Fusarium Türlerinin İzolasyonu ve Patojenitelerinin Belirlenmesi
Aydan ARAZ2 Neslihan UĞUZ 1 Perihan GÜLER3*1Ankara Zirai Mücadele Merkez Araştırma Enstitüsü, Ankara, TÜRKİYE 2Tarımsal Üretim ve Geliştirme Genel Müdürlüğü, Ankara, TÜRKİYE
3Kırıkkale Üniversitesi, Fen-Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü, Yahşihan-Kırıkkale, TÜRKİYE
*Sorumlu Yazar Geliş Tarihi : 04.11.2009
e-posta: perihangler@yahoo.com Kabul Tarihi : 08.12.2009
Özet
Ülkemizde meydana getirdiği zarar ile ülke ekonomisine önemli kayıplar verdiren, toprakta bulunan ve önemli bitki patojeni Fusarium spp ile mücadele edebilmek için laboratuar ortamında izole edilmesi, patojenitelerinin belirlenmesi çalışmamızın konusunu oluşturmuştur.
Birçok bitkide solgunluk hastalığı ve kök çürüklüğü hastalıklarına neden olan F. culmorum, F. graminearum materyal olarak seçilmiştir. Ankara, Eskişehir ve Sakarya’daki buğday tarlaları çalışma alanı seçilmiş, kök ve kök boğazı çürüklüğü gösteren buğdaylar laboratuarımıza getirilerek bitkilerin kök boğazlarından parçalar alınmış %2’lik sodyum hipoklorit ile yüzeysel dezenfeksiyon yapılmış ve Patates Dekstroz Agar ve spesifik agar ortamlarına inoküle edilmiştir. Yakın UV ışık (> 256 < 400 nm) altında 24±2°C’de 1 hafta inkübe edilmiş, gelişen funguslar incelenerek cinslerine göre gruplandırılmıştır. Bu cinslerden seçilen izolatlara patojenite testleri uygulanmıştır. Patojenite testleri petrilerde ve saksı denemeleri ile gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla seçilen izolatların 250 µg/ml chloramphenicol ilave edilmiş çeşme suyu agarı (Tap Water Agar) üzerinde çimlenmiş buğday tohumları üzerinde patojenitesi için ön eleme testleri yapılmıştır. Oluşan belirtilere göre yüksek derecede etkili olduğu gözlenen izolatlar saksılarda yapılacak patojenite denemeleri için ayrılmıştır. Saksı denemelerinde bitkilerin çıkışı düzenli olarak takip edilmiş ve bir ay sonra elde edilen sonuçlara göre, saksılardaki bitkiler hasta ve sağlam olarak kaydedilmiştir. Bitkilerin % çıkış ve % canlılık oranları belirlenerek yüksek patojeniteye sahip izolatlar belirlenmiştir.
Anahtar Kelimeler: Fusarium culmorum, F.graminearum, izolasyon, patojenite testi.
Isolation of Fusarium spp. and Defining of their Pathogenities
Abstract
The subject of our study was to define the pathogens by isolating in a laboratory environment in order to combat the Fusarium spp. which is found in the soil and is an important plant pathogen that gives grate loss to the countries economy with the damage it causes.
The F. culmorum and F.graminearum are chosen as material which causes paleness sickness and root corrosion in lots of plants. The wheat fields of Ankara, Eskisehir and Sakarya were chosen as workspace and the wheat that shows root and root neck corrosion were transferred to our Laboratory and segments were taken from the plants and were made a cursory disinfection with %2 sodium hypochlorite and inoculated in Potato Dextrose Agar and specific agar environments. They were incubated under close UV light (>256<400 nm) at 24±2°C for 1 week and the developing funguses were investigated and were grouped according to their species. The pathogenicity tests were applied to the isolates chosen from these species. The pathogenicity tests conducted both in Petri dishes and in flowerpot trials. Patojenite testleri hem petrilerde hem de saksı denemeleri ile gerçekleştirilmiştir. The isolates that were chosen for this purpose were conducted an pre elimination test for pathogenicity in 250 µg/ml chloramphenicol added Tap Water Agar on a sprouted wheat seed. The formed indicators were graded and the isolates that were sighted to have the high degree affect were separated for the pathogenicity tests that will be conducted at the flowerpots. In the flowerpot trials the plant growths were followed regularly and with the results at the end of 1 month the plants in the pots were registered as healthy and diseased. The highest pathogenitic isolates were defined by determining the growing percentage and liveliness percentage.
