GAMA IŞINLAMANIN
T H E I L E R I A
A N N U L A T A
ÜZERİNE ETKİLERİ
TÜRKİYE ATOM ENERJİSİ KURUMU
TEKNİK RAPOR
GAMA IŞINLAMANIN THEILERIA ANNULATA
TÜRKİYE ATOM ENERJİSİ KURUMU
2690 sayılı kanun ile kurulmuş olan Türkiye Atom Enerjisi Kurumunun ana görevi; atom enerjisinin barışçıl amaçlarla ülke yararına kullanılmasında izlenecek ulusal politikanın esaslarını ve bu konudaki plan ve programları belirlemek; ülkenin bilimsel, teknik ve ekonomik kalkınmasında atom enerjisinden yararlanılmasını mümkün kılacak her türlü araştırma, geliştirme, inceleme ve çalışmayı yapmak ve yaptırmak, bu alanda yapılacak çalışmaları koordine ve teşvik etmektir.
Bu çalışma TAEK personeli tarafından gerçekleştirilmiş araştırma, geliştirme ve inceleme sonuçlarının paylaşımı amacıyla Teknik Rapor olarak hazırlanmış ve basılmıştır.
Teknik Rapor 2017/1
Türkiye Atom Enerjisi Kurumu yayınıdır. İzin almaksızın çoğaltılabilir. Referans verilerek kullanılabilir. TÜRKİYE ATOM ENERJİSİ KURUMU Adres : Mustafa Kemal Mah. Dumlupınar Bulv.
No: 192 Çankaya/ANKARA Tel : +90(312) 295 87 00 Fax : +90(312)287 87 61 Web : www.taek.gov.tr
ONSOZ
Tropikal Theileriosis’in etkeni zorunlu hücre-içi protozoer bir parazit olan Theileria annulata'dır. Hyalomma soyuna bağlı keneler yoluyla büyük ruminantlara aktarılan parazit hayat siklusunun bazı evrelerini sığırlarda (şizont, merozit vepiroplasın), bazı evrelerini kenelerde (gamet ve sporozoit) tamamlar.
T annulata, dünyada çok geniş bir alanda sığırcılığın en önemli problemlerinden biridir. Theileria enfeksiyonlarının neden olduğu
kayıpların (ölüm, yavru atma, sütten kesilme, genç hayvanlarda gelişmenin yavaşlaması ve erişkinlerde et veriminde düşüş gibi) ekonomik boyutları çok büyük olmaktadır. Enfekte hayvanlardaki ölüm oranı dünyada %5-80 dolaylarında seyretmekte olup kültür ırkı ve melez hayvanların hastalığa direnci daha düşüktür.
Hastalığın tedavisinde kullanılan anti-theilerial kemoterapötiklerin maliyeti yüksektir ve enfeksiyon etkenini tamamen ortadan kaldıramamaktadır. Hastalıkla mücadelede aşılama güvenilir ve yüksek düzeyde koruyucu bağışıklık sağlamaktadır. İsrail Uluslararası Tarımsal İşbirliği Merkezi ile Pendik Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü arasında 1974 yılından itibaren başlayan ortak bilimsel çalışmalar sonucunda T annulata Ankara suşunun 250. pasajının patojenitesini kaybettiği ve bağışıklık sağlayıcı olduğu tespit edilmiştir. Yapılan saha denemeleri ile güvenilirliği ve koruyucu bağışıklık verme özellikleri saptanan Ankara suşu canlı aşısı 1982yılından beri ülkemizde başarıyla uygulanmaktadır.
Kullanılan aşının üretim ve dağıtım aşamalarında üzerinde çalışılması gereken bazı sorunları bulunmaktadır. Bunlar aşının ticaretini kısıtlamaktadır. Aşının zayıflatılma işlemi uzun süren, zahmetli ve pahalı hücre kültürü pasaj işlemlerini gerektirmektedir. Zayıflatılmış aşının uygulanan sığırda ateş oluşturmaması, kanda şizont veya piroplasmların görülmemesi gerekmektedir. Bu ancak 250. pasaj sonrasında mümkün olmaktadır. Ayrıca, aşılanan sığırlardan kan
yoluyla alman zayıflatılmış etken kenelerde tekrar hastalık yapma yeteneği (virulans) kazanabilmektedir. Bu durum hastalığın oluşum döngüsünün devam etmesine neden olmakta, koruyucu bağışıklığın sağlanmasını engellemektedir.
Gama ışınlamanın son yıllarda hastalık etkeninin zayıflatılma (attenüasyon) işleminde kullanılarak aşı yapımında önemli gelişmelere neden olduğu bilinmektedir. T. annulata aşı kültürlerinin gama ışınlama ile zayıflatılması amacıyla yürütülen ve rapor olarak sunulan bu çalışmada attenüasyon için gerekli optimal doz çalışmaları yapılmış, gama ışınlamanın aşının kararlılığı ve virulans kazanma yeteneği üzerindeki etkileri araştırılmıştır. Bir dizi test ve hayvan denemeleri sonucunda gama ışınlama uygulanan hücre kültürlerinde T. annulata virulansının zayıfladığı ve aşı olarak kullanılabileceği belirlenmiştir. Bu çalışma “Gama ışınlamanın Theileria annulata kültivasyonu üzerine etkileri ” başlıklı TAEKprojesi kapsamında Sarayköy Nükleer Araştırma ve Eğitim Merkezi, Nükleer Teknikler Bölümü, Hayvancılık Birimi ile T.C. Tarım ve Köy İşleri Bakanlığı İstanbul Pendik Veteriner Kontrol Enstitüsü, Theleria Annulata Referans Teşhis LaboratuvarEnin işbirliği ile yürütülmüştür. Çalışma sonunda Gama ışınlamanın T. annulata aşısının üretimindeki zaman kaybını engellediği, güvenli ve ekonomik bir çözüm getirdiği belirlenmiştir. Bu raporda sunulan verilerin yararlı olması en büyük dileğimizdir
İÇİNDEKİLER
Tablolar Dizini... i
Şekiller Dizini... ii
Yönetici Ö zeti... iii
Executive Sum m ary... v
1. G İR İŞ ... 1
2. GEREÇ ve YÖNTEM...10
2.1 Enfektif Hücre Kültürü... 10
2.2 Enfekte Hücrelerin Işınlanması... 10
2.3 Aşı materyalinde ışınlama öncesi ve sonrası lenfosit sayımı/canlılık testi...11
2.4 Işınlanmış Theileria annulata’da ve kenelerin tükrük bezinde Tamsl geninin analizi...12
2.5 Theileria annulata’mn ELISA ile teşhisi.13 2.6 Indirect flourescent antibody testi (IFAT)... 14
2.7 Hayvan deneyleri...15
3. BULGULAR...18
3.1 Gama ışınlama... 18
3.2 Aşı materyalinde ışınlama öncesi ve sonrası lenfosit sayım ı/canl ılık testi...19
3.3 Işınlanmış Theileria annulata’daTamsl geninin analizi (PCR)... 19
3.4 Teşhis...24
3.4.1 Perifer kan frotisi örneklerinde Giemsa boyama ..24
3.4.2 Aşılama sonrası deneme hayvanlarının ortalama vücut ısıları... 25
3.4.3 Lenf nodüllerinin biyopsisi...25
3.4.4 ELISA...25
3.4.5 IF A T ... 27
3.5 Kenelerin tükrük bezinde Theileria nın PCR ile belirlenmesi... 27
4. TARTIŞMA... 28
5. SONUÇ ve ÖNERİLER... 33
TABLOLAR DİZİNİ
Tablo 1. Deney hayvanları aşı programı... 16 Tablo 2. Işınlanmış hücrelerde Tamsl geninin
dizilimi (CLUSTAL W ) ...20
Tablo 3. Giemsa boyama sonuçları... 24 Tablo 4. ELISA sonuçları (Soluble şizont antijen kullanılarak) .26
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 1. Lenfoblast içindeki şizontlar... 1 Şekil 2. Sporozoitlerle kaplı bir m onosit... 1 Şekil 3. Enfeksiyonun akut fazında eritrositler içindeki
piroplasm form ları... 2
Şekil 4. Theileria annulata’nın yaşam siklusu...2 Şekil 5. Theileria annulata’nın Türkiye’nin coğrafi
bölgelerindeki dağılım ı...5
Şekil 6. T.C. Tarım ve Köyişleri Bakanlığı T. annulata aşısı.... 8
Şekil 7. Neubauer lamında lenfosit sayımı...11
Şekil 8. 10 gözlü test lam ı... 15
Şekil 9. Işınlanmış hücrelerin (0, 50, 100, 150, 200 Gy)
inkübasyon öncesi durumları... 18
Şekil 10. Işınlanmış hücrelerde iki gün inkübasyon
sonrasında hücre kültürlerinde metabolik
aktiviteyi gösteren renk değişimleri...18
Şekil 11. Çeşitli ışınlama dozlarında lenfositlerin
canlılık oranları (% )... 19
Şekil 12. PCR sonrası Ethidium bromid ile boyanmış jelde
Tamsl g e ni...20
Şekil 13. Işınlanmış T.annulata hücrelerinin PubMed BLAST
filogenetik ağaç üzerindeki konum u... 23
Şekil 14. Enfeksiyonun akut evresinde alyuvarlar içinde
paraziti k form lar... 24
Şekil 15. Soluble şizont antijen kullanılarak elde edilen
ELISA sonuçları... 25
Şekil 16. Kenelerin tükrük bezinde Theileria annulata’yı
YÖNETİCİ ÖZETİ
Tropikal theileriosis’in de içinde bulunduğu kene-kaynaklı
hastalıklar hayvan yetiştiriciliğinde sorun teşkil etmekte ve önemli ekonomik etki yaratmaktadır. Theileria annulata’mn neden olduğu tropikal theileriosis önemli bir sağlık ve işletme sorunu olarak sadece Türkiye’de değil Kuzey Afrika, Güney Avrupa ve Asya’da da büyük önem taşımaktadır. Theileriosis’den kaynaklanan kayıpların kontrolünde halen üç yöntem kullanılmaktadır: Kenelerin kimyasal ilaçlarla kontrolü, hastalanan hayvanların ilaçlarla tedavisi ve aşılama. Akarisidlere direnç kazanan keneler nedeniyle kimyasal ilaç kullanımı kısıtlı kalmakta, ayrıca süt, et ve çevrede bıraktıkları kalıntılar nedeniyle halk sağlığını tehdit etmektedir. İlaçlarla tedavi
etkili görünmekle birlikte birçok olumsuzluğu da birlikte
getirmektedir. Kemoterapötikler hayvanlarda ilk enfeksiyona engel olsa bile ikinci bir enfeksiyona karşı koruyuculuk sağlamamaktadır. Bu durum sık ilaç kullanımını gerektirmektedir. İlaçların sık kullanılması kenelerde ilaca karşı genetik direnç geliştirmekte ve ilacın etkisiz olmasına yol açmaktadır.
