DEJENERATİF KIKIRDAK HASARLARINA YÖNELİK ENJEKTE EDİLEBİLİR HİDROJEL SİSTEMLERİNİN
GELİŞTİRİLMESİ VE KARAKTERİZASYONU
DEVELOPMENT AND CHARACTERIZATION OF INJECTABLE HYDROGELS FOR DEGENERATIVE CARTILAGE
EKİN ÇELİK
PROF. DR. EMİR BAKİ DENKBAŞ TEZ DANIŞMANI
Hacettepe Üniversitesi
Lisansüstü Eğitim-Öğretim ve Sınav Yönetmeliğinin Biyomühendislik Anabilim Dalı için Öngördüğü
DOKTORA TEZİ olarak hazırlanmıştır.
2018
i
ÖZET
DEJENERATİF KIKIRDAK HASARLARINA YÖNELİK ENJEKTE EDİLEBİLİR HİDROJEL SİSTEMLERİNİN GELİŞTİRİLMESİ VE KARAKTERİZASYONU
EKİN ÇELİK
Doktora, Biyomühendislik Bölümü
Tez Danışmanı: Prof. Dr. EMİR BAKİ DENKBAŞ Eylül 2018, 137 Sayfa
Kıkırdak dejenerasyonu, kıkırdağın önce yumuşamasıyla başlayan, daha sonra tamamen yok olmasıyla sonuçlanan, zamanla gelişen bir rahatsızlıktır. Travmaya bağlı olabileceği gibi, osteoartirit, romatoid artirit, obezite gibi hastalıklar sonucunda da gelişmektedir. Hastalığın tam olarak nasıl başladığı bilinmemekle birlikte, bir çok hastalıkta olduğu gibi genetik faktörlerin rol oynadığı düşünülmektedir. Dejeneratif kıkırdakta dokunun hücre-dışı matris içeriğinin büyük kısmı degrade olmakta, bu da eklem kıkırdağının elastikliğini, viskozitesini, kayganlığını ve dayanıklılığını kaybetmesine neden olmaktadır. Önerilen tez, hali hazırda ağrı kesici terapiler dışında non-invazif tedavisi olmayan kıkırdak dejenerasyonunun, kıkırdak degradasyonunu engelleyecek mikro RNAlar barındıran nanopartiküller içeren hidrojeller ile tedavisi amaçlanarak tasarlanmıştır. Tezde geliştirilen hidrojeller artiküler kıkırdak hücre-dışı matrisi taklit etmek amacıyla metakrilatlanmış kondroitin sülfat ve jelatinden, mikro RNA 149-5p taşıyan nanopartiküller ise kıkırdak dejenerasyonu tedavilerinde sıkça kullanılan hyaluronik asit ve kitosandan oluşturulmuştur. Yapılan optimizasyonlarla hidrojeller enjekte edilebilir forma kavuşturulmuş, nanopartiküller ve hidrojellerin fiziksel ve kimyasal karakterizasyonları tamamlanmıştır. Nanopartiküllerin gen transfeksiyon başarısı ve hidrojel ve nanopartiküllerin kondrosit gelişimine etkisi insan mezenkimal kök hücreleri üzerinde test edilmiş, sitotoksisite, proliferasyon, sitolojik boyamalar ve gen ekspresyon analizleriyle gösterilmiştir.
Anahtar Kelimeler: artiküler kıkırdak, kıkırdak dejenerasyonu, mikro RNA, kondroitin sülfat, ,jelatin, hyaluronik asit, kitosan
ii
ABSTRACT
DEVELOPMENT AND CHARACTERIZATION OF INJECTABLE HYDROGELS FOR DEGENERATIVE CARTILAGE
EKİN ÇELİK
PHD, Department of Bioengineering Supervisor: Prof. Dr. EMİR BAKİ DENKBAŞ
September 2018, 137 pages
Cartilage degeneration is a pathology that develops over time, beginning with the softening of the cartilaginous gland and then completely disappearing. It may be due to trauma, as well as diseases such as osteoarthritis, rheumatoid arthritis and obesity. Although it is not known exactly how the disease has begun, it is thought that genetic factors play a role likewise many diseases. In degenerative cartilage, most of the extracellular matrix content is degraded, which causes the joint cartilage to lose its elasticity, viscosity, lubrication and durability. The proposed thesis is designed for cartilage regeneration with hydrogels containing nanoparticles containing microRNAs that inhibit cartilage degradation. The hydrogels developed in the thesis were formed from methacrylated chondroitin sulphate and gelatin to mimic articular cartilage extracellular matrix and nanoparticles carrying microRNA 149-5p were formed with hyaluronic acid and chitosan, which are commonly used in cartilage degeneration treatments. With the optimizations performed, the hydrogels are formed into the injectable form and the physical and chemical characterization of the nanoparticles and hydrogels is completed. The ability of nanoparticles for gene transfection and the effect of hydrogel and nanoparticles on chondrogenesis were tested on human mesenchymal stem cells and demonstrated by cytotoxicity tests, proliferation analysis, cytological stainings and gene expression analysis.
Keywords: articular cartilage, cartilage degeneration, microRNA, chondroitin sulfate, gelatin, hyaluronic acid, chitosan
iii
TEŞEKKÜR
Doktora eğitimim süresince bilgi, birikim ve tecrübelerinden yararlandığım, her zaman beni destekleyen ve yol gösteren çok değerli hocam Prof. Dr. Emir Baki Denkbaş ve ailesine;
Çalışmalarım süresince sahip olduğu bilgi, deneyim ve imkanları benimle paylaşarak desteğini esirgemeyen, laboratuvar imkanlarını sağlayan sayın hocam Yrd. Doç. Dr. Ekim Taşkıran’a,
Tez çalışmam sırasında çok değerli yardım ve desteklerinden dolayı sayın hocam Dr. Cem Bayram’a;
Çalışma sürecinde benden desteklerini esirgemeyen sevgili çalışma arkadaşlarım Esra Elif Aydın Dede, Neval Dicle Sungur, Serhat Öztürk ve sayın hocam Doç. Dr.
Murat Demirbilek’e;
Birlikte çalışmaktan zevk aldığım çalışma arkadaşlarım, çok sevdiğim Biyopolimerik Araştırma Grubu üyelerine;
Hayatım boyunca her an yanımda olan, her alanda inanç ve sabırla bana olan desteklerini esirgemeyen canım aileme, sevgili büyükanneme ve beni bir yerlerden izlediğini hep bildiğim dedeme ve pamuk dedeme;
Sonsuz teşekkürlerimi borç bilirim..
EKİN ÇELİK
iv
İÇİNDEKİLER DİZİNİ
Sayfa
ÖZET ... i
ABSTRACT ... ii
TEŞEKKÜR ... iii
İÇİNDEKİLER DİZİNİ ... iv
ŞEKİLLER DİZİNİ ... viii
ÇİZELGELER DİZİNİ ... x
SİMGELER ve KISALTMALAR ... xi
1. GİRİŞ... 1
2. GENEL BİLGİLER ... 3
2.1. Enjekte edilebilir hidrojeller ... 3
2.1.1. Enjekte edilebilir hidrojellerde biyobozunur malzemeler ... 5
2.1.1.1. Doğal malzemeler ... 5
2.1.1.2. Sentetik malzemeler ... 7
2.1.2. Enjekte edilebilir hidrojellerin sentez mekanizmaları ... 8
2.1.2.1 Fiziksel çapraz bağlanma mekanizmaları ... 8
2.1.2.2. Kimyasal çapraz bağlanma mekanizmaları ... 10
2.1.3. Enjekte edilebilir hidrojel uygulamaları ... 12
2.1.3.1. Kıkırdak onarımı ... 12
2.1.3.2. Yumuşak doku rejenerasyonu ... 13
2.2. İlaç taşınım sistemleri ... 13
2.2.1. Polisakkaritler ... 14
2.2.2.Polisakkarit nanopartiküllerin sentez mekanizmaları ... 15
2.2.2.1. Polielektrolit komleksi (PEC) ... 15
2.2.2.2.Kendiliğinden düzenlenme ... 16
2.2.2.3. Kovalent çapraz bağlanma ... 16
2.2.2.4. İyonik çapraz bağlanma ... 17
2.2.3. Polisakkarit bazlı nanopartiküller ... 18
2.2.3.1. Kitosan bazlı nanopartiküller ... 18
v
2.2.3.2. Heparin bazlı nanopartiküller ... 19
2.2.3.3. Hyaluronik asit bazlı nanopartiküller ... 20
2.2.3.4. Aljinat bazlı nanopartiküller ... 22
2.2.3.5. Kondroitin sülfat bazlı nanopartiküller ... 23
2.3. Artiküler kıkırdak ... 24
2.3.1. Artiküler kıkırdak yapısı ve içeriği ... 24
2.3.2. Kıkırdak dejenerasyonu ... 25
2.3.3. Kıkırdak dejenerasyonu için uygulanan tedaviler ... 25
2.3.3.1. Mikrofraktür ... 25
2.3.3.2. Otolog kondrosit implantasyonu (ACI) ... 26
2.3.3.3. Doku iskelesi bazlı tedaviler ... 27
2.3.3.4. İntra-artiküler enjeksiyonlar ... 28
2.3.3.5. Platelet zengin plazma (PRP) tedavisi ... 33
2.4. Gen terapisi ... 35
2.4.1. Mikro RNA ... 41
3. DENEYSEL ÇALIŞMALAR ... 42
3.1. Kondroitin sülfat metakrilat sentezi ... 42
3.2. Jelatin metakrilat sentezi ... 42
3.3. CSMA ve GELMA hidrojellerinin sentezi ... 42
3.4. CSMA:GELMA hidrojellerinin reoloji deneyleri ... 42
3.5. CSMA:GELMA hidrojellerin şişme deneyleri ... 43
3.6. CSMA:GELMA hidrojellerinin degredasyon deneyleri ... 43
3.7. HA/CS ve ChoS (HA/CS) nanopartiküllerin sentezlenmesi ... 43
3.8. HA/CS ve ChoS (HA/CS) nanopartiküllerin stabilite deneyleri ... 44
3.9. HA/CS nanopartiküllerin mikro RNA-149-5p enkapsülasyonu ... 44
