T.C.
ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ TIBBİ MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI
HIV-POZİTİF OLGULARDA CRYPTOCOCCUS ANTİJENİNİN LATERAL FLOW TESTİ İLE
ARAŞTIRILMASI
Dr. Evrim KARAMAN
UZMANLIK TEZİ
TEZ DANIŞMANI Prof. Dr. Macit İLKİT
ADANA-2019
T.C.
ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ TIBBİ MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI
HIV-POZİTİF OLGULARDA CRYPTOCOCCUS ANTİJENİNİN LATERAL FLOW TESTİ İLE
ARAŞTIRILMASI
Dr. Evrim KARAMAN
UZMANLIK TEZİ
TEZ DANIŞMANI Prof. Dr. Macit İLKİT
Bu tez Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri tarafından TTU-2018-10976 No’lu proje ile desteklenmiştir.
ADANA-2019
ETIK KURUL
TEŞEKKÜR
Öncelikle uzmanlık eğitimim de dahil bugünlere gelene kadar eğitimimin her aşamasında bana bu hakkı verdiği için minnettar olduğum Gazi Mustafa Kemal Atatürk’e,
Okuduğum ve çalıştığım her yerde benden maddi ve manevi desteğini hiçbir zaman esirgemeyen anneme ve babama,
Tezimin her aşamasında bana yardımcı olan tez danışmanım Prof.Dr.M.Macit İLKİT’e, asistanlığım süresince bilgi ve deneyimleriyle bana yol gösteren Anabilim Dalı başkanımız Prof.Dr.Fatih KÖKSAL’a ve uzmanlık eğitimim boyunca eğitimime katkı sağlayan Anabilim Dalımızın tüm hocalarına,
Tez çalışmam süresince bana sabrı ve bilgisiyle destek veren Prof.Dr.Süleyha HİLMİOĞLU POLAT’a
Asistanlığım süresince pek çok şey paylaştığımız, beraber çalışmaktan keyif aldığım Dr.Feride AKIŞ, Dokt. Hazal KANDEMİR başta olmak üzere bölümümüzdeki tüm çalışma arkadaşlarıma
TTU-2018-10976 No’lu proje olarak bu çalışmanın düzenlenmesine katkı sağlayan Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi’ne
Hayatımın her anında yanımda olan ablama, son bir yıldır hayatımıza giren ailemin en yeni üyesi canım yeğenime ve kardeşime teşekkür ederim.
Dr.Evrim KARAMAN
İÇİNDEKİLER
Sayfa No:
TEŞEKKÜR ... iii
İÇİNDEKİLER ... iv
TABLO LİSTESİ ... vi
ŞEKİL LİSTESİ ... vii
KISALTMA ve SİMGELER ... viii
ÖZET ... x
ABSTRACT ... xi
1. GİRİŞ ... 1
2. GENEL BİLGİLER ... 4
2.1. Cryptococcus biyolojisi ... 4
2.1.1. Taksonomi ... 4
2.1.2. Hayat Döngüsü ... 6
2.2. Virulans faktörleri ... 6
2.3 Ekoloji ... 8
2.4. Patogenez ... 10
2.5. Kriptokokkoz kliniği ... 10
2.6. AIDS hastalarında Cryptococcus menenjitinin yeri ve önemi ... 12
2.7. Epidemiyoloji ... 13
2.8. Kriptokokkoz tanı ... 15
2.8.1. Görüntüleme ... 15
2.8.2. Lomber ponksiyon ... 16
2.8.3. Direkt bakı ... 16
2.8.4. Mantar kültürü ... 17
2.8.5. Seroloji ... 18
2.8.6. Moleküler teknikler ... 22
2.8.7. Kütle spektrometresi ... 23
2.8.8. Histopatoloji ... 23
2.8.9. Antifungal duyarlılık testi ... 24
2.9.Tedavi ... 24
2.10. Korunma ... 25
3. GEREÇ ve YÖNTEM ... 26
3.1. Klinik örneklerin toplanması ve saklanması ... 26
3.2. Hasta bilgilerinin toplanması ... 26
3.3. Serum örneklerinde lateral flow assay yöntemiyle Cryptococcus antijeni aranması ... 28
3.4. İstatistiksel inceleme ... 30
4. BULGULAR ... 31
5. TARTIŞMA ... 34
6. SONUÇLAR ve ÖNERİLER ... 39
KAYNAKLAR ... 40
ÖZGEÇMİŞ ... 50
TABLO LİSTESİ
Tablo No: Sayfa No:
Tablo 1. Sınıflandırma ... 4
Tablo 2. Cryptococcus türlerinin serotip, varyete ve genotipleri ile coğrafi dağılımı (9,12) ... 5
Tablo 3. Kriptokokkozda tanı yöntemlerinin karşılaştırılması (73,11). ... 17
Tablo 4. Cryptococcus serolojik tanısında LA, LFA ve EIA testlerinin karşılaştırılması (101). ... 20
Tablo 5. CrAg LFA sonucu pozitif ve negatif bulunan HIV-pozitif hastaların özellikleri ... 31
Tablo 6. HIV-negatif kontrol grubunun özellikleri ... 33
Tablo 7. Kriptokokkoz tanısında LFA ile birlikte LA ve/veya EIA kullanılan çalışmaların sonuçları (128–137). ... 36
Tablo 8. HIV-pozitif hastalarda LFA ile Cryptococcus antijeni aranan çalışmalara ilişkin sonuçlar (138–152). ... 37
ŞEKİL LİSTESİ
Şekil No: Sayfa No:
Şekil 1. HIV+ Hasta Formu ... 27
Şekil 2. Dynamiker® Cryptococcal Antigen Lateral Flow Assay kiti ... 28
Şekil 3. Dynamiker® CrAg LFA test stribinin dizaynı ... 28
Şekil 4. CrAg LFA pozitif sonuç ... 29
Şekil 5. CrAg LFA negatif sonuç ... 29
Şekil 6. CrAg sonucu pozitif bulunan hastaların dağılımı ... 32
KISALTMA ve SİMGELER
- : negatif
L : mikrolitre
m : mikrometre
+ : pozitif
°C : santigrat derece
ABD : Amerika Birleşik Devletleri
AFLP : Amplified fragment length polymorphism
AIDS : Acquired Immune Deficiency Syndrome (Kazanılmış İmmün Yetmezlik Sendromu)
ART : Antretroviral tedavi
BDG : (1,3)-β-D-glucan
BOS : Beyin-omurilik sıvısı BT : Bilgisayarlı tomografi
cc : cubic centimeter (santimetreküp)
CE : Conformité Européenne
CGB agar : Kanavanin-glisin-bromtimol mavisi agar CLSI : Klinik ve Laboratuar Standartları Enstitüsü CrAg : Cryptococcus Antijeni
EIA : Enzyme Immuno-assay
FDA : U.S. Food and Drug Administration
GM-CSF : Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor
GXM : Glukuronoksilomannan
GXMGal : Glukuronoksilomannogalaktan
HIV : Human Immunodeficiency Virus (İnsan İmmünyetmezlik Virüsü) IRIS : Immune Reconstitution Inflammatory Syndrome
ISHAM : Uluslararası İnsan ve Hayvan Mikolojisi Topluluğu
LA : Lateks Aglutinasyon
LFA : Lateral Flow Assay (Yanal Akış Testi)
MALDI-TOF MS : Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry
MİK : minimum inhibe edici konsantrasyon
mL : mililitre
MLST : Multilocus sequence typing
MR : Manyetik rezonans
PAS : periyodik asit-Schiff
PCR : Polymerase Chain Reaction (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) POC : point-of-care (hasta-başı test)
RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism rpm : revolutions per minute
SOD : Süperoksit dismutaz
SSS : Santral Sinir Sistemi
UNAIDS : Birleşmiş Milletler HIV/AIDS Ortak Programı
var. : varyete
WHO : World Health Organization (Dünya Sağlık Örgütü)
ÖZET
HIV-pozitif Olgularda Cryptococcus Antijeninin Lateral-Flow Testi ile Araştırılması
Cryptococcus neoformans özellikle CD4 sayısı düşük olan (<100 hücre/L) HIV-pozitif kişilerde yaşamı tehdit eden meningoensefalit etkenidir. Türkiye'de Cryptococcus meningoensefaliti (CM) yükü, 0.13/100.000 olarak tanımlanmış olmasına rağmen, kriptokokkoz riski taşıyan asemptomatik kişilerin, hastalığı önlemek veya erken tanı için antijenemi yönünden taranması gerekir. Lateral flow testi BOS'ta ve serumda Cryptococcus antijeni (CrAg) saptamak için kullanılır. Bu çalışmada, HIV-pozitif hastalarda Cryptococcus antijenemisi sıklığını, bir strip test olan Dynamiker® CrAg-LFA kullanarak belirlendi.
Hastaların demografik verileri, CD4 sayısı, HIV-RNA seviyeleri ve antiretroviral tedavi durumu da kaydedildi. Taranan 254 HIV-pozitif erişkin hastanın 28'inde (% 11) CrAg tespit edildi. Önemle belirtmek gerekir ki, kontrol grubu olarak seçilen 100 HIV-negatif erişkinin CrAg açısından negatif olduğu belirlenmiştir.
