T.C.
ERCİYES ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
Veteriner Zootekni Anabilim Dalı
TÜRKİYE’DE YETİŞTİRİLEN BAZI KEÇİ IRKLARINDA
MELATONİN RESEPTÖR 1A (MTRN1A) GEN POLİMORFİZMİNİN PCR- RFLP YÖNTEMİ İLE BELİRLENMESİ
Hazırlayan Hakan EREN
Danışman
Doç. Dr. Bilal AKYÜZ
Yüksek Lisans Tezi
Ağustos 2016
KAYSERİ
T.C.
ERCİYES ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
Veteriner Zootekni Anabilim Dalı
TÜRKİYE’DE YETİŞTİRİLEN BAZI KEÇİ IRKLARINDA MELATONİN RESEPTÖR 1A (MTRN1A) GEN
POLİMORFİZMİNİN PCR-RFLP YÖNTEMİ İLE BELİRLENMESİ
Hazırlayan Hakan EREN
Danışman
Doç. Dr. Bilal AKYÜZ
Yüksek Lisans Tezi
Bu Tez Erciyes Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından TSY-2014-5432 kodlu proje ile desteklenmiştir.
Ağustos 2016
KAYSERİ
ii
BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK
Bu çalışmadaki tüm bilgilerin, akademik ve etik kurallara uygun bir şekilde elde edildiğini beyan ederim. Aynı zamanda bu kural ve davranışların gerektirdiği gibi, bu çalışmanın özünde olmayan tüm materyal ve sonuçları tam olarak aktardığımı ve referans gösterdiğimi belirtirim.
Adı-Soyadı : Hakan EREN
İmza :
iii
YÖNERGEYE UYGUNLUK ONAYI
“Türkiye’de Yetiştirilen Bazı Keçi Irklarında Melatonin Reseptör 1A (MTRN1A) Gen Polimorfizminin PCR-RFLP Yöntemi ile Belirlenmesi” adlı Yüksek Lisans Tezi, Erciyes Üniversitesi Lisansüstü Tez Önerisi ve Tez Yazma Yönergesi’ne uygun olarak hazırlanmıştır.
Tezi Hazırlayan Danışman
Hakan EREN Doç. Dr. Bilal AKYÜZ
Anabilim Dalı Başkanı Prof. Dr. Kaan M. İŞCAN
iv
v
TEŞEKKÜR
Bu tez projesinin hazırlanması, yapılması ve yazılması aşamalarında bana yardımlarını esirgemeyen ve vermiş olduğu desteğinden dolayı tez danışmanım Erciyes Üniversitesi Veteriner Fakültesi Öğretim Üyesi Doç. Dr. Bilal AKYÜZ’e teşekkür ederim.
Ayrıca tez projemizi maddi olarak destekleyen Erciyes Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi’ne (BAP) ve Birim Personeline, araştırma materyalini temin etmeme yardımcı olan keçi yetiştiricilerine ve tez çalışmamın laboratuar aşamasında yardımcı olan Araş. Gör. Esma Gamze İLGAR’a, çalışmalarım süresince birçok fedakârlıklar gösterip yaşamımın her döneminde bana destek olan aileme en derin duygularla teşekkür ederim.