3.10. Mikro RNA’nın yüklenme etkinliğinin belirlenmesi ve salım deneyleri ... 45
3.11. Jel retardasyon deneyleri ... 45
3.12. Sitotoksisite deneyleri ... 45
3.13. Mikro RNA transfeksiyon deneyleri ... 46
3.13.1. RNA izolasyonu ... 46
vi
3.13.2. cDNA sentezi ... 47
3.13.3. Gerçek zamanlı PCR deneyleri ... 48
3.14. Sitolojik boyamalar (sGAG boyamaları) ... 49
3.15. İstatiksel analizler ... 50
4. BULGULAR VE TARTIŞMA ... 51
4.1. CSMA ve GELMA yapılarının karakterizasyonu ... 51
4.2. CSMA:GELMA hidrojellerinin karakterizasyonu ... 63
4.2.1. CSMA:GELMA hidrojellerinin fiziksel karakterizasyonu ... 64
4.2.2. CSMA:GELMA hidrojellerinin reolojik incelemeleri ... 65
4.2.3. CSMA:GELMA hidrojellerinin şişme ve degradasyon davranışlarının analizi ... 68
4.2.4. CSMA:GELMA hidrojellerinin sitotoksisite analizleri ... 71
4.3. HA/CS ve ChoS (HA/CS) nanopartiküllerinin karakterizasyonları ... 72
4.3.1. HA/CS ve ChoS (HA/CS) nanopartiküllerinin stabilite testleri ... 75
4.3.2. HA/CS ve ChoS (HA/CS) nanopartiküllerinin sitotoksisite analizleri .... 76
4.3.3. HA/CS nanopartiküllerinin mikro RNA-149-5p ile etkileştirilme analizleri………... 77
4.3.4. Mikro RNA-149-5p ile etkileştirilmiş HA/CS nanopartiküllerinin mikro RNA salım profillerinin belirlenmesi ... 78
4.3.5. ChoS (HA/CS) nanopartiküllerinin mikro RNA-149-5p ile etkileştirilme analizleri ... 79
4.3.6. Mikro RNA-149-5p ile etkileştirilmiş ChoS (HA/CS) nanopartiküllerinin mikro RNA salım profillerinin belirlenmesi ... 81
4.3.7. Mikro RNA-149-5p ile etkileştirilmiş HA/CS ve ChoS (HA/CS) nanopartiküllerinin jel retardasyon analizleri ... 82
4.4. Mikro RNA-149-5p ile etkileştirilmiş HA/CS nanopartikülleri katkılı 2:1 CSMA:GELMA hidrojellerinin karakterizasyonları ... 83
4.5. Mikro RNA-149-5p ile etkileştirilmiş ChoS (HA/CS) nanopartikülleriyle etkileştirilmiş hücrelerin gen ekspresyon analizleri ... 84
4.6. Mikro RNA-149-5p ile etkileştirilmiş ChoS (HA/CS) nanopartikülleri ile etkileştirilen hücrelerin sGAG boyamaları ... 88
4.7. Mikro RNA-149-5p ile etkileştirilmiş HA/CS nanopartikülleri ile bu partiküllerle katkılanmış 2:1 CSMA:GELMA hidrojelleriyle etkileştirilen hücrelerin gen ekspresyon analizleri ... 89
vii
4.8. Mikro RNA-149-5p ile etkileştirilmiş HA/CS nanopartikülleri ile bu partiküllerle katkılanmış 2:1 CSMA:GELMA hidrojelleriyle etkileştirilen hücrelerin sGAG
boyamaları ... 93
4.9. Mikro RNA-149-5p ile etkileştirilmiş HA/CS ve ChoS (HA/CS) nanopartikülleri ile etkileştirilmiş hücrelerin proliferasyon analizleri ... 94
5. SONUÇLAR ve ÖNERİLER ... 96
KAYNAKLAR ... 106
ÖZGEÇMİŞ ... 137
viii
ŞEKİLLER DİZİNİ
Sayfa
Şekil 2.1. RNA interferans mekanizması ... 41
Şekil 4.1. Metakrilik anhidrit ile kondroitin sülfatın metakrilatlanma mekanizması ... 51
Şekil 4.2. (a) CSMA 1, (b) CSMA 2 hidrojellerinin 1H-NMR spektrumları ... 52
Şekil 4.3. Metakrilik anhidrit ile jelatinin metakrilatlanma mekanizması ... 53
Şekil 4.4.a GELMA 1 hidrojelinin 1H-NMR spektrumu ... 54
Şekil 4.4.b GELMA 2 hidrojelinin 1H-NMR spektrumu ... 55
Şekil 4.4.c GELMA 3 hidrojelinin 1H-NMR spektrumu ... 55
Şekil 4.5. Enjekte edilebilir (a) CSMA’nın 1H-NMR grafiği (b) Grafiğin aralıkları açılmış hali ... 60
Şekil 4.6. Enjekte edilebilir GELMA formülasyonun 1H-NMR grafiği ... 63
Şekil 4.7. CSMA:GELMA enjekte edilebilir hidrojellerin masa üstü reoloji fotoğrafları ... 64
Şekil 4.8. CSMA:GELMA enjekte edilebilir hidrojellerin SEM görüntüleri ... 65
Şekil 4.9. CSMA:GELMA enjekte edilebilir hidrojellerinin frekans taramaları ... 66
Şekil 4.10. CSMA:GELMA enjekte edilebilir hidrojellerinin depolama modulüs değerleri ... 67
Şekil 4.11. 2:1 CSMA:GELMA hidrojelinin kayma gerilim analizi ... 68
Şekil 4.12. 2:1 CSMA:GELMA enjekte edilebilir hidrojelinin görüntüsü ... 68
Şekil 4.13. CSMA: GELMA hidrojellerinin şişme davranışlarının analizi ... 69
Şekil 4.14. CSMA:GELMA hidrojellerinin degradasyon davranışları ... 70
Şekil 4.15. CSMA:GELMA enjekte edilebilir hidrojelinin degradasyon deneyleri sırasında çekilmiş görüntüleri ... 71
Şekil 4.16. CSMA:GELMA hidrojellerinin sitotoksisite grafikleri ... 71
Şekil 4.17. Elde edilen nanopartiküllerin FT-IR grafiği ... 73
Şekil 4.18. HA/CS nanopartiküllerin SEM görüntüleri ... 74
Şekil 4.19. Kondroitin sülfatla etkileştirilmiş nanopartiküllerin SEM görüntüleri ... 75
Şekil 4.20. Nanopartiküllerin stabilite analizleri ... 75
ix
Şekil 4.21. Nanopartiküllerin sitotoksisite sonuçları ... 77 Şekil 4.22. Farklı N:P oranlarıyla hazırlanmış HA/CS nanopartiküllerin mikro RNA salım profilleri ... 79 Şekil 4.23. ChoS(HA/CS) nanopartiküllerin mikro RNA salım profilleri ... 81 Şekil 4.24. Jel retardasyon analizleri sonuçları ... 82 Şekil 4.25. HA/CS nanopartiküller içeren CSMA:GELMA enjekte edilebilir hidrojelinin mikro RNA salım profili ... 84 Şekil 4.26. ChoS (HA/CS) nanopartiküllerin FUT-1 ve mikro RNA-149-5p gen ekspresyon analizi sonuçları ... 86 Şekil 4.27. ChoS (HA/CS) nanopartiküllerin SOX-9 ve COMP gen ekspresyon analizi sonuçları ... 87 Şekil 4.28. ChoS (HA/CS) nanopartiküllerin AGC ve COL2A-1 gen ekspresyon analizi sonuçları ... 88 Şekil 4.29. ChoS (HA/CS) nanopartiküllerle etkileştirilmiş mezenkimal kök hücrelerin sGAG boyamaları ... 89 Şekil 4.30. mikro RNA ile etkileştirilmiş HA/CS nanopartikülleri içeren CSMA:GELMA hidrojelinin FUT-1 ve mikro RNA-149-5p gen ekspresyon analizi sonuçları ... 90 Şekil 4.31. mikro RNA ile etkileştirilmiş HA/CS nanopartikülleri içeren CSMA:GELMA hidrojelinin SOX-9 ve COMP gen ekspresyon analizi sonuçları ... 92 Şekil 4.32. mikro RNA ile etkileştirilmiş HA/CS nanopartikülleri içeren CSMA:GELMA hidrojelinin AGC ve COL2A-1 gen ekspresyon analizi sonuçları ... 93 Şekil 4.33. HA/CS nanopartiküller ve CSMA:GELMA hidrojellerle etkileştirilmiş mezenkimal kök hücrelerin sGAG boyamaları ... 94 Şekil 4.34. Mikro RNA-149-5p taşıyan HA/CS ve ChoS (HA/CS) nanopartikülleri uygulanan hücrelerin proliferasyon sonuçları ... 95
x
ÇİZELGELER DİZİNİ
Sayfa Çizelge 2.1. Doğal ve sentetik malzemelerden üretilmiş enjekte edilebilir ve biyolojik olarak parçalanabilir hidrojel sistemleri ... 4 Çizelge 2.2. Kök hücrelerin transfeksiyonu için kullanılan viral olmayan taşıyıcılar ... 37 Çizelge 3.1. Gerçek zamanlı PCR deneylerinde kullanılan primer sekansları ... 48 Çizelge 4.1. CSMA örneklerinin yer değiştirme dereceleri ve metakrilatlanma oranları ... 53 Çizelge 4.2. GELMA örneklerinin yer değiştirme dereceleri ve metakrilatlanma oranları ... 56 Çizelge 4.3. CSMA enjekte edilebilir hidrojellerinin optimizasyon sonuçları ... 56 Çizelge 4.4. GELMA enjekte edilebilir hidrojellerinin optimizasyon sonuçları .. 60 Çizelge 4.5. Farklı oranlarda karıştırılan CSMA:GELMA yapılarının hidrojel oluşturma optimizasyon sonuçları ... 64 Çizelge 4.6. Farklı oranlarda hyaluronik asit ve kitosan çözeltisi kullanılarak hazırlanan HA/CS nanopartiküllerin yük/boyut analizleri ... 72 Çizelge 4.7. Farklı miktarlarda kondroitin sülfat ile etkileştirilen HA/CS nanopartiküllerin yük/boyut analizleri... 73 Çizelge 4.8. Farklı N:P oranlarıyla hazırlanmış HA/CS nanopartiküllerin boyut/yük analizleri ... 77 Çizelge 4.9. Farklı N:P oranlarıyla hazırlanmış HA/CS nanopartiküllerin boyut/yük analizleriyle birlikte enkapsülasyon etkinlik değerleri ... 78 Çizelge 4.10. Farklı tekniklerle mikro RNA ile etkileştirilen nanopartikül yük/boyut ve etkileşim analizleri sonuçları ... 80 Çizelge 4.11. Kondroitin sülfatla etkileştirilmiş olan HA/CS nanopartiküllerin mikro RNAlar ile etkileştirildikten sonraki boyut/yük özellikleri, etkileştirme verimleri ... 81