HIV-pozitif erişkinlerde CrAg-LFA pozitifliği oranı, HIV-negatif kontrollerden istatistiksel olarak farklı idi (x2 = 11.970; P <0.05). CrAg pozitif bulunan kişilerde medyan CD4 sayısı 666 hücre/L (115–1344 hücre/L), medyan viral yük ise 23 kopya/mL (0–3.69x106 kopya/mL) olarak belirlendi. HIV-pozitif CrAg-negatif olan hastalarda ise medyan CD4 sayısı 633 hücre/L (31–2953 hücre/L), medyan viral yük ise 12 kopya/mL (0–1.95x106 kopya/mL) idi. Bu nedenle, Cryptococcus antijeni yönünden CD4 sayısı <100 hücre/L veya <200 hücre/L olan HIV-pozitif hastalar gibi CD4 >200 hücre/L olan hastalar da araştırılmalıdır. Ayrıca, HIV ile ilişkili asemptomatik kriptokokkoz Türkiye’de nadir değildir ve bu durumun sistematik olarak araştılması gereklidir. HIV pozitif ve/veya AIDS hastalarında kriptokok meningoensefalitinin önlenmesi için güncel stratejiler endemik olmayan ülkelerde bile uygulamaya alınmıştır.
Anahtar Sözcükler: Cryptococcus menenjiti, tanı, HIV, hasta-başı test, Türkiye
ABSTRACT
Investigating Cryptococcus Antigen Using Lateral Flow Assay in HIV-positive Patients
Cryptococcus neoformans causes life-threatening meningoencephalitis, particularly in HIV-positive individuals with low CD4 levels (< 100 cells/L).
Although the burden of Cryptococcus meningoencephalitis (CM) in Turkey has been described as 0.13/100,000 individuals, asymptomatic individuals at risk of cryptococcosis should be screened for antigenemia to prevent the disease or for early CM diagnosis. Lateral flow assay (LFA) is used to detect Cryptococcus antigen (CrAg) in the cerebrospinal fluid and serum. Here, we determined the prevalence of Cryptococcus antigenemia in HIV-positive patients using the Dynamiker® CrAg-LFA, a point-of-care dipstick test. Patients’ demographic data, CD4 count, HIV-RNA levels, and antiretroviral therapy status were also recorded.
CrAg was detected in 28 (11%) of 254 HIV-positive adults screened. Importantly, 100 HIV-negative control adults were determined as negative for CrAg. The CrAg- LFA positivity rate in HIV-positive adults was statistically different than of HIV- negative controls (x2=11.970; P<0.05). In the CrAg-positive patients, the median CD4 level was 666 cells/L (115–1344 cells/L), with the median viral load of 23 copies/mL (0–3.69 106 copies/mL). In the HIV-positive CrAg-negative patients, the median CD4 level was 633 cells/L (31–2953 cells/L), with the median viral load of 12 copies/mL (0–1.95 106 copies/mL). Hence, HIV-positive patients with both, low (< 200 cells/L) and high (> 200 cells/L) CD4 counts should be screened for asymptomatic cryptococcal antigenemia. HIV-associated asymptomatic cryptococcosis is not uncommon in Turkey, which warrants systematic screening.
Updated strategies for the prevention of CM among HIV-positive and/or AIDS patients are warranted even in non-endemic countries.
Keywords: Cryptococcal meningitis, diagnosis, HIV, point-of-care, Turkey
1. GİRİŞ
Son on yılda, mantar hastalıkları yılda yaklaşık 1.5 milyon kişinin ölümüne sebep olmuş ve dünyada bir milyardan fazla insanda mantar enfeksiyonlarının görüldüğü hesaplanmıştır (1). Mantar hastalıklarının halk sağlığı sürveyansı genellikle zorunlu değildir ve hemen daima yapılmaz, bu durum maalesef çoğu tahminin sınırlı kalmasına sebep olmuştur (2). Mantarlar, insan hastalıklarının yanı sıra bitki ve ürünlerine zarar verebilir, tarımsal faaliyetlerde ve gıda üretiminde büyük kayıplara sebep olabilir (3). Hayvanlarda da patojen olan mantarlar, nesli tükenmekte olan yarasaları, sürüngenleri ve iki-yaşayışlıları da tehdit etmektedir (2). Mantarların, enfekte ettikleri hayvan ve bitki türleri için en büyük yaşamsal tehdit olduğu tahmin edilmektedir, bu da enfeksiyon sebepli konakçı kaybının yaklaşık %65’ini temsil eder (4). Bununla birlikte, küresel ısınma ve beraberindeki iklim değişikliklerinin birçok mantar hastalığının görülme sıklığında artışa neden olduğu açıktır (5). Yukarıda anılan sebeplerle, yakın gelecekte mantar kökenli bir pandeminin ortaya çıkması ile ilgili endişeler oluşmaya başlamıştır (2). Günlük pratikte her ne kadar mantar hastalıkları gözardı edilse de tüm bu faktörler göz önüne alındığında, mantar hastalıkları asla küçümsenmemeli ve unutulmamalıdır.
Tıbbi Mikoloji ve Klinik Mikoloji alanında çalışanlar tarafından sıkça hatırlatılan eski bir deyişin belirttiği gibi “düşmanını tanı” sözü mantar enfeksiyonlarıyla mücadelenin başlangıç noktasıdır. Küresel bir felaketten kaçınmak için; mantarların biyolojisi, insan ve bitki patojenliği, terapötik ilaçlar, tanı yöntemleri ve aşılar da dahil olmak üzere mantar araştırmalarına yapılan yatırım önemli ve gereklidir (6). Gelişmekte olan ülkeleri etkileyen hastalıklara özel dikkat gösterilerek, tarımsal ve çevresel kayıplar ile insan sağlığına zararlı etkilerin önlenmesi için bir koruma olarak dünya genelinde mantar biyolojisi ve patogenezine daha fazla dikkat çekilmelidir.
Mantar hastalıkları alanında finansman ve ölüm oranları arasındaki dengesizlik daha çok Cryptococcus enfeksiyonunda belirgindir. Dünya Sağlık Örgütü’nün 2015 ve 2017 yılları verileri; sıtmanın sebep olduğu 429.000 ölüm, tüberküloz kaynaklı ise 1.6 milyon ölüm olduğunu tahmin etmektedir, Cryptococcus menenjiti ise yılda yaklaşık 180.000 ölüme sebep olmaktadır (7). Bununla birlikte kriptokokkoz, küresel araştırma
ve geliştirme fonlarının %0.5’inden daha azını alırken, sıtma ve tüberküloz, bulaşıcı hastalıklarda araştırma ve geliştirmeye yapılan toplam yatırımın %35.5’ini almıştır (8).
Özellikle bağışıklık sistemi baskılanmış konakta ciddi morbidite ve mortalite ile seyreden Cryptococcus enfeksiyonlarına dikkat çekmek kaçınılmaz olmuştur.
Cryptococcus cinsi maya mantarları, primer veya fırsatçı, hayatı tehdit edebilen ve kriptokokkoz adı verilen ve dünya genelinde görülen hastalığa sebep olur. İnsan ve hayvanlarda hastalık etkenidirler. İnsan enfeksiyonlarından hemen daima iki tür sorumludur: Cryptococcus neoformans ve Cryptococcus gattii. Cryptococcus’ların en önemli çevresel kaynakları kuş dışkısıyla kirlenmiş toprak (C. neoformans) ile bitki artıkları ve özellikle güneş görmeyen ağaç kovukları (C. gattii)’dır (9).
İnsanlarda C. neoformans, AIDS hastalarında görülen Cryptococcus enfeksiyonlarının %98’inden sorumlu olup etken genellikle Cryptococcus neoformans var. grubii’dir. Cryptococccus neoformans var. neoformans yalnızca bağışıklık sistemi baskılanmış konakta enfeksiyon etkenidir. Cryptococcus gattii ise daha çok bağışıklık sistemi sağlam konakta enfeksiyondan sorumlu olup primer patojendir (9).
Dünya genelinde 1950’li yıllara dek kayıtlı kriptokokkoz sayısı 300’den azdır (10). Bu durum, izleyen yıllarda AIDS başta olmak üzere bağışıklık sistemi baskılanmış popülasyonun artışı ile büyük bir değişim göstermiştir. Aralık 2013 itibarı ile dünya üzerinde 31.8 milyon erişkin HIV ile yaşamakta ve 2013 yılında 1.3 milyon AIDS ile ilişkili ölüm olduğu tahmin edilmektedir (7). Cryptococcus antijenemisi prevalansının
%6 olduğu (278.000 olgu) ve yıllık Cryptococcus menenjiti sayısının 223.100 olduğu belirtilmektedir. Bu menenjit olgularının 162.500’ü Sahra-altı Afrika’da, nispeten tedaviye ulaşımın altyapı ve maliyetle sınırlı olduğu, gelişmemiş veya gelişmekte olan ülkelerde görülmektedir (7).