Hakan EREN Kayseri, Ağustos 2016
vi
TÜRKİYE’DE YETİŞTİRİLEN BAZI KEÇİ IRKLARINDA MELATONİN RESEPTÖR 1A (MTRN1A) GEN POLİMORFİZMİNİN PCR-RFLP YÖNTEMİ
İLE BELİRLENMESİ
Hakan EREN
Erciyes Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü Veteriner Zootekni Anabilim Dalı Yüksek Lisans Tezi, Ağustos 2016 Danışman: Doç. Dr. Bilal AKYÜZ
ÖZET
Bu çalışmada, Türkiye’de yetiştirilen yerli keçi ırklarından Kıl keçileri ve Halep keçilerinde melatonin reseptör 1A (MTRN1A) geninin allel yapısının PCR-RFLP yöntemi ile belirlenmesi amaçlanmıştır. Araştırmanın materyalini, Türkiye yerli keçi ırklarından 110 baş Kıl keçisi ve 55 baş Halep keçisi olmak üzere toplam 165 baş keçi oluşturmuştur. MTRN1A allellerinin belirlenmesi amacıyla yapılan PCR işlemi sonunda 824 bç’lik PCR ürünleri elde edilmiştir. Elde edilen PCR ürünleri RsaI endonükleaz enzimi ile kesilmişken, MnlI enzimi ile kesilmemiştir. RsaI enzim kesim işlemi sonunda, R ve r olarak adlandırılan iki allel ile iki genotip (RR ve Rr) gözlenmiştir. RR genotipinin hem Kıl keçilerinde (%94,55) hem de Halep keçilerinde (%96,36) en yaygın genotip olduğu belirlenmiştir. İncelenen örneklerde rr genotipli bireylere rastlanılmamıştır. Çalışma sonunda Kıl keçilerinde ve Halep keçilerinde R allel frekansı sırasıyla yaklaşık olarak 0,973 ve 0,982; r allelinin frekansı ise sırasıyla 0,027 ve 0,018 olarak hesaplanmıştır. İncelenen Kıl keçileri ve Halep keçilerinin MTRN1A lokusu yönünden Hardy-Weinberg dengesinde (HWE) oldukları belirlenmiştir.
Anahtar Kelimeler: Halep keçisi; Kıl keçisi; Melatonin reseptör 1A; RFLP.
vii
DETECTION OF MELATONIN RECEPTOR 1A (MTRN1A) GENE
POLYMORPHISM USING PCR-RFLP METHOD IN SOME GOAT BREEDS IN TURKEY
Hakan EREN
Erciyes University, Graduate School of Healthy Sciences Department of Veterinary Animal Science
M.Sc. Thesis, August 2016 Supervisor: Assoc. Prof. Bilal AKYÜZ
ABSTRACT
The purpose of this study was to examine the allele structures of melatonin receptor 1A (MTRN1A) gene PCR-RFLP method in Hair goat and Damascus goat breeds. The animal material of the study was a total of 165 head Turkish native goats, which were consisted of Hair goat (n= 110) and Damascus goat (n= 55). An 824 bp fragment was obtained at the end of PCR. The obtained PCR products were digested by RsaI and MnlI endonuclease enzymes to determine the MTRN1A alleles. RsaI endonuclease enzyme was digested the PCR products, while MnlI enzyme wasn’t digested. In the study, two types of alleles (R and r) and two types of genotypes (RR and Rr) for MTRN1A gene were observed. The RR genotype was identified as the most common genotype of the Hair (94.55%) and Damascus (96.36%) goat breeds. It was not shown the rr genotypes both of Hair goat and Damascus goat breeds. At the end of the study the frequency of the allele R was found highest both of Hair goats (0.973) and Damascus goats (0.982);
the frequency of the allele r was calculated as 0.027 and 0.018, respectively in Hair goats and Damascus goats. Both of Hair and Damascus goat breeds were in Hardy–
Weinberg equilibrium for the MTRN1A gene.
viii
Key Words: Damascus goat; Hair goat; Melatonin receptor 1A; RFLP.