xi
SİMGELER ve KISALTMALAR
Simgeler
Ca Kalsiyum
CaCl2 Kalsiyum klorür Cu Bakır
G α-L-gluronik asit gr Gram
miRNA Mikro RNA M Mannuronik asit Mg Magnezyum mL Mililitre mmol Milimol Mn Manganez mV Milivolt ng Nanogram nM Nanomolar nm Nanometre nmol Nanomol Pa Paskal Sr Stronsiyum ug Mikrogram ul Mikrolitre uM Mikromolar V Volt
Zn Çinko
xii
Kısaltmalar
5FU 5-flurourasil
ACA 4,4'-azobis (4-siyanamerik asit) ACI Otolog kondrosit implantasyonunun
ACTB β-aktin
AGC Agrekan
AIBN 2,2-azobisizobutironitril ALP Alkalen fosfataz
ASC Adipoz türevi kök hücre BPO Benzil peroksit
cDNA Komplementer DNA ChoS Kondroitin sülfat
ChoS (HA/CS) Kondroitin sülfatla etkileştirilmiş hyaluronik asit/kitosan CMCS Karboksimetil kitosan
COL2A1 Kolajen tip 2
CPP Hücre Penetran Peptitler
CS Kitosan
CSC Kanser kök hücresi
CSMA Metakrilatlanmış kondroitin sülfat DDS İlaç taşınım sistemleri
DLS Dinamik ışık saçılımı DNA Deoksiribo nükleik asit DOX Doksorubisin hidroklorür ECM Hücre dışı matris
EDC Karbodiimid hidroklorid EPR Retansiyon
xiii
FBS Fetal bovin serumu
FDA Amerikan Gıda ve İlaç Dairesi FGF Fibroblast büyüme faktörü (FGF)
FT-IR Fourier dönüşümlü kızılötesi spektroskopisi FUT-1 Fukozil transferaz
GAG Glikozaminoglikan GalNAc N-asetilgalaktozamin GELMA Metakrilatlanmış jelatin GFP Yeşil floresan protein GlcA Glukuronik asit
HA Hyaluronik asit
HA/CS Hyaluronik asit/kitosan
hBMMSC İnsan kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücresi hMSC İnsan mezenkimal kök hücresi
IA İntra-artiküler
IGF-1 İnsülin benzeri benzeri büyüme faktörü-1 IKDC Uluslararası Diz Dokümantasyon Komitesi KS Kortikosteroid
LMWP Düşük Moleküler Ağırlıklı Protamin MAAH Metakrilik anhidrit
MACI Matriks kaynaklı otolog kondrosit implantasyonu MBA N-metilenebisakrilamid
mRNA Mesajcı RNA
MSC Kemik iliği (mezenkimal) stromal (kök) hücreler
MTT 3-[4,5-Dimetiltiyazol-2-yl]-2,5-difeniltetrazolyum bromür nHa Nano-hidroksiapatit parçacıkları
xiv
NHS N-hidroksisülfosüksinimid NHS Ulusal Sağlık Servisi
NMR Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi
NP Nanopartikül
PAA Poliakrilamid
PAMAM Poliamidoamin
PBS Fosfat tamponlu tuz çözeltisi PCL Poli kapro lakton
PCLA Poli kapro lakton ko-laktid
PCN Polielektrolit kompleks nanopartiküller pDNA Plazmid DNA
PEC Poli elektrolit kompleksi
PEI Poli (etilen imin)
PEG Poli etilen glikol
PEGDA Poli (etilen-glikol) -diakrilat PEGDMA Poli (etilen glikol) –dimetiakrilat PEO Poli etilen oksit
PGA Poliglikolik asit PLLA Poli laktik asit
PLGA Poli (laktit-ko-glikolid) PMMA Poli (metakrilik asit) PNIPAAm Poli (N-izopropilakrilamid) PPF Poli propilen fumarat PPO Poli fenilen oksit
PRP Platelet zengin plazma PVA Poli vinil alkol
xv
RNA Ribonükleik asit SDS Sodyum dodesil sülfat
SEM Taramalı elektron mikroskopisi sGAG Sülfatlanmış glikozaminoglikan siRNA Küçük engelleyici RNA
RNAi RNA interferansı TBE Tris Borik Asit EDTA TPP Tri-poli fosfat
OA Osteoartirit
OARSI Uluslararası Osteoartrit Araştırma Derneği OPF Oligo(poli (etilen glikol) fumarat
UV Ultraviyole
VEGF Vasküler endotelyal büyüme faktörleri
1
1. GİRİŞ
Kıkırdak dejenerasyonu travma, artirit, sporla ilişkili yaralanmalar, yaşlanma gibi çeşitli sebepler sonucu gelişebilmektedir. Özellikle vaskülarizasyon, innervasyon, lenfatik ağlar ve progenitör hücrelerden yoksun olması nedeniyle hasarlı kıkırdağın kendiliğinden iyileşmesi oldukça sınırlı olduğundan, dejenerasyonun tedavisi sağlanamamakta, klinikte daha çok hastaların semptomlarının geçici olarak giderilmesi sağlanmaktadır. Bunun için klinikte en sık kullanılan yöntem, viskosuplementasyon yöntemidir, bu da hyaluronik asit (HA) enjeksiyonları ile yapılmaktadır. Genel anestezi veya cerrahi operasyon gerekmeksizin intra-artiküler olarak uygulanan bu enjeksiyonlarla, subkondral doku ve çevresindeki sürtünmenin azaltılması, kemik- kıkırdak arası kayganlığın arttırılması ve dolayısıyla hastaların ağrılarından geçici bir süreliğine de olsa kurtulması hedeflenmektedir.
Artiküler kıkırdak, yüksek miktardaki hyaluronik asit içeriği sayesinde viskozite ve kayganlık sağlamanın yanısıra esas olarak kollajenler ve proteoglikanlardan oluşan yoğun bir hücre dışı matrisine sahiptir. Dejeneratif kıkırdakta, artiküler kıkırdağın üzerinde yer alan sinoviyal sıvı viskozitesi, kıkırdaktaki su içeriği ve hyaluronik asit miktarı azalmaktadır. HA, sinovyal sıvı viskozitesini korumak, proteoglikan sentezine yardımcı olmak, inflamatuar ve ağrı yanıtlarını modüle etmek ve kıkırdak matrisini korumaktan sorumludur. Bu nedenle, HA sentezini uyararak ve bozunmasını azaltarak dizin normal viskoelastik özelliklerini geri getirme çabasıyla intra-artiküler viskosuplemasyon yöntemleri geliştirilmiştir.
Artiküler kıkırdak matrisi proteoglikanlardan, spesifik olarak da kondroitin sülfattan oluşmaktadır. Kondroitin sülfat dokuya elastikiyet sağlamakta, aynı zamanda dokunun mekanik direncinden sorumu kolajenlere yardımcı olmaktadır. Dejeneratif kıkırdakta hem kondroitin sülfat hem de hyaluronik asit içeriğinin oldukça azaldığı bilinmekte, bu da eklem kıkırdağının elastikliğini, viskozitesini ve su içeriğini ve ekstraselüler matriks bozulmasından dolayı mekanik dayanıklılığını da kaybetmesine neden olmaktadır.
Hidrojeller, üç boyutlu (3D) bir yapı sunan, hidrofilik polimerlerden oluşan ve önemli miktarda su tutan bir malzeme sınıfıdır. İyi biyo uyumlulukları, kolay üretilebilirlikleri, değişken kompozisyonları fizyolojik koşullara benzer fiziksel özellikleri nedeniyle, tek başına veya hücrelerle birleştirilen hidrojellerin birçok biyomedikal uygulaması bulunmaktadır. Özellikle enjekte edilebilir hidrojeller, yüksek kalıplanabilirlikleri,
2
minimal invazif uygulamalara yatkınlıkları ve kolay ve etkili hücre/gen/ilaç enkapsülleme yetenekleri sayesinde tıp, biyomedikal ve farmasötik gibi bir çok alanda kullanılmaktadır.
Karbon, metal, metal oksitler veya organik maddelerden oluşan nanopartiküller, daha yüksek ölçeklerdeki ilgili parçacıklara kıyasla, daha geniş bir yüzey alanı, kimyasal işlemlerde artan reaktivite veya stabilite, arttırılmış mekanik dayanıklılık gibi bir çok benzersiz fiziksel, kimyasal ve biyolojik özellik sergilemektedir. Son yıllarda nanopartiküllerin hidrojeller içerisine enkapsüle edildiği hibrid sistemlere literatürde sıkça rastlanmaktadır. Bu hibrid oluşumlar sayesinde, nanopartiküller agregasyondan kurtulmakta, hidrojeller de nanopartikül karakterine göre iyileştirilmiş fiziksel özellikler kazanmaktadır. Ayrıca olası bir tedavi modelinde taşıyıcının toksisitesi düşürülmekte veya ajan salımının kontrollü bir şekilde geciktirilmesi sağlanmaktadır.
Önerilen tezde de, enjekte edilebilir bir hidrojel-nanopartikül hibrid sistemi geliştirilmiştir. Hidrojel formülasyonu olarak metakrilatlanmış kondroitin sülfat (CSMA)- metakrilatlanmış jelatin (GELMA), nanopartikül formülasyonu olarak hyaluronik asit/kitosan (HA/CS) kullanılmıştır. Bu sisteme ek olarak kondroitin sülfatla etkileştirilmiş hyaluronik asit/kitosan (ChoS(HA/CS)) nanopartikülleri, ikinci bir nanopartikül formülasyonu olarak geliştirilmiştir. Ayrıca nanopartiküller mikro RNA 149- 5p ile etkileştirilerek hidrojel içerisinde enkapsüle edilmiştir. Sistem, kıkırdak hasarlarında tedavinin yanısıra, kıkırdak sürtünmesinin azaltılması ile hastaların ağrılarından kurtulması hedeflenerek, alternatif bir viskosuplemasyon yöntemi olarak tasarlanmıştır. Geliştirilen bu hibrid nanopartikül-hidrojel sistemi insan mezenkimal kök hücrelerle etkileştirilmiş, gen transfeksiyon başarısı ve kondrogenez varlığı kontrol edilmiştir.
