ml solüsyon ile karıştırılmıştır ve karışım 25 °C’de 30 dakika inkübe edilmiştir. Karışım içerisinden 50 μl süspansiyon alınmış ve bunun üzerine 1,0 ml N,N-dimethil formamid eklenmiş ve karışım 4000 g’de 5 dakika santrifüj edilmiştir. Daha sonra bu karışım ayrı bir tüp içerisine alınmış ve 540 nm optik densititede N,N-dimethil formamid kör örneğine karşı okunmuştur. Sonuçlar 4 ile çarpılarak tespit edilmiştir.
3.2.4.3. Lizozim Aktivitesi Tespiti
Serum lizozim aktivitesi (3.5) spektrometrik olarak ölçülmüştür. Lizozim çözeltisi, 1 tablet fosfat tamponlu tuz (PBS) ve 0.02 g Micrococcus lysodeicteus bakterisinin (Sigma M3770-5g) 100 ml saf su da çözülmesiyle elde edilmiştir. Lizozim aktivitesi türbidimetrik inceleme yoluyla yapılmıştır ve hazırlanan çözeltiye 40 µl serum eklenerek 530 nm’de 0. ve 4. dakikalarda okutmaları yapılmıştır (Parry, Chandan ve Shahani, 1965).
3.2.4.4. Myeloperoksidaz (MPO) Aktivitesi
Serumdaki myeloperoksidaz (MPO) aktivitesi (3.6) Quade ve Roth (1997) ve Sahoo, Kumari ve Mishra (2005) yöntemlerinde bazı değişiklikler yapılarak ölçüm gerçekleştirilmiştir. 1 tablet fosfat sitrat 100 ml saf suda çözülerek birinci çözelti hazırlanmıştır. Sonrasında ikinci çözelti olarak 1 tablet tetramethilbenzidin dihidroklorür birinci çözeltiden 10 ml alınarak çözülmüştür. Daha sonra 370 µl Hank’s Balanced Solüsyonu (HBSS) 30 µl serum ile karıştırılmış ve okutmandan hemen önce ikinci çözeltiden 100 µl üzerine eklenmiştir. 0. ve 4. dakikalarda 450 nm’de okutmaları gerçekleştirilerek aşağıdaki formüle göre hesaplamaları yapılmıştır.
MPO = Absorbans farkı * 1906,4 = U/ µl (3.6)
3.2.5. Hematolojik Analizler
Kan örneklerinden kırmızı kan hücresi (RBC), Hemoglobin (Hb), hematokrit (PCV), ortalama alyuvar hacmi (MCV), ortalama alyuvar hemoglobini (MCH) ve kırımızı kan hücrelerindeki hemoglobin yoğunluğu (MCHC) değerlerini ölçmek amacıyla Oto Hematoloji Cihazı (BC-3000plus) kullanılmıştır (Fotoğraf 3.3).
3.2.5.1. Eritrosit Sayımı
Kan örneği eritrosit pipetine alınarak 1/200 oranında Dacie solüsyonu ile seyreltilerek ve toplam eritrosit sayısı Thoma lamı kullanılarak hesaplanmıştır (Blaxhall ve Daisley 1973).
3.2.5.2. Hematokrit Seviyesinin Tespit Edilmesi
Hematokritin ölçülmesinde mikrohematokrit yöntem kullanılacaktır. Hematokrit tüpleri kan ile doldurulacak ve hematokrit santrifüjde 10500 g devirde 5 dk santrifüj edilecektir. Sonrasında skala kullanılarak yüzde hematokrit değer ölçülecektir (Blaxhall ve Daisley 1973).
3.2.5.3. Hemoglobin Miktarının Tayini
Hemoglobin miktarının tayini için cyanomethemoglobin metodundan yararlanılacaktır (Blaxhall ve Daisley 1973) Bu amaçla 20 μl kan örneği 4 ml Drapkin solüsyonu içerisine konulacaktır. Devamında 10 dakikalık inkübasyondan sonra karışım 540 nm’de okunacak ve sonuçlar g/dl olarak değerlendirilmiştir.
3.2.5.4. Eritrosit indeksleri
3.2.5.4.1 Ortalama Eritrosit Hacmi (MCV)
Ortalama eritrosit hacmi (3.7) formülden yararlanılarak hesaplanmıştır (Lewis, Bain ve Bates, 2006).
Hct: Hematokrit, RBC: Kırmızı Kan Hücre Sayısı
MCV (fl)= Hct x 10/RBC(106μL-1) (3.7)
3.2.5.4.2. Eritrosit Başına Düşen Ortalama Hemoglobin (MCH)
Eritrosit başına düşen ortalama hemoglobin (3.8) formülden yararlanılarak hesaplanmıştır (Lewis vd., 2006).
Hb: Hemoglobin
MCH (pg)= [Hb (g dL-1) x 10]/RBC(106/mm-1) (3.8)
3.2.5.4.3. Eritrosit Başına Düşen Ortalama Hemoglobin Konsantrasyonu (MCHC)
Eritrosit başına düşen ortalama hemoglobin konsantrasyonu (3.9) formülden yararlanılarak hesaplanmıştır (Lewis vd., 2006).
MCHC (g-1) = [Hb (g dL-1) x10]/Hct (3.9)
3.2.6. Antioksidan Enzim Aktiviteleri
Antioksidan enzim analizleri belirlemek için balıkların karaciğer örnekleri kullanılmıştır. Balıklar örnekleme dönemlerinde yüksek dozda karanfil yağı ile bayıltılmışlardı. Bu balıklardan karaciğer ve kan örnekleri alınmıştır. Karaciğer örnekleri ultra saf suda yıkanmış ve sıvı azot tankına ependorf tüpler içinde aktarılarak dondurulmuştur. Bu örnekler laboratuvara getirilmiş ve burada -80°C’de saklanmıştır. Karaciğer dokularının analizlere hazırlanması için 0,1 g ağırlığında parçalara bölünmüş ve üzerlerine 1 ml EDTA’lı fosfat buffer eklenerek homojenizatörde parçalanmıştır. İyice parçalanan dokular 20000 g’de 45 dakika santrifüj edildikten sonra üstte kalan süpernatantlar analizler için kullanılmıştır.
