Theileria annulata’nın neden olduğu tropical theileriosis Türkiye’de
sığırlarda yaygın olarak görülen ve ekonomik kayıplara neden olan bir hastalıktır. Zatıflatılmış (attenüe) hücre kültürü ile aşılama hastalıkla mücadelede en yaygın olarak kullanılan yöntemlerden biridir. Üretimindeki zorluklar nedeniyle aşının geliştirilmesi için çalışmalar yapılmaktadır. Ayrıca hastalığın teşhisinde, taşıyıcı hayvanların belirlenmesinde çeşitli teşhis yöntemleri geliştirilmekte,
duyarlı tanı yöntemlerinin sahaya uygulanması çalışmaları
yürütülmektedir. Bu amaçla parazitik formların antijenleri
İncelenmekte, parazite karşı gelişen immun yanıtın anlaşılması ve kullanılan zayıflatılmış aşının geliştirilmesi için yoğun çalışmalar yapılmaktadır.
Bu raporda anlatılan çalışma halen T.C. Tarım ve Köy İşleri Bakanlığı, Pendik Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü tarafından üretilen T. annulata aşı kültürlerinin gama ışınlama ile zayıflatılması amacıyla yürütülmüştür. Bu amaçla attenüasyon için gerekli optimal doz çalışmaları yapılmış, gama ışınlamanın aşının kararlılığı ve virulans kazanma yeteneği üzerindeki etkileri araştırılmıştır. Ayrıca teşhis açısından ELISA testinin kurulması ve duyarlı hale getirilmesi yönünde çalışmalar yapılmıştır.
Theileriosis’in teşhisi klinik bulgulara (ateş, lenf nodüllerinin şişmesi vb.) ve laboratuvar testlerine (Giemsa boyama, IFAT, ELISA ve PCR) dayanmaktadır. Laboratuvar testlerinin içinde en pratik olanı Giemsa boyama tekniğidir. Bu teknik akut enfeksiyonlarda kan ve lenf yumrusu frotilerinde etkenin tespiti amacıyla kullanılsa da
subklinik olgularda teşhis zor olabilmektedir (44). Latent
enfeksiyonların teşhisinde kullanılan IFAT ve ELISA serolojik yöntemlerdir. Serolojik testler çapraz reaksiyonlar verebilmekte, yanlış negatif ve pozitif sonuçlara neden olabilmektedir (7,44). Laboratuvarımızda geliştirdiğimiz ELISA yönteminde üretilen antijenler istenilen sonuçları tam verememiştir. Pozitif ve negatif
örneklerde en iyi sonuçlar çözülmüş (soluble) şizont antijen ile elde edilmiştir. Bu antijen ile negatif ve kuvvetli pozitif olgularda teşhis kesin olmakla birlikte birlikte hafif pozitif olgularda hassasiyetin düşük olduğu anlaşılmıştır. Manuja ve ark. (45) hayvanların sadece şizont membran antijenlerine cevap verdiklerini bu nedenle ELISA testinde hücresel antijenin daha iyi çalıştığını bildirmişlerdir. OIE el kitabında ELISA testinin her zaman doğru sonuç vermediği ve başka testlerle desteklenmesi gerektiği belirtilmektedir (43). Renneker ve ark (46) tarafından geliştirilen ELISA testinde monoclonal antikor kullanılmasına rağmen hassasiyet % 77 olmuştur. Elde ettiğimiz sonuçlar tüm bu bulgularla benzerlik arzetmektedir. Çok hafif pozitif olgularda yanlış negatif sonuçlar
alınabilmektedir. Bu durumda ELISA testine fazla
güvenilemeyeceği, bir başka test ile teşhisin desteklenmesi gerektiği savı doğru olmaktadır. Çalışmamızda ikinci serolojik test olarak IFAT kullanılmıştır.