Hidrojel ve nanopartiküllerin fiziksel ve kimyasal karakterizasyonları tamamlanmış, ayrıca insan mezenkimal kök hücreleri üzerinde sitotoksisite, proliferasyon, boyama testleri ve gen ekspresyon analizleri yapılmıştır.
3
2. GENEL BİLGİ 2.1. Enjekte edilebilir hidrojeller
Enjekte edilebilir hidrojeller, canlı dokuya benzer yüksek su içerikleri, homojen olarak hücreleri kapsülleme yetenekleri, etkin kütle transfer yetenekleri, kolayca manipüle edilen fiziksel özellikleri ve minimal invaziv olarak dokulara taşınabilir olmaları sebebiyle doku mühendisliği uygulamaları için umut verici malzemelerdir [1-3].
Büyüme faktörleri ve / veya hedeflenmiş hücrelerle yüklü olan hidrojeller sorunlu doku bölgesine direkt enjekte edilebileceği gibi, fiziksel veya kimyasal uyaranlara bağlı olarak enjekte edildikten sonra yerinde bir çözelti-jelasyon geçişi (sol-jel) ile jelleşen formları da bulunmaktadır [4-6]. Oldukça yüksek su tutma kapasitesine sahip hidrojeller, hücre dışı matriksin (ECM) kimyasal ve fiziksel ortamlarını çok iyi taklit edebilmektedir ve bu nedenle, hücre çoğalması ve farklılaşması için ideal hücresel mikro ortama sahiptir. En önemlisi, hücre dışı matris (ECM) ile yüksek benzerlikte bir mikroyapıya sahip olan enjekte edilebilir hidrojeller sorunlu doku ile daha iyi fiziksel entegrasyon sağlayarak, açık cerrahi tedavi prosedürlerinin önüne geçilmesi ve materyal ve/veya hücre taşınımı için minimal invaziv yaklaşımların kullanılmasını kolaylaştırma potansiyeline sahiptir [7-8].
Son on yılda, doku mühendisliği uygulamalarıda kullanılmak üzere enjekte edilebilir hidrojeller oluşturmak için çeşitli doğal ve sentetik materyaller kullanılmıştır [1,2,5].
Doğal ve sentetik malzemelerden üretilmiş enjekte edilebilir ve biyolojik olarak parçalanabilir hidrojel sistemleri Çizelge 2.1’de listelenmiştir.
4
Çizelge 2.1: Doğal ve sentetik malzemelerden üretilmiş enjekte edilebilir ve biyolojik olarak parçalanabilir hidrojel sistemleri
Hidrojeller Polimer Jelasyon mekanizması
Doğal hidrojeller
Kolajen/ Jelatin Termal/kimyasal çapraz bağlanma
Kitosan Termal/kimyasal/schiff
baz reaksiyonu/serbest radikal çapraz bağlanma Hyaluronik asit Termal/kimyasal/schiff
baz reaksiyonu çapraz bağlanma
Kondroitin sülfat Serbest radikal çapraz bağlanma
Aljinat İyonik/ Serbest radikal
çapraz bağlanma
Agar/Agaroz Termal çapraz bağlanma
Fibrin Termal çapraz bağlanma
Sentetik hidrojeller
PEG/PEO Kimyasal/ Serbest radikal
çapraz bağlanma
PVA Kimyasal/ Serbest radikal
çapraz bağlanma
PPF/OPF Serbest radikal çapraz
bağlanma
PNIPAAm Termal çapraz bağlanma
PEO-PPO-PEO PLGA-PEG-PLGA PEG-PLLA-PEG
Termal çapraz bağlanma Poli (aldehit guluronat) Kimyasal çapraz
bağlanma
Polianhidrit Serbest radikal çapraz bağlanma
Enjekte edilebilir yerinde oluşturulmuş hidrojellerin hazırlanması için termal jelasyon, iyonik etkileşim, fiziksel kendi kendine birleşme, fotopolimerizasyon ve glutaraldehit, genipin, adipik dihidrazid ve bis (sülfosüksinimidil) suberat gibi ajanlar ile kimyasal çapraz bağlanma dahil birçok yöntem kullanılmıştır [5-7]. Enjekte edilebilir hidrojeller, jelasyon mekanizmalarına göre fiziksel ve kimyasal jeller olarak ikiye ayrılmaktadır [9- 10]. Polimerik zincirler veya nanopartiküller arasındaki fiziksel bağ ile çapraz bağlanan hidrojel ağı, fiziksel jel olarak adlandırılırken, bir kimyasal jel oluşumu, polimerik zincirler arasındaki kovalent bağlar vasıtasıyla gerçekleşmektedir. Konvansiyonel hidrojel sentez yöntemleri, operasyonel karmaşıklık, sitotoksik reaktiflerin tutulumu, fonksiyonel grupların istikrarsızlığı, muhtemel yan reaksiyonlar ve düşük bağlanma
5
etkinliği ile sınırlanmaktadır. Doku mühendisliği için biyoaktif fonksiyonun tamamen korunduğu, biyolojik olarak bozunabilir hidrojellerin geniş bir sınıfına uygulanabilen, basit, spesifik ve yüksek verimli konjügasyon yöntemlerinin geliştirilmesine sürekli bir ihtiyaç bulunmaktadır.
2.1.1. Enjekte edilebilir hidrojellerde biyobozunur malzemeler
Doğal polimerlerden türetilen hidrojeller, vücut sıvıları veya ortamı ile temas ettiğinde genellikle hızlı bozunuma uğramaktadır. Doğal hidrojellerin bu sınırlamaları, polimerleri değiştirmek için çeşitli sentetik polimerler kullanmak üzerine kurulmuş yaklaşımları doğurmuştur.
2.1.1.1.Doğal malzemeler
Doğal olarak türetilen hidrojel oluşturabilen polimerler, doğal doku ECM'sinde bulunan veya benzer makromoleküllere sahip olduklarından, doku mühendisliği uygulamalarında sıklıkla kullanılmaktadır [11-12]. Doğal olarak türetilen polimerler arasında bulunan kolajen, jelatin, kitosan, hyaluronik asit, kondroitin sülfat, agaroz, aljinat ve fibrin doku mühendisliği yaklaşımlarında en sık kullanılan malzemelerin başında gelmektedir.
Doğal ECM'nin ana bileşeni ve memeli dokularında bulunan en bol protein olduğundan, kolajen, biyomedikal uygulamalar için dikkat çekici bir materyaldir [13-15]. Kolajenin temel yapısı, üç zincirli ip yapısı oluşturmak için birbirlerine sarılmış üç polipeptit zincirinden oluşmaktadır [5,14]. Kolajen doğal olarak metaloproteazlar, özellikle kolajenaz ve serin proteazlar tarafından bozunmaktadır [16-17]. Jelatin, kolajenin doğal tripleheliks yapısının hidrolizi ile tek sarmallı moleküllere bölünmesiyle oluşan kısmi bir türevidir [18]. Jelatin, öncülüne (kolajen) kıyasla daha az immünojeniktir ve RGD sekansı gibi bilgi sinyallerini tutarak hücre yapışması, göç, farklılaşma ve çoğalmayı teşvik etmektedir [19]. Kolajen ve jelatin hidrojelleri gerek çıplak halde, gerekse çeşitli kimyasal çapraz bağlayıcıların (glutaraldehit, genipin ve karbodiimid) varlığında mekanik özellikleri arttırılmış şekilde, doku mühendisliği çalışmalarında sıklıkla kullanılmaktadır.
Kitosan, kısmen deasetillenmiş bir kitin türevi olan doğrusal bir polisakkarittir. Bu polikatyonik polisakkarit, glukozamin ve N-asetilglukozamin moleküllerini içerdiğinden, doğal glikozaminoglikanlara (GAG) yapısal olarak yüksek derecede benzerlik göstermektedir [20-22]. Kitosan yüksek biyouyumluluk ve biyolojik bozunabilirliği,
6
düşük immünojenisitesi ve katyonik niteliği nedeniyle son yıllarda çeşitli doku mühendisliği uygulamaları için araştırılmıştır [22-25]. Bununla birlikte, modifiye edilmemiş kitosan, kuvvetli moleküllerarası hidrojen bağları nedeniyle asitli çözeltilerde çözülebilmektedir; bu da, enjekte edilebilir bir hidrojel olarak kullanımını sınırlamaktadır. Kitosan türevleri, glutaraldehid ile çapraz bağlanma, UV ışınlaması ve termal varyasyonlar yoluyla jelleştirilebilmektedir. Son yıllarda kitosan, biyouyumluluk özelliklerinin arttırılarak ısıya duyarlı kitosan hidrojeller oluşturmak için poli (N- izopropilakrilamid) (PNIPAAm) ve N-izobütiril grupları ile, ultraviyole (UV) çapraz bağlanabilir kitosan hidrojeller elde etmek için vanilin veya hidroksibenzaldehidler ile graftlanmıştır [21-26 ].
Hyaluronik asit (HA), insan ve diğer hayvanlardaki tüm bağ dokularının ECM'sinde geniş çapta dağılmış halde bulunan, doğal olarak oluşan sülfatlanmamış bir glikozaminoglikandır [27-28]. Hyaluronik asit, doku hidrasyonu, besin difüzyonu, proteoglikan organizasyonu ve hücre farklılaşması gibi birçok biyolojik işlemde önemli rol oynamaktadır. HA, özellikle yara iyileşmesi sırasında ve eklemlerin sinovyal sıvısında bulunmaktadır. Hyaluronik asit, N-asetil-D-glukozamin ve D-glukuronik asidin birden fazla yinelenen disakkarit biriminden oluşan bir gikozaminoglikandır. Hyaluronik asit hücrelerde ve serumda bulunan hyaluronidaz enzimi tarafından parçalanır [29].