3.2.6.1. Süperoksit Dismutaz (SOD) Aktivitesi
SOD analizi SIGMA 19160-1KT-F SOD Assay Kit kullanılarak yapılmıştır. SOD enzimi süperoksit anyonlarının hidrojen peroksit ve moleküler oksijene dismutasyonla katalizler. Bu bağlamda çalışmada, 20 µl örnek serumu 20 µl ultra distile su ile karıştırılmıştır. Bunun üzerine 200 µl çalışma solüsyonu eklenmiş ve karıştırılmıştır. Daha sonra balnk solüsyonu olarak hazırlanan çukurlara 20 µl dilisyon sıvısı eklenmiştir. Bunların üzerine 20 µl enzim çalışma solüsyonu eklendikten sonra 37C°’de 20 dakika inkübe edilmiştir. Sonuçlar 450 nm dalga boyunda okunmuş ve SOD aktivitesi (3.10) aşağıdaki fromül kullanılarak hesaplanmıştır.
SOD aktivitesi={[(Ablank1-Ablank3)-(Aörnek-Ablank2)]/(Ablank1-Ablank3)}x100 (3.10)
3.2.6.2. Katalaz (CAT) Aktivitesi
Katalaz analizi Cayman 707002 kodlu Catalase Assay Kit kullanılarak yapılmıştır. Kısaca, doku örnekleri PBS solüsyonu ile (pH 7,4) yıkanmıştır. Dokular 50mM potasyum fosfat ve 1 mMEDTA içeren solüsyonda homojenize edilmiştir. Homojenize dokular 10000 g’de 15 dakika + 4 C°’de santrifüj edilmiştir. Santrifüj sonrası serum kısmı ayrılmış ve çalışmada kullanılmıştır. Kit içerisinde 10 µl katalaz formaldehit standardı ile 9,99 ml örnek sıvısı karıştırılmış ve 4,25 mM formaldehit stok solüsyonu oluşturulmuştur. Kuyucuklara 100 µl yöntem solüsyonu, 30 µl methanol, ve 20 µl standart eklenmiştir. Pozitif gruba standart yerine katalaz konulmuştur. Örek çukurlarında ise standart yerine çalışılan örnek eklenmiştir. Örnekler 20 dakika inkübe edilmiştir. Tüm çukura, sonrasında, 30 µl potasyum hidroksit ve 30 µl katalaz purpald (707017) eklenmiştir. Örnekler 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edilmiştir. Bunu üzerine 10 µl katalaz potasyum periodat eklenmiş ve 5 dakika inkübe edilmiştir. Sonuçlar 540 nm de okunmuştur. Sonuçlar (3.11) formüle göre değerlendirilmiştir.
CAT aktivitesi= µM Örnek/20 dakika x seyreltme miktarı (nmol/min/ml) (3.11)
3.2.6.3. Glutatyon Peroksidaz (GSH-Px) Aktivitesi
Glutatyon peroksidaz analizi Cayman 703102 kodlu Glutathione Peroxidase Assay Kit kullanılarak yapılmıştır. Kısaca, doku örnekleri katalaz aktivitesinde olduğu gibi hazırlanmıştır. Toplam 190 µl örnek içeren kutucuklara GPx eklenmiştir. 25 C°’de yürütülen işlemlerin sonunda örnekler 340 nm dalga boyunda okunmuştur. Sonuçlar (3.12) formül kullanılarak belirlenmiştir.
∆A340/dk=│A340 (Zaman2)- A340 (Zaman1) │/Zaman2-Zaman1
GPX aktivitesi=∆A340/dk/0,00373µM-1 x0,19 ml/0,02ml x seyreltme nmol/dk/ml
3.2.6.4. Lipit Peroksidasyonu
Cayman 10009055 kodlu TBARS Assay Kit kullanılarak yapılmıştır. Dokuları hazırlamak için 25 mg doku ile 250 µl RIPA sıvısı karıştırılmıştır. 1600 g’de 10 dakika santrifüj edilmiştir. Serum analiz için ayrılmıştır. 100 µl örnek üzerine 100 µl SDS solüsyonu eklenmiştir. Bunları üzerine 4 ml renk aktivatörü eklenmiştir. Örnekler kaynatılmıştır. Daha sonra buz içine taransfer edilerek 10 dakika bekletilmiştir. 10 dakika sonunda 1600 g’de 10 dakika santrifüj edilmiştir. 30 dakika oda sıcaklığında beklenmiştir. Örnekler 530-540 nm’de okunmuştur. Sonuçlar aşağıdaki formüle (3.13) göre belirlenmiştir.
MDA(µM)= ((Doğrulama abs)-(ykesim))/Eğim (3.13)
3.2.7. İstatistiksel Analizler
Deneyde elde edilen bütün verilerin ortalama ve standart sapma (±Std) değerleri Microsoft Office Excel programı yardımıyla hesaplamıştır. Verilerin istatistiksel olarak değerlendirilmesinde SPSS 22 paket programı kullanılarak varyans analizi (ANOVA) testine tabi tutulduktan sonra gruplar arasındaki farklılıklar %95 güven aralığı içeresinde Fisher LSD testi kullanılarak belirlenmiştir.