Keywords: Fusarium culmorum, F.graminearum, isolation, pathogenity test
GİRİŞ
Buğday ülkemizde üretimi yapılan tahıl ürünleri içerisinde en büyük üretim payına sahip olup, ülkemiz için önemli bir tahıl ürünüdür. Türkiye’de ekili tarım alanlarının yaklaşık %50’sinde tahıl ürünleri yetiştirilmekte, bu alanların üçte birinde buğday üretilmektedir [1]. Buğday tarımını olumsuz yönde etkileyen ve önemli ürün kayıplarına neden olan birçok
faktör vardır. Kök ve kök boğazı fungal hastalıkları buğdayda verimi sınırlayan faktörlerin başında gelmektedir [2]. Fusarium cinsi funguslar içerdikleri tür sayılarının fazla, enfekte ettiği konukçu dizilerinin geniş ve dünya üzerindeki farklı ekolojik ortamlarda varlıklarına rastlanabilir olmaları nedeniyle büyük öneme sahiptirler [3]. Nitekim Fusarium spp Almanya’da %60-80 [4] oranında zarar yapmakta, Kanada ve Amerika gibi ülkelerde kök ve kök boğazı hastalıklarından dolayı
oluşan kayıplar ise %17’ye ulaşmaktadır [5].
Ülkemizde bu hastalığı oluşturan funguslar arasında yer alan Fusarium spp, bitkinin kalitesini azaltmakta, verim kayıplarına neden olmaktadırlar [6]. Ankara ili ve ilçelerinde yapılan incelemeler sonucunda; kök boğazı ve sap çevresinde kahverengileşme, çürüklük bulunan zayıf gelişme ve cücelik gösteren bitkilerde F. graminearum, F. culmorum, F. acuminatum, F. heterosporum’un patojen olduğu tespit edilmiştir [7]. Ayrıca yine Orta Anadolu bölgesine ait Konya ilinde yapılan bir çalışmada da F. culmorum’un %21.8 hastalık belirtisi ve %9 verim kaybı, F. moniliforme’nin % 21.5 hastalık belirtisi ve %5 ürün kaybına sebep olduğu saptanmıştır [8]. F.graminearum ve F. culmorum hem kışlık hem de yazlık buğdaylara (Triticum aestivum L.)’a zarar vermektedir [9].
Bu çalışmanın hedefi; birçok bitkide ve özellikle ülkemiz açısından önemli olan buğday bitkisinde, kök ve kök boğazı çürüklüğü hastalıklarına neden olan Fusarium culmorum, F.graminearum ile mücadele edebilmek için laboratuvar ortamında izole edilmeleri ve patojenitelerinin belirlenmeleridir.
MATERYAL VE YÖNTEM
Eskişehir ve Sakarya’daki merkez ilçe ekilişlerinden buğday tarlalarından kök ve kök boğazı çürüklüğü belirtisi gösteren buğday örnekleri (Şekil 1.) ve patojenite testlerinde kök ve kök boğazı çürüklüklerine hassas buğday çeşidi Kınacı-97 materyal olarak seçilmiştir.