Tropikal theileriosis’e karşı geliştirilen zayıflatılmış hücre-kültürü aşısı tüm sığır ırklarında güvenle kullanılmaktadır. Yine de keneler
tarafından bulaştırılan etkenlere karşı kanda piroplasmlar
görülebilmekte, immunizasyon ile hastalığın eradikasyonu mümkün olamamaktadır. Sadece lenfositlerdeki şizontların zayıflatılması yoluyla hastalığın virulansının geri dönmesi engellenebilmektedir.
T.annulata şizontlarının kültür yoluyla zayıflatılması uzun süren
pasajları gerektirmektedir. Son yıllarda yeni moleküler biyolojik yöntemler ve bağışıklık sistemi hücrelerinin kullanılmasıyla bazı viral ve bakteriyel aşıların geliştirilmesi mümkün olmuştur. Paraziter aşılarda rekombinant teknikler çok etkili olmamış, geliştirilen aşılar ya zayıf kalmış ya da bağışıklık sağlayamamıştır. Alternatif teknik olarak gama ışınlama ile zayıflatılan organizmaların metabolik olarak aktif kalsalar bile enfeksiyon yaratmadıkları, ayrıca
konakçıya verildiklerinde hücresel ve bağışıklık mekanizmalarının aktif hale gelebildiği ortaya konmuştur.
Bu çalışmada şizontların tam olarak zayıflatılması için gerekli ışınlama dozunun saptanması amacıyla çeşitli denemeler yapılmış, ışınlanmış şizontların metabolik aktivitesi incelenmiş, ışınlanan aşı deney hayvanlarında test edilmiştir. Şizont evresinin zayıflatılması amacıyla sığır lenfositleri 60Co kaynağında 0, 50,100,150,200,250
ve 300 Gy dozlarda ışınlanm ıştır. Denemeler sonucunda
parazitlerin metabolik aktivitesi üzerinde en etkili dozun 150 Gy olduğu belirlenmiştir. 150 ve 200 Gy dozda ışınlanan aşılar hayvanlar üzerinde denenmiş, 150 Gy dozda ışınlanan aşı ile immunize edilen hayvanların aynı kene suşu ile yapılan sınama testine direnç gösterdikleri görülmüştür. Bir yıl sonra 150 Gy dozdaki aşı ile aynı hayvanlara ikinci aşılama yapılmıştır. Aşılamayı
izleyerek gerçekleştirilen kene uygulaması kanda etkenin
bulunmadığını göstermiştir. Kenelerin enfeksiyon almadıkları ayrıca PCR testiyle de belirlenmiştir.
Sonuç olarak, gama ışınlama ile zayıflatılmış T. annulata
şizontlarının laboratuvar koşullarında sığırlarda bağışıklık
oluşturduğu saptanmıştır. T. annulata hücre kültürü aşısının
geliştirilmesi amacıyla şizontların zayıflatılmasında gama
ışınlamanın yararlı olduğu kanıtlanmıştır.
Anahtar kelimeler: Theileria annulata, tropikal theileriosis, aşı, in- vitro hücre kültürü
EXECUTIVE SUMMARY
Tick-borne diseases including tropical theileriosis, constitute a major constraint of livestock production and have considerable economic impact. Tropical theileriosis caused by Theileria annulata is a major health and management problem of cattle in Turkey as well as in North Africa, Southern Europe and Asia. Chemical tick control, treatment of animals and vaccination are the measures available to limit losses incurred by theileriosis. Chemical control is limited owing to selection of acaricide-resistant ticks, in addition, residues in meat, milk and environment have raised public health concerns. Chemotherapy can be effective, however has a number of disadvantages. Firstly, even though animals are cleared of infection after tratment, it often fails to prevent re-infection thereby requiring frequent administration of the drug. Secondly, parasites are able to adapt genetically to the action of the drugs, resulting in the development of drug resistance - a common cause of overuse. The attenuated cell-culture-derived vaccine against tropical theileriosis has proved to be safe for all breeds of cattle, however doesnot always prevent development of piroplasms following tick transmission, eradication of the disease cannot be achieved by immunization. Reversion of virulence is not possible when the schizonts are completely attenuated. Attenuation of T. annulata schizonts is achieved by prolonged growth and passage in culture.
During the last decade or so vaccine development has been facilitated by advances in the molecular and cell biology of the immune system. A new generation of vaccines produced for parasitic diseases through recombinant technology are only weakly or non-immunogenic. Gamma irradiation - attenuated organisms are proved to be metabollically active, however they fail to develop into a mature infection. Moreover, they activate both cellular and immune responses when they are introduced to the host.
In this study, a series of experiments were carried out to investigate the metabolic activity of irradiated schizonts for the determination of optimum radiation dose for complete attenuation, and to test
irradiated T.annulata vaccines in experimental calves. The
possibility of attenuation of the schizontal stage of T. annulata within bovine lymphocytes was investigated using 60Co radiation at 0, 50,100, 150, 200, 250 and 300 Gy levels. It was demonstrated that 150 Gy was the most effective dose for the metabolic activity of the parasites. 150 and 200 Gy irradiated vaccines were tested on animals, vaccinated calves with 150 Gy irradiated vaccine were resistant to subsequent tick challenge with the same virulent strain. One year later, second vaccination with 150 Gy vaccine was applied to the same group of calves. The challenge realized with the
Hyalomma ticks, did not show any infection in the peripheral blood.
These results were assessed by PCR.
As a result, immunoprophylaxis of susceptible cattle with gamma- irradiated T. annulata schizonts seems to be potentially practical under laboratory conditions. The use of gamma irradiation for the attenuation of schizonts for the improvement of T. annulata vaccine is proved to be very beneficial.
Key words: Theileria annulata, tropical theileriosis, vaccine, in-vitro cell-culture
1. GİRİŞ
Theileria annulata’nın yol açtığı tropikal theileriosis Türkiye’de
sığırların en önemli ve en sık görülen hastalıklarından biridir. Hastalık Türkiye’de mevsimsel aktivite gösterir ve ülkenin tüm iklim kuşaklarında görülür. Theileriosis aynı zamanda Avrupa’nın güneyinde, Kuzey Afrika, Orta Asya, Ortadoğu, Hindistan ve Rusya’nın güneyinde sığırlarda yaygındır (1,2). T. annulata zorunlu hücre içi bir protozoon parazittir ve Ixodidae ailesinde yer alan
Hyalomma türü kenelerle, özellikle Hyalomma anatolicum anatolicum ve Hyalomma detritum tarafından aktarılır. Memeli
hayvanlarda parazitlerin hayat siklusu üç gelişim safhası gösterir: Sporozoit, Şizont ve Piroplasm. Kan emme sırasında nimf veya ergin kene tarafından verilen sporozoitler monosit ve makrofajlara girerek burada şizontlara dönüşürler. (Şekil 1 ve 2). Şizontlar konak
hücrelerin bölünmesi ve kardeş hücre (daughter cells)
oluşturmasıyla çoğalırlar.
Şekil 1. Lenfoblast içindeki Şekil 2. Sporozoitlerle kaplı bir
şizontlar monosit
Şizontlar içinde gelişen merozoitler enfekte hücrenin yırtılmasıyla serbest hale geçer ve eritrositlere girerler, eritrositler içinde piroplasmik formları oluştururlar (Şekil 3) (3). Larva ve nimf safhasında enfekte konaktan kan emen keneler, kanla birlikte bu
gametogenesis ve fertilizasyon gerçekleşir. Zigot mide epitellerine girer ve hareketli kinetler oluşur. Kinetler mide duvarını delerek tükürük bezlerine ulaşır ve burada sporogonik çoğalma sonucunda binlerce sporozoit meydana gelir. Siklus bu şekilde döngüsünü tamamlar ve devam eder (Şekil 4).
Şekil 3. Enfeksiyonun akut fazında eritrositler içindeki piroplasm formları
The life-cycle o f T. annul at a
merogony
leucocyte
Clonal expansion
erythrocyte
Salivary gland Nymph gut
spo rorrt
Bu safhaların içinde sadece şizontlar in vitro gelişebilirler ve uzun süren bir kültivasyon sonrasında zayıflatabilirler. Bu özellik hücre kültürü aşısının temelini oluşturmaktadır (4).
T. annulata en patojen Theileria türlerinden biridir ve sığırlarda
lenfoproliferatif karakterde, yüksek morbidite ve mortalite ile seyreden theileriosis’e neden olur. Hastalığın patogenezi parazitin lenf hücreleri ile eritrositlerde yaptığı tahribat sonucu ortaya çıkar. (5,6,7).
Hastalık belirtileri, sporozoitlerin vücuda girişinden ortalama 15 gün (9-25 gün) sonra ortaya çıkar. T. annulata'mn neden olduğu tropikal theileriosis'de, şizont (lenfosit evresi) ve piroplasm (eritrosit evresi) formları patojendir ve kenelerle iletilen hastalıklar arasında en
önemli yeri tutmaktadır (8). Lenf hücrelerinin sınırsız
çoğalmasından sonra bu hücrelerin tahribatına yol açan hastalık etkeninin en patojen dönemi başlangıçtaki şizont evresidir. Şizont evresi sığırların bağışıklık sisteminde tahribat oluşturur ve diğer oportünist patojenlerin de hastalık yapabilme kabiliyetlerini arttırır (3,5).