İÇİNDEKİLER
TÜRKİYE’DE YETİŞTİRİLEN BAZI KEÇİ IRKLARINDA MELATONİN RESEPTÖR 1A (MTRN1A) GEN
POLİMORFİZMİNİN PCR-RFLP YÖNTEMİ İLE BELİRLENMESİ
Sayfa
İÇ KAPAK………... i
BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK ONAYI SAYFASI..……… ii
YÖNERGEYE UYGUNLUK ONAYI SAYFASI…...………... iii
KABUL VE ONAY SAYFASI………... iv
TEŞEKKÜR………... v
ÖZET……….. vi
ABSTRACT………... vii
İÇİNDEKİLER………... viii
KISALTMALAR……… x
TABLO VE ŞEKİL LİSTESİ…….……… xii
1. GİRİŞ ve AMAÇ……… 1
2. GENEL BİLGİLER……… 3
3. GEREÇ VE YÖNTEM………... 15
3.1. Örneklerin Seçimi……….. 15
3.2. Kan Örneklerinin Alınması.……….. 15
3.3.Fenol: Kloroform: İzomil Alkol Yöntemiyle DNA İzolasyonu………. 16
3.3.1. DNA İzolasyonu Aşamasında Kullanılan Tampon Solüsyonlar………... 17
3.4. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)………... 18
3.5. Genotipleme İçin Elektroforez İşlemi………... 19
3.5.1. Agoroz Jel Hazırlanması………...………... 19
3.5.2. Örneklerin Kuyucuklara Yüklenmesi………... 20
3.6. Bantların Gözlenmesi ve Fotoğraf Çekilmesi………... 20
ix
3.7. PCR Ürünlerinin MnlI ve RsaI Endonükleaz Enzimleriyle Kesimi…... 21
4. BULGULAR……….. 22
5. TARTIŞMA VE SONUÇ………... 26
6. KAYNAKLAR………... 35
EKLER………... 40
ÖZGEÇMİŞ……… 41
x
KISALTMALAR
AFLP : Çoğaltılmış Parça Uzunluk Polimorfizmi
β-LG : Beta-Laktoglobülin
bç : Baz Çifti
oC : Santigrat Derece
cm : Santimetre
DGAT1 : Diacylglycerol Acyltransferase1
ddH2O : Bi Distile Su
dNTP : Deoksinükleotid Trifosfat EDTA : Etilendiamin Tetraasetik Asit
FAO : Dünya Gıda Örgütü
FecB : Booroola
g : Gram
GH : Büyüme Hormonu
HCI : Hidroklorik Asit
HWE : Hardy-Weinberg Dengesi
κ-CN : Kappa Kazein
MAS : Markır Destekli Seleksiyon
M : Mol
mg : Miligram
ml : Mililitre
µl : Mikrolitre
M : Mikromolar
mM : Milimolar
MTRN1A : Melatonin Reseptör 1A MTRN1B : Melatonin Reseptör 1B
NaCI : Sodyum Klorür
ng : Nanogram
PCR : Polimeraz Zincir Reaksiyonu
pH : Potansiyel Hidrojen
PRL : Prolaktin Hormonu
QTL : Kantitatif Özellik Lokusu
xi
RAPD : Rastgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA RFLP : Restriksiyon Parça Uzunluk Polimorfizmi
TBE : Tris-Borik Asit-EDTA
TE : Tris-EDTA
TNE : Tris-NaCI-EDTA
TÜİK : Türkiye İstatistik Kurumu
SDS : Sodyum Dodesil Sülfat
SNP : Tek Nükleotid Polimorfizmi
SSCP : Tek Zincir Konformasyon Polimorfizmi
U : Ünite
UV : Ultra Viyole
xii
TABLO VE ŞEKİL LİSTESİ
Sayfa Tablo 2.1. Dünya Keçi Popülasyonu, Kıta Bazında...……… 7 Tablo 2.2. Dünya Keçi Popülasyonu Ülke Bazında…………... 8 Tablo 4.1 Kıl ve Halep keçilerinde MTNR1A geninin allel ve genotip frekansı. 25 Şekil 4.1. MTNR1A PCR ürünlerinin agaroz jel görüntüsü..………... 22 Şekil 4.2. RFLP görüntüsü ürünlerinin agaroz jel ……… 23
2
1. GİRİŞ ve AMAÇ
Günümüz çiftlik hayvanları yetiştiriciliğinde, bir işletmenin önemli verim özelliklerini bilmesi ve bu özelliklerin genetik markırları ile sahip olduğu hayvan varlığının genetik yapısını bilmesi işletmenin geleceği için çok önemlidir. Bunun sonucunda işletme belli markırlar yönünden genetik yapısı bilinen ve hedefine uygun damızlık hayvanlardan oluşabilir. Seleksiyon, eldeki sürüde veya ırkta önemli verim özellikleri yönünden üstün verimlilerinin seçilerek damızlık olarak kullanılmasıdır. Seleksiyonun plansız uygulanması, eldeki sürüde varyasyonun azalmasına neden olarak beklenen hızda genetik ilerlemenin elde edilmesini engelleyebilmektedir. Günümüz çiftlik hayvanları yetiştiriciliğinde suni tohumlama ve embriyo transferi gibi yardımcı üreme tekniklerinin kullanılması daha az sayıda erkek damızlık kullanımına olanak vererek, seleksiyon uygulamalarıyla birlikte ırk içi genetik çeşitliliği azaltmaktadır. Damızlık adayının önemli verim özellikleri yönünden genetik yapısının bilinmesi moleküler genetik alanındaki çalışmalar neticesinde mümkün olup, moleküler genetik alanındaki gelişmeler doksanlı yıllardan günümüze yükselen bir öneme sahiptir.