Şekil 1. İzolasyonlarda kullanılan hastalıklı buğday kök
örnekleri
Fungusun İzolasyonu
Kök ve kök boğazı çürüklüğü belirtisi gösteren buğdayların kök boğazlarından parçalar alınıp %2’lik NaOCL (Sodyum hipoklorit) ile 2 dakika yüzeysel dezenfeksiyona tabi tutularak Patates Dekstroz Agar
(PDA) ve spesifik agar (SNA, CMA) ortamlarına alınmıştır (Şekil 2). Yakın UV ışık (> 256 < 400 nm) altında 24±2°C’de 1 hafta inkübe edildikten sonra gelişen funguslar incelenmiş ve gelişen funguslar türlerine göre gruplandırılmış ve teşhisleri mikolojik kriterlere göre yapılmıştır [3, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18]. Bu türlerden çalışma konumuzu oluşturan Fusarium culmorum, F.graminearum izolatları patojenite testlerine tabi tutulmak üzere ayrılmış ve tüplerde eğik PDA ortamında +4°C’de, buzdolabında saklanmıştır.
Şekil 2. Patates Dekstroz Agar (PDA) ve SNA
ortamında gelişen F. culmorum a-PDA; b-SNA
Fungusun patojenite testi
Petri kaplarında ön patojenite testi
Bu amaçla Fusarium culmorum, F.graminearum’un izolatları 250 µg/ml Chloramphenicol ilave edilmiş çeşme suyu agarı (Tap Water Agar, TWA) üzerinde çimlenmiş buğday tohumları üzerinde patojenitesi için ön eleme testleri yapılmıştır. Çapı 10 mm olan Agar parçaları TWA içeren petrilerin merkezine yerleştirilmiş ve 24 saat 25oC’ de inkübe edilmiştir. Tohumlar %2’lik NaOCl’de 3 dak. yüzeysel dezenfeksiyona tabi tutulmuş, 2 kez steril su ile yıkandıktan sonra steril kağıt havluda kurutulmuş ve TWA üzerine 24 saat 25oC’ de ön çimlenme için yerleştirilmiştir. Her petriye 5 tohum konulmuştur. Petriler 25oC’de 12 saat fotoperiyotta, ışık altında, 6 gün boyunca inkübe edilmiştir [19]. Buğday tohumlarından gelişen filizler üzerindeki belirtiler gözlenmiştir. Oluşan belirtilere göre yüksek derecede etkili olan izolatlar, saksılarda yapılacak patojenite denemeleri için ayrılmıştır.
Kontrollu koşullarda F. culmorum ve
Fgraminearum için saksılarda yapılan patojenite
denemeleri
İzolatlar Kunwar ve ark. (1989), Ahmad and Sharma (1990)’ya göre, toprak inokulasyonu yöntemiyle patojenite testine alınmıştır [20,21]. Bu amaçla denemelerde kullanılan plastik saksılara steril kum+ steril tarla toprağı (400-500 g) konulmuştur. Fusarium culmorum ve F.graminearum PDA besiyerinde geliştirilmiş, yaklaşık 10 günlük kültürlerden 10-15 fungus diski mantar deliciyle alınarak, önceden steril edilen 90 gr kum+10 gr mısır unu karışımı içeren şişelerin içine konulmuş, 15 gün oda sıcaklığında kolonizasyonun sağlanması için bekletilmiştir. Saksı denemeleri kurulurken, saksı yüzeyinden bir miktar toprak alınarak
inokulum konulduktan sonra üzeri tekrar toprakla kapatılmıştır. Bu saksılar F. culmorum ve F.graminearum izolatlarının gelişerek toprağı sarması için en az 10 günlük inkübasyona bırakılmıştır. Kök çürüklüklerine hassas buğday çeşidi Kınacı-97’nin tohumları %2’lik sodyum hipoklorit ile 3 dakika bekletilerek, yüzeysel dezenfeksiyona tabi tutulmuş, steril saf sudan geçirildikten sonra, steril kurutma kağıtları arasında fazla suları alınmış ve deneme toprağına ekim yapılmıştır.
F. culmorum ve F.graminearum için ayrı ayrı 4 tekerrürlü saksı denemesi kurulmuştur. Her bir saksıya, her iki fungusun denemeleri için 12 tohum ekilmiştir. Saksılar 15-20°C’de 14 saat aydınlık ve 10 saat karanlık içeren kontrollu koşullara alınmıştır.