Theileriosis özellikle Mayıs-Eylül ayları arasında %40-60 mortalite ile seyretmektedir. Kültür ırkı sığırlar hastalığa daha duyarlıdır. (9). Türkiye’de saf ve melez kültür ırklarının hastalığa yakalanma ve ölme riskinin % 60 olduğu bildirilmektedir (10). Hastalığın en önemli belirtileri, ateş yükselmesi (ilk günlerde 41-42°C) ve lenf bezelerinin asimetrik şişmesidir. Bundan başka ağız, göz, burun akıntısı, nabız ve solunum artışı, konjuktiva ve mukozalarda önce hiperemi, daha sonra anemi ve ikterle birlikte peteşiler görülür. Hemoglobinuri tablosuna bilirubinuri ve bilirubinemi eşlik eder. Hasta inekler sütten kesilir ve bazı gebe inekler yavru atar. Şiddetli durumlarda ateş yükselmesinden 1 -2 hafta sonra ölümler meydana gelir (2,6,11). Türkiye’de theileriosis ile ilgili araştırmalar, uzun yıllar lenf ve perifer kan frotilerinin mikroskobik bakısına dayanılarak yapılmıştır (8,12). Daha sonra geliştirilen serolojik yöntemler, özellikle IFAT (13,14,15) yerini moleküler yöntemlere bırakmıştır (7,16,17,18). Bu çalışmalar, Türkiye’de sığırlarda patojen Theileria türlerinden T.annulata’mn yüksek oranda bulunduğunu göstermiştir. Moleküler teknikler diğer yöntemlere göre daha hassas olup latent enfeksiyonları da ortaya
çıkarması bakımından teşhiste daha etkili görünmektedir. Theileria
annulata’ya karşı recombinant subunit aşı ve tanı amaçlı test
geliştirme çalışmalarında kullanılan proteinlerden (30 kDa) biri olan Tam sl, parazitin en belirgin immunodominant merozoit yüzey antijenidir (19). Bu antijen analizi yapılan bütün T annulata suşlarında bulunmuştur. Tamsl genini belirleyen primerler tüm T.
annulata sekanslarında bulunmaktadır. Sekans diğer Theileria
türlerinde varyasyonlar göstermektedir (20). Moleküler tekniklerle
yapılan teşhis çalışmalarının çoğu Tamsl primerini temel
almaktadır (21,22).
Theileria annulata’mn aktarılmasında rol oynayan en önemli kene
türünün Hyalomma anatolicum anatolicum olduğu belirlenmiştir (13). Elazığ, Malatya ve Tunceli yöresinden toplanan toplam 7455
Hyalomma türü üzerinde yapılan çalışmada Hy. a. anatolicum türü
kenelerde enfeksiyon oranının %34 olduğu bulunmuştur.
Enfeksiyonu taşıyan ikinci önemli tür ise %18.4 ile Hy. detritum’dur (23).
Theileria annulata’mn yol açtığı tropikal theileriosis, Türkiye’nin
bütün coğrafik bölgelerinde görülen en önemli sığır hastalıklarından biridir. Türkiye’de sığırlarda Theileria annulata’mn yaygınlığı Şekil 5’te gösterilmektedir. Hastalık genel olarak Marmara Bölgesinde %33.3, Ege Bölgesinde % 40, Akdeniz Bölgesi’nde % 3.4, İç Anadolu’da % 29, Kapadokya Bölgesinde %60, Karadeniz Bölgesinde %46.8, Doğu Anadolu’da % 48.2, Güneydoğu Anadolu’da % 91.4 oranında görülmektedir (14, 24, 25, 26).
Theileriosis, ateş yükselmesini takiben çok kısa sürede gelişir ve çoğunlukla ölümle sonuçlanır. Enfeksiyona yakalanan hayvanlarda hızlı zayıflama ile meydana gelen canlı ağırlık kayıpları, süt veriminde kesilme veya azalma, yavru atma, ölümler ve ilaç masrafları ekonomik kayıplara neden olur (27). Yapılan analizler en yüksek ekonomik kaybın (%51.62) hastalığın yayılmasından kaynaklandığını ortaya koymaktadır. Bunu sırasıyla ölümler (%22.84), diğer kayıplar (%9.29) ve kontrol için harcanan para (%3.45) izlemektedir (28). Hastalıkla mücadelede kenelere karşı kimyasal maddeler yaygın olarak kullanılmaktadır.
Şekil 5. Theileria annulata'nm Türkiye'nin coğrafi bölgelerindeki dağılımı S: Froti testi, ABT: Antikor testi, MP: Moleküler teknikler kullanılarak
belirlenmiştir.
Bununla birlikte, anti-paraziter moleküllere karşı kenelerin
geliştirdiği direnç, bu kimyasalların yüksek maliyetleri ve ülkedeki hayvan hareketlerinin kontrolsüz oluşu kenelerle mücadelede çok yetersiz kalınmasına yol açmaktadır. Hastalığın tedavisinde kullanılan ilaçlar yurtdışı kaynaklıdır ve fiyatları yüksektir. Bu ilaçlar enfeksiyon etkenini tamamen ortadan kaldıramamakta üstelik döviz kaybına neden olmaktadır (9, 26, 27, 28).
Yarattığı ekonomik kayıplar nedeniyle theileriosis sığırcılık
endüstrisinin en önemli tehditlerinden biridir. Kültür ırkı sığırlar ve aşısız hayvanlar yüksek risk taşımakta ve bu hayvanlarda ölüm oranı %70 den fazla olmaktadır (29). İnci ve ark. (28) hastalığın sığırlarda %30 süt, %37 et kaybına neden olduğunu belirtmişlerdir. Kapadokya Bölgesi’nde yapılan bir araştırmada aşısız ve kültür ırkı 554 sığırın 156 sına (%27.61) akut theileriosis teşhisi konduğu, bunlardan 86 sının (%56.21) öldüğü bildirilmektedir (26).
Primer Theileria enfeksiyonunu takiben gelişen kazanılmış
bağışıklık, homolog parazit suşuna bağlı ikinci enfeksiyona karşı çok etkin koruyuculuk sağlamaktadır (9). Bu konuda yapılan araştırmalardan çıkan sonuçlara göre, "natural killer" (NK, doğal öldürücü) hücreler ve makrofajlar, primer Theileria enfeksiyonuna karşı doğal savunma reaksiyonlarının en önemli kısmını oluştururlar
(30). Buna karşılık, spesifik antikorlar ve T-lenfositleri (CD4+T- hücreleri ve sitotoksik T-lenfositleri (CTLs), kazanılmış aktif
bağışıklıkta yeni enfeksiyonlara karşı en önemli rolü
üstlenmektedirler (31). Belirli bir suşa karşı kazanılmış koruyucu bağışıklığın bazı başka suşlara karşı da koruyucu olabildiği gözlemlenmiştir (32).Kazanılmış bağışıklığın en etkin "effector" mekanizması olan CTLs cevabı, Hissar (Hindistan aşı suşu) suşu ile bağışıklanmış sığırlarda otolog parazitle enfekte hücrelere (Hissar suşu ile enfekte lenfoblastoid hücreler) karşı etkili olmasına rağmen, Gharb (Fas aşı suşu) ve Ankara (Türkiye aşı suşu) suşları ile enfekte hücrelere sitotoksik etki göstermemektedir (33). Buna karşılık Ankara suşu ülkemizde değişik yörelerden elde edilen izolatlar ile Hindistan ve Fas'ta izole edilen heterolog patojen T.
annulata suşlarına karşı çapraz-bağışıkİık sağlamaktadır (34).
Hastalık halen Türkiye için sorun olmaya devam etmektedir. Hastalıkla mücadele üç şekilde yapılmaktadır: Kene mücadelesi, aşılama ve ilaçlar (kemoterapi):
- Kenelerle kimyasal mücadelede kullanılan akarisidler kenelerin tamamına etki edememektedir. Ayrıca keneler zaman içinde bu
kimyasallara karşı direnç kazanmaktadırlar. Bu kimyasalların
yüksek maliyetleri ve ülkedeki hayvan hareketlerinin kontrolsüz oluşu da kenelerle mücadelede yetersiz kalınmasına yol açmaktadır (9,26).
- Hastalığın tedavisinde Parvaquone, Buparvaquone ve
Halofuginone gibi bazı kemoterapötik ilaçlar kullanılmaktadır. Bu ilaçlar enfeksiyon etkenini tamamen ortadan kaldıramamakta, sığırlarda taşıyıcı formların gelişmesine neden olmaktadır (2). - Theileria annulata Ankara suşu zayıflatılmış doku kültürü aşısı 30 yıldır Türkiye’de yaygın ve başarılı biçimde kullanılmaktadır. Theileria şizontlarını taşıyan lenfoid hücrelerin doku kültüründe sürekli pasajı sonucu zayıflatılan etken aşı olarak hazırlanmakta,
her 20-30 pasajda bir virulans kontrol edilmektedir. İstenilen
attenüasyona genellikle 250. pasajda ulaşılmaktadır ve aşı 250.
pasajın üstündeki pasajların subkültivasyonu şeklinde
hazırlanmaktadır (32). Endemik bölgelerde yaklaşık yılda 170.000 doz aşı uygulanmaktadır (35). Kullanılan aşının üretim ve dağıtım
aşamalarında üzerinde çalışılması gereken bazı sorunları bulunmaktadır. Bunlar aşının ticaretini kısıtlamaktadır (34,35): 1. Aşının zayıflatılma işlemi uzun süren, zahmetli ve pahalı hücre kültürü pasaj işlemlerini gerektirmektedir. Zayıflatılmış aşının uygulanan sığırda ateş oluşturmaması, kanda şizont veya piroplasmların görülmemesi gerekmektedir. Bu ancak 250. pasaj sonrasında mümkün olmaktadır.
2. Aşılanan sığırlardan kan yoluyla alınan zayıflatılmış etken
kenelerde tekrar hastalık yapma yeteneği (virulans)
kazanabilmektedir. Bu durum hastalığın oluşum döngüsünün
devam etmesine neden olmakta, koruyucu bağışıklığın
sağlanmasını engellemektedir.
3. Aşının üretimi ve kullanım alanı arasında, taşınma ve dağıtımda soğuk zincirin kırılmaması gerekmektedir. Bu nedenle aşı sürekli sıvı azot veya kuru buz içinde (-196°C) tutulmaktadır.