T. annulata ve T. parva enfeksiyonlarına karşı aşı çalışmaları bu
parazitlerin tanımından itibaren başlamıştır. Bugün kullanılan zayıflatılmış şizont hücre kültürü aşısı yıllardır İsrail, İran, Türkiye,
Hindistan Kuzey Afrika, Orta Asya ve Çin’de güvenle
kullanılmaktadır (32). Tüm bu ülkelerde aynı şekilde üretilen aşının bazı problemleri bulunmaktadır: (i) Etkenin zayıflatılması amacıyla yapılan ve uzun zaman alan, zahmetli hücre kültürü pasajları ve aşı dozunun standardizasyonundaki güçlükler; (ii) Virulansın geri dönme riski; (iii) koruma ve taşımadaki zorluklar. Parazitlerin gama veya X-ışını kullanarak zayıflatılması öncelikle T. parva için denenmiştir. T. parva ile enfekte lenfoid hücreler en yüksek 1200 rad (12 Gy) dozda ışınlanmış, bu dozun parazitlerin çoğalmasına etkili olmadığı belirlenmiştir (47). Srivastava ve Sharma (36,37) 10 kR (kiloroentgen) dozda ışınladıkları T. annulata sporozoit formlarını tekrar hayvanlara vererek ışınlanan sporozoitlerin daha hafif bir enfeksiyon yarattığını ve inkübasyon süresinin uzadığını fakat parazitin morfolojisinde değişiklik olmadığını görmüşlerdir. En başarılı deneme Babesia bovis ile gerçekleşmiş, 350 Gy dozda zayıflatılan B. bovis aşısının yüksek immunite sağladığı, biryıl sonra bile virulans kazanmadığı ve kenelerce nakledilmediği belirtilmiştir (40).
Doku kültürü sistemlerinde gama ışınlamanın etkisi karmaşıktır. Kültür sisteminin yanı sıra ışınlama dozu gibi birçok fiziksel faktör bu etkide rol oynar. Işınlama hücrelerin senkronizasyonunu
bozmakta, hücre içindeki parazitlerin hücre gelişimine ve
davranışına etki etmektedir. Bu etkileri gidermek için besi yerleri belli aralıklarla kontrol edilip değiştirilmekte, böylece hücre yan ürünleri ortamdan atılarak büyüme ortamı yenilenmektedir. Buna rağmen radyasyon dozuyla doğru orantılı olarak hücrelerin ve hücre içi parazitlerin normal gelişimlerini sürdüremediği görülmektedir
(47). Bu durum kontrol olarak kullanılan besiyerleri ile
karşılaştırıldığında çok belirgin olarak ortaya çıkmaktadır.
Çalışmamızda, hücre kültürlerinin 50-300 Gy doz aralığında çeşitli
dozlarda ışınlanmasından sonra anlatılan bu aşamaları
gözlemlemek mümkün olmuştur. Işınlanan tüm hücre kültürlerinde birinci günün sonunda mitotik indeksin düştüğü belirlenmiş fakat mitosis devam ettiği için ışınlanmış kültürlerle kontrol kültür arasında fazla bir fark oluşmamıştır. 3. günden sonra 150-300 Gy dozda ışınlanan kültürlerde canlı hücre sayısının azaldığı, çoğu hücrenin Trypan blue boyasını aldığı yani öldüğü görülmüştür. 150 Gy dozda ışınlanan kültür 4. günden itibaren mitotik indeks artışı göstermiş fakat canlı hücrelerin sayısı başlangıç sayısına göre azalma göstermiştir. 150 Gy dozun üstündeki ışınlamalarda besi yerinin tazelenmesine rağmen hücrelerin öldüğü, DNA sentezinin normal düzeyine ulaşamadığı görülmüştür. Bu bulguların tümü Irvin ve ark (47) tarafından yapılan çalışma ile benzerlik göstermektedir. Araştırıcılar gama radyasyon dozu arttıkça hücre ölümlerinin doğru orantılı olarak arttığını belirlemişler, ölen hücrelerin 1-3 kez mitoz geçirdikten sonra interfaza geçemediklerini ortaya koymuşlardır.
Çalışmamız sonucunda 50 ve 100 Gy dozların etkeni
zayıflatmadığı, 200-300 Gy dozların hücre metabolizması üzerinde
etkili olduğu, hücrelerin morfolojisinin bozulduğu, duvarlarının
yırtılması ile hücrelerin tamamen öldüğü görülmüştür. 150 Gy dozda ise hücrelerin sayıca azaldığı fakat kalan hücrelerin canlı olduğu
saptanmıştır. Bu bulgulardan yola çıkılarak hücre kültüründe
etkenleri zayıflatan optimum dozun 150 Gy olduğuna karar verilmiştir. Aşı denemelerinde 150 Gy dozda ışınlanan hücre kültürü ile kontrol amaçlı olarak 200 Gy dozda ışınlanan hücre kültürleri kullanılmıştır.