Bitkilerin çıkışı ile beraber düzenli olarak gözlem yapılmış ve 1 aylık bir süre sonunda saksılardaki bitkiler sökülerek, kökleri musluk suyunda yıkanmış ve 0-7 skalası’na (Çizelge 1) Aktaş (2001)’a göre değerlendirilmiştir [6]. Hastalık şiddeti ile ilgili değerin ortaya konmasında; Tawsend-Heuberger formülü uygulanmıştır [22]. Hastalık Şiddeti % = ∑(Skala DeğerixSkala Değerine Dahil olan Bitki Sayısı) X 100 Toplam Bitki Sayısı x En Yüksek Skala Değeri
SONUÇLAR VE TARTIŞMA
Petri kaplarında patojenite testi sonuçları
Eskişehir ili Alpu ilçesi ekilişlerinden elde edilen Fusarium culmorum izolatı ön patojenite testlerinde
oldukça yüksek derecede patojen bulunmuştur, buğday’ın filizlenmesini dahi engellemiştir. Sakarya ilinin merkez ilçesinden alınan Tahirova çeşidinden yapılan izolasyonlardan elde edilen Fusarium graminearum izolatı da buğdayın filizlerini sarmış, test’e göre patojen bulunmuştur (Şekil 3).
Şekil 3. Patojenite testi A- F.culmorum, B- F.graminearum Saksı denemeleri sonuçları
Kontrollü koşullarda yapılan patojenite testlerine göre; F. culmorum ortalama %75.59 oranında hastalık oluşturmuştur. Ön patojenite testlerinde ise %100 fungusun etkili olduğu bulunmuştur. Petri ortamında yapılan testte, toprak yapısının kompleksliği yoktur ve petride daha kontrollü, kapalı bir ortam söz konusudur, denemelerde kullandığımız tarla toprağı steril olsa bile yine de toprakta bir mikroorganizma rekabetçiliği olduğu belirlenmiştir. F. graminearum, kontrollü koşullarda yapılan saksı denemelerinde %82.14 oranında hastalık oluşturmuştur (Şekil 4).
2007 yılı, tüm Türkiye’de ve özellikle Orta Anadolu Bölgesine dahil olan illerde oldukça fazla kuraklık
Skala Değeri Hastalığın tanımı 0 Sağlam 1 Hafif kahverengi 3 Orta derecede kahverengileşme (1. yaprak kınına kadar ilerlemiş) 5 Şiddetli kahverengileşme 7 Bitki ölmüş Çizelge-1. Hastalık şiddetinin değerlendirilmesinde kullanılan tanımsal skala [6] Şekil 4. Patojenite testi, A-Kontrol, B- F.culmorum, C- F.graminearum
sorununun yaşandığı bir yıl olmuştur. Bu nedenle Ankara’da bazı tarlalarda hasat’a gidilemeden çoğu tarlalar kurumuştur (Şekil 5).
Fakat kurak şartlar olsa dahi, F. culmorum yine de bazı taban arazilerde Eskişehir’in Alpu ilçesinde bulunmuş ve izole edilmiştir. Ortalama 15 yıl aralıksız olarak buğday ekiminin yapıldığı 3 farklı alanda topraktaki Fusarium türlerinin populasyon dalgalanmaları incelenmiş ve özellikle F. culmorum üzerinde çalışılmıştır. Çalışmaların sonucuna göre topraktaki Fusarium türlerinin populasyon yoğunluğu yıldan yıla farklılık göstermiştir. Bazı alanlarda buğdaydan sonra başka bir ürünün yetiştirilmesiyle ertesi yıl F. culmorum populasyonu düşmüştür. Diğer yandan sonbaharda sıcaklığın düşmesi ve yağış miktarının artmasıyla beraber fungusun populasyonu azalırken, ilkbaharda sıcaklık artmaya başladığında yağış miktarı da artsa bile F. culmorum yoğunluğu tekrar artmaya başlamıştır [23]. Orta Anadolu bölgesinde yer alan Eskişehir ilinde genellikle sulanan alanlar fazla olmadığından, monokültür tarım yapılmaktadır. Özellikle monokültür hububat tarımının yapıldığı alanlarda topraktaki inokulum yoğunluğu zamanla artış göstermektedir. Hastalık yoğunluğunun fazla olduğu yerlerde hasadın ardından inokulumun yarısı toprakta kalmakta ve bu inokulum 2 yıl süreyle topraktaki varlığını sürdürebilmektedir [24].