Gama ışınlama son yıllarda hastalık etkeninin zayıflatılma
(attenüasyon) işleminde kullanılarak aşı yapımında önemli
gelişmelere neden olmuştur. Özellikle hazırlanma aşaması zahmetli aşılarda gama radyasyonun büyük kolaylık sağladığı, güvenilir ve etkili bir teknik olduğu bildirilmektedir (36,37).
Uluslararası Atom Enerjisi Ajansı (IAEA) canlı aşı etkenlerinin zayıflatılmasında gama radyasyon ile başarı sağlanabileceğini yürüttüğü ve halen yürütmekte olduğu çeşitli çalışmalarla belgelemektedir. Örneğin, gama ışınlama son yıllarda sıtma ve insanlarda enfeksiyon oluşturan Schistosoma mansoni etkenlerinin zayıflatılmasında çok iyi sonuçlar vermektedir. Bu sonuçlara rekombinant aşılarla ulaşmak mümkün olmamıştır (38,39). Gama ışınlamanın dayanıklı, virulent Babesia bovis suşlarını baskılaması için 350 Gy doz yeterli olmaktadır. Zayıflatılmış avirulent B. bovis etkenlerinin immunojenitelerinin yüksek olduğu, bir yıl sonra bile virulans kazanmadığı ve kenelerce nakledilmediği belirtilmektedir (40). Srivastava and Sharma (36) 0.5 ve 1 kR (kiloroentgen) dozlarda gama ışınlamanın sığır lenfositleri içindeki şizontlar üzerindeki etkilerini incelemişlerdir. Işınlanan zayıflatılmış parazitler enfeksiyona duyarlı hayvanlara verildiğinde hastalığın şiddetli
seyretmediğini, ateşin, paraziteminin, mortalite ve morbiditenin düşük olduğunu görmüşler, hastalığı yenen danalarda aynı virulent
suşa karşı direnç geliştiğini belirlemişlerdir. Araştırıcılar
şizontlardaki hasar ve zayıflama oranının dozla doğru orantılı olduğunu saptamışlardır. Gama ışınlama ile zayıflatılmış aşının profilaksi amacıyla kullanılabileceğini göstermişlerdir.
Bu veriler, gama ışınlamanın, halen üretilmekte olan T.annulata aşısında yaşanan sorunlara çözüm getirebileceğini, İyonlaştırıcı radyasyonun steril ve güvenilir bir yöntem olarak aşının zayıflatılmasında konvansiyonel tekniklerden daha etkili ve başarılı
olacağını göstermektedir. Gama ışınlamanın ayrıca şizont
kültürlerinin zayıflatılmasında stabilizasyon problemini çözebileceği düşünülmektedir (39).
Aşılama en etkin kontrol ve eradikasyon yöntemidir. Bir
enfeksiyonun yaratacağı maddi-manevi tüm kayıpları önleyecek,
koruyucu tek sağlık yatırımıdır. Aşılar çoğunlukla enfeksiyonu
yaratan canlı etkenin zayıflatılarak vücuda verilmesi asasına dayanır ve bu yolla hastalığa karşı koruyucu bağışıklık oluşması sağlanır. Aşı üretim teknolojsii sürekli yenilenmekte, üretilen aşıların etkinlikleri ve kolay kullanılır olmaları yönünde çalışmalar devam etmektedir. Son yıllarda paraziter hastalıklarla mücadelede rekombinant aşılar denenmiş, immunojenitelerinin zayıf veya hiç olmadığı görülmüştür. Bu yönde yeni stratejilere gerek duyulmuş, gama ışınlamanın bu amaçla kullanılabileceği düşünülmüştür (38).
Bu çalışma ülkemizde T.C. Tarım ve Köy İşleri Bakanlığı, Pendik Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü tarafından Ankara suşu kullanılarak üretilen T. annulata aşı kültürlerinin gama ışınlama ile zayıflatılması amacıyla yürütülmüştür. Bu amaçla, attenüasyon için gerekli optimal doz çalışmaları yapılmış, gama ışınlamanın aşının kararlılığı ve virulans kazanma yeteneği üzerindeki etkileri araştırılmıştır.
2. GEREÇ ve YÖNTEM 2.1 Enfektif Hücre Kültürü
Enfekte hücreler Glaskow Minimal Essential Medium (GMEM), %20 buzağı serumu, penisilin (100 ünite/ml), streptomisin (50pg/ml) ve mikostatin (75 ünite/ml) içeren besi yerleri içinde, 25 ml’lik kapaklı doku kültürü şişelerinde kültüre edildiler. Besi yerleri her 2 günde bir yenilendi, vasat içinde parlak ışınım veren hücrelerin varlığı faz- kontrast ve ters mikroskopta incelenerek kontrol edildi, hücrelerin çoğalıp çoğalmadığı izlendi. Vasat değişirken tek sıra (monolayer) üreyen hücrelerin etkilenmemesi için vasata %0.025 EDTA (Versene) eklendi. Şişelere bölüştürülen hücre sayısı mikroskopta sayılarak belirlendi. Her 25 ml’lik şişeye yaklaşık 107 hücre konuldu. Işınlama dozları için her biri 5x107 hücre içeren 10’arşişe hazırlandı.
2.2 Enfekte Hücrelerin Işınlanması
Gama ışınlama Sarayköy Nükleer Araştırma ve Eğitim Merkezi bünyesindeki 60Co kaynağında (Tenex-lssledovatel) ve oda
sıcaklığında gerçekleştirildi. Çeşitli tarihlerdeki ışınlamalarda
kaynağın doz hızı 0.710-0.640 kGy/h arasında olup ışınlama süresi doz hızı dikkate alınarak aşağıdaki şekilde hesaplandı.
D = R x T
D = Uygulanan radyasyon dozu (Gy) R = Doz hızı (Gy/h)
T = Işınlama süresi (h)
İlk ışınlama 0-350 Gy doz aralığında yapıldı [0 (kontrol), 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 Gy]. Her ışınlama dozu için her biri 5x107 hücre içeren 10 adet hücre kültürü şişesi kullanıldı. İn vitro değerlendirme sonrası doz aralığı 0, 100, 150, 200 Gy olarak daraltıldı. Işınlamalar sonrası ikişer seri pasaj çalışması yapıldı. Ayrıca hücrelerdeki canlılık oranları belirlendi.
Ayrıca ışınlama sonrası Theileria annulata merozoite surface antigen geni (Tam sl) üzerinde moleküler düzeyde çalışmalar yapılarak antijenin nükleotid diziliminde değişiklik olup olmadığı incelendi.
2.3 Aşı materyalinde ışınlama öncesi ve sonrası lenfosit sayımı /canlılık testi
Aşı materyali sulandırıldıktan sonra içinden alınan miktar (0.2 mİ), PBS (pH.6.8) ile 5 katı sulandırıldı, Trypan blue katıldı. Sayımlar Neubauer lamında 5 büyük karedeki canlı ve ölü hücreler sayılarak yapıldı (Şekil 7).
Şekil 7. Neubauer lamında lenfosit sayımı.
Oklar ölü (mavi renkli) ve canlı (renksiz) lenfositleri göstermektedir.
Toplam hücre sayısı ve canlılık oranları canlı hücrelerin mavi renkteki Trypan blue boyasını almamaları esasına dayanarak aşağıdaki formüllere göre hesaplandı.
Toplam Hücre Sayısı = Sayılan Hücre x 2 x 1000 x 13.5 x 5 Canlı Hücre Sayısı / Toplam Hücre Sayısı x 100
2.4 Işınlanmış Theileria annulata’da ve kenelerin tükrük bezinde Tamsl geninin analizi
Işınlanmış enfekte lenfositlerden DNA ekstraksiyonu için 10x106 hücre içeren ve sıvı azot içinde -196°C de dondurulmuş örnekler 37 °C lik su banyosunda çözdürüldü. Total DNA ticari kit kullanılarak (QIAGEN) ekstrakte edildi.
İkinci aşılama sonrası danaların kulaklarından alınan keneler
dondurularak steril havanda ezildi, 500 |Jİ PBS içinde homojenize
edildi. Bu homojenattan DNA ticari kit (QIAGEN) protokolü izlenerek elde edildi.
PCR Amplifikasyonu: Theileria annulata’nın protein yapısındaki (30 kDa) olup 776 baz çifti (bp) taşıyan merozoit yüzey antijeni (Tam sl) total DNA örneklerinden aşağıdaki primerler kullanılarak amplifiye edildi (22):
Tamsl F (5’-ATGCTGCAAATGAGGAT-3’)
Tspm sIR (5’-GGACTGATGAGAAGACGATGAG- 3’)
DNA amplifikasyonu 50 pl hacımda gerçekleştirildi. Her bir reaksiyon için 0,5 pl primer, 0,2 pl dNTP, 20 pM tris HCL, 5 mM
(NH4)2S04, 3mM MgCİ2, 150pl BSA, 0,025U/pl Taq Polymerase ve
5 pl DNA kullanıldı. PCR Programı: 94°C 3 dk 94°C 1 dk ~ 60C 1 dk 72 C 1 dk _ 72 C 10 dk 40 tur
Jel Elektroforez: 20 pl PCR ürünü %1,5’luk agaroz jelde yürütüldü. Spesifik DNA bantları UV transilluminatör yardımıyla belirlendi. Sekanslama: 25 pl saflandırılmış örneklerin sekansları Pendik Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Genetik Laboratuvarı’nda gerçekleştirildi. Sonuçlar BLAST ve CLUSTALW programları kullanılarak değerlendirildi.
2.5 Theileria annulata’nin ELISA ile teşhisi
T. annulata’ya karşı oluşan antikorların teşhisi amacıyla ELISA
yöntemi farklı antijenler kullanılarak çalışıldı. Tüm antijenler için
T.annulata şizontları içeren hücreler kullanıldı (hücre konsantrasyonu 5x107/2ml, canlılık >%90).
