Proteom, protein sentezi, proteinlerin yapıları

(1)

Proteom, protein sentezi, proteinlerin yapıları

OMÜ I Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü Dr. Ali Osman ADIGÜZEL

(2)

Translasyon (Protein sentezi)

• Genetik bilginin protein molekülü şeklinde ifadesidir.

• Üç bileşeni vardır: mRNA, tRNA ve ribozomlar

(3)

Ribozomlar

(4)

tRNA’lar

tRNA sadece 75-90 nükleotit içerir ve yapıları bakteri ve ökaryotlarda neredeyse özdeştir. Ancak birkaç

nükleotitin trna ya özgün olduğu bilinmektedir.

DNA’daki bazların modifiye halleri

bulunmaktadır.

(5)

Her bir amino asit için özgül bir aminoaçil-tRNA sentetaz enzimi vardır.

(6)

mRNA’da kodonlar şeklinde yazılmış genetik şifre amino asit dizisine çevrilir.

(7)

mRNA’nın Translasyonu Üç Basamakta İncelenebilinir

Başlama Uzama Sonlanma

(8)

Başlama

Üç başlama faktörü önce küçük alt birime bağlanır.

mRNA’nın başlama kodonu AUG nin önünde bulunan özel bir dizi (Shine Dalgarno) 16S rrna nın bir bölgesi ile baz eşleşmesi yaparak translasyonun başlamasını

kolaylaştırır.

(9)

Başlama faktörlerinden IF2, mRNA ve yüklü tRNA ile etkileşerek, onları P bölgesinde kararlı halde tutar

IF1, öncelikli olarak bir tRNA'nın A bölgesine bağlanmasını bloke ederken ve IF3 ise küçük alt-birimin büyük alt-birimle birleşmesini inhine etmekle görevli

(10)

IF3'ün ayrılmasıyla meydana gelen kümeleşme, 70S'lik başlama kompleksini oluşturmak üzere büyük ribozomal alt-birimle birleşir.

Başlama kompleksi artık mRNA üzerindeki ikinci kodona karşılık gelen yüklü tRNA'nın A bölgesine girmesi için

hazırdır

(11)

Uzama

Bir sonraki adım ise P bölgesinde bulunan terminal amino asitin (bu durumda metiyonin), A bölgesinde bulunan tRNA'nın taşıdığı amino asit ile bağlanarak bir peptid bağı oluşturmasıdır. Büyümekte olan polipeptit zincirinin bir amino asit eklenerek uzatılmasına ise uzama adı verilmektedir. Bundan hemen önce, P bölgesini işgal eden tRNA ile bunun taşıdığı kökdeş amino asit arasındaki

kovalent bağ hidrolize edilir (kırılır). Yenice oluşan dipeptit ise hala A bölgesini işgal etmekte olan tRNA'nın ucuna bağlı olarak bulunur bu katalitik aktivite,

ribozomun büyük alt-biriminde bulunan 23S rRNA'nın fonksiyonudur (ribozim)

(12)

P bölgesinde bulunan tRNA, ribozomun üçüncü bölgesi olan

E bölgesine (E: exit) hareket eder. Bu süreç translokasyon

olarak adlandırılır.

(13)

Uzama ve translokasyon olayları defalarca tekrarlanır.

(14)

Sonlanma

Protein sentezinin sonlanma sinyalini muhtemel üç adet üçlü kodonlardan herhangi birisinin A bölgesinde

belirmesi oluşturur: UAG, UAA ya da UGA. Bu kodonlar ne bir amino asiti belirlerler ne de A bölgesine bir tRNA çağırırlar. Bu kodonlara dur kodonları, sonlanma kodonları ya da anlamsız kodonlar denir.

Dur kodonu, GTP-bağımlı salınma faktörlerine harekete geçme sinyalini verir ve polipeptit zinciri ve tRNA arasındaki bağı kırarak polipeptit

zincirinin translasyon kompleksinden ayrılmasını sağlar

(15)

(16)

Uzama süreci devam ederken ve bir mRNA’nın ilk kısmı ribozomu henüz geçmişken, ribozomu geçen bu kısım başka bir küçük ribozom alt-birimine bağlanarak ikinci bir başlama kompleksi oluşturabilir. Bu işlem, tek mRNA ile defalarca tekrarlanabilir ve sonuçta poliribozomlar veya kısaca polizomlar olarak adlandırılan yapılar meydamna gelir.

(17)

(18)

Proteinlerin Katlanması

Şaperon, proteinlerin katlanarak üç boyutlu hâle gelmesi işleminde yer alan refakatçi proteinlerdir. Aynı zamanda proteinlerin ribozomca

sentezlenmesinden sonra zamanı gelmeden katlanmalarını engeller ve yanlış katlanmış proteinleri düzelterek, onarılması mümkün olmayan proteinleri parçalar.

(19)

Translasyon sonucu ribozomdan salınan polipeptit

katlanarak, fonksiyonel üç-boyutlu yapısını kazandığında ise

protein olarak adlandırılır.

(20)

Protein yapısı

Proteinler için dört yapı düzeyi tanımlanmıştır: birincil (primer), ikincil (sekonder), üçüncül (tersiyer) ve dördüncül (kuaterner). Polipeptitin doğrusal iskeletini oluşturan amino asit dizini, onun birincil yapısıdır. Bu dizilim, mRNA aracılığı ile DNA’daki deoksiribonükleotitlerin dizini tarafından belirlenir. Bir polipeptitin birincil yapısı, bir protein oluşurken daha yüksek derecedeki organizasyonun özgül karakteristiklerinin belirlenmesine yardımcı olur.

(21)

Bir molekül H

₂

O'nun salındığı bir dehidrasyon (kondensasyon)

reaksiyonu ile bir amino asitin amino grubunun, diğer bir amino

asitin karboksil grubu ile reaksiyona girdiğini göstermiştir. Bu

reaksiyon sonunda, peptit bağı olarak adlandırılan kovalent bağ

meydana gelir

(22)

Amino asit dizilimlerinin yönü vardır

(23)

(24)

İkincil yapı

oksijen ve azot atomları, aralarında hidrojen bağları kurulur.

Böylece amino asitlerin oluşturduğu bir spiral zincir olan  sarmal ( heliks) tabaka meydana gelir

-pileli-tabaka (-pleated-sheet) bir polipeptit zinciri kendi üstüne tekrar katlanır ya da birkaç zincir yan yana paralel veya antiparalel şekilde uzanırlar

(25)

Üçüncül yapıda amino asitlerin kimyasal özellikleri devreye girmektedir

daha fazla hidrojen bağı, kovalent bağ, hidrofobik etkileşim ya da sülfidril köprüleri gibi diğer atomik etkileşimler kurulması ile meydana gelir.

(26)

Sistein amino asitleri ve sülfidril grupları aynı ya da farklı

polipeptidlerde olabilir.

(27)

Protein çalışmalarında disülfit bağlarının yıkımı için genellikle β-

merkaptoetanol kullanılmaktadır.

(28)

3 boyutlu yapıda amino asitlerin gruplanması

(sarı hidrofobik, mavi yüklü)

(29)

Normal Konumlanışın Aksine H. Zarında Hidrofobikler Farklı

(Yüzeyde) Konumlanır

(30)

(31)

(32)

• Serin, aspartat ve asparagin α-sarmal yapısını yıkma eğilimindedir.

• Glisin bütün yapılara kolayca uyum sağlayabilmektedir.

Bunlar gibi amino asitlerin bilinen yapısal yönelimleri bir proteinin

birincil dizisinden yola çıkarak o proteinin 3 boyutlu yapı analizleri

yapmamızı olanaklı kılar

(33)

(34)

(35)

Asetil gruplarının eklenmesi  proteinlerin bozunmaya karşı direncini arttırır.

Proline hidroksil gruplarının ilavesi  Yeni sentezlenen kollojen ipliklerini kararlı hale getirir.

Karbonhidrat ilavesi  proteinleri daha hidrofilik yapar ve diğer proteinlerle etkileşimlerini arttırır.

Amino grubu ya da bir yağ asidi ilavesi  hidrofobikik kazandırır.

Fosfat grubunun ilavesi  fosforillenme, aktivite sağlama

(36)

Proteinlerin moleküler ağırlıklarıdalton olarak

ifade edilir.

(37)

Proteinlerin rolü

• Biyokimyasal kataliz

• Yapı

• Hareket

• Taşıma

• Hücresel süreçlerin düzenlenmesi

• Depolama

OMÜ I Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü

(38)

Proteom

• Hücrenin belirli bir andaki protein repartuvarıdır ve genomun işlevsel ifadesidir.

• Bu proteinler transkriptomu oluşturan mRNA’dan translasyonla

sentezlenirler

(39)

(40)

Amonyum sülfat ileçökeltme

Diyaliz

(41)

(42)

(43)

(44)

(45)

(46)

(47)

(48)

(49)

(50)

(51)

•İlgilenilen proteinin amino asit dizisi önemli bir benzerliğin

olup olmadığını belirlemek için dizilimi bilinen ptotein türleri ile karşılaştırılabilir.

•Amino asit dizilim karşılaştırması ile proteinlerin evrimsel değişim mekanizması aydınlatılabilir.

•Bir çok proteinin gideceği yerin neresi olduğunun belirlenmesi

•İlgilenilen proteine özgü antikorların hazırlanması

•Proteini şifreleyen genlere özgü DNA probları hazırlamak

(52)

Edman parçalanması ile peptit diziliminin belirlenmesi

İlk aşamada peptidin amino asit bileşimi belirlenir. Bu amaçla protein 6

M HCl içinde 110 C’de 24 saat ısıtılarak hidroliz edilir.

(53)

(54)

(55)

(56)

(57)

(58)

(59)

(60)

(61)

(62)

(63)

MALDİ (Matris yardımlı lazer desorbsiyon İyonlaşma): Proteinler özgül dalga boylarındaki ışığı absorblayabilen aromatik , uçucu bir bileşik varlığında buharlaştırılır. Gaz fazındaki ilave çarpışmalar moleküller arası yük aktarımına neden olarak analiti iyonlaştırır.

TOF (Uçuş zamanlı kütle analizatörü): Kütlesi düşük iyonlar dedektöre daha hızlı ulaşır

ESI: Protein çözeltisi elektriksel olarak elektriksel olarak yüklü bir püskürtücü uca doğru sürüklenir. Analit damlaları artık yüklüdür ve uçtan çıkarak düşük basınçlı bir alana girer ve burada buharlaşır.

(64)

(65)

(66)

(67)

(68)

(69)

(70)

(71)