Moleküler genetik alanında geliştirilen restriksiyon parça uzunluk polimorfizmi (RFLP) ve dizi analizi gibi yöntemlerin çiftlik hayvanları yetiştiriciliğinde kullanımı artmıştır.
Bu yöntemler eldeki hayvan varlığında fenotipten bağımsız olarak, verimlerle ilişkili kantitatif özellik lokuslarında (quantitative trait loci, QTL) bulunan varyasyonların belirlenmesine olanak vermektedir. Belirlenen bu varyasyonlar ise istenen özellikler arasındaki ilişkilerin araştırılması çalışmalarında kullanılmaktadır. Bu amaçla yapılan çalışmaların ve bu çalışmalarda kullanılan ırk ve türlerin artırılması gerekmektedir.
Bir genin genetik markır olarak seçilmesinde, seçilen genin görev aldığı fizyolojik ve biyokimyasal süreçler, bu süreçler ile iyileştirilmek istenen verim özellikleri veya markır gen ile kalıtsal hastalıklar arasında ilişkinin bulunup bulunmaması dikkate alınır.
Son yıllarda çiftlik hayvanlarında farklı verim özellikleriyle ilişkili olduğu ve genetik
3
markır olarak kullanılabileceği bildirilen bazı genler belirlenmiştir. Sığır ve manda gibi büyük ruminatlarda süt, et ve döl verimi, koyun ve keçi gibi küçük ruminantlarda süt, et ve bir batındaki yavru sayısı gibi önemli verim özelliklerinin ortaya çıkmasında etkili olan fizyolojik süreçlerde rolü olan ve bu özelliklerinin iyileştirilmesinde önemli potansiyele sahip bazı genetik markırlar bildirilmiştir. Diacylglycerol acyltransferase 1 (DGAT1), kapa-kazein (κ-CN), beta-laktoglobülin (β-LG), büyüme hormonu (GH) ve prolaktin hormonu (PRL) genlerinin çiftlik hayvanlarında süt ve et veriminin iyileştirilmesi çalışmalarında kullanılabileceği; Booroola (FecB) geninin koyunlarda ikizliğin artırılması çalışmalarında kullanılabileceğini bildiren çalışmalar mevcuttur.
Dolayısıyla, genetik markır olarak eldeki sürü veya ırkın istenen verim özelliği yönünden iyileştirilmesinde kullanılabileceği düşünülen genlerin genetik karakterizasyonu önemlidir.