Antiretroviral tedavi kullanımının yaygınlaşması sonucunda; AIDS ile ilişkili ölümler %45 oranında azalmış olmasına karşılık, yüksek gelirli ülkelerden farklı olarak, düşük ve orta gelirli ülkelerde Cryptococcus enfeksiyonunun prevalansında büyük bir değişiklik veya düşüş olmamıştır (7). AIDS ile ilişkili Cryptococcus menenjiti AIDS'e bağlı ölümlerin yaklaşık %15’inden sorumludur. Son 10 yılda, menenjit ve buna bağlı mortalitenin belirteci olarak asemptomatik Cryptococcus antijenemisinin önemi daha iyi anlaşılmış ve Cryptococcus antijenemisinin prevalansını belirlemeye yönelik çalışmalar önem kazanmıştır. Cryptococcus antijenemisinin belirlenmesi ile önleyici antifungal
tedavi birleştiğinde ekonomik olarak daha yararlı bulunmuş ve sağkalımı artırdığı kanıtlanmıştır. Bu durum, Botswana, Kenya, Mozambik, Namibya, Ruanda, Güney Afrika, Svaziland (Esvatini Krallığı), Uganda, ABD ve Zimbabve’de mevcut HIV ulusal klavuzlarına dahil edilmiştir (7).
Kriptokokkoz tanısında serolojik yöntemler, hızlı ve güvenilir yöntemler olup uzun yıllardır kullanılmaktadır. Cryptococcus’ların kapsül polisakkaritinin glukuronoksilomannan bileşenini saptamaya yönelik bu testlerin tanı için en duyarlı yöntemler olduğu kabul edilmektedir (11). Bu tez çalışmasında HIV- pozitif olgularda hızlı ve ucuz bir hasta-başı serolojik test olan lateral flow yöntemi kullanılarak ülkemize ilişkin Cryptococcus antijenemisi prevalansını belirlemeye katkı sağlanması ve asemptomatik Cryptococcus antijenemilerinin saptanması ve uygun önleyici tedavi ile menenjit ve ölümlerin azaltılması ve sağkalımın artırılması amaçlandı.
2. GENEL BİLGİLER
2.1. Cryptococcus biyolojisi
2.1.1. Taksonomi
Tablo 1. Sınıflandırma
Krallık Mantarlar
Şube Basidimycota
Alt-şube Basidimycotina
Takım Sporidiales
Aile Sporidiobolaceae
Cins Filobasidiella (Cryptococcus)
Cryptococcus cinsi içerisinde çoğu çevresel saprofit olan basidyomiçetöz kapsüllü maya mantarları yer alır. Kriptokokkoz etkeni olan başlıca iki tür: C.
neoformans ve C. gattii’dir. C. neoformans iki varyeteye ayrılır: C. neoformans var.
grubii ve C. neoformans var. neoformans. Ayrıca, C. neoformans, moleküler olarak VNI-VNIV ve VNB genotiplerine ayrılır. C. neoformans var. grubii, serotip A veya VNI, VNII ve VNB; C. neoformans var. neoformans, serotip D veya VNIV ve hibrid serotip AD, VNIII olarak değerlendirilir. Cryptococcus gattii ise serotip B ve C olmak üzere iki serotipe ve VGI-VGIV olarak dört moleküler tipe ayrılır. Nadir de olsa hastalık etkeni olarak bildirilen ve genellikle bağışıklık sistemi baskılanmış konakta enfeksiyon etkeni olabilen diğer iki Cryptococcus türü ise Cryptococcus laurentii ve Cryptococcus albidus’tur (9).
Tablo 2. Cryptococcus türlerinin serotip, varyete ve genotipleri ile coğrafi dağılımı (9,12)
Tür Varyete Serotip MLST AFLP Coğrafi
Dağılım C. neoformans var. grubii A VNI AFLP1 Global C. neoformans
var. grubii
A
VNII 1A/1B
Global
(Avustralya, Afrika, Kuzey Amerika) C. neoformans
var. grubii
A
VNB
Güney Afrika C. neoformans var.
neoformans
D VNIV AFLP2 Global (Avrupa) Hibrit AD VNIII AFLP3 Global
(Avrupa) C. gattii – B,C VGI AFLP4 Global
(Avustralya) C. gattii – B,C VGII AFLP6 Kuzey
Amerika (Kanada, Birleşik Devletler) Güney Amerika (Kolombiya) C. gattii – B,C VGIII AFLP5 Güney
Amerika C. gattii – B,C VGIV AFLP7 Kuzey
Amerika VGIV/VGIIIc AFLP10
C. gattii DB hibrit
AFLP8
C. gattii AB hibrit
AFLP9, 11
2.1.2. Hayat Döngüsü
Cryptococcus neoformans hayat döngüsü eşeysiz ve eşeyli şekillerden oluşur.
Eşeysiz şekli tomurcuklanarak çoğalır. Bu haploid, tek hücreli C. neoformans ve C.
gattii insan enfeksiyonlarından izole edilen şekildir.
Cryptococcus neoformans ve C. gattii’nin eşeyli şekli ise yalnızca laboratuvar koşullarında görülür. Eşeyli yapılar doğada bulunmasa da belirgin eşeyli rekombinasyon saptanmıştır. Maya mantarı a ve olmak üzere iki çiftleşme şeklinden birinde bulunur. a ve şekillerinin konjugasyonu bağlantı noktaları içeren dikaryotik hiflerden oluşan eşeyli şekillerin oluşumu ile sonuçlanır. Bazı hifler basidyum adı verilen özelleşmiş yapılar geliştirir. Mayoz bölünme basidyaların terminal kısmında gerçekleşir ve tek çekirdekli basidyospor oluşumuyla sonuçlanır. Bu sporlar başlangıçta kapsülsüzdür, ancak basidyadan salındığında hızla kapsül geliştirir. Tomurcuklanma kapsül oluşumundan sonra başlar ve böylece hayat döngüsü tamamlanır (13).
2.2. Virulans faktörleri
Bu iki patojen mayanın virülansına katkı sağlayan ana faktörler şu şekilde sıralanabilir: (i) 37°C’de üreyebilme yeteneği, (ii) melanin üretimi ve (iii) geniş polisakkarit kapsül varlığıdır (14).
Kapsül: Mayanın virülansında esas rolü oynar (15). Kapsülün ana bileşenleri;
glukuronoksilomannan (GXM), glukuronoksilomannogalaktan (GXMGal) ve mannoproteinlerdir (16). Kapsülün maya mantarını bir kalkan gibi sararak konağın bağışık sisteminden koruduğu düşünülmektedir (17). Her ne kadar kapsül zayıf immünojenik olsa da; (i) enfeksiyon bölgesine lökosit göçünü inhibe eder, (ii) T hücre çoğalmasını önler, (iii) IL–10 sekresyonunu indükler, (iv) sistemik inflamasyonu baskılar, (v) mantarın akciğer dışı yayılımından sorumludur (18), ayrıca (vi) kompleman ve antikor yanıtını inaktive eder (19).
Kapsül genişlemesi: Cryptococcus’lar çevresel değişikliklere kapsül genişlemesi ile cevap verir ve bu adaptif cevap özellikle hücre döngüsünün G1 fazı ile ilişkilidir. Mutant suşlarda G1 fazı uzamıştır ve daha geniş kapsül oluşturur. Bu suşlar daha çok ekstraselüler vezikül oluşturur ve fagositik hücrelerce sindirilmesi zordur (20).
Ekstraselüler veziküller: Hücre duvarı ilişkili yapılar olan ekstraselüler veziküller moleküllerin hücre dışına taşınmasında rol oynar ve son çalışmalar virülans
ile de ilişkili olduklarını göstermiştir. Bu ‘virülans paketleri’ lakkaz, üreaz, SOD, ısı şok proteinleri ve ribozomal proteinler gibi önemli proteinler içerir (21). Ekstraselüler veziküller, konağın bağışıklık sistemini uyarır, her ne kadar bu mantar için olumsuz bir durum gibi görünse de, C. neoformans makrofajların içinde canlı kalabilir ve bağışıklık sisteminin antifungal etkisinden saklanabilir (19). Ayrıca, enfeksiyon sırasında bu veziküllerin üretimi mantarın kan-beyin bariyerinden geçişini kolaylaştırır (22).
Melanin: Melanin esas olarak mantar hücre duvarında bulunur, por boyutlarını küçültür ve hücre duvarının sertliğine katkı sağlar (23). Melanin, özellikle amfoterisin B ve kaspofungin gibi antifungallere dirençle ilişkilidir (16). Cryptococcus neoformans ömelanin (gerçek melanin) üretir ve ömelanin siyah veya kahverengi olup ʟ-DOPA’dan lakkaz enzimi aracılığıyla üretilir (24). Cryptococcus, ʟ-DOPA, monofenol, difenol ve eskülin varlığında ömelanin sentezler (16). Lakkaz aktivitesi ile C. neoformans’ın BOS’ndaki canlılığı ilintilidir (25). Beyin ʟ-DOPA açısından zengindir ve C.
neoformans bu molekülü beyin enfeksiyonu sırasında kendini oksidatif stresten korumak için kullanabilir. Ancak, lakkazın yokluğu, mantarın akciğer dokusundaki gelişimini önlemez (26).