SelülerŞizont Antijeni: Antijen canlı T. annulata taşıyan hücrelerden hazırlandı (41). Hücreler 3 kez soğuk PBS (pH.7.2) ile yıkandı (200g, 10 dk, 4°C). Trypan blue boyası kullanılarak canlılık sayıldı. Ayrıca, %0.1 poly-L-Iysine (Sigma)/ PBS ELISA plaklarının (Dynatech MicroELISA) gözlerine pipetlendi ve plaklar oda sıcaklığında 2 saat bekletildi. Daha sonra 3 kez PBS ile yıkandı. Her göze hazırlanan antijenden 60.000 şizont /200pl olacak şekilde pipetlendi ve 37°C’de 1 saat bekletildikten sonra 3 kez PBS ile yıkandı. Gözlere tam dolduracak şekilde % 0.25 gluteraldehyde / PBS koyuldu. Üç dakika sonra plak PBS ile yıkanıp kurutuldu. Plak gözleri %1 Bovine Serum Albumin (BSA) ile bloke edildikten sonra plaklar kapatıldı ve test gününe kadar 4°C’de saklandı.
Çözülmüş (Soluble) Şizont Antijen: T.annulata ile enfekte hücreler 3 kez soğuk PBS (pH 7.2) ile yıkandı. Son pelete 130 pl soğuk PBS eklendi. Süspansiyon buz içinde ve 4°C’de 30 saniye aralarla 5 kez
45’er saniyelik ultrasonikasyona tabi tutuldu. Daha sonra
süspansiyon 10.000 g’de 10 dk santrifüj edildi. Üst fazlar toplandı, 150pl PBS eklendi ve tekrar santrifüj edildi. Bu işlem 5 kez tekrar edilerek üst fazlar toplandı, porsiyonlara ayrılarak -20°C’de antijen olarak saklandı (42).
Şizont Antijen: T.annulata ile enfekte hücreler 200 g, 2 dk, 4°C’de santrifüj edildiler. Üst faz atıldı, hücre peleti soğuk PBS ile sulandırılarak tekrar santrifüj edildi. Bu işlem 3 kez tekrarlandı. Son hücre peleti 107 hücre/ml olacak şekilde sulandırılarak -20°C’de antijen olarak saklandı. Protein içeriği kolorimetrik biüret total protein testi ile 2.0 mg/ml olarak belirlendi (43).
ELISA protokolü: Antijenlerin, pozitif /negatif serumların ve
konjugatın optimum konsantrasyonları titrasyon testleriyle
belirlendi. Titrasyonlarda en iyi sonucu çözülmüş şizont antijen verdi ve ELISA testlerinde bu antijen kullanıldı.
96 gözlü ELISA plakları (Dynatech MicroELISA) 200pl antijen (1:200 sulandırma/ coating buffer, pH 9.6) ile kaplandı ve kapatılarak 4°C’de bir gece bırakıldı. Ertesi sabah gözlerin bağlanma olmayan alanları %1 BSA ile bloke edildi (250 pl/göz), 37°C’de 1 saat inkübasyona bırakıldı. İnkübasyon sonrası plaklar boşaltılarak PBS-Tween 20 %0.01 (PBST) ile 3 kez ve PBS ile 2 kez yıkandı. Yıkama sonrası PBST içinde 1:100 oranında sulandırılan serum örnekleri (referans pozitif ve negatif serumlar
dahil) belirlenmiş gözlere 200pl olarak pipetlendi. Plaklar
kapatılarak 4°C’de bir gece bırakıldı. Ertesi sabah plak boşaltılarak yukarıda belirtilen şekilde yıkandı. Yıkama sonrası PBST içinde 1:1000 oranında sulandırılan konjugat (Rabbit antibovine IgG, whole molecule horseradish peroxidase, Miles Scientific) her göze 200pl pipetlendi. Pipetleme öncesi konjugatın özgünlüğünü artırmak ve antijen-konjugat bağlanmasını önlemek amacıyla konjugata %0.2 oranında at serumu katıldı. Plaklar 37°C’de 1 saat inkübe edildi. İnkübasyon sonrası plaklar aynı şekilde yıkandı. Yıkama sonrası tüm gözlere 200 pl substrat solüsyonu (5- Aminosalicylic acid) pipetlendi. Plaklar çalkalayıcı üzerinde 30 dk inkübe edildi. Oluşan renklerin optik dansitesi (OD) ELISA
okuyucuda (Multiskan Titertek) 492 nm’de okundu. Pozitif
örneklerin ayrım değeri (cut off value) aşağıdaki şekilde hesaplandı:
Cut off değeri: 10 negatif örneğin OD değerleri ortalaması ± __________________ 2 standart sapma__________________ 2.6 Indirect flourescent antibody testi (IFAT)
Deneme hayvanlarında deneme öncesi ve birinci aşılamadan sonra uygulanan bu serolojik test aynı zamanda ELISA testi sonuçlarının karşılaştırılması amacıyla kullanıldı. IFAT testi OIE tarafından önerilen protokole göre gerçekleştirildi (2).
IFAT antijeni: T. annulata ile hafif enfekte 2 günlük kültürlerden
toplanan şizont enfekte hücreler 500 g’de 10 dk santrifüj edildiler. PBS ile yıkandılar (3 kez, 500 g 10 dk). Son yıkamayı takiben hücrelerin canlılığı saptandı ve hücreler 5x107 olacak şekilde sulandırıldı. Buna 1:10 sulandırılmış formaldehit eklenerek 10 dk buz içinde bekletildi. Daha sonra 3 kez aynı şekilde PBS ile yıkandı. Bu antijenden aşağıda resmi görülen 10 gözlü lamların her bir gözüne 30pl pipetlendi, kurutuldu, alüminyum folyoya sarılarak test
gününe kadar-20°C’de bekletildi.
Şekil 8. 10 gözlü test lamı
IFAT protokolü: Antijen içeren lamlar silikajel içinde 30 dk bekletildi (4°C). Lamlar aseton içinde fikse edildi ve 4 kez PBS içinde yıkandı. Gözlere farklı serum dilüsyonları pipetlendi (10pL), 30 dk oda sıcaklığında bekletildi. Her lama protokol dahilinde pozitif, negatif ve substrat kontrolleri pipetlendi. İnkübasyon sonrası lamlar 3 kez PBS ile yıkandı. Her göze 10 pl FITC işaretli anti bovine IgG konjugat eklendi. Lamlar karanlık, nemli ortamda 30 dk. bekletildikten sonra tekrar 3 kez PBS ile yıkandılar. Lamlar %66 gliserol içeren 50 mM Tris HCL ile kaplandılar. Lamlardaki gözler tek tek floresan mikroskop altında incelendi. Değerlendirmede 1:40 ve üstü titreler pozitif, bu titrelerin altındaki titreler negatif kabul edildi.
2.7 Hayvan deneyleri
Deneme hayvanları kene ve diğer akarisidlerden arındırılmış temiz ahırlarda tutuldular. Tüm hayvanlara deneme öncesi Giemsa boyama testi ve IFAT uygulanarak T. annulata taşıyıp taşımadıkları belirlendi. Tüm hayvanlar negatif bulundu. Aşılama sonrası ateş yükselmesi ve lenf yumrularının şişme durumu hergün muayene edilerek kaydedildi. Aşılama denemesi aşağıdaki tabloda (Tablo 1) belirtilen şekilde gerçekleştirildi. Deneme sırasında toplanan serum örnekleri test gününe kadar - 20°C’de tutuldular.
T a b lo l. D e n e y h ay v a n la rı a ş ı pr o gr am ı 0 0) CD ■o (/) CD CD CD ■o CD CD (/) C LÜ CD E CD <D > O 0) 0) > <1) Hay va n G ru p la rı (H e r g rup ta 5 hay va n o la c a k ş e k ild e )
Deneme sonrası T. annulata teşhisi için aşağıdaki parametreler kullanıldı:
• Giemsa boyama (sınamayı izleyen 8. haftadan sonra bir hafta arayla sürekli): Danalardan kan alınarak lam üzerine ince froti preparatları hazırlandı, kuruduktan sonra 5 dk. metanolde fikse edildi ve deiyonize su ile hazırlanmış %5 Giemsa içinde 30 dk.
boyandı. Boyanan preparatlar 100 büyütme ile Theileria
piroplasmları yönünden incelendi. Bu uygulama hayvanlar
hastalanıncaya ve/veya ölünceye kadar devam etti.
• Vücut ısısı (Deneme süresince sürekli, tüm gruplarda hergün) • Lenf nodülü ponksiyonu (Lenflerin şişmesini takiben hergün) • Sınama amaçlı kene stabilatı (1. aşılamayı izleyen haftada): Kene stabilatı olarak T.C. Tarım ve Köy İşleri Bakanlığı, Pendik Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü laboratuvarlarındaki mevcut stok kullanıldı. Bu stok Theileria annulata enfeksiyonu taşıyan Hyalomma detritum kenelerinden hazırlanarak sıvı azot içinde (-196°C) saklanmaktaydı.
• Kene Uygulaması (ikinci aşılama sonrasında): 150 Gy aşı ile ikinci aşılama birinci aşılamadan bir yıl sonra, C grubundaki aynı hayvanlara uygulandı. Aşı yapıldıktan 1 hafta sonra enfeksiyon taşımadığı bilinen Hyalomma keneleri, her kulağa 20 kene olacak
şekilde danaların kulaklarına yerleştirildiler. Önce havayı
geçirebilecek bir bez kullanılarak bir yanı açık özel torbalar hazırlandı. Torba tabanından plasterle kulağa tesbit edildi. Keneler yerleştirildikten sonra açık kenar da plasterle kapatıldı. Keneler hergün kontrol edildi, doyup düşen keneler bir şişeye alındı ve muayene gününe kadar sıvı azot içinde (-196°C) muhafaza edildi.
3. BULGULAR
3.1 Gama ışınlama
50 ve 100 Gy dozda ışınlanan hücreler canlılıklarını korudular, bölünmeye devam ettiler. 150 Gy dozda ışınlanan hücreler canlılıklarını korudular fakat çoğalmaları azaldı. > 200 Gy dozda ışınlanan hücrelerin metabolizmaları durdu ve öldüler (Şekil 9 ve 10). Dolayısıyla 150 Gy dozun optimum doz olduğuna karar verildi. Aşı denemelerinde de 150 Gy dozda ışınlanan aşının koruyucu özelliğinin konvansiyonel attenüe T.annulata aşısı ile aynı olduğu görüldü.