HA ve türevleri, iyi biyouyumluluk, biyolojik bozunabilirlik ve mükemmel jel oluşturma özellikleri nedeniyle doku mühendisliğinde kullanılmak üzere hidrojeller olarak geniş çapta araştırılmıştır [30-31]. Hyaluronik asit hidrojelleri, hidrazid türevleri ile kovalent çapraz bağlanma ve esterifikasyon gibi yöntemlerle oluşturulabilmektedir [30-35]. Ek olarak, hyaluronik asidin kompozit hidrojeller oluşturmak için hem kollajen hem de aljinat ile kombine edildiği çalışmalar mevcuttur [33-35].
Aljinat özellikle kahverengi yosun ve bakterilerden türetilen (1-4) -bağlı β-D- mannuronik asit (M) ve α-L-gluronik asit (G) monomerlerinden oluşan bir hidrofilik ve doğrusal polisakkarittir [1-2 , 36-38]. Ca2+, Mg2+, Ba2+ veya Sr2+ gibi iki değerlikli katyonlar iyonik köprüler oluşturmak için G monomer bloklarıyla birlikte etkileşime girdiğinde basit jelleşme oluşabilmektedir [5,39-41]. Aljinat nazik koşullar altında jel oluşturma yeteneği, düşük toksisitesi ve kolaylıkla bulunabilmesi nedeniyle hücre kapsüllemesi, doku mühendisliği ve ilaç taşınımı dahil olmak üzere bir çok tıbbi uygulamada kullanılmıştır [42-46]. Avantajlı özelliklerine rağmen, aljinat tam olarak degrade edilememektedir. İyonik olarak çapraz bağlanmış aljinat hidrojeller, iki
7
değerlikli iyonların çevre ortam içerisine kaybolmasını içeren bir iyon değiştirme işlemi vasıtasıyla degrade olur ve kontrolsüz bir şekilde çözünmektedir. Aljinat, doku mühendisliği uygulamalarında, özellikle hücreyle etkileşimini arttırmak üzere, lektin ve RGD ile konjuge edilerek kullanılmaktadır [1,5,44-45].
2.1.1.2.Sentetik malzemeler
Sentetik polimerler, kimyasal ve fiziksel özelliklerinin doğal polimerlere göre daha iyi kontrol edilebilir ve tekrarlanabilir olmaları sebebiyle hidrojel çalışmaları için sıklıkla kullanılan materyallerdir. Sentetik polimerler, belirli blok yapıları, molekül ağırlıkları ve parçalanabilir bağlarla tekrar üretilebilir şekilde geliştirilebilmektedir. Doğal hidrojellerle karşılaştırıldığında, sentetik hidrojeller, ECM kimyasal bileşimi ve mimarisinin kontrolünü daha iyi sağlamakla birlikte, daha düşük biyolojik aktiviteye sahip olma eğilimindedir. Doku mühendisliği uygulamaları için ideal hidrojel yaratmaya yönelik bir yaklaşımla, hücresel biyo-aktivitenin arttrılması için sentetik hidrojellere biyoaktif elementlerin eklendiği çalışmaalar bulunmaktadır [47]. Enjekte edilebilir hidrojeller geliştirmek için en çok kullanılan sentetik polimerler, poli etilen glikol (PEG), poli vinil alkol (PVA), poli propilen fumarat (PPF), PNIPAAm, pluronik F-127 ve polipeptitler olarak öne çıkmaktadır.
Poli etilen glikol (PEG) birçok tıbbi uygulama için FDA tarafından onaylanmıştır. Her ne kadar birçok sentetik polimer kimyasal çapraz bağlanma yoluyla biyouyumlu, biyolojik olarak parçalanabilir hidrojeller oluştursa da, PEG en yaygın olarak araştırılan sistemlerden biri olmaya devam etmektedir [47-50]. Biyolojik olarak parçalanabilir PEG hidrojelleri, poli laktik asit, poli glikolik asit ve poli propilen fumarat gibi parçalanabilir polimerler ile kopolimerizasyon yoluyla elde edilebilmektedir [51-53]. Bunun yanı sıra, hyaluronik asit, fibrinojen, kitosan ve heparin gibi doğal olarak oluşan birçok biyopolimer de genel olarak biyolojik olarak parçalanabilir PEG hidrojelleri ile birlikte analiz edilmektedir [54-58]. PEG hidrojelleri, hücre iskeleleri, yapışkan tıbbi uygulamalar taşıyıcı araçlar olarak kullanılmış ve umut vaadeden sonuçlar alınmıştır [59-62]. Özellikle, çapraz bağlanma yoğunluğunu kontrol etme kabiliyeti PEG bazlı hidrojellere hücre etkileşimi ve doku büyümesi için esneklik ve uyarlanabilirlik sağlar.
PEG ve kimyasal olarak benzer poli etilen oksit (PEO), iki ucu akrilatlar veya metakrilatlar ile modifiye edilerek foto çapraz bağlanabilen hidrofilik polimerlerdir.
8
PVA ve PPF de, doku mühendisliği uygulamalarında kullanılan enjekte edilebilir hidrojel için araştırılan sentetik hidrofilik polimerlerdir. PVA, çeşitli malzemelerle türevlendirilebilen asılı hidroksi gruplarının bolluğu sayesinde çok fonksiyonlu makromerlere dönüştürülebilmektedir [5]. Fiziksel ve kimyasal olarak hidrojel oluşturmak üzere çapraz bağlanabilmekte ve diğer suda çözünen polimerler ile harmanlanabilmektedir [2,63-64]. PVA hidrojelleri, tekrarlanan donma/çözme yöntemleriyle fiziksel olarak çapraz bağlanarak veya glutaraldehit veya epiklorohidrin ile kimyasal olarak çapraz bağlanarak oluşturulmaktadır [1,5]. PPF, ester bağlantısının hidroliziyle bozunmaya uğrayan lineer bir poliesterdir. PPF, hidrofilik PEG ile bir blok kopolimer olarak sentezlendiğinde UV yardımıyla veya kimyasal olarak çapraz bağlanarak hidrojel oluşturabilmektedir [1-2].
2.1.2. Enjekte edilebilir hidrojellerin sentez mekanizmaları
Enjekte edilebilir hidrojellerin hazırlanması için birçok yöntem kullanılmıştır. Bu jelleşme yöntemlerinden biri olan termal çapraz bağlanma, fotopolimerizasyon tekniğinde bulunan enjeksiyon derinliği sınırlaması olmadığından nispeten daha kolay gerçekleşmektedir. Kolajen ve fibrin yapıştırıcısı gibi doğal hidrojellerin çoğu, jelin son yapısı ve özelliklerini sınırlayan fiziksel ve iyonik çapraz bağlanma mekanizmaları ile oluşmaktadır, ve bu mekanizmalar kontrol edilememektedir. Bunun aksine, kovalent bağlarla çapraz bağlanan hidrojeller kontrol edilebilir çapraz bağlanma yoğunluğu ve yapı özellikleri gibi birçok avantaj sunmaktadır.
Özellikle, çapraz bağlanma yoğunluğunu kontrol etme yetenekleri hücre bağlanması, doku büyümesi ve iyileşmesi için çeşitli polimerik ağ formlarının tasarlanabilmesine imkan sağlamaktadır.
2.1.2.1. Fiziksel çapraz bağlanma mekanizmaları
Sıcaklık, pH gibi dış uyaranlara yanıt olarak faz geçişi yapabilen biyolojik olarak bozunabilir hidrojeller, biyomedikal uygulamalar için enjekte edilebilir hidrojellerin hazırlanması için kullanılan yöntemlerden biridir.
2000 yılında, bir poliol karşı-iyonik dibaz tuzu olan β-gliserol fosfat disodyum eklenmesiyle pH nötr bir kitosan çözeltisi geliştirilmiştir. Chenite ve arkadaşları, kitosan solüsyonunun, β-gliserol fosfat disodyum formunda in situ jelleşme sistemleri ile nötrleştirildiğini, ve bu jelin oda sıcaklıklarında uzun süre boyunca sıvı halde kaldığını, ancak sıcaklık 37°C'ye yükseltildiğinde makro gözenekli bir jele dönüştüğünü
9
göstermiştir [65]. Kitosanın sulu çözeltiler içinde çözünürlüğü asidik ortamlarda amin gruplarının protonlanmasıyla elde edilmektedir. Kitosan ve β-gliserol fosfat disodyumun kombinasyonu, hidrojen bağlama, elektrostatik etkileşimler ve hidrofobik etkileşimler de dahil olmak üzere jel oluşumuna elverişli birçok etkileşimden yararlanmaktadır [65]. Bu bağlar, bir çok uygulama için uzun zamandır önemli bir sınırlama olan kitosan çözeltilerinin pH instabilitesini aşmak için yeterlidir. Böylece malzeme enjekte edilebilir forma kavuşmakta ve mümkün olan en az cerrahi müdahale ile in situ bir iskele oluşturabilmektedir [66-67]. Bir fare modelinde kondrositlerle yüklü bu hidrojelin enjeksiyonu ve ekiminin, in vivo olarak proteoglikan açısından zengin bir matris oluşturduğu gösterilmiştir. Bu sistemlerin vücut içinde ve depolama koşullarına bağlı olarak laboratuvar ortamında fiziksel özelliklerini koruduğu ve bir kaç saatten bir kaç güne kadar içerlerine hapsedilen biyomoleküllerin salımlarının devam ettiği gösterilmiştir [67-68].
Termosensitif polimerlerden biri olan PNIPAAm, yaklaşık 32 ° C'lik bir bobin-globül faz geçişine maruz kalan bir polimerdir [69-75]. Hidrojellerin termo duyarlılığı, PNIPAAm'nin biyo-bozunur polimerlerin omurgasına dahil edilmesiyle sağlanabilmektedir. Son yıllarda, PEG, kitosan, jelatin, hyaluronik asit ve PNIPAAm kopolimerlerini içeren çeşitli ısıya duyarlı ve enjekte edilebilir hidrojeller çeşitli ortamlarda geliştirilmiş ve kullanılmıştır [71-84]. PNIPAAm'yi biyo-bozunabilir polimerler ile birleştirmek için kullanılan etkili yöntemlerden biri 2,2-azobisizobutironitril (AIBN), 4,4'-azobis (4-siyanamerik asit) (ACA), benzil peroksit (BPO) ve amonyum persülfat kullanılarak serbest radikal polimerizasyonu ile kopolimerizasyondur [76–79].
Bu prosedür, daha sonra biyomakromoleküler veya peptit sekanslarına bağlanan bir karboksil- veya amino-uçlu NIPAAm kopolimerinin sentezini içermektedir.
Triblok kopolimerleri, birçok araştırmacı tarafından, enjekte edilebilir hidrojel sistemlerinde termojelleşebilen bir polimer olarak geniş çapta araştırılmıştır. PEO- PPO-PEO (Pluronik), PLGA-PEG-PLGA, PEG-PLLA-PEG, PCL-PEG-PCL, PCLA- PEG-PCLA ve PEG-PCL-PEG gibi blok kopolimerler, sıcaklık artışı ile su içerisinde sol-jel geçişleri sergileyen tipik ısıya duyarlı biyo-bozunabilir polimerlerdir [85-88].
Amfifilik blok polimer zincirleri ilk olarak düşük sıcaklıklarda misellere ve köprülü misellere birleşmekte, ve sıcaklığın artmasıyla sıralı forma geçerek makroskobik jel oluşturmaktadır [85-86]. Bu termojelleşebilen kopolimer hidrojelleri, biyouyumlulukları
10
ve in vivo jel formunda uzun süre kalıcılıkları nedeniyle hücre terapisi, doku rejenerasyonu ve yara iyileşmesinde başarıyla uygulanmıştır.
Geleneksel hidrojellere ek olarak, pH, sıcaklık, iyon dengesi ve strese karşı akıllı yanıt ile kendiliğinden birleşen peptit hidrojeller de, doğal ECM'ye yapısal benzerlikleri ve kıkırdak ve yumuşak doku rejenerasyonundaki yüksek biyoaktiviteleri açısından doku mühendisliği çalışmalarında ön plana çıkmaktadır [89-90]. Bazı hidrojellerin, kendiliğinden birleşmiş α-sarmal yapıların arasındaki etkileşimle çapraz bağlanabildikleri, bazılarının da DNA dizileri ve moleküller gibi nanofibröz yapıları oluşturmak için kendi kendine birleşebildikleri bilinmektedir [91].
2.1.2.2. Kimyasal çapraz bağlanma mekanizmaları Serbest radikal polimerizasyonu ile oluşturulan hidrojeller:
Fotopolimerizasyon, fizyolojik pH ve sıcaklıkta çapraz bağlanmış ağların in situ oluşumunu sağlayan bir süreçtir [92-93]. Hafif jelasyon koşulları, hücrelerin foto çapraz bağlanmış hidrojellerde canlı halde enkapsüle edilmesine olanak tanımakla birlikte, biyoaktif ajanların da kolaylıkla yüklenmesine izin vermektedir [94-97]. Ayrıca, fotopolimerleştirilmiş hidrojel sistemleri jelleşme prosesi üzerinde zaman ve konum olarak daha iyi kontrol sağlayabilir, doğal olarak enjekte edilebilir formda elde edilebilir ve herhangi bir ekstremitedeki veya vücuttaki kusurları doldurmak için in situ polimerize olabilir.
Pek çok araştırmacı PEG-bazlı makromoleküler monomerlerin foto-modifiye edilmiş polimerizasyonunu, doku rejenerasyonu için hücre taşıyıcı araçlar olarak hidrojeller oluşturmak için kullanmakla ilgilenmektedir [96-99]. Poli (etilen-glikol) -diakrilat (PEGDA) ve poli (etilen glikol) -dimetiakrilat (PEGDMA), doymamış C = C çift bağ grupları ile modifiye edilmiş PEG'lerdir ve bunları UV'ye maruziyet için fotopolimerleştirilebilir hidrojel adayları haline getirmektedir. Önceki çalışmalar, PEGDA ve PEGDMA'nın kondrositleri ve kemik iliği stromal hücrelerini (MSC) foto- kapsüle etmek için kullanılabileceğini göstermiştir [98-101]. PEGDA ve PEGDMA solüsyonundaki hücre süspansiyonları vücuda enjekte edilebilir ve bir doku iskelesi olarak işlev gören çapraz bağlı bir PEG jeli oluşturmak üzere UV'ye maruz bırakılarak polimerize edilebilmektedir. Ayrıca, PEG'nin PVA gibi diğer sentetik makromerler ile kopolimerizasyonu, özellikle doku mühendisliği perspektifinden önemli olan işlevsellik ve özelliklerin ek kontrolünü sağlamaktadır. PEG, aljinat, kitosan, hyaluronik asit ve
11
kondroitin sülfatın yanı sıra, metakrilatlanmış ve fotopolimerizasyon ve diğer serbest radikal polimerizasyonları ile hidrojeller hazırlanmıştır [98-104].
Doku mühendisliği uygulamalarında kullanılmak üzere foto-çapraz bağlanabilir poli (propilen fumarat) (PPF) ve oligo (poli (etilen glikol) fumarat) (OPF) hidrojelleri yaygın olarak çalışılmıştır [105-111]. PPF ve OPF hidrojellerinin mekanik özellikleri ve bozunma oranları, her ikisi de biyo-bozunabilir özelliğe sahip oldukları için makromer oluşumunda kontrol edilebilmektedir. PPF ve OPF hidrojellerinin minimum veya ihmal edilebilir sitotoksisite taşıdıkları ve histo-uyumlu oldukları gösterilmiştir.
Micheal tipi ekleme reaksiyonu ile geliştirilen hidrojeller:
Enjekte edilebilir hidrojellerin jelleşmesi için Michael-tipi konjugat ekleme reaksiyonu kullanılabilmektedir. Örneğin peptitler üzerindeki tiol ve vinilsülfon ya da hyaluronik asit gibi polimerik makromoleküller konjuge olarak doku mühendisliği için hidrojel olarak kullanılmak üzere sentetik hücre dışı matrisler oluşturabilmektedir [112-113]. Düşük molekül ağırlıklı vinilsulfonların glutatyon ve DNA ile etkileşerek toksisite gösterdikleri bilindiğinden, toksisitelerini önlemek için suda çözünür biyo-makromoleküllerin omurgalarına bağlanarak kullanılmaktadır [114]. Örneğin, tiyol ile modifiye edilmiş hyalüronik asit temelli in situ çapraz bağlanabilir hidrojeller, in vitro ve in vivo doku mühendisliği için birçok tasarım kriterine uymaktadır [114-117]. Hücrelerin hidrojelin polimerizasyon reaksiyonundan etkilenmediği ve kovalent olarak bağlanmış jelatin veya RGD peptitleri içeren hyaluronik asit hidrojellerinde canlılıklarını koruyabildiği gösterilmiştir. Ek olarak, metakrilat HA-bazlı hidrojellere de michael-tipi konjugat ekleme reaksiyonu uygulanmıştır, ancak metakril grubunun nispeten düşük reaktivitesi nedeniyle hidrojel oluşumu için daha uzun bir jelleşme süresi gerektiği gözlenmiştir.
Hidrojelin jelleşmesini hızlandırmak için tiyol ile modifiye edilmiş HA ve PEGDA arasında konjugat ekleme çapraz bağlanma reaksiyonu oluşturularak alternatif bir enjekte edilebilir hidrojel sistemi geliştirilmiştir [115-116]. Micheal tipi ekleme reaksiyonu ile geliştirilen hidrojellerin yanı sıra, literatürde genipinle çapraz bağlanmış hidrojeller hakkında da bir çok çalışma bulunmaktadır, özellikle PEG ile konjugasyonun doku mühendisliği uygulamaları için umut vaadeden enjekte edilebilir hidrojeller oluşturduğu gösterilmiştir [117-127].
12
Schiff bazı reaksiyonu ile çapraz bağlanmış hidrojeller:
Doku mühendisliği uygulamaları için kullanılmak üzere biyobozunur, enjekte edilebilir ve in-situ biyouyumlu hidrojeller geliştirilmesinin bir başka yolu da schiff bazı reaksiyon mekanizmalarıdır [128-134]. Polisakkarit hidrojeller, herhangi bir kimyasal çapraz bağlama maddesi kullanılmadan, ilk olarak suda çözünebilen kitosan ve oksitlenmiş hyaluronik asit jelinden türetilmiştir [128]. Jelleşme, suda çözünebilen N-Süksinil- kitosan ve oksitlenmiş hyaluronik asit aldehit gruplarının amino grupları arasındaki Schiff-baz reaksiyonuyla gerçekleştirilmiştir. Bu polisakkarid hidrojel, doku rejenerasyonu için biyo-uyumluluk ve biyo-degradasyon özelliklerinin yanı sıra biyomimetik bir mikro ortam oluşturmaktadır. Dekstran, arap zamkı ve kondroitin sülfat gibi başka birçok polisakkarit, kısmen oksitlenebilir ve Schiff-baz bağı için kullanılabilmektedir [134].
2.1.3. Enjekte edilebilir hidrojel uygulamaları
Enjekte edilebilir biyo-bozunur hidrojeller özellikle kemik-kıkırdak hasarları olmak üzere kıkırdak rejenereasyonu, kemik dolgusu veya ameliyat sonrası doku rejenerasyonu gibi bir çok biyomedikal uygulamada kullanılmaktadır. Hidrojelin fiziksel özellikleri, uygulandığı alandaki doğal doku ile eşleşen mekanik özelliklerine kolayca uyacak şekilde tasarlanabilir olmalıdır. Bu hidrojeller ayrıca ilaç taşıyıcı sistemler olarak da çalışılmış, bu da uygulama alanlarını oldukça genişletmiştir [135-139].
Hidrojellerin bu uygulamalar için klinik öncesi ve klinik çalışmaları aşağıda açıklanmaktadır.
2.1.3.1.Kıkırdak onarımı
Doku mühendisliği yardımıyla oluşturulmuş kıkırdak benzeri yapılar büyük bir klinik öneme sahiptir. Eklem kıkırdağının travmatik ve dejeneratif lezyonları, klinik disabilitilerin önde gelen nedenlerindendir [140]. Dünya Sağlık Örgütü verilerine göre 2050 yılında dünya nüfusunun %20’sinden fazlasının osteoartiritli olacağı öngörülmektedir [141]. Bu sebeple kıkırdak iyileşmesi ve rejenerasyonu için enjekte edilebilir hidrojellerin kullanımı yüksek klinik etkiye sahiptir. Kıkırdak onarımı için enjekte edilebilir tedavilerin avantajı, implantın sadece kusur içinde muhafaza edilmesi, neredeyse anında elde edilen ve etkili olan iyileştirici özelliği ve kolay uygulanabilir olmalarıdır. Ek olarak, enjekte edilebilir tedavilerin genel bir avantajı, açık cerrahiyle karşılaştırıldığında minimal invaziv cerrahinin kullanılmasıdır. Bu nedenle enjekte edilebilir hidrojeller kıkırdak rejenarasyonu alanındaki bir çok çalışmaya konu olmuştur.
13 2.1.3.2. Yumuşak doku rejenerasyonu
Yumuşak doku rekonstrüksiyonu rekonstrüktif cerrahide önemli bir sorundur. Yumuşak doku yokluğu, örneğin adipoz doku eksikliği, travmatik sebepler veya onkolojik cerrahi sonucu oluşabilmektedir [142,143]. Bu sorun şuan klinikte otolog yağ dokusunun transplantasyonu ile çözülmektedir. Ancak, adipoz doku transplantasyonun klinik sonuçları vaskülerizasyon eksikliğine bağlı olarak değişken greft rezorpsiyonu olduğu için öngörülebilir değildir, bu da önemli bir risk taşımaktadır [144]. Yumuşak dokunun tamir edilmesi için arzu edilen bir strateji, in situdaki adipogenezin indüklenmesidir.
Bunun için geliştirilen bir yöntemde adipoz doku oluşturmak için farklılaşabilen hücrelerin bir iskele içine yerleştirilerek adipoz doku oluşumu ile sonuçlanması hedeflenmiştir. Başka bir strateji ise enjektabl sistemlerle doku oluşumunun hızlandırılmasıdır. Bu şekilde, hem sentetik hem de doğal biyomateryallere dayanan birçok enjekte edilebilir hidrojel incelenmiştir. Örneğin, Hemmerich ve diğ. enfekte olmamış adipoz türevi kök hücreler (ASC'ler) ile karıştırılmış enjekte edilebilir hyaluronik asit bazlı jel kullanılarak küçük kusurların rekonstrüksiyonunu bildirmiştir.
ASC'ler ve iskele olarak hyaluronik asit kullanılarak yeterli yağ dokusu oluşumu gözlenmiştir [145,146].
Diğer enjekte edilebilir iskele matrisleri arasında biyolojik olarak parçalanabilir polimerik mikroküreler bulunmaktadır. Örneğin, Yüksel ve ark. PLGA'dan insülin benzeri büyüme faktörü-1 (IGF-1) ve insülinin salınımını sağlayan mikroküreler ile de novo adipoz doku formasyonunu arttırmıştır [147]. PLGA mikrokürelere ek olarak, enjektabl sistemler olarak hücre dışı matris (ECM) parçacıklarının kullanımı da adipoz doku mühendisliği sistemleri için incelenmiş, jelatin benzeri mikroküreler ile adipoz türevi kök hücrelerin (ASC'ler) proliferasyonu ve farklılaştığı rapor edilmiştir [139,148, 149].
2.2. İlaç taşınım sistemleri
İlaç taşınım sistemleri (DDS), polimer bilimi, biyokonjugat kimyası, farmasötikler ve moleküler biyolojiyi birleştiren disiplinlerarası yaklaşımlara dayanmaktadır [150].
DDS'nin temel amacı, farmakokinetiklerin, farmakodinamiğin, immünojenik olmayan, non-spesifik toksisitenin ve hedef alanın biyo-tanınmasının kontrol altına alınmasına dayanan farmasötik ajanları, istenen farmakolojik etkiyi elde etmek için sistemik dolaşımda taşımaktır [151,152]. DDS'nin geleneksel sistemlere göre başlıca avantajları, farmasötik ajanları belirli bir bölgeye daha seçici bir şekilde vermek, fazla
14
veya az dozlamayı ortadan kaldırmak (istenilen seviyedeki ilaç seviyelerini korumak), hasta uyumunu artırmak, ilgi hücresi içinde daha tutarlı emilim sağlamak ve yan etkileri önlemek olarak sıralanmaktadır [153].
Çapı 10 ile 1000 nm arasında değişen boyutlarda olan nanoparçacıklar (NP'ler), büyük yüzey alanı, yüksek adsoblama ve taşıma kabiliyetleri gibi benzersiz bir özellikleri sebebiyle, ilaç taşınım sistemlerinde yüksek potansiyele sahiptir [154-156]. Nispeten geniş (fonksiyonel) yüzey alanının bir sonucu olarak NP'ler, kovalent veya kovalent olmayan etkileşimler yoluyla yüksek miktarda ilaç kapsülleyebilmekte veya sabitleyebilmektedir [157,158]. Bu nedenle, biyo-uyumlu ve biyolojik olarak çözünebilen polimerlerden oluşan NP'ler ilaç taşınım sistemlerinde kullanılabilmektedir [159]. Polimerik nanotaşıyıcılar doğal proteinlerden (albümin, kollajen, jelatin, vb.) veya sentetik polimerlerden (poliakrilamid (PAA), polilaktik asit (PLA), poliglikolik asit (PGA), poli ( laktit-ko-glikolid) (PLGA), dendrimerler, vs.) sentezlenebilmektedir [160-168].
Günümüzde, biyo-uyumluluk ve biyo-bozunabilirlik gibi fizikokimyasal özelliklerine ek olarak benzersiz çok fonksiyonlu gruplarından dolayı polisakkarit tabanlı nanopartiküller taşınım araçları olarak sıklıkla çalışılmaktadır [156,169,170].
Polisakkarit omurganın çok fonksiyonlu grupları, çeşitli NP'leri sentezlemek için kolay kimyasal modifikasyonlara elverişlidir [171,172]. Bunun yanısıra bazı polisakkaritler, belirli hücre tiplerine spesifiktir, bu da taşıyıcı olarak tasarlanan polisakkaritin hedeflediği hücreyi bularak reseptör aracılı endositoz yoluyla hücreye girmesini mümkün kılmaktadır.
2.2.1. Polisakkaritler
Polisakkaritler, tekrar eden çoklu monosakkaritlerin glikozidik bağlarla oluşturduğu büyük polimerik oligosakkaritlerden oluşan bir karbonhidrat grubudur. Doğada polisakkaritler, bitki (pektin, selüloz, nişasta), hayvan (kitosan, kitin, glikozaminoglikan), mikrobiyal ( dekstran, pullulan, ksantan sakızı, gellan sakızı) ve alg (ör., agar, aljinat ve karagenan) kökenli bulunabilmektedir [173,174]. Monosakkarit birimlerinin bileşimine bağlı olarak, polisakkarit homopolimerler (aynı monosakkarit tekrarlarından oluşan glikojen, nişasta, selüloz, pullulan, pektin vb.) veya heteropolimerler ( farklı monosakkarit birimlerinden oluşturulan kitosan, heparin, hiyalüronik asit, kondroitin sülfat, keratan sülfat, heparan sülfat ve dermatan sülfat vb.) olarak sınıflandırılabilmektedirler [175-177]. Polisakkaritler, kolay ulaşılabilir ve modifiye edilebilir, biyo-bozunur ve biyo-uyumlu malzemelerdir. Bunların yanısıra,
15
toksik karakter göstermemeleri ve biyoaktivitelerinin yüksek olması polisakkaritleri biyomühendislik alanlarında gelecek vaat eden biyomalzemeler haline getirmiştir [178- 180]. Ek olarak, polisakkaritlerin reaktif fonksiyonel gruplarının (hidroksil, amino ve karboksilik gibi) sayısı çok fazladır, bu da yapısal ve fonksiyonel bir çok değişikliğe olanak sağlamaktadır [181,182].
Polisakkaritlerin modifikasyonları nükleofiller olarak şeker hidroksil grubu kullanılarak ester ve eter oluşumu, primer alkollerin aldehit ve karboksilik asitlere kimyasal oksidasyonu, primer alkollerin üronik aside enzimsel oksidasyonu, EDC / NHS gibi bağlayıcı ajanlar kullanarak sakkaritlerin karboksil grubu ve heteroatomik nükleofiller arasında amid bağı oluşumu, kitosan benzeri polisakkaridlerin amin gruplarının nükleofilik reaksiyonları gibi metotlarla gerçekleştirilebilmektedir [183]. Biyo-bozunur ve toksik olmayan son ürünler oluşturduklarından, polisakkaritler ve türevlerinin ilaç taşınım sistemi olarak nanopartikül, hidrojel, nanojel vb. potansiyel uygulamaları için çok sayıda çalışma yapılmıştır [184].
2.2.2. Polisakkarit nanopartiküllerin sentez mekanizmaları
Nanopartiküller, polisakkaritlerin yapısal özelliklerine bağlı olarak, polielektrolit kompleksleme, kendi kendine birleşme (self-assembly) , kovalent çapraz bağlama ve iyonik çapraz bağlanma metotları ile sentezlenmektedir [185,186].
2.2.2.1. Polielektrolit kompleksi (PEC)
Polielektrolit kompleksleri (PEC'ler) en az iki zıt yüklü grup arasında kurulan güçlü elektrostatik etkileşimler ile oluşturulmaktadır [187,188]. PEC oluşumu için özellikle çevreleyen çözeltideki iyonların serbest bırakılmasıyla gelişen entropi artışı gereklidir [189]. Kitosan, aljinat, heparin, hyaluronik asit, dekstran sülfat, kondroitin sülfat ve siklodekstrinler gibi katyonik ve anyonik polisakkaritler, moleküller arası elektrostatik etkileşimlerle zıt yüklü polimerler ile PEC oluşturabilmektedir [190,191]. PEC'nin oluşumu ve stabilitesi esas olarak polielektrolitin yapısına, polielektrolitin moleküler ağırlığına, polielektrolitin yüzey yük yoğunluğuna, etkileşimin süresine, polielektrolit kompleksin karışım oranına, çözücünün pH, sıcaklık, iyonik güç vb. özellikleri gibi çevresel faktörlere bağlıdır [192,193]. Boddohi ve diğ. çalışmalarında kitosan-heparin ve kitosan-hyaluronan polikatyon-polianyon çiftleri için farklı yük karıştırma oranlarında polielektrolit kompleks nanopartiküllerin (PCN'ler) oluşumunu göstermiştir [194].