Termotolerans: Tremellales takımı içerisinde 37°C’de üreyebilen iki tür C.
neoformans ve C. gattii’dir ve bu sebeple insan konağına uyum sağlayabilirler. Diğer Cryptococcus türleri 37°C’de ya hiç üremez ya da çok az ürer. Güvercinler kriptokokkoz belirtisi vermeden C. neoformans ile kolonize olabilir ve mantarı taşıyabilir. Bu durum, vücut sıcaklığı 42°C olan güvercinlerin makrofajlarında mantarların çoğalmasının baskılanması ile açıklanmıştır (14).
Üreaz aktivitesi: Cryptococcus neoformans izolatlarının %99.6’sı üreaz aktivitesi gösterir (27). Üreaz, ürenin besin kaynağı olarak kullanılmasıyla mantara mikrokapiller yatakta canlı kalma imkanı verir (28). Üreaz aktivitesi sonucu oluşan amonyak endotele mekanik etkiyle mikro-damarlarda yapı değişikliğine neden olur.
Ayrıca, endotelyal sıkı bağlantıları (tight-junction) açarak kan beyin bariyerinden geçişi kolaylaştırır (29).
Titan hücreleri: Cryptococcus enfeksiyonu sırasında mantardaki en önemli yapısal değişiklik Titan hücrelerinin oluşumudur. Normal koşullarda, C. neoformans hücre büyüklüğü 4–8 m iken, Titan (dev) hücreleri 100 m’ye ulaşabilir (30). Titan hücreleri fagosite edilemediği için özellikle enfeksiyonun erken dönemlerinde normal
C. neoformans hücrelerinin de fagositozunu önler (31). Titan hücreleri beyin dokusuna geçememesine karşılık, normal hücrelerin akciğerlerden diğer dokulara geçişini kolaylaştırır. Ayrıca, bu hücreler oksidatif ve nitrosatif strese dirençlidir ve bu da enfeksiyonun temizlenmesini zorlaştırır ve latent enfeksiyon gelişiminde önemlidir (32).
Mannitol: Mannitol üretimine bağlı artmış ozmotik basınç beyin ödemine neden olur ve bu da mantarı oksidatif hasardan korur (33). Düşük miktarlarda mannitol üreten suşların ısıya ve osmotik strese daha duyarlı oldukları gösterilmiştir (34).
İnositol: İnsan ve hayvanların beynindeki major moleküllerden biri olan inositol, Cryptococcus türleri tarafından besin olarak kullanılabilir. Beyindeki mikrovasküler endotelyal hücrelerle mantar arasındaki ilişkiyi destekler ve artmış transmigrasyondan sorumludur. İnositol, mantarın fosfolipid üretiminde de önemli bir rol oynar ve bu da mikrovasküler endotel hücrelerine etkisini açıklamaya yardımcı olur (35).
Biyofilm oluşumu: Cryptococcus neoformans’ın polistren yüzeylerde, ventriküloatrial şantlarda, ventriküloperitoneal şant kateterlerinde ve kalp kapaklarında biyofilm oluşturduğu gösterilmiştir. Cryptococcus biyofilmleri; flukonazol ve vorikonazole dirençli olup amfoterisin B, kaspofungin ve oksidatif strese normal hücrelerden daha da dirençlidir (36).
Fenotipik switching (değişim): Düz yüzeyli, S tipi koloniler daha güçlü biyofilm oluşturur (37), kapsülleri küçüktür ve kan-beyin bariyerini daha kolay geçerler (38). Buruşuk kolonilerdeki hücreler ise daha geniş kapsüllü olup daha virülandır (39).
Demir ve bakır kullanımı: Cryptococcus, siderofor kullanımının yanı sıra ferrik redüktaz (lakkaz), yüksek afiniteli ferroksidaz ve permeaz kompleksi gibi demir alım sistemleri geliştirmiştir (40). Demir kullanımı; melanin üretimi, kapsül oluşumu, glikoliz, ergosterol sentezi ve inositol kullanımı gibi mantarın virülansı ve enfektivitesini sağlayan pek çok süreçle ilişkilidir (41). Bakır ise lakkaz ve SOD gibi bazı yapısal enzimlerin aktivitesi için gereklidir, ancak bu metalin birikimi mantar için toksiktir (42).
2.3 Ekoloji
Patolog Otto Busse ve cerrah Abraham Buschke, 1894’te genç bir kadında kemik enfeksiyonundan “Saccharomyces benzeri” bir organizmayı izole ederek bu
mayayı ilk kez insan patojeni olarak tanımlamıştır (43,44). Aynı yıl, Francesco Sanfelice, benzer bir mayanın fermente şeftali suyundan izole edildiğini bildirmiş ve eşsiz koloni şekli nedeniyle Saccharomyces neoformans adını vermiştir (45). Jean-Paul Vuillemin, 1901’de bu maya mantarını Cryptococcus neoformans olarak yeniden adlandırmış, çünkü Saccharomyces’lerin ayırt edici özelliği olan askosporların üretilmediğini belirlemiştir (46). Dr Chester Emmons 1951’de mantarı toprak ve güvercin dışkısından izole etmiştir. İzleyen yıllarda, C. neoformans, tavuk, papağan, serçe, tarlakuşu, sığırcık, kanarya ve kumru dahil diğer kuş türlerinin gübrelerinden ve ayrıca kriptokokkoz olsun ya da olmasın kedi, köpek, koala ve gelinciklerin üst solunum yollarından izole edilmiştir. Kuş dışkısı C. neoformans için topraktan daha uygun bir üreme ortamıdır. Ağaç oyuklarından da izole edilebilmesine karşılık ağaç oyukları ile olan ilişkisi, C. gattii’ye göre daha azdır (9).
Tarihsel olarak, C. gattii enfeksiyonu bazı ağaç türleri ile ilişkilendirilmiştir.
Özellikle, iki tür Avustralya ökaliptüsü (veya kırmızı sakız), Eucalyptus camaldulensis ve Eucalyptus tereticornis ile çevresel ilişki ilk kez 1990’ların hemen başında bildirilmiştir (47). Avustralya’da, Eucalyptus camaldulensis’in su yolları boyunca yoğunluğu ve buradaki kırsal konutlarda Aborijinlerin yaşamasının bu popülasyondaki yüksek enfeksiyon prevalansını açıkladığı düşünülmüştür. Bu bağlantı daha sonra klinik ve moleküler epidemiyolojik çalışmalar ile doğrulanmış (48) ve C. gattii enfeksiyonunun kırsal ya da yarı-kırsal bir konutta ikamet etmek ya da buralarda çalışıyor olmak ile ilişkisi açıklanmıştır (49). Ökaliptüslerin yanı sıra, Britanya Kolombiyası, Kanada’daki Vancouver Adası’na özgü Douglas köknarı, kıyı batı baldıranotu, akçaağaç, Garry meşesi, büyük köknar ve sedir gibi ağaçların C. gattii için önemli odaklar olduğu dikkati çekmiştir. Ayrıca, ABD’nde de C. gattii topraktan izole edilmiştir (50). İnsan olgularının büyük oranda kırsal kesimde görüldüğü Avustralya’nın aksine, Britanya Kolombiyası, Kanada’daki olgular, ağırlıklı olarak kentler ve banliyölerden rapor edilmiştir (51). Kuzey Amerika’daki pek çok hastanın, endemik bölgelerde yaşadığı veya turist olarak ziyaret etmek sureti ile maruziyeti anlaşılmıştır.
2.4. Patogenez
Cryptococcus’lar doğada kapsülsüz ya da çok ince kapsüllüdür ve solunum yoluyla vücuda alınır. Akciğerlerde kuru maya hücreleri su alır ve geniş polisakkarit kapsül geliştirir. Alveolar makrofajlarca fagosite edilir ve bundan sonra klinik tablo konağın bağışıklık sistemine bağlı olarak değişir. Bağışıklık sistemi sağlam olanlarda asemptomatik veya kendiliğinden geçen subklinik bir enfeksiyon olarak seyreder.
Hücresel bağışıklığı baskılanmış ya da makrofaj aktivasyonu olmaz ise mantar akciğerlerden kana geçer ve SSS başta olmak üzere diğer organ ve dokulara yayılır.
Maya mantarının SSS’ne tropizmi şu şekilde açıklanabilir:
(i) Serumda bulunan ve Cryptococcus’ların büyümesini engelleyen faktörler BOS’nda olmadığı için, BOS, maya açısından olumlu bir büyüme ortamıdır (52).
Serumda mikroorganizma alternatif kompleman yolunu aktive eder, ancak BOS’ndaki kompleman aktivitesi çok düşüktür (53).
(ii) SSS’deki dopamin seviyesi, mikroorganizmanın melanin üretimi için substrat olarak kullanılarak Cryptococcus virülansını destekleyebilir (54).
(iii) Mikrorganizmanın mannitol üretimi beyin ödemini arttırır ve fagosit fonksiyonunu inhibe edebilir (55).
Cryptococcus meningoensefalitinde beyindeki inflamatuar cevap genellikle bakteri meningoensefalitinde görülenden daha hafiftir. İnflamatuar hücre sızıntısı baskın olarak mononükleer hücrelerden oluşur, ara ara polimorfonükleer lökositler görülür.
Genel olarak, beynin diffüz tutulumu yaygındır, ancak lokalize enfeksiyon (kriptokokkoma) da görülebilir.
2.5. Kriptokokkoz kliniği
Santral sinir sistemi tutulumu: SSS enfeksiyonu Cryptococcus enfeksiyonlarından en sık görüleni olup etkili tedaviye karşılık, ölüm oranı halen yüksektir (56). Santral sinir sistemi kriptokokkozu subakut menenjit veya meningoensefalit şeklinde olup sıklıkla sinsi başlangıçlıdır. Hastaların tamamına yakınında beyin parankimi tutulumu olduğu için ‘‘meningoensefalit’’ terimi daha uygundur. Hastalarda semptomlar haftalardır veya aylardır var olabilir (1–120 gün). En
sık görülen semptom başağrısı olup iki taraflı ve yaygındır. Bunun dışında ateş, kranial sinir felçleri, letarji, koma ve hafıza kaybı görülebilir. Cryptococcus gattii’nin sebep olduğu serebral kriptokokkoma lezyonları olan olgularda artan kafa içi basıncı bulgularına bağlı kranial nöropatiler, başağrısı, bulantı ve kusma ile nöbetler görülebilir (57).
Akciğer tutulumu: Akciğer tutulumu asemptomatik kolonizasyondan solunum yetmezliğine sebep olabilen pnömoniye kadar geniş bir spektrumda görülebilir; klinik tablonun şekillenmesinde hastanın bağışıklık durumu önemli rol oynar (58). Bağışıklık sistemi sağlam bireylerde akciğer tutulumu asemptomatik seyredebilir (%30) (59). HIV- negatif olgularda HIV-pozitiflere göre akciğer tutulumu daha sık görülür (60). Akciğer kriptokokkozunda öksürük, ateş, kas ağrısı, göğüs ağrısı, kilo kaybı, nefes darlığı, gece terlemesi olabilir, belirtiler özgül olmadığından tanı gecikebilir (58).
Deri tutulumu: Cryptococcus menenjitli olguların yaklaşık %5’inde deri tutulumu görülebilir ve takrolimus alan karaciğer transplantlılarda ise daha sıktır (61).
Takrolimusun 37–39°C’de antikriptokokkal aktivitesi de vardır. Bu sebeple, takrolimus alanlarda deri tutulumu ile seyreden kriptokokkoz gelişme olasılığı santral sinir sistemi kriptokokkozuna göre daha yüksektir. Deri tutulumu sıklıkla kan yolu ile yayılım sonrası sekonder olarak oluşur. Papül, vezikül, derialtı apse, plak, sellülit, purpura, akne, drene olan sinüs, ülser ve bül gibi birçok lezyon görülebilir. Bunlar arasında en sık olarak papül ve ortası ülserleşmekte olan makülopapül şeklindeki lezyonlar görülür.
Lezyonlar; molluscum contagiosum, bazal hücreli karsinom, akne vulgaris ile karışabilir ve bu sebeple tanı gecikebilir (62).
Genitoüriner sistem tutulumu (Prostatit): Sistemik mikozlarda prostatit tablosuna Blastomyces dermatitidis gibi C. neoformans da sebep olabilir. Bu durumu, ilk kez Voyles ve Beck 1946’da dissemine kriptokokkozlu bir hastada göstermişlerdir.
Bağışıklık sistemi baskılanmış bireylerde, dissemine kriptokokkoz veya santral sinir sistemi kriptokokkozunun tedavisini izleyen dönemde C. neoformans prostat dokusunda sekestre olabilir, böylece relapslara yol açabilir. Prostat bezinin C. neoformans’a bağlı primer enfeksiyonu sık görülmez (63).
Göz tutulumu: Cryptococcus menenjitli olguların yaklaşık yarısında oküler bulgular ve semptomlar görülebilir, en sık oküler felçler ve papil ödem bulguları ile karşılaşılır. Görme kaybı optik sinirin infiltrasyonuna veya serebral ödem nedeniyle
intrakranial basıncın artıp oftalmik artere baskı yapmasına bağlı olabilir. Koroidit, endoftalmit tabloları görülebilir (62).
IRIS: İmmun rekonstitüsyon sendromu denilen bu terim bağışıklık sisteminin yeniden yapılanmasını ifade eder. CD4 sayısı düşük olan hastalarda ART ile viral yük azalıp CD4 sayısı artınca, önceden geçirilmiş fırsatçı bir enfeksiyonun bulgularının ortaya çıkması IRIS olarak tanımlanır. HIV ile enfekte bireylerde görülebilen IRIS tablosuna sebep olan etkenler arasında Cryptococcus’lar da yer alır. Cryptococcus’lar nedeniyle gelişen IRIS tablosu genellikle antiretroviral tedaviye başlandıktan 1–22 ay sonra görülür. Cryptococcus’ların sebep olduğu IRIS tablosu en sık lenfadenit şeklinde seyreder (64).
Diğer bölgelerde de (kas-iskelet sistemi, gastrointestinal sistem, tiroid, meme, adrenal bezler, baş-boyun bölgesi gibi) yayılım sonrasında enfeksiyon tablosu görülebilir. Cryptococcus’ların sebep olduğu peritonit olguları da bildirilmiştir (65).
2.6. AIDS hastalarında Cryptococcus menenjitinin yeri ve önemi
WHO ve UNAIDS verilerine göre 2016 yılı sonunda dünyada 36.7 milyon insan HIV ile yaşamaktadır. Aynı yıl 1.8 milyon insan HIV ile yeni enfekte olmuş ve 1 milyon kişi HIV-ilişkili hastalıklar dolayısı ile kaybedilmiştir (66). AIDS, yirmiden fazla fırsatçı enfeksiyon ve HIV-ilişkili kanserlerle tanımlanır. ART’ye erişimin kolaylaşması, düşük ve orta gelirli ülkelerde yaşayan HIV-pozitif kişilerde prognozu değiştirmiştir. HIV tanı ve tedavisindeki imkanların genişlemesi 2005–2016 yılları arasında HIV’e bağlı ölümlerin %50 oranında azalmasını sağlamıştır. Bu gelişmelere karşılık, HIV-pozitif hastaların yarısından fazlası ilerlemiş hastalıkla yaşamaya ve birçoğu da HIV-ilişkili fırsatçı enfeksiyonlardan ölmeye devam etmektedir (67).
Kriptokokkoz, ilerlemiş HIV hastalığı olan insanlar arasında en önemli fırsatçı enfeksiyonlardan ve önemli mortalite sebeplerinden biridir.Cryptococcus türleri, hemen daima solunum yolu ile konağa girer, ancak genel popülasyonda nadiren klinik olarak anlamlı invazif hastalıkla sonuçlanır. İnvazif hastalığın, HIV-pozitif kişiler gibi bağışıklık sistemi baskılanmış bireyler arasında etkenin, vücuda alınmasından yıllar sonra aktifleşmesinden kaynaklandığı düşünülmektedir (67).
HIV-ilişkili Cryptococcus hastalıklarının %70–90’ını Cryptococcus menenjiti oluşturur ve 2014’de HIV-pozitif bireyler arasında 223.100 olgu ve 181.100 ölümden
sorumlu olduğu tahmin edilmektedir. Bu veriler, tüm dünyada HIV kaynaklı ölümlerin
%15’ini oluşturur. HIV-pozitiflerde %10–30 oranında ise kriptokoka bağlı akciğer, deri, lenf nodu ve kemik tutulumu görülür. Kriptokokkoz, erişkinlerde hastalık yükünün yüksek olduğu bölgelerde bile çocuklarda daha az görülür (67).
2.7. Epidemiyoloji
Kriptokokkoz hastalarının büyük çoğunluğunun bağışıklığı baskılanmış olup altta yatan hastalıklar, sıklık sırasına göre; AIDS, uzun süreli glukokortikoid tedavisi, solid organ transplantasyonu, malignensiler, karaciğer hastalıkları (68) ve sarkoidozdur (69). Ayrıca, tirozin kinaz inhibitörü (ibrutinib) kullanımı (70) ve GM-CSF otoantikoru varlığının da Cryptococcus menenjiti için risk faktörü olduğu bildirilmiş (71) ve anti- GM-CSF varlığı ile C. gattii’nin SSS enfeksiyonu arasındaki ilişki açıklanmıştır (72).
GM-CSF, Cryptococcus’ların kontrolünde önemli olan fagositik hücrelerin ve alveolar makrofajların fonksiyonlarını düzenler.
Sahra-altı Afrika’da HIV-pozitif erişkinlerde menenjitin en sık sebebi Cryptococcus’lardır. ART’ye erişimin giderek kolaylaşmasına karşılık, yüksek gelirli ülkelerden farklı olarak düşük ve orta gelirli ülkelerde Cryptococcus prevalansında büyük bir değişiklik olmamıştır. Günümüzden 10 yıl öncesinde, dünya genelinde yıllık kriptokokkoz insidansı 957.900 olgu/yıl idi ve 600.000’den fazlası ölümle sonuçlanmış idi. ART kullanımının yaygınlaşmasıyla AIDS-ilişkili ölümler %45 oranında azalarak 2 milyondan 1.1 milyona gerilemiştir (7).