Türkiye’de yetiştirilen keçi ırkları arasında popülasyon büyüklüğü en fazla olan, dolayısıyla da en çok yetiştirilen keçi ırkı Kıl keçisidir. Kıl keçisi, et verimi yönüyle öne çıkmış bir ırktır. Ancak son yıllarda süt verimini arttırmak amacıyla, İsviçre orijinli sütçü bir keçi ırkı olan Saanen ırkı ile melezlenmeler yapılmaktadır. Yapılan literatür taramalarında, Burdur ilinde yetiştirilen Kıl keçisi örneklerinde MTRN1A gen polimorfizmi incelenmiş olmasına rağmen Türkiye’nin iç bölgelerinde özellikle de Kayseri civarında yetiştirilen Kıl keçisi örneklerinde ve sütçü Halep keçilerinde MTRN1A geninin allelik yapısının incelendiği çalışmalara rastlanılamamıştır.
Bu tez çalışmasında Türkiye yerli keçi ırklarından Kıl keçisinin Kayseri ve civarında yetiştirilen örnekleri ile Ülkemizde yetiştirilen bir yerli sütçü keçi ırkı olan Halep keçilerinde MTRN1A geninin allelik yapısının araştırılması amaçlanmıştır.
2. GENEL BİLGİLER
İstenen verime ulaşmak için uygulanılan seleksiyon yöntemlerinin hepsinde, bir sonraki neslin ebeveyni olacak bireylerin doğru seçilmesi hedeflenmektedir (2). Ancak bir sonraki neslin ebeveyninin seçimi, hayvan yetiştiriciliği için önemli olduğu kadar aynı zamanda oldukça karmaşık konudur. Hayvan ıslahı çalışmalarında hedeflenen verim özelliği yönünden damızlık olarak seçilecek hayvanların, genetik kapasitelerinin yüksek doğrulukta belirlenebilmesi için değişik seleksiyon metotları geliştirilmiştir (3). Fakat, uzun jenerasyon aralığına sahip çiftlik hayvanları için yapılacak ıslah çalışmalarında, uygulanan klasik seleksiyon yöntemleri ile daha düşük bir genetik ilerleme elde edilmektedir. Keçi gibi uzun jenerasyon aralığına sahip olan çiftlik hayvanı türlerinde damızlık adaylarının belirlenebilmesi, klasik seleksiyon yöntemlere göre daha kısa süre ve daha yüksek başarı oranına sahip yöntemlerin geliştirilmesi ve kullanılmasını zorunlu hale getirmiştir.
Diğer taraftan çiftlik hayvanlarında iyileştirilmesi istenen et verimi, süt verimi, döl verimi ve hastalıklara direnç gibi özellikler poligenik yapıda kantitatif özelliklerdir (4).
Bireyin fenotipik yapısı, genotipini çoğunlukla doğru yansıtmamaktadır. Dolayısıyla iyileştirilmesi istenen özellik yönünden damızlık adayların genetik değerinin yüksek doğrulukta tahmin edilmesi önemlidir. Kantitatif özellikler yönünden bireyler arasındaki farklılıkların genetik temelini oluşturan genlerin ırklar arası ve bireyler arası farklılıklara olan etkisi bilinmemektedir. Klasik Mendel kalıtım yolu izlemeyen bu genlerin her birinin belirlenmesi ve varyasyona etkilerinin tek tek ortaya konması henüz mümkün değildir (4).
Kantitatif özellikler et verimi, süt verimi, günlük canlı ağırlık artışı ve yarış performansı gibi ölçümle belirlenen ve süreklilik gösteren özellikler ile döl verimi gibi süreklilik göstermeyen eşik özellikler olarak ikiye ayrılır (5). Kantitatif özellikler genetik yapıdan
etkilendiği gibi önemli ölçüde çevre faktörlerinden de etkilenmektedirler (4). Bu nedenle fenotipik varyasyonda, genotipik varyasyona sebep olan gen veya genlerin belirlenmesi ve bu genler yönünden de damızlık seçimi için yapılacak seleksiyon çalışmalarından elde edilecek başarı ciddi bir sorundur. Ancak çiftlik hayvanlarında, kantitatif özellikleri diğer genlerden daha fazla etkileyen ve basit Mendel kalıtım yolu izleyen etkili, kalıtım derecesi yüksek ve major gen olarak adlandırılan bazı allellerin bulunduğu bildirilmiştir (4). Moleküler genetik alanında elde edilen başarılar ve geliştirilen yöntemler, kantitatif özellik üzerine etki eden major genlerin belirlenmesi ve damızlık adaylarının bu genler yönünden genotiplendirilmesi sorununa önemli katkılar sağlayabilmektedir (3).