Şekil 9. Işınlanmış hücrelerin (0, 50, 100, 150, 200 Gy) inkübasyon öncesi
durumları
Şekil 10. Işınlanmış hücrelerde iki gün inkübasyon sonrasında hücre
kültürlerinde metabolik aktiviteyi gösteren renk değişimleri (Hücre kültürü şişeleri üstüste ikişerli örnekler şeklindedir)
3.2 Aşı materyalinde ışınlama öncesi ve sonrası lenfosit sayımı /canlılık testi
Işınlama öncesi ve sonrası lenfositlerin canlılığı sayılarak incelendi. 50 ve 100 Gy dozda ışınlanan T. annulata aşısında lenfosit sayılarında ışınlama öncesi ve sonrası canlılık oranlarının benzer olduğu, bu dozlarda ışınlamanın canlı hücre sayısı üzerinde fazla etkili olmadığı belirlendi. 150 Gy dozda ışınlanan örneklerde canlı hücre sayısında %30-40 oranında azalma olduğu hesaplandı. 200 Gy ve üstündeki ışınlamalarda canlı hücre sayısının önemli oranda azaldığı görüldü (Şekil 11).
3.3 Işınlanmış Theileria annulata1 da Tamsl geninin analizi (PCR)
Çeşitli dozlarda ışınlama sonrası Theileria annulata merozoit yüzey antijen geni (Tarns 1) PCR amplifikasyonu ile incelenerek genin nükleotidlerinde değişiklik olup olmadığı incelendi Tarns 1 geninin amplifikasyonu sonrasında alınan görüntüde, ışınlanan aşı ile konvansiyonel attenüe T.annulata aşısı arasında Tamsl geni açısından bir farklılık olmadığı görüldü. Şekil 12’de 776 baz çifti taşıyan Tamslgeninin ışınlanmış ve ışınlanmamış hücrelerdeki konumu gösterilmektedir.
800 bp
500 bp
Şekil 12. PCR sonrası Ethidium bromid ile boyanmış jelde Tamsl geni A Kontrol, B-G Işınlanmış hücreler (50, 100,150, 200, 250, 300 Gy), M marker. Gama ışınlamanın Tams 1 geni üzerinde bir etkisinin olmadığı
görülmektedir.
Tamsl geninin sekans sonuçları
Sekans sonuçları ışınlamadan sonra Tamsl geninde nükleotid dizilimi yönünde bir değişim olmadığını göstermiştir (Tablo 2). Bu
dizilim PubMed BLAST filogenetik ağaç üzerinde
konumlandırılmıştır (Şekil 13).
Tablo 2. Işınlanmış hücrelerde Tamsl geninin dizilimi (CLUSTAL W)
TA1 (50Gy), TA2 (100Gy), T A3 (150Gy), TA4 (200Gy), TA5 (250Gy), TA6 (300Gy)
r e f . TA AATGCTGCAAATGAGGATGAAAAGAAAAAGGAGGAAAAAAAAGATGTTGTTCTTGATGTT12 0 T A İ ATGAGGATGAAAAGAAAAAGGAGGAAAAAAAAGATGTTGTTCTTGATGTT 50 TA2 ATGAGGATGAAAAGAAAAAGGAGGAAAAAAAAGATGTTGTTCTTGATGTT 50 TA3 ATGAGGATGAAAAGAAAAAGGAGGAAAAAAAAGATGTTGTTCTTGATGTT 50 TA4 ATGAGGATGAAAAGAAAAAGGAGGAAAAAAAAGATGTTGTTCTTGATGTT 50 T A 6 ATGAGGATGAAAAGAAAAAGGAGGAAAAAAAAGATGTTGTTCTTGATGTT 50 TA5 ATGAGGATGAAAAGAAAAAGGAGGAAAAAAAAGATGTTGTTCTTGATGTT 50 r e f . TA ACTCTCACTTCATGTGAGAATGTAACCTTTAAAAACGTCGACTCTAACACCACTGAGTTAl T A İ ACTCTCACTTCATGTGAGAATGTAACCTTTAAAAACGTCGACTCTAACACCACTGAGTTAl TA2 ACTCTCACTTCATGTGAGAATGTAACCTTTAAAAACGTCGACTCTAACACCACTGAGTTAl TA3 ACTCTCACTTCATGTGAGAATGTAACCTTTAAAAACGTCGACTCTAACACCACTGAGTTAl TA4 ACTCTCACTTCATGTGAGAATGTAACCTTTAAAAACGTCGACTCTAACACCACTGAGTTAl TA 6 ACTCTCACTTCATGTGAGAATGTAACCTTTAAAAACGTCGACTCTAACACCACTGAGTTAl TA5 ACTCTCACTTCATGTGAGAATGTAACCTTTAAAAACGTCGACTCTAACACCACTGAGTTAl 80 10 10 10 10 10 10
r e f TA1 TA2 TA3 TA4 TA 6 TA5 r e f TA1 TA2 TA3 TA4 TA6 TA5 r e f TA1 TA2 TA3 TA4 TA6 TA5 r e f TA1 TA2 TA3 TA4 TA6 TA5 r e f TA1 TA2 TA3 TA4 TA6 TA5 r e f TA1 TA2 TA3 TA4 TA6 TA5 . TA ACTGTCGCGGATGGCTACCGTTTCAAGACCCTTAAGGTCGGAGACAAGACCTTGTTCAAT2 4 0 ACTGTCGCGGATGGCTACCGTTTCAAGACCCTTAAGGTCGGAGACAAGACCTTGTTCAAT17 0 ACTGTCGCGGATGGCTACCGTTTCAAGACCCTTAAGGTCGGAGACAAGACCTTGTTCAAT17 0 ACTGTCGCGGATGGCTACCGTTTCAAGACCCTTAAGGTCGGAGACAAGACCTTGTTCAAT17 0 ACTGTCGCGGATGGCTACCGTTTCAAGACCCTTAAGGTCGGAGACAAGACCTTGTTCAAT17 0 ACTGTCGCGGATGGCTACCGTTTCAAGACCCTTAAGGTCGGAGACAAGACCTTGTTCAAT17 0 ACTGTCGCGGATGGCTACCGTTTCAAGACCCTTAAGGTCGGAGACAAGACCTTGTTCAAT17 0 . TA GTTGACACCTCAAAACATACCCCAGTACAGGCATTCAAACTTAAGCATGAATCCGATGAG3 00 GTTGACACCTCAAAACATACCCCAGTACAGGCATTCAAACTTAAGCATGAATCCGATGAG2 3 0 GTTGACACCTCAAAACATACCCCAGTACAGGCATTCAAACTTAAGCATGAATCCGATGAG2 3 0 GTTGACACCTCAAAACATACCCCAGTACAGGCATTCAAACTTAAGCATGAATCCGATGAG2 3 0 GTTGACACCTCAAAACATACCCCAGTACAGGCATTCAAACTTAAGCATGAATCCGATGAG2 3 0 GTTGACACCTCAAAACATACCCCAGTACAGGCATTCAAACTTAAGCATGAATCCGATGAG2 3 0 GTTGACACCTCAAAACATACCCCAGTACAGGCATTCAAACTTAAGCATGAATCCGATGAG2 3 0 . TA TGGTTCAGACTTAATCTTCACCCTGCCCAGCCAAAGATGTTCAAGAAGAAGGGAGACAAG3 6 0 TGGTTCAGACTTAATCTTCACCCTGCCCAGCCAAAGATGTTCAAGAAGAAGGGAGACAAG2 9 0 TGGTTCAGACTTAATCTTCACCCTGCCCAGCCAAAGATGTTCAAGAAGAAGGGAGACAAG2 9 0 TGGTTCAGACTTAATCTTCACCCTGCCCAGCCAAAGATGTTCAAGAAGAAGGGAGACAAG2 9 0 TGGTTCAGACTTAATCTTCACCCTGCCCAGCCAAAGATGTTCAAGAAGAAGGGAGACAAG2 9 0 TGGTTCAGACTTAATCTTCACCCTGCCCAGCCAAAGATGTTCAAGAAGAAGGGAGACAAG2 9 0 TGGTTCAGACTTAATCTTCACCCTGCCCAGCCAAAGATGTTCAAGAAGAAGGGAGACAAG2 9 0 . TA GAATATTCTGAGGTCAAATTCGAGACCTACTACGATGATGTCTTGTTCAAGGGAAAATCC4 2 0 GAATATTCTGAGGTCAAATTCGAGACCTACTACGATGATGTCTTGTTCAAGGGAAAATCC350 GAATATTCTGAGGTCAAATTCGAGACCTACTACGATGATGTCTTGTTCAAGGGAAAATCC350 GAATATTCTGAGGTCAAATTCGAGACCTACTACGATGATGTCTTGTTCAAGGGAAAATCC350 GAATATTCTGAGGTCAAATTCGAGACCTACTACGATGATGTCTTGTTCAAGGGAAAATCC350 GAATATTCTGAGGTCAAATTCGAGACCTACTACGATGATGTCTTGTTCAAGGGAAAATCC350 GAATATTCTGAGGTCAAATTCGAGACCTACTACGATGATGTCTTGTTCAAGGGAAAATCC350 . TA GCCAAGGAACTAGATGCTTCCAAGTTCGAAGATACATCTTTGTTCACCTCCTCCGCCTTC4 8 0 GCCAAGGAACTAGATGCTTCCAAGTTCGAAGATACATCTTTGTTCACCTCCTCCGCCTTC410 GCCAAGGAACTAGATGCTTCCAAGTTCGAAGATACATCTTTGTTCACCTCCTCCGCCTTC410 GCCAAGGAACTAGATGCTTCCAAGTTCGAAGATACATCTTTGTTCACCTCCTCCGCCTTC410 GCCAAGGAACTAGATGCTTCCAAGTTCGAAGATACATCTTTGTTCACCTCCTCCGCCTTC410 GCCAAGGAACTAGATGCTTCCAAGTTCGAAGATACATCTTTGTTCACCTCCTCCGCCTTC410 GCCAAGGAACTAGATGCTTCCAAGTTCGAAGATACATCTTTGTTCACCTCCTCCGCCTTC410 . TA GGCACTGGAAAGATGTACACCTTTAAAAAGGAATTTAAACCTTCCAAAGTCACCTTCGAC5 4 0 GGCACTGGAAAGATGTACACCTTTAAAAAGGAATTTAAACCTTCCAAAGTCACCTTCGAC4 7 0 GGCACTGGAAAGATGTACACCTTTAAAAAGGAATTTAAACCTTCCAAAGTCACCTTCGAC4 7 0 GGCACTGGAAAGATGTACACCTTTAAAAAGGAATTTAAACCTTCCAAAGTCACCTTCGAC4 7 0 GGCACTGGAAAGATGTACACCTTTAAAAAGGAATTTAAACCTTCCAAAGTCACCTTCGAC4 7 0 GGCACTGGAAAGATGTACACCTTTAAAAAGGAATTTAAACCTTCCAAAGTCACCTTCGAC4 7 0 GGCACTGGAAAGATGTACACCTTTAAAAAGGAATTTAAACCTTCCAAAGTCACCTTCGAC4 7 0