Aşı denemelerinde 150 Gy dozda ışınlanan aşının koruyucu
özellikte olduğu, aşılanan hayvanların kene stabilatından
etkilenmediği gözlenmiştir. Çalışmalar sırasında 150 Gy dozda ışınlanan aşının konvansiyonel attenüe T.annulata aşısı ile aynı klinik sonuçları verdiği kaydedilmiştir. Deneme hayvanlarından belirli aralarla düzenli olarak alınan kan örneklerinde Giemsa sonuçları konvansiyonel aşı ile aynı olmuştur. 200 Gy dozda ışınlanan aşının koruyuculuk açısından etkili olmadığı, parazitleri öldüren bu dozun immunoprofilaktik özellik taşımadığı, hastalığın seyrinde kontrol grubu ile aynı bulguları verdiği görülmüştür. Elde
edilen bu sonuçlar yapılan bazı araştırmalarla parallelik
arzetmektedir. Samantaray ve ark. (48) 50 ve 100 Gy dozda
ışınladıkları sporozoitleri aşı olarak kullanmışlar, 50 Gy dozda
ışınlamanın parazitleri etkilemediğini, 100 ve 150 Gy dozlarda
parazitlerin dozla doğru orantılı olarak azaldığını, aşı
denemelerinde sınama enfeksiyonu sonrası kontrol grubu
hayvanların öldüğünü fakat aşılı hayvanların enfeksiyonu hafif geçirdiklerini belirtmişlerdir. Bu araştırıcılar aynı zamanda ışınlama dozu arttıkça parazitin enfektif formlarının zarar gördüğünü, yüksek dozların attenüasyondan ziyade ölüme yol açtığını belirtmişlerdir. Srivastava ve Sharma (36) 60Co kaynağı ile 0.5 ve 10 kR (kiloroentgen) dozlarda ışınladıkları T. annulata ile enfekte lenfositleri hayvanlara verdiklerinde hastalığın hafif seyrettiğini, hayvanların sınama amaçlı uygulanan kene stabilatına direnç gösterdiğini gözlemlemişlerdir. Singh ve ark. (49) kenelerin T.
annulata ile enfekte partiküllerini toplayıp 0-9 krad aralığında
ışınlamışlar ve aşı olarak kullanmışlardır. 9 krad (90 Gy) dozda
ışınlanan partiküllerle aşılanan grupta hayvanlar sınama
enfeksiyonuna karşı klinik bulgu göstermemişler, IFAT antikor testine negatif cevap vermişlerdir.
Theileria annulata’ya karşı recombinant subunit aşı ve tanı amaçlı
test geliştirme çalışmalarında kullanılan proteinlerden (30 kDa) biri olan Tamsl parazitin en belirgin merozoit yüzey antijenidir. Tamsl antijeni ile yapılan araştırmalar daha ziyade teşhis amaçlı olmuştur. Tam sl, T. annulata’mn en bilinen immunodominant merozoit yüzey antijenidir (19). Bir polipeptid olan bu antijen Theileria türlerinin hemen hepsinde mevcuttur. Tamsl genini belirleyen primerlertüm
T. annulata sekanslarında bulunmaktadır (20). T. annulata Tamsl
saha çalışmaları ile portör hayvanlar tespit edilmiş, tür ayrımı ve polimorfik dizilim çalışmaları yapılmıştır (7,21,22). Çalışmamızda ışınlamanın Tamsl antijeni üzerindeki etkisi PCR testi yapılarak araştırılmıştır. Elde edilen sonuçlar konvansiyonel hücre kültürü aşısı ile ışınlanmış hücre kültürü materyali arasında Tamsl geni açısından bir farklılık olmadığını göstermiştir. Sekans sonuçları nükleotid dizinlerinde bir fark görülmediğini ortaya koymuştur. Elde edilen sekans dizilimleri PubMed BLAST filogenetik ağaç üzerinde konumlandırılmıştır. İkinci aşılama sonrası deneme danalarının kulaklarına yerleştirilen kenelerin tükrük bezlerinde etkenin tespiti yine Tamsl geni yardımıyla gerçekleştirilmiştir. İkinci kez 150 Gy aşı ile immunize edilen hayvanlara kene uygulaması yapılmış, kenelerin tükrük bezinden elde edilen DNA örneklerinde T.