Farklı verim özellikleriyle ilişkili son yıllarda önemli genetik markırlar belirlenmiştir (6). Doksanlı yılların başından itibaren farklı verim özellikleri yönünden eldeki damızlıkların ıslahında belirlenen bu markırlar ile klasik seleksiyon metotlarının birlikte kullanıldığı markır destekli seleksiyon (MAS) yöntemi, çiftlik hayvanları yetiştiriciliğinde kullanılmaya başlanmıştır. Bu yöntem sayesinde yüksek damızlık değerine sahip damızlık adayları genç yaşlarda ve cinsiyetten bağımsız olarak damızlık olarak seçilebileceği düşünülmektedir (7, 8).
Moleküler genetik yöntemlerin hayvan yetiştiriciliğinde ki kullanımı, eldeki mevcut sürünün bilinen genetik markırlar yönünden genetik yapılarının belirlenmesi gibi çalışmalarla her geçen gün artmaktadır. Özellikle önemli gen kaynağı olan yüksek verimli bireyler ve yerli ırkların bu markırlar yönünden genotiplerinin belirlenmesinin bu ırkların korunmasına yardım edebilecektir.
Bir verim özelliğinin iyileştirilmesinde kullanılabilecek genetik markırların belirlenmesi için birçok yöntem geliştirilmiştir. Geliştirilen bu yöntemlerin başında Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) yöntemi gelmektedir. Bu yöntem sayesinde, kodladığı protein varyantları çeşitli dokulardan izole edilemeyen veya varyantları belirlenmesinin zor ve pahalı olduğu markör genlerdeki, genetik varyasyonların ve bireylerin markör genler
6
yönünden genotiplerinin kolayca belirlenmesine olanak sağlayan Restriksiyon Parça Uzunluk Polimorfizmi (Restriction Fragment Length Polymorphism-RFLP), Tek Zincir Konformasyon Polimorfizmi (Single-Strand Conformational Polymorphism -SSCP), Rastgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA yöntemi (Randomly Amplified Polymorphic DNA-RAPD), Çoğaltılmış Parça Uzunluk Polimorfizmi (Amplified Fragment Length Polymorphism-AFLP), Tek Nükleotid Polimorfizmleri (Single Nucleotide Polymorphism-SNP) gibi genetik markör sistemleri geliştirilmiştir (9).
Günümüz moleküler genetik yöntemlerinde kullanılan genetik materyalde seçilecek yöntemin belirlenmesi önemlidir. Yapılacak çalışmalarda seçilecek yöntemin belirlenmesinde, yöntemin kolaylığı, ucuzluğu ve kesinliği önemli rol oynar. Bu yöntemler içerisinde RFLP yöntemi yukarıda belirtilen özelliklerin hepsini içermektedir. Yöntem PCR sonunda elde edilen PCR ürünlerinin restriksiyon endonükleaz adı verilen kesim enzimleriyle kesilmesi sonucu elde edilen farklı büyüklükteki kesim ürünlerinin agaroz jel elektroforezi ile belirlenmesi esasına dayanmaktadır. Her restriksiyon enzimi DNA’yı kendine özgü tanıma bölgesinden keser. Bu nedenle kesim sonucunda, bireyde o kesim bölgesinin bulunup bulunmamasına göre genotipleme yapılabilir.
Bir çiftlik hayvan türü içerisindeki genetik varyasyonun devam ettiği yerli ırklar, o tür için önemli gen kaynaklarıdır. Diğer taraftan artan nüfusun ihtiyaçlarının karşılanması amacıyla yüksek verimli “kültür ırkı” olarak adlandırılan ırkların üretimde daha çok kullanılmasına neden olmuştur. Bