Alkali lizis yöntemi ile plazmit DNA’nın izolasyonu
•Plazmidler bakteriler ve bazı mayalarda bulunan, yaşamsal olayları kodlamamakla beraber mikroorganizmaların hayatta kalmalarına yardımcı olabilecek genleri (antibiyotik direnci, bazı
enzimler vb.) ekstrakromozomal DNA yapılarıdır.
•Plazmidler moleküler biyolojide, klonlama çalışmalarında sıklıkla kullanıldıklarından ötürü son derece önemlidirler.
• Alkali lizis metodunun temelinde ortamdaki pH değişimlerinin kromozomal ve plazmid kökenli DNA parçalarına farklı etki etmesi yatmaktadır.
• Temel anlamda bakıldığında ortam bazikleştiğinde hem kromozomal hem de plazmid DNA tek iplik halini alır. Bununla beraber ortamın pH’sı tekrar düşürülüp asitleştirildiğinde küçük olan plazmit DNA’nın iplikçikleri hızlıca birleşir fakat kromozomal DNA daha büyük olduğundan çift zincir oluşumu kolayca gerçekleşmez ve kromozomal DNA denatüre olur.
• Bu sayede kromozomal DNA ile plazmid DNA’sı birbirlerinden ayrılabilir.
• Prosedür
• Gereçler
• Gecelik bakteri kültürü (E. coli DH5α)
• Steril Ependorf tüp
• Steril mikropipet ucu
• Tüplük
• Otomatik pipet
• Mikrofüj
• a. Uygun bakteri suşunun üretilmesi
• 1. Tek bir bakteri kolonisi 2 ml uygun antibiyotik içeren LB (Luria Bertani) besiyerinde 37 °C'de gece boyu çalkalamalı etüvde üretilir.
• 2. 1.5 ml kültür bir eppendorf tüpe aktarılarak 13000 rpm de 30 sn santrifüj edilir.
• 3. Süpernatant atılır ve pelet plazmid izolasyonu için kullanılır.
• b. Alkali lizis yöntemi ile plazmid izolasyonu
1. Bakteri peleti 200 µL soğuk çözelti I ile sulandırılır, vortekslenir.
2. Üzerine 200 µl çözelti II (160 ml NaOH+ 40 ml SDS ) eklenir. Tüp alt-üst edilerek 5 kez iyice karıştırılır.
Buzda 10' bekletilir.
3. 250 µl soğuk çözelti III eklenir. Vortekslenir ve buzda 15' bekletilir.
4. 13000 rpm de 5' santrifüj edilir. Süpernatant temiz bir tüpe aktarılır.
5. Eşit hacimde fenol:kloroform eklenir, vortekslenir.
• b. Alkali lizis yöntemi ile plazmid izolasyonu
6. 2' 13000 rpm'de santrifüj edilir. Süpernatant temiz bir tüpe alınır.
7. Süpernatant üzerine iki hacim saf alkol eklenerek buz üzerinde 15' bekletilir.
8. 13000 rpm'de 5' santrifüj edilerek plazmid DNA çöktürülür.
9. Pelet üzerindeki alkol iyice kurutularak üzerine %70 lik soğuk etanol eklenerek pelet yıkanır.
10. Alkol uzaklaştırılır ve pelet 10 ml steril distile su içinde çözülür.
• Çözeltilerin hazırlanması :
• Çözelti I :
• 50 mM Glukoz
• 25 mM Tris.HCl ( pH: 8.0)
• 10 mM EDTA ( pH: 8.0 )
• Çözelti II :
• 0.2 N NaOH
• % 1 SDS
• Çözelti III :
• 5 M potasyum asetat 60 ml
• Glacial asetik asit 11.5 ml
• H2O 28.5 ml
• EDTA, hücre yapısının korunması için gerekli olan Mg+
+ iyonlarını bağlayarak hücre yapısını bozar ve DNA'nın degredasyonunu sağlayan hücre enzimlerini inhibe eder.
• SDS, lipid moleküllerini lizise uğratarak uzaklaştırır ve hücre membran yapısını bozar.
• Fenol-kloroform, poreinleri çöktürerek DNA'dan uzaklaşmasını sağlarlar.
• Saf Etanol, ortamdaki H2O molekülleri ile rekabete girerek DNA'nın çökmesini sağlar.
• % 70 Etanol, Na+ gibi tek değerlikli katyonların ve tuzların çözünerek ortamdan uzaklaşmasını sağlar.