CD4 sayısı < 100 olan ve ART almayan, tedaviye devam etmeyen veya virolojik başarısızlık yaşanan erişkinler kriptokokkoz açısından risk altındadır. Bununla birlikte, ART başlanan ve virolojik başarısızlık yaşanmayan ve Cryptococcus antijenemisi olmayan hastaların kriptokok enfeksiyonu riski taşımadığı söylenebilir (7).
Cryptococcus menenjiti sonucu görülen 1 yıllık mortalite riski ülkelerin gelir düzeyine göre değişir: düşük gelirli ülkelerde Cryptococcus menenjiti gelişen hastalarda tedavi almasına karşılık, mortalite %70 iken tedavisiz bu oran %100’dür. Orta gelirli ülkelerde: amfoterisin B ve flukonazol ile tedavi edilen hastalarda mortalite %40 iken, tedavi almayan (ART’siz) hastalarda oran %60’lara çıkmaktadır. Avrupa’da tedavi altında mortalite %30, tedavi almayanlarda %45 iken; Kuzey Amerika’da tedavi alanlarda %20, almayanlarda %30 olarak tahmin edilmektedir (7).
Aralık 2013 itibarı ile yeryüzünde 31.8 milyon HIV-pozitif erişkinin 21.7 milyonu Sahra-altı Afrika’da yaşamaktadır. UNAIDS tahminlerine göre 2013’de dünyada 1.4 milyon AIDS ile ilişkili ölüm olmuştur. Yıllık 223.100 Cryptococcus menenjiti olgusunun %73’ü (162.500 olgu) Sahra-altı Afrika’da görülmektedir. Bunu
%19 (43.200 olgu) ile Asya ve Pasifik izlemektedir. Ülke bazında ise ilk beş sırada Nijerya, Güney Afrika, Mozambik, Hindistan ve Uganda bulunmaktadır. Benzer şekilde, dünya genelinde Cryptococcus menenjiti sonucu yıllık 181.100 ölümün %75’i (135.900 ölüm) Sahra-altı Afrika’da görülmektedir (7).
Dünya genelinde kriptokokkoz olgularının büyük bir kısmı C. neoformans (serotip A ve D) tarafından oluşturulmaktadır. C. neoformans var. grubii (serotip A);
dünya genelinde yaygın bir serotip olup AIDS hastalarında görülen hastalık başta olmak üzere tüm kriptokokkoz olgularının %90’ından sorumludur. C. neoformans var.
neoformans (serotip D) dünya genelinde yayılım gösteren bir serotiptir, ancak klinik olgular Avrupa’da yoğunlaşmıştır. C. gattii (serotip B ve C) önceleri ‘‘tropikal veya subtropikal mantar’’ olarak bilinirdi. Ancak, 1999’da başlayan salgın ile birlikte C.
gattii enfeksiyonlarının Vancouver Adası, Kanada ve Britanya Kolombiyası’nın diğer bölümleri ile ABD’nin kuzeybatısına yayıldığı belirlenmiştir. C. gattii daha çok bağışıklık sistemi sağlam konakta enfeksiyon oluşturur, ancak HIV-pozitif ve diğer bağışıklık yetmezlikler ile GM-CSF oto-antikorları varlığı gibi risk gruplarında da hastalık etkenidir (73).
Asya, Afrika, Amerika, Avrupa ve Okyanusya’yı kapsayan son epidemiyolojik bir çalışmada 68.811 (%83 klinik ve %17 çevresel) C. neoformans ve C. gattii izolatının analizi, Okyanusya hariç en yaygın moleküler tipin C. neoformans var. grubii VNI olduğunu göstermiştir (74–77). Bu çalışmalarda Avustralya, Yeni Zelanda, Papua Yeni Gine ve Hawaii’de C. gattii tip VGI, toplam izolatların %39’unu temsil etmiştir ve bu sonuç C. gattii’nin endemisitesi ile uyumludur (74).
Asya’daki farklı ülkelerde farklı MLST tipleri bildirilmiştir (78,79). Güneydoğu Asya’da (Endonezya, Hindistan ve Tayland), Doğu Asya'dan (Çin, Hong Kong, Japonya ) daha fazla Cryptococcus polimorfizmi gösterilmiştir. Endonezya ve Hindistan izolatlarında nadir görülen bir türün (ST93) baskın olduğu bildirilmiştir (78,79).
2.8. Kriptokokkoz tanı
İzole ateş ve başağrısı şikayeti olan HIV-pozitif (CD4 <100) bir hastada Cryptococcus meningoensefalitinden şüphelenilmelidir. Böyle bir hastada ilk değerlendirme ayrıntılı bir öykü, fizik muayene ve serum örneğinde Cryptococcus antijeni bakılmasını içerir. Ayrıca, artmış intrakraniyal basınç gösterilerek ve semptomları olan ya da Cryptococcus antijeni pozitif bulunan hastada BOS kültürü yapılarak tanı doğrulanmalıdır.
2.8.1. Görüntüleme
Görüntüleme yöntemleri Cryptococcus enfeksiyonlarının erken tanısına yardımcı olur. Akciğerler, beyin ve klinik olarak diğer uygun bölgelerin görüntülenmesi C. gattii enfeksiyonları için esastır, çünkü indüksiyon tedavisinin ve toplam antifungal tedavinin tipi ve süresi tutulum bölgesine bağlıdır. Ayrıca, seçilen kitle lezyonlarının cerrahi rezeksiyonu veya BOS şantı gerekebilir (80).
Akciğer görüntülemesi: Akciğerin görüntülenmesi Cryptococcus hastalığının varlığına ilişkin ilk ipucunu sağlayabilir. Pulmoner alveoler veya interstisyel infiltratlar, C. gattii’nin endemik olduğu Avustralya’da VGI ile (49) ve Vancouver Adası salgınında VGII ile gelişen enfeksiyonlarda nadiren görülmüştür. Ancak, bağışıklık sistemi baskılanmış hastalarda, akciğer lezyonlarının %70’ini oluşturmaktadır (81).
Pulmoner ve serebral kriptokokkomalar, C. gattii enfeksiyonunda C. neoformans’a göre daha sık görülür (82).
Serebral görüntüleme: Bilgisayarlı tomografi (BT) veya manyetik rezonans (MR) kullanılarak yapılan beyin görüntüleme, beyin tutulumunun derecesini ve özelliklerini tanımlamaya yardımcı olur (80). Lezyonlar kriptokokkoma, obstruktif hidrosefali, apse veya kontrast artışı ve ödem odakları olarak görülebilir. MR görüntüleme, özellikle küçük lezyonların saptanması için BT taramalarından daha hassastır (83). Eğer kafa içinde kitle saptanırsa toksoplazma, lenfoma, tüberküloz gibi alternatif bir tanı düşünülmelidir. C. neoformans’a bağlı kitle lezyonu nadir iken, C.
gattii enfeksiyonlarında yaygın görülür (84).
2.8.2. Lomber ponksiyon
Cryptococcus meningoensefalitinde BOS profili kısaca; beyaz kan hücresi sayısında azalma ve mononükleer hücre hakimiyeti (<50 hücre/L), proteini hafif yüksek ve glikoz konsantrasyonu genellikle düşük bulunur. BOS profili, kültür pozitif hastalarda bile normal bulunabilir (85). Lomber ponksiyon, ayrıca morbidite ve mortalite ile ilişkili olan kafa içi basıncını göstermek için de önemlidir (86).
2.8.3. Direkt bakı
BOS, balgam ve biyopsi örneklerinin sedimenti direkt mikroskopi için uygun klinik örneklerdir. Çini mürekkebi veya Giemsa tercih edilen boyama yöntemleridir.
Giemsa boyama, Cryptococcus’un kapsülünü görünür hale getirerek diğer maya hücrelerinden ayırt edilmesini sağlar. Çini mürekkebi, BOS örneği için 5 dakikadan daha kısa sürede sonuç verebilecek ucuz ve basit bir tanı testidir. Cryptococcus’lar, siyah zeminde kapsülü bir halo şeklinde olan 5‒7 m çapında yapılar olarak görünür.
Tomurcuklanan maya hücrelerinin görülmesi Cryptococcus’ları lökositlerden ayırır (87). Balgam veya BOS’nın çini mürekkebi ile incelenmesi tanıda ilk aşamada kullanılabilir, ancak bu teknik C. neoformans/C. gattii tür komplekslerini ayırt etmez.
Çoğunlukla, C. neoformans yuvarlak maya hücreleri şeklinde görünürken, C. gattii hücreleri oval veya puro şeklinde görülür (50).
AIDS hastalarında organizma yükü genellikle yüksek olduğundan, BOS’nın çini mürekkebi ile incelenmesi hastaların %60–80’inde Cryptococcus ile uyumlu olarak tipik kapsüllü maya hücrelerini gösterecektir (88). Çini mürekkebi ile incelemenin avantajı, doğrulayıcı testler yapılırken (örneğin, BOS kültürü veya CrAg) Cryptococcus enfeksiyonunun çabuk bir şekilde tanınabilmesidir. Çini mürekkebi ile inceleme, mikroorganizmanın yapısal özelliklerini bilen bir mikrobiyolog tarafından yapılmalıdır.
AIDS ile ilişkili Cryptococcus menenjitinde duyarlılığı %80–85 olsa da, sonuçlar incelemeyi yapan kişiye bağımlıdır ve parçalanmış lökositler mantar elemanları (blastospor) ile karışabilir (73). Çini mürekkebi sonucundan bağımsız olarak, tanıyı doğrulamak için bir CrAg testi de yapılmalıdır. Antijen titresinin ölçümü mantar yükü ve prognozun tahminini de sağlayabilir.
Tablo 3. Kriptokokkozda tanı yöntemlerinin karşılaştırılması (73,11).
Tanı Testi Duyarlılık Özgüllük
Çini mürekkebi %86.1 %97.3
BOS Kültürü
10 L BOS %82.4 %100
100 L BOS %94.2 %100
LFA %99.3 %99.1
Lateks aglutinasyon %97 %100
EIA %98 %100
2.8.4. Mantar kültürü
Eğer uygun şartlar varsa kültür, patojen mantarların varlığını göstermek için en uygun yöntemdir. Klinik örnek olarak kan, bronkoalveolar lavaj, balgam, idrar, prostat sıvısı gibi örnekler kullanılabilir. AIDS ile ilişkili Cryptococcus menenjitinde BOS ve kan kültürlerinin duyarlılığı, sırası ile, %90 ve %50–70’tir. Mantar kültürünün duyarlılığı BOS miktarına da bağlıdır (10 L için %82, 100 L için %94). BOS örneğinden kültür, Cryptococcus menenjiti için altın standart tanı yöntemi olarak kabul edilmektedir (73).
Cryptococcus’lar, Sabouraud glikoz agar veya beyin kalp infüzyon agar gibi standart mikolojik kültür ortamları da dahil olmak üzere çeşitli besiyerlerinde, klinik örneklerin 26°C’de 3–10 günlük inkübasyonu sonucu üreyebilir. Ancak, yalnızca C. neoformans/C. gattii tür kompleksinde yer alan suşlar 37°C’de büyüyebilir. SGA gibi bir standart mikolojik besiyerinde kuru ya da mukoid, beyaz-sarı renkte koloniler oluşturur. Kolonilerin mukoid görünümüne, hücrelerin etrafındaki polisakkarit kapsülleri sebep olur (9).
Cryptococcus neoformans ve C. gattii’nin primer izolasyonu için seçici besiyerleri, son 40 yıldır klinik mikrobiyoloji alanında kullanılmaktadır. Antibakteriyel antibiyotik veya bifenil eklenmiş Guizotia abyssinica agar (Staib agar ve kuşyemli agar olarak da bilinir) kriptokokların ilk izolasyonu için uygundur (89–92). Fenoloksidaz aktivitesine bağlı kahverengi pigment oluşumu; G. abyssinica agar (Staib agar) (89,90), Helianthus annus (Pal ayçiçeği tohumu agarı) (93) veya Brassica juncea (hardal tohumlu agar) (94) gibi besiyerleri veya kafeik asit, ʟ-3-4 dihidroksifenilalanin (ʟ-DOPA) gibi kimyasallar kullanılarak hem C. neoformans hem de C.
gattii’nin (89,90,93) tanımlanmasında yaygın olarak olarak kullanılmıştır. Cryptococcus’larca kahverengi pigment üretimi, ʟ-DOPA (89–92) gibi difenolik substratların varlığına bağlıdır.
Diğer Cryptococcus türleri ve maya türleri krem/bej rengi koloniler oluşturur ve pigment
üretmez. Özellikle, diğer mantarların da bulunabildiği non-steril bölgelerden ya da çevreden alınan örneklerde bu seçici besiyerleri kullanışlıdır (9).
C. neoformans ve C. gattii izolatlarının tür veya alt tür düzeyinde tanımlanması;
farklı suşların epidemiyoloji, virülans, antifungal ilaç duyarlılığı ve hastalık seyrinin farklı olması nedeniyle önemlidir.
Cryptococcus gattii’nin C. neoformans’tan ayrımı çoğu durumda basit, ucuz ve etkili yöntemlerle sağlanabilir. Bu amaç için kanavanin-glisin bromtimol (CGB) agar kullanılabilir.
Bu agarda, C. neoformans kolonileri besiyerinin rengini değiştirmez iken C. gattii kolonileri ise besiyerindeki glisini (95,96) kullanmaları sonucunda oluşan pH değişikliğinden dolayı besiyerinin rengini sarıdan maviye çevirir. Yalancı-pozitif ve yalancı-negatif sonuçlarına karşılık, CGB agar C. gattii ve C. neoformans ayrımı için önerilir ve yaygın olarak kullanılır (9). Triptofan türevleri içeren birkaç ortam da C. gattii’nin C. neoformans’tan hızlı bir şekilde ayrılması için kullanılabilir (97).
2.8.5. Seroloji
Mikroorganizmanın polisakkarit kapsülünün bir bileşeni olan glukuronoksilomannan’ın saptanması (CrAg), kriptokokkoz tanısı için en duyarlı tanı yöntemdir (11).
Serumda ve BOS’nda CrAg’nin lateks aglütinasyon testi (CrAg-lateks) veya enzim bazlı immünolojik testler (EIA) ile saptanması 35 yıldan uzun süredir kullanılmaktadır (98). Serumda CrAg-lateks duyarlılığı %83–97, özgüllüğü %93–100 iken, BOS için CrAg-lateks duyarlılığı %93–100, özgüllüğü %93–98’dir. EIA serum için duyarlılığı ve özgüllüğü sırasıyla %94 ve %96; BOS için ise %98 ve %100’dür (73). CrAg-lateks testinde örneklere (özellikle serum) romatoid faktör varlığına bağlı yalancı-pozitif sonuçları önlemek için pronaz ile ön işlem uygulanır (99). Her ne kadar CrAg-lateks, EIA ve kültür ile karşılaştırıldığında iyi performans gösterse de, temel sınırlaması LA testinin sonucun yorumlanmasında öznelliği olan, maliyeti yüksek bir test olmasıdır. CrAg-lateks ve EIA, ayrıca, laboratuvar ekipmanı ve reaktiflerin buzdolabında saklanmasını gerektirir, bu da altyapısı olmayan veya az altyapıya sahip olan ortamlarda kullanım için uygun değildir (100). Soğutma ihtiyacı, kaynakların sınırlı olduğu ortamlarda test maliyetini önemli ölçüde artırır. CrAg-lateks ile CrAg serotip C (yani C. gattii)’ye duyarlılık azalmıştır; EIA, CrAg serotip C ve D için düşük duyarlılık gösterir. Yalancı pozitiflik oranı %1’den azdır ve genel olarak teknik
sorunlar, diğer enfeksiyonlar veya kontaminasyona bağlıdır (Trichosporon beigelii, Capnocytophaga canimorsus ve Stomatococcus mucilaginosus). Düşük mantar yükü olduğunda, prozon fenomeni varlığında, zayıf kapsüllü suşlarda ve erken enfeksiyonlarda yalancı negatif sonuçlar görülebilir (98).
CrAg LFA, bir yanal akış immüno-kromatografik testtir ve tanı için iki kritik kriteri karşılayacak şekilde tasarlanmıştır: (i) Cryptococcus serotiplerinin tamamında CrAg tespit edilebilir ve (ii) minimum altyapıya sahip veya altyapısı olmayan ortamlarda kullanılabilir (101). CrAg LFA, düşük gelirli ülkelerin ihtiyaçlarını karşılar ve Dünya Sağlık Örgütü (WHO) ’nün tanı testlerine uygun ASSURED kriterlerini karşılar (Affordable, düşük maliyetli; Sensitive, Diğer CrAg testlerine eşit veya daha iyi; Specific, diğer CrAg testlerine benzer; User-friendly, Gebelik strip testine benzer bir formatta; Rapid/robust, 10 dakikada net bir sonuç verir; Equipment-free, test elektrik veya laboratuvar altyapısı gerektirmez ve Delivered, test küçük, hafiftir, soğutma istemez ve uzun bir raf ömrüne sahiptir) (73).
LFA, iki monoklonal antikor kombinasyonu kullanır. Bir monoklonal antikor, A, B ve C serotiplerinin CrAg'si ile yüksek oranda reaktiftir; ikinci monoklonal, CrAg A ve D serotipleri ile reaktiftir. Bu antikorlar birlikte kullanıldığında, CrAg-lateks veya EIA ile karşılaştırıldığında bir avantaj olarak bütün kriptokok serotiplerine reaktiftir.
LFA, immüno-kromatografik test şeridi üzerine emdirilmiş altınla konjuge, iki monoklonal antikor kullanır. Bir örnekte kriptokok antijeni varsa, süspanse edilmiş, altınla konjuge antikorlar antijene bağlanır. Altın-antikor-CrAg kompleksi, test şeridi boyunca kapiller hareket ile göç eder, immobilize edilmiş CrAg'ye özgü monoklonal antikorlarla etkileşime girer ve kırmızı bir çizgi oluşturur. Test kitleri oda sıcaklığında yaklaşık 2 yıl saklanabilir (73).
CrAg LFA, hem kalitatif hem de yarı kantitatif bilgi verir; pozitif veya negatif sonuç ve titre. Test çizgisinin yoğunluğundan bağımsız olarak iki çizginin varlığı (test ve kontrol çizgileri) pozitif bir sonucu gösterir. Yalnızca, kontrol çizgisi varlığı negatif bir test sonucunu gösterir. Kontrol çizgisi görünmezse, sonuçlar geçersizdir ve test tekrarlanmalıdır. Yarı kantitatif sonuç için, hastanın titreleri, pozitif sonuç veren en yüksek dilüsyon olarak rapor edilir. CrAg LFA, serum ve BOS’nda kullanım için ABD Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) tarafından onaylanmıştır. Ayrıca test serum, plazma ve BOS
için Conformité Européenne (CE) işaretini almıştır. CE işareti, testin Avrupa Uygunluk Direktiflerinin temel şartlarına uygun olduğunu gösterir (73).
Tablo 4. Cryptococcus serolojik tanısında LA, LFA ve EIA testlerinin karşılaştırılması (101).
Ön işlem
Serotip
duyarlılığı Süre Maliyet
Ülkelerin gelir durumu
LFA Gerekmez A,B,C,D 10 dk Düşük Düşük,orta,yüksek
LA Pronaz ile A,B,D 10–30 dk Orta Yüksek
EIA Gerekmez A,B 35–45 dk Yüksek Yüksek
LFA kullanım alanları:
1. Subklinik kriptokokkoz için tarama ve önleyici tedavi: Güncel literatür bilgileri, HIV-pozitif, CD4 <100 hücre/L olan hastalarda saptanabilir serum Cryptococcus antijenemisinin %2–21 arasında olduğunu göstermiştir (102).
CrAg taraması ile ilgili çoğu veri CrAg-lateks testi ile elde edilmiştir. ART’den önce saptanmış pozitif serum CrAg, özellikle CrAg titresi ≥ 1:8 olduğunda Cryptococcus menenjitinin gelişimini öngörür (102). CrAg-LFA, yarı kantitatif titreleri seri dilüsyonla belirlemede CrAg-lateks’ten yaklaşık 5 kat daha duyarlıdır (11). Örneğin, CrAg-lateks ile 1:8 titrede pozitif olan bir numune genellikle, LFA ile 1:40 titrede pozitiftir. Rutin klinik kullanımda maliyet nedeniyle genellikle titrasyon yapılmaz, bu sebeple tedavi için kalitatif sonuç yeterlidir. Laboratuvarlarda, düşük (<1:160), orta (≥1:160), yüksek (≥1:1280) enfeksiyon riskini belirlemeye yardımcı olacak 1:160 ve 1:1280’de iki dilüsyon çalışılabilir. CD4 <100 hücre/L ve ART almamış erişkinlerde rutin serum veya plazma antijenemi taraması, takiben önleyici flukonazol tedavisi Cryptococcus menenjiti gelişimini azaltabilir ve sağkalımı artırabilir (73,103).
2. Cryptococcus menenjiti tanısı: Üreticilerden elde edilen veriler LFA sensitivitesi, spesifitesi, pozitif prediktif değeri ve negatif prediktif değerinin, kültürle kıyaslandığında serum, plazma, BOS ve idrar örneklerinde, sırası ile,
%99.5, %99, %98 ve %99.7 olduğunu göstermektedir.İdrar veya tam kan örneği kullanılarak kriptokokkoz tanısı, laboratuvar olmayan herhangi bir ortamda erişilebilir gerçek bir hasta-başı testidir. İdrar veya tam kan hala değerlendirilme
aşamasında olup henüz FDA onaylı değildir. İdrar ile ilgili mevcut veriler yüksek duyarlılık ve özgüllük göstermektedir (104). Tam kan, serum ve plazma LFA sonuçları arasında %100 uyum olduğunu bildiren yeni bir çalışma, CrAg LFA’nın güvenilir bir başucu tanı testi olduğunu göstermiştir (105). LFA, Cryptococcus menenjiti tanısı için önemli, basit ve çabuk bir test gibi görülmektedir.
3. CrAg LFA titreleri: Yüksek mantar yükü ve tedavi sırasında etkenin vücuttan yavaş atılması, değişen mental durumla birlikte, erken dönemde Cryptococcus ile ilişkili mortalitenin en önemli sebepleridir (106). Yüksek mantar yükü, serum veya BOS’ndaki bazal bir yüksek titre CrAg ile öngörülebilir (örn; CrAg-lateks
>1:1024). Bu çizgide, başlangıç LFA titreleri, kantitatif kültürler ile uyumludur ve hastalığın 2–10 haftalık mortalitesini gösterir (107). CrAg testleri ve çini mürekkebi, uzun süren pozitiflik olasılığı nedeniyle sonraki kriptokok menenjiti ataklarının tanısı için yararlı değildir (108). Bu sebeple, C. neoformans için pozitif bir BOS kültürü, mikolojik nüks veya tedavi başarısızlığını doğrulayan tek testtir (109).
4. CrAg LFA ve Cryptococcus gattii hastalığı: LFA’nın CrAg-lateks veya EIA’ye göre avantajı, dört Cryptococcus serotipi için CrAg’nin saptanmasına yönelik bir immünokromatografik test şeridi üzerine emdirilmiş iki monoklonal antikor kullanmasıdır (101). Bununla birlikte, C. gattii hastalığını teşhis etmek için LFA kullanımı ve deneyimi sınırlıdır, ancak C. neoformans hastalığında olduğu gibi benzer şekilde performans göstermesi muhtemeldir. Özellikle, SSS veya akciğer hastalıkları bulunan hastalarda C. gattii hastalıklarının tanısında kullanımının daha iyi değerlendirilmesi gerekmektedir (80).
Cryptococcus menenjiti tanısında (1,3)-β-D-glucan’ın yeri: (1,3)-β-D-glucan, Candida ve Aspergillus türleri başta olmak üzere birçok maya ve küf mantarının hücre duvar yapısında bulunan bir moleküldür. Fusarium, Trichosporon, Saccharomyces ve Acremonium gibi nadiren sistemik hastalık etkeni olan mantarlarda da bulunur. Denizde yaşayan ve “horseshoe crab” denilen bir canlıdan elde edilen faktör G, β-glukan ile temas ettiğinde kimyasal bir reaksiyon verir. β-glukan testi bu kimyasal etkileşim temelinde geliştirilmiştir (110).
(1,3)-β-D-glucan Zygomycetes ve Cryptococcus cinslerinde ya bulunmaz ya da saptanamayacak kadar azdır. Ancak, son kanıtlar bu tezi çürütmüştür. HIV ile enfekte Ugandalı ve Güney Afrikalı şüpheli menenjit hastalarıyla yapılan bir çalışmada, Cryptococcus menenjiti olan bireylerin BOS’nda yüksek BDG konsantrasyonu tespit edilmiştir. Bu, Cryptococcus menenjiti olan çok sayıda kişinin BOS’ndaki BDG konsantrasyonlarını sistematik olarak değerlendiren ilk çalışmadır ve 117 BOS örneğinde
%89 duyarlılık ve %85 özgüllük göstermiştir. BOS’nda yüksek BDG konsantrasyonu olanlarda (>500 pg/mL) 10 haftalık mortalite riskinin üç kat daha yüksek olduğu bulunmuştur (111).
Bu çalışmanın ve BOS’nda BDG konsantrasyonlarını ölçmenin değerini gösteren diğer çalışmaların ışığında (112,113,114) mantar menenjiti şüphesi olan kişilerin BOS’nda BDG testi çalışılabilir. BOS’nda BDG sonucu pozitif olan hastalarda özellikle bağışıklık sistemi baskılanmış olanlarda Cryptococcus menenjitinden şüphelenilmelidir.
BDG, düşük duyarlılığından dolayı ilk menenjit atağının tanısında Cryptococcus antijeni testinin yerini alamaz, ancak, Cryptococcus antijen testinin aksine BDG, enfeksiyonun temizlenmesi ile hızlı bir şekilde normale döner ve bu sebeple tedavi yanıtını izlemede veya paradoksal IRIS sendromunu Cryptococcus menenjiti relapsından ayırmada daha yararlı olabilir.
Yukarıda belirtilen çalışma (111) BOS’nda BDG kadar duyarlı veya özgül olmamasına karşılık BDG’nin Cryptococcus menenjiti olan bireylerin serumunda sıklıkla saptanabileceğini de rapor etmiştir (109 serum örneğinde %79 duyarlılık ve %61 özgüllük). Serumda BDG ölçümü Cryptococcus tanı testi olabilmesi için yeterli duyarlılığa veya özgüllüğe sahip olmamasına karşılık, pozitif sonuçlar ileri tanı testleri ile değerlendirilmeli, ciddi mantar enfeksiyonu şüphesinde pozitif BDG testi olan bir hastada bir olasılık olarak kriptokokkoz düşünülmelidir (115).
2.8.6. Moleküler teknikler
Klinik pratikte, C. neoformans ve C. gattii’nin SSS enfeksiyonları için multipleks PCR sistemleri giderek daha fazla kullanılmaktadır. Afrika'da yapılan bir çalışmada, multipleks PCR, ilk Cryptococcus enfeksiyonu atağında hastaların BOS’nda Cryptococcus’u >%90 duyarlılık ve özgüllük ile tespit etmiş ve kalıcı enfeksiyonun