r e f TA1 TA2 TA3 TA4 TA 6 TA5 r e f TA1 TA2 TA3 TA4 TA6 TA5 r e f TA1 TA2 TA3 TA4 TA6 TA5 r e f TA1 TA2 TA3 TA4 TA6 TA5 r e f TA1 TA2 TA3 TA4 TA6 TA5 r e f TA1 TA2 TA3 TA4 TA6 TA5 . TA AAGAAAGAAGTCGGAAAACCAAACAATGCCAAGTATCTTGAAGTTGTTGTTTTTGTTGGT60 0 AAGAAAGAAGTCGGAAAACCAAACAATGCCAAGTATCTTGAAGTTGTTGTTTTTGTTGGT53 0 AAGAAAGAAGTCGGAAAACCAAACAATGCCAAGTATCTTGAAGTTGTTGTTTTTGTTGGT53 0 AAGAAAGAAGTCGGAAAACCAAACAATGCCAAGTATCTTGAAGTTGTTGTTTTTGTTGGT53 0 AAGAAAGAAGTCGGAAAACCAAACAATGCCAAGTATCTTGAAGTTGTTGTTTTTGTTGGT53 0 AAGAAAGAAGTCGGAAAACCAAACAATGCCAAGTATCTTGAAGTTGTTGTTTTTGTTGGT53 0 AAGAAAGAAGTCGGAAAACCAAACAATGCCAAGTATCTTGAAGTTGTTGTTTTTGTTGGT53 0 . TA TCTGATTCCAAGAAGTTCGTCAAACTCTACTACTTCTATACCGGTGACTCAAGGTTGAAG6 60 TCTGATTCCAAGAAGTTCGTCAAACTCTACTACTTCTATACCGGTGACTCAAGGTTGAAG5 9 0 TCTGATTCCAAGAAGTTCGTCAAACTCTACTACTTCTATACCGGTGACTCAAGGTTGAAG5 9 0 TCTGATTCCAAGAAGTTCGTCAAACTCTACTACTTCTATACCGGTGACTCAAGGTTGAAG5 9 0 TCTGATTCCAAGAAGTTCGTCAAACTCTACTACTTCTATACCGGTGACTCAAGGTTGAAG5 9 0 TCTGATTCCAAGAAGTTCGTCAAACTCTACTACTTCTATACCGGTGACTCAAGGTTGAAG5 9 0 TCTGATTCCAAGAAGTTCGTCAAACTCTACTACTTCTATACCGGTGACTCAAGGTTGAAG5 9 0 . TA GAGACCTACTTCGAGCTTAAGGACGATAAGTGGGTTCAAATGACACAGGCAGATGCAAAC7 2 0 GAGACCTACTTCGAGCTTAAGGACGATAAGTGGGTTCAAATGACACAGGCAGATGCAAAC 6 5 0 GAGACCTACTTCGAGCTTAAGGACGATAAGTGGGTTCAAATGACACAGGCAGATGCAAAC 6 5 0 GAGACCTACTTCGAGCTTAAGGACGATAAGTGGGTTCAAATGACACAGGCAGATGCAAAC 6 5 0 GAGACCTACTTCGAGCTTAAGGACGATAAGTGGGTTCAAATGACACAGGCAGATGCAAAC 6 5 0 GAGACCTACTTCGAGCTTAAGGACGATAAGTGGGTTCAAATGACACAGGCAGATGCAAAC 6 5 0 GAGACCTACTTCGAGCTTAAGGACGATAAGTGGGTTCAAATGACACAGGCAGATGCAAAC 6 5 0 . TA AAGGCCTTGAATGCCATGAACTCATCCTGGTCAACCGATTACAAACCAGTTGTCGACAAG7 8 0 AAGGCCTTGAATGCCATGAACTCATCCTGGTCAACCGATTACAAACCAGTTGTCGACAAG710 AAGGCCTTGAATGCCATGAACTCATCCTGGTCAACCGATTACAAACCAGTTGTCGACAAG710 AAGGCCTTGAATGCCATGAACTCATCCTGGTCAACCGATTACAAACCAGTTGTCGACAAG710 AAGGCCTTGAATGCCATGAACTCATCCTGGTCAACCGATTACAAACCAGTTGTCGACAAG710 AAGGCCTTGAATGCCATGAACTCATCCTGGTCAACCGATTACAAACCAGTTGTCGACAAG710 AAGGCCTTGAATGCCATGAACTCATCCTGGTCAACCGATTACAAACCAGTTGTCGACAAG710
. TA TT CTCC CCCCTTG CA G TCTTC G CCTCA G TA CTCA TCG TCTTCTCA TCA G TCCTTTA CTTC8 4 0 TT CTCC CCCCTTG CA G TCTTC G CCTCA G TA CTCA TCG TCTTCTCA TCA G TCCTTTA CTTC7 7 0 TT CTCC CCCCTTG CA G TCTTC G CCTCA G TA CTCA TCG TCTTCTCA TCA G TCCTTTA CTTC7 7 0 TT CTCC CCCCTTG CA G TCTTC G CCTCA G TA CTCA TCG TCTTCTCA TCA G TCCTTTA CTTC7 7 0 TT CTCC CCCCTTG CA G TCTTC G CCTCA G TA CTCA TCG TCTTCTCA TCA G TCCTTTA CTTC7 7 0 TT CTCC CCCCTTG CA G TCTTC G CCTCA G TA CTCA TCG TCTTCTCA TCA G TCCTTTA CTTC7 7 0 TT CTCC CCCCTTG CA G TCTTC G CCTCA G TA CTCA TCG TCTTCTCA TCA G TCCTTTA CTTC7 7 0 * * * * * * * * * * * * TA CTTTAA 8 4 6 CTTTAA 7 7 6 CTTTAA 7 7 6 CTTTAA 7 7 6 CTTTAA 7 7 6 CTTTAA 7 7 6 CTTTAA 7 7 6
[I Q gulayvural • Vahoo!7 Mail * 1KEmlakkuhsi.com - Türkiye'nin^^ % NCBI BlastıTheılerıa annulata J rj Blast Tree View Widget t_________________S ij
C 0 b last,n cb i.n lm .n ih .g o v /b lc S t/tie e ve w /tT e e V ie w ,eg ☆ a ^
&A sayfanın dili | İngilizce ▼ Çevrilm esini ısöyor m u sun uz? | Çevir | Hayır | S e ç e n e k le r*
This tree was produced using BLA5T pairwise alignments, more... ....A
Fast Minimum Evolution v W 10 75
r e c t a n g le s la n t e d r a d ia l f o r c e
or alignment
Tree view for RID: XBJ8FB4101II, query ID: Icl 148029, database: nr
li!a> $e<| Difference
Download l in Newick Formal v y?
0 Sliou distance Mouse over an internal node for a subtree , _ îiico ıro leK an s 16 leases
ifcl-oUH 31C?5 itikcîoi!»-DifODİaînı sjrtar» antigen lami ı gona, complete cds a rNcılcH»ânruılat%.İ30İat« 2 3-* mcrorcife piroplasm sürfece antgun lams 1gene, complete cds <W rheilenaannulafeisolate 2i i meioroifepiioolasm surfece antigen lamsi gene, complete cds
5 rheileriaannulafeisolafe23l meroroife piroplasm surfece antigen lams I gene, complete cds j iKeilena annulafe isolate Mcl 3 meiozoile- piroplasm surface antigen Tams I gene, complete cds g 8- J Iheileria annulafe isolate gal meroeoiVonoolasm surface antigen lams 1 gene, complete cd
A Iheileria annulafe isolate 9a) merojoile piroplasm surfece antigen lams I gene, complete cds Iheilena annulafeisolate HbSmenwoiVpiroplasm surfen antigen lamst gene, complete cds ’ si' 3 Ttieilena annulafeisolale dS2e meroîoıfe piroplasm surfece antigen Tams I gene, complete cds J Iheilena annulafeisolale Hell meroroile-piroplasm surface antigen rams I gene, complete cds ---3 Iheilena annulafe isolate 9ba merocoile- piroplasm surfece an tigen lams I gene, comole ItP»-3 Iheileria annulafe isolate 2 i? merotoitie piroplasm surfece antigen ramsl ger 'i-lheileiiaannulafeisolate 2IS meroroite-piroplasm surfece antigen lamst gene, c ^iheilena annulafeisolate 2ismeroeoifepiraplasui surfece antigen tarnst gene, c j T'lheileria annulafeisolate 218 meroecifepiroplasm surfece antigen lamst gene.c i ■ilheıleıiaannulafeısolatelPSmeroroifepıroplasmsıırfeceantgenlamsi gene,c . ■t rheilena annulafe isolate tPis meroroi to-piroplasm surface antigen Tamsl ge theilena annulafeisolale tP!2 mero20ile-piroplasm surface antigen Tams I gene kr -Tle±iia annulafe isolate IPi meracoıfe-proplasın surface antigen ramsl gen v Iheileria annulafe isolate IP? merojoite-piioolasm surfece antigen lamst gene, c. ■Vıheıleıia annulafe isolate HC20mer>Hoitr piroplasm surface antigen lamst gene ■ 0 Iheilena annulafe isolate ti 10 meioroife-piroplasm surface antigen lams' geh. ' Iheileria annulafe isolate lit meroeoile- piroplasm surfece antigen
■9 rheilena annulafeisolale tBt meroeoile- piroplasm surface antigen ramsl gene, comple
greet Vilgm mst'xnuccapaele.
—i> rheilena annulafe isolate IPs meroroile- piroplasm surfece an h gen tamsl gene, complete cds ■ ■ TiriEna annulafe isolate fASmeroroite- piroplasm surfece antigen ramsl gene, comp menenaannuiaiaisolalelA5mero20ite-piropfesm surface antigen Tams' gene, compete cds
— i I heıIeiiaannulafe isolate İAU meroroife piroplasm surfece antigen lams' gene, coiriolet* cds
Iheileria ai
S ha ria annulafeisolale t M2 3 meroroile- piroplasm surfece antigen rams I gene, complete cds apicompleeans 15 leanes
aWheileiia annulafe isolate nag Sd meroroile-piroplasm surfece antigen ramsl gene, complete cds theileiiaannulafe isolate na3 3 mensroite- piroplasm surfece antigen lams' gene, complete cds Iheileria annulafe mst gene, mstconprl l gene | partial i, ms icon^srt2 gene and ms' contort} gene (oartii 1 annulafe lams'-' mPNA tor meroroile surfeceglpcopnolein
1 heileiia annulafe isolate na9 Sc meroroi le- piropfesm surtac e an tigen rams I gene, comple te c d s ijtoicompleiiansuleaues
'A t theileiia annulafe isolate na961 meroroife piroplasm surfece antigen lams' gene, complete cds "* theileiia annulafe meroeoite surface glycoprotein lams i (lamst-1 allele) mRNA, complete cds
theileiia annulafe strsun Aolnia lams i irradiated
J theileiia annulafeisolale 1A? mero2oite-piroplasm surfece antigen lams i gene, complete cds
Sequence Label Sequence Idle (it available)
Cnllapce Mode Custom v | V
Bldft namei colei map
V
apicomplexans nkno
Şekil 13. Işınlanmış T.annulata hücrelerinin PubMed BLAST filogenetik ağaç
3.4 Teşhis
3.4.1 Perifer kan frotisi örneklerinde Giemsa boyama
Şekil 14. Enfeksiyonun akut evresinde alyuvarlar içindeki parazitik formlar
Giemsa boyama (x100)
Tablo 3. Giemsa boyama sonuçları
Hafta/Gün Grup A Kontrol Grup B Attenue aşı Grup C 150 Gy ışın, aşı Grup D 200 Gy ışın, aşı Kod No. 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 O.gün Aşılama Aşılama yok Giemsa (-) l.h a fta /7 . gün 2.hafta/14.gün 3.hafta/ 21.gün 4.hafta/28.gün 5.hafta/35.gün 6.hafta/42.gün
7. hafta/49.gün Challenge/Sınama (kene stab Tüm gruplarda Giemsa (-ilatı) 8.hafta/56.gün 9.hafta/63.gün 10.hafta/70.gün + - - + + + - + + + ll.h a fta /7 7 .g ü n + + + + + + + + + + 12.hafta/84.gün + + + + + + + + + + 13.hafta/91.gün + Ö + Ö + K + K + Ö + Ö + K + K + K + Ö 14.hafta/98.gün 15.hafta/105.gün Ö. Ölüm K. Kesim
3.4.2 Aşılama sonrası deneme hayvanlarının ortalama vücut ısıları:
Aşılama sonrası 7. günden sonra B ve C grubunda ateş hafif yükselmiştir. Kontrol ve D grubunda bulunan hayvanlarda ateş dönem dönem 41°C’nin üzerine çıkmıştır.
• Kontrol grubu (A): max 41.8°C
• Konvansiyonel aşı grubu (B): max 38.8°C • 150 Gy ile aşılanan grup (C): max 38.9°C • 200 Gy ile aşılanan grup (D): max 40.7°C
3.4.3 Lenf nodüllerinin biyopsisi
Aşılama sonrası 11-13. günlerde kontrol ve D grubundaki hayvanların lenf bezlerinin şiştiği anlaşıldı (70 mm), biyopsilerinde
parazitin şizogonik formları görüldü. B ve C gruplarının
biyopsilerinde şizontlara rastlanmadı.
3.4.4 ELISA
ELISA testi antijeni olarak üç farklı antijen ile çalışılmış ve en iyi sonuçlara çözülmüş (soluble) şizont antijeni kullanıldığında ulaşılmıştır. Diğer iki antijenin hassasiyeti yeterli olmamıştır (Şekil 15).
Şekil 15. Soluble şizont antijen kullanılarak elde edilen ELISA sonuçları
(Grup A ve D / 63, 70, 77, 84 ve 91. günler) Kolon 11-12 kontroller: A-B (negatif), C-D (pozitif), E-F (konjugat + % 0.2 at serumu), G-H (Ag+konjugat)
T a b lo 4 . E LI S A s o n u ç la rı (S o lu bl e ş iz o n t ant ijen k u lla n ıl a ra k ) Ha fta /G ün G ru p A G ru p B G ru p C G ru p D u y 03 u y E c oş c u y >% O o o <N u y 03 u y E c oş c ç* O o Lf) (D O *£ö ^ g i > s £Z O ^3 C O m I I I I I I I I I + ++ + + + + + + O + 1 I 1 1 1 1 1 I 1 + + + + + + + + + + + 00 1 1 1 1 1 1 1 1 1 + ++ + + + + + + + CM 1 1 1 1 1 1 1 1 1 I ++ + + + + + + + 1 1 1 1 1 1 1 1 1 + ++ ++ ++ O + + + m 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 I I 1 I I 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 00 1 1 1 1 1 1 1 C h a lle n g e (k en e s ta b ila tı ) Tü m g ru p la r 1 1 1 1 1 1 1 1 CM 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 - 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 m 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Tt 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 00 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 CM 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 - 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 m 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ++ + + + + + + o + y o k 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ++ + + + + + + + 00 03E _cç 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ++ + + + + + + + CM u y < 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ++ + + + + + + o + 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ++ + + + + o + + + O .g ü n A ş ıla m a 1 .haf ta/7. gü n 2 .h a fta /1 4 .g ü n 3 .h a ft a / 2 1 .g ü n 4 .h a fta /2 8 .g ü n 5 .h a fta /3 5 .g ü n 6 .h a fta /4 2 .g ü n 7 . h a fta /4 9 .g ü n |8 .h a ft a /5 6 .g ü n 9 .h a fta /6 3 .g ü n 1 0.h a ft a /7 0 .g ü n 11 , h a ft a/ 7 7. g ü n 1 2.h a ft a /8 4 .g ü n 13 .ha fta/91 . g ü n 1 4.h a ft a /9 8 .g ü n 1 5 .h a ft a /1 0 5 .g ü n K o d N o . (ö) ö lü m (k ) k es im (+) h a fi f e n fe k s iy o n (++) orta şi d d e tt e e nf e k s iy on (+ + + )ş id d e tli e n fe ks iy o n
3.4.5 I FAT
Denemeye alınan danalar birinci aşılama sonrasında ELISA ve IFAT testleri yapılarak serolojik yönden incelendiler. 10. haftadan sonra kontrol ve D grubundaki hayvanların hepsi pozitif bulundu.
3.5 Kenelerin tükrük bezinde Theileria nın PCR ile belirlenmesi
PCR sonuçları ikinci aşılama sonrası C grubundaki hayvanların kulaklarından alınan kenelerin T. annulata ile enfekte olmadığını göstermiştir (20 kene/dana). Şekil 16’da bu kenelerden elde edilen DNA örnekleri ile yapılan PCR sonuçları görülmektedir. Kenelerde
T. annulata enfeksiyonunu temsil eden Tams 1 (776 bp) geni
saptanmamıştır.
l c 1 2 İ 4
776 bp 500 bp
Şekil 16. Kenelerin tükrük bezinde Theileria annulata’y\ betimleyen
Tamsl geninin (776bp) durumu L: DNA marker; C: Kontrol; 1-4: Örnekler
4. TARTIŞMA
Theileria annulata’nın neden olduğu tropical theileriosis Türkiye’de
sığırlarda yaygın olarak görülen ve ekonomik kayıplara neden olan bir hastalıktır. Zatıflatılmış (attenüe) hücre kültürü ile aşılama hastalıkla mücadelede en yaygın olarak kullanılan yöntemlerden biridir. Üretimindeki zorluklar nedeniyle aşının geliştirilmesi için çalışmalar yapılmaktadır. Ayrıca hastalığın teşhisinde, taşıyıcı hayvanların belirlenmesinde çeşitli teşhis yöntemleri geliştirilmekte,
duyarlı tanı yöntemlerinin sahaya uygulanması çalışmaları
yürütülmektedir. Bu amaçla parazitik formların antijenleri
İncelenmekte, parazite karşı gelişen immun yanıtın anlaşılması ve kullanılan zayıflatılmış aşının geliştirilmesi için yoğun çalışmalar yapılmaktadır.
Bu raporda anlatılan çalışma halen T.C. Tarım ve Köy İşleri Bakanlığı, Pendik Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü tarafından üretilen T. annulata aşı kültürlerinin gama ışınlama ile zayıflatılması amacıyla yürütülmüştür. Bu amaçla attenüasyon için gerekli optimal doz çalışmaları yapılmış, gama ışınlamanın aşının kararlılığı ve virulans kazanma yeteneği üzerindeki etkileri araştırılmıştır. Ayrıca teşhis açısından ELISA testinin kurulması ve duyarlı hale getirilmesi yönünde çalışmalar yapılmıştır.
Theileriosis’in teşhisi klinik bulgulara (ateş, lenf nodüllerinin şişmesi vb.) ve laboratuvar testlerine (Giemsa boyama, IFAT, ELISA ve PCR) dayanmaktadır. Laboratuvar testlerinin içinde en pratik olanı Giemsa boyama tekniğidir. Bu teknik akut enfeksiyonlarda kan ve lenf yumrusu frotilerinde etkenin tespiti amacıyla kullanılsa da
subklinik olgularda teşhis zor olabilmektedir (44). Latent
enfeksiyonların teşhisinde kullanılan IFAT ve ELISA serolojik yöntemlerdir. Serolojik testler çapraz reaksiyonlar verebilmekte, yanlış negatif ve pozitif sonuçlara neden olabilmektedir (7,44). Laboratuvarımızda geliştirdiğimiz ELISA yönteminde üretilen antijenler istenilen sonuçları tam verememiştir. Pozitif ve negatif