Sakarya’da genellikle mısır ekiminden sonra buğday ekimi yapılmaktadır. F. graminearum ve F. culmorum’un mısır’da ve buğdayda zararlı olduğu, önceki yıllarda da çeşitli bölgelerde yapılan çalışmalarda bulunmuştur [25, 26, 27]. Sakarya ilinde yapılan bu ardışık mısır-buğday ekimi özellikle F. graminearum’un toprakta iyice kolonize olmasına yol açmaktadır. Son yıllarda F. graminearum Grup 1 ve Grup 2 olarak adlandırılmaktadır. Bu adlandırmanın nedeni; Birinci grupta yer alan populasyonların (F. pseudograminearum) buğday, arpa ve yulafta kök, kök boğazı ve sap çürüklüğüne yol açmaları, 2. gruba dâhil olanların ise mısır’da sap ve koçan çürüklüğüne neden olmaları ve buğdayda başak yanıklığına neden olmalarıdır [28].
KAYNAKLAR
[1] Anonymous, 2001. Tarımsal Yapı-Üretim, Fiat, Değer. T.C. Başbakanlık Devlet İstatistik Enstitüsü Matbaası Ankara, Yayın no: 2758, 8+13.s.
[2] Stubbs RW, Prescott JM, Sari EE, Dubin HJ, 1992,. Tahıl Hastalıkları Metodları Klavuzu. S.120. [3] Booth C, 1971. The Genus Fusarium. Com.
Myc. Inst. Kew, Surrey, England, 237.
[4] Mıshra CBP, 1973. Untersuchungen über Fusarium-Arten an weizen-karyopen und Nachweis ihrer Pathogenitet Fusskrankheitserreger. Arch Phytopath. PflSchutz., 9(2): 123-132.
[5] Mathieson, JT, Rush GM, Bordovsky D, Clark LE, Jones OR, 1990. Effects of Tillage on common Root rot of wheat in Texas. Plant Dis. 74. 1006-1008. [6] Aktaş H, 2001, Önemli Hububat Hastalıkları ve
Survey Yöntemleri. Tarımsal Araştırmalar Genel Müdürlüğü yayını, Tarım ve Köyişleri Bakanlığı Tarımsal Araştırmalar Genel Müdürlüğü Bitki Sağlığı Araştırmaları Daire Başkanlığı.
[7] Muratçavuşoğlu N, Hancıoğlu Ö, 1995. Ankara ili Buğday ekim alanlarında kök ve kök boğazı hastalıklarına neden olan Fusarium türlerinin tesbiti üzerine araştırmalar. VII. Türkiye Fitopatoloji Kongresi Bildirileri 20-29 Eylül, sayfa: 174-177. [8] Aktaş H, Kınacı E, Yıldırım AF, Sayın L, Kural A,
1999, Konya yöresinde hububatta sorun olan kök ve kökboğazı çürüklüğü etmenlerinin hububatta verim komponentlerine etkileri ve mücadelesi üzerinde araştırmalar. Orta Anadolu Hub. Tarımının Sorunları ve Çözüm Yolları Semp., 8-11 Haziran 1999, Konya, 392-403.
[9] Haberle J, Schmolke M, Schweizer G, Korzun V, Ebmeyer E, Zimmermenn G, Hartl L, 2007. Effects of two major Fusarium head blight resistance OTL verified in a winter wheat backcross population. Crop. Sci., 47, 1823-1831.
[10] Booth C, 1977. Fusarium. Laboratory Guide to the Identification of the Major Species. Commonwealth Mycological Inst. Kew, Surrey, England. pp:58.