Çalışmada PCN'nin oluşumu için kullanılan polimerazyon ve polianyon çözeltilerinin
16
tek adımlı eklenmesinin, polisakkarit çiftlerinden hem katyonik hem de anyonik nanoparçacıkların oluşumuna olanak tanıdığı rapor edilmiştir.
PEC bazlı nanoparçacıkların avantajları maliyet etkinlikleri, basit uygulabilir olmaları ve elektrostatik etkileşimlerin uygun koşullar altında tersinir hale getirilebilmesiyle in situ oluşumu mümkün kılmalarıdır [195].
2.2.2.2. Kendiliğinden düzenlenme
Kendiliğinden düzenlenme, doğada sıklıkla görülen yaygın bir süreçtir ve çok çeşitli karmaşık biyolojik yapıların oluşumunu tetiklemektedir [196]. Kendi kendine birleşme sistemlerinde, her bir bileşen (atomlar, moleküller, kolloidler ve polimerler), yüksek sıralı yapılar oluşturacak şekilde önceden tanımlanmış yollarla kendiliğinden organize olmaktadır [197]. Hidrofilik polisakkarit zincirleri (örneğin, heparin, kitosan, dekstran, nişasta ve pullulan) hidrofobik segmentler eklendiğinde amfifilik kopolimerler üretilmektedir [198]. Amfifilik polisakkaritler, sulu ortamda hidrofobik kısımları arasında molekül içi veya moleküller arası etkileşimler kurarak nanopartiküller oluşturma eğilimindedirler [199]. Bu polisakkarit türevli nanoparçacıklar, yüksek mekanik güç, çekirdek-kabuk yapılı küçük parçacık boyutu ve kopolimerlerin hidrofilik / hidrofobik bileşenlerine bağlı olarak yüksek termodinamik stabilite gibi benzersiz özellikler sergilemektedir [200]. Hidrofobik gruplarla türevlendirilen polisakkaritler, hidrofilik dış kabukla çevrelenmiş çekirdek grupları nedeniyle hidrofobik ilaç enkapsülasyonu için ümit vadeden taşıyıcılar olarak kabul edilmektedir [201]. Ayrıca, hidrofilik DDS'ler normal dokular tarafından daha az emildiği ve gelişmiş geçirgenlik ve retansiyon (EPR) etkisi ile tümör dokularında birikebildiği için ilaçların toksisitesinin azaltılmasına yardımcı olmaktadır [198]. Ayrıca, F. Alhaique ve diğ. tarafından çeşitli hidrofobikleştirme stratejileri kullanılarak kendiliğinden düzenlenme ile elde edilen pullulan bazlı nanohidrojeller rapor edilmiştir [202].
2.2.2.3. Kovalent çapraz bağlanma
Polisakkarit nanopartikülleri sentezlemenin diğer yolu, polisakkarit zincirleri arasındaki kovalent bağların dahil edilmesini içeren kovalent çapraz bağlanma mekanizmasıdır [203]. Kovalent çapraz bağlama stratejileri temel olarak radikal polimerizasyonları, Schiff-baz reaksiyonu, tiyol-disülfid değişim reaksiyonu ve fotoreaksiyonları içermektedir [204]. Ek olarak, glutaraldehit gibi farklı türde bir çapraz bağlayıcı, sıklıkla polisakkarit (örneğin kitosan) bazlı NP'leri çapraz bağlamak için kullanılmıştır [205, 206]. Kovalent çapraz bağlanan NP'lerin sentezi, daha stabil NP'lerin oluşmasını
17
sağlamaktadır, ancak genellikle aktif bileşenle olası istenmeyen yan reaksiyonlar nedeniyle engellenmektedir. Ayrıca bu çapraz bağlayıcıların toksisitesi de kullanımını sınırlandırmaktadır [207]. Bununla birlikte, son zamanlarda biyo-uyumlu çapraz bağlayıcıların farklı formları tanımlanmış ve kovalent çapraz bağlanma yoluyla polisakarit bazlı NP'lerin hazırlanması için kullanılmıştır [208]. Karbodiimid, di- ve trikarboksilik asit (malik asit, tartarik asit, süksinik asit ve trikarboksilik asit gibi) gibi suda çözünebilir yoğunlaştırma ajanları biyo-bozunabilir polisakkarit NP'lerin moleküller arası çapraz bağlanmaları için kullanılmıştır [209]. Kovalent çapraz bağlama yöntemi, düşük pH ve nötr koşullarda, hafif alkali sulu ortamda stabil olan polianyonlar, polikatyonlar ve poliampolit NP'lerin oluşturulmasına olanak sağlamaktadır. Genel olarak kovalent olarak çapraz bağlanmış polisakkarit bazlı NP'ler, çözücü buharlaştırma, emülsiyon çapraz bağlama, sprey kurutma veya termal çapraz bağlama dahil olmak üzere sayısız yöntemle sentezlenebilmektedir [210-212].
Kimyasal çapraz bağlama yoluyla kovalent bağlar yoluyla oluşturulan nanomalzemelerin birincil önemi, in vivo ortamlardaki kolloidal stabilitesidir, bu da jel ağının ayrışması ile tetiklenen ilaç salımı için çok önemlidir [213,214]. J. Berger ve diğ.
kovalent ve iyonik olarak çapraz bağlanmış kitosan bazlı hidrojellerin biyomedikal önemini ayrıntılı olarak raporlamışlardır [191].
2.2.2.4. İyonik çapraz bağlanma
Kovalent çapraz bağlayıcılar (glutaraldehit ve formaldehit gibi) ile karşılaştırıldığında, iyonik çapraz bağlayıcılar ( magnezyum sülfat, sodyum sülfat ve sodyum tripolifosfat (TPP) gibi), hafif hazırlanma koşulları ve basit deneysel prosedürleri nedeniyle daha avantajlıdır [187, 215]. İyonik çapraz bağlayıcılar, polielektrolit polisakkaritleri (hem katyonlar hem de anyonlar) karşı iyonları ile iyonik etkileşim yoluyla jel oluşturma eğilimindedir [216]. Listelenenlere ek olarak, düşük molekül ağırlıklı polianyonlar ve polikatyonlar, polikatyonik ve polianyonik polisakkaritler için iyonik çapraz bağlayıcılar olarak hareket edebilmektedir [217]. İyonik çapraz bağlanma yoluyla NP'lerin sentezini etkileyebilen faktörler, polisakkaritin türü ve molekül ağırlığı, çözücünün iyonik gücü ve pH'ı, polisakkarit konsantrasyonu ve iyonik çapraz bağlayıcının polisakkaritlere oranı sıralanmaktadır [218-220]. İyonik çapraz bağlayıcı yoluyla sentezlenen NP'ler, bağlanma kuvvetindeki farklılıklardan dolayı olabilecek kovalent olarak çapraz bağlanmış NP'lerden daha az dayanıklı olarak kabul edilmektedir [185,191].
18 2.2.3. Polisakkarit bazlı nanopartiküller
Polisakkarit bazlı nanopartiküller, küçük moleküler ağırlıklı ilaçlardan, proteinler, peptidler ve nükleik asitler gibi büyük biyomoleküllere kadar bir çok farmasotik ajanın kontrollü olarak salımı için çalışılmıştır [221]. İlacın fizyokimyasal özelliklerine bağlı olarak enkapsülasyonu için bir çok yöntem geliştirilmiştir ancak en sık kullanılanları aşağıda belirtilmiştir [222,223]:
1. Çapraz bağlayıcı varlığında ilacın nanopartikül solüsyonuna doğrudan eklenmektedir (bu yöntem ilaçların enkapsülasyonu için kullanılmaktadır). Alternatif olarak, farmasötik ajanların çapraz bağlama işleminden sonra solüsyona eklenmektedir.
2. İlacın polimer matrikse kovalent bağlanmaktadır.
Aşağıda en sık çalışılan polisakkarit nanotaşıyıcılar özetlenmiştir.
2.2.3.1. Kitosan bazlı nanopartiküller
Kitosan, p-1,4'e bağlı glukozamin (2-amino-2-deoksi-β-Dglukoz) ve küçük miktarlarda N-asetil glukozamin içeren bir deasetillenmiş kitin (poli-N-asetil glukozamin) türevidir [224]. Kitosan, selülozdan sonra en sık bulunan ikinci polisakkarittir ve reaktif fonksiyonel grupları, biyouyumluluğu, biyo-bozunabilirliği, jel oluşturucu özelliği, toksisite göstermemesi nedeniyle farmasötik uygulamalar için kullanılmaktadır [225].
Kitosan, hidrojen bağlanmasını sağlayan çok fonksiyonlu (polihidroksil ve amino) gruplara sahiptir ve lineer molekül, yeterli bir zincir esnekliği ifade etmektedir [226].
Ayrıca, kitosanın katyonik polielektrolit doğası negatif yüklü mukoza yüzeyi ile güçlü bir elektrostatik etkileşim sağlayarak, hücresel alımı ve hedefe yönelik ilaç salımını arttırmaktadır [227,228]. Kitosan bazlı nanopartikülleri sentezlemek için, iyonik çapraz bağlayıcı (örneğin tripolifosfat (TPP)) veya kimyasal çapraz bağlayıcı (örn., Glutaraldehid) gerekmektedir [229]. TPP, pozitif yüklü amino grupları olan kitosanla iyonik etkileşim kurabilen, anyonik ve toksik olmayan bir iyonik çapraz bağlayıcıdır [185]. TPP-çapraz bağlı kitosan nanopartiküller ilk kez 1997 yılında Alonso ve arkadaşları tarafından sentezlenmiş ve bildirilmiştir [230]. Halihazırda birtakım kitosan ve kitosan kökenli nanopartiküller farklı protokoller ile sentezlenmiş ve ilaç taşıyıcı sistemler olarak kullanılmıştır.
C. Feng ve diğ., kitosan ve karboksimetil kitosandan (CMCS) oluşan doksorubisin hidroklorür (DOX) yüklü muko-yapışkan nanopartiküllerin (DOX: CS / CMCS NP'ler)
![Synthesis and Characterization of Poly[2-(diethylamino ethyl methacrylate)] Hydrogels](https://data09.123doks.com/thumbv2/9libnet/000/429/429388/cover.webp)