[11] Karaca İ, 1974. Sistematik Bitki Hastalıkları, Deuteromycetes (Fungi Imperfecti) Cilt IV. Ege Üniv. Zir. Fak. Yayınları, No: 217.
[12] Ellis MB, 1971. Dematiaceus Hyphomycetes. Comm. Mycol. Inst., Kew, Surrey, England, C.A.B.,608.
[13] Ellis MB, 1976. More Dematious Hypomycetes. Commenwealth Mycol. Inst. England. Pp. 507. [14] Domsch KH, Gams W, Anderson TH, 1980.
Compendium of Soil Fungi. Academic Pres, London, Newyork, Toronto, Sydney, San Fransisco, I:859.
[15] Singh K, Frisvard JC, Thrane U, Mathur SB, 1991. An Illustrated Manual on Identification of some seed-borne Aspergilli, Fusaria, Penicillia and their Mycotoxins. Danish Gow. Inst. of Seed Path. For Developing Countries Denmark, pp:233.
[16] Burgess L, Summerell BA, Bullock S, Gott PG, Backhouse D, 1994. Laboratory Manual for Fusarium research. 3rd Ed. Fusarium Research Lab. University of Sydney, pp: 133.
[17] Samson AR, Hoekstra ES, Frisvard JC, Filtenborg O,1996. Introduction to food-borne Fungi, Fifth Edition, Centraalbureau voor Schimmelcultures, P.O.Box 273, 3740 AG BAARN The Netherlands pp:119. [18] Toussoun TA, Nelson PE, 1995, A pictorial Guide to the Identification of Fusarium species. Fusarium. The Pennsylvania State University Pres.n University Park and London. Pp.43.
[19] Sneh B, Ichievlevich-Auster M, 1998. Induced resistance of Cucumber Seedlings Caused by Some Non-Pathogenic Rhizoctonia (np-R) Isolates. Phytoparasitica 26, (1), 27-38.
[20] Kunwar IK,, Satyaprasad K, Ramarao P, 1989. Histopathology of Chickpea Plants Infected with F. oxysporum f. sp. İceri. Int. Chickpea Newsletter. 20: 17-18. [21] Ahmad Q, Sharma RN, 1990. Sources of Resistance to Fusarium Wilt of Chickpea in Bihar. International Chickpea Newsletter. 23: 20-21.
[22] Karman M, 1971. Bitki Koruma Araştırmalarında Genel Bilgiler, Denemelerin Kuruluşu ve Değerlendirme Esasları. T.C.Tarım Bak. Zir.Müc. Zir. Karantina Gn. Müd. Yayınları, Mesleki Kitaplar serisi 279.
[23] Bateman GL, Murray G, 2001. Seasonal Variations in Populations of Fusarium Species in wheat field Soil. Applied Soil Ecology, 18. 117-128.
[24] Inglis DA, Cook RJ, 1986. Persistence of Clamydospores of Fusarium culmorum in wheat field soils of Eastern Washington. Phytopathology, 76: 1205-1208.
[25] Bremer H, 1948. Türkiye Fitopatolojisi. Özel Bölüm. Tarım Bakanlığı. Neşriyat Müdürlüğü. Sayı: 657.
[26] Hatat G, Maden S, 1988. Fungal Disease of Corn and Their Incidence in Samsun. J. Turk. Phytopath., 17(3), 117.
[27] Aktaş H, Bostancıoğlu H, Tunalı B, Bayram E, 1996. Sakarya yöresinde buğday kök ve kök boğazı çürüklüğüne neden olan hastalık etmenlerinin belirlenmesi ve bu etmenlerin buğday yetiştirme teknikleri ile ilişkileri üzerinde araştırmalar. Bitki koruma bülteni, 36 (3-4): 151-167.
[28] Wiese MV, 1987. Common (Dryland) root and foot rot and associated leaf and seedling diseases. Pages 53-55 in: Compendium of Wheat Diseases. American Phytopathological Society, St. Paul, MN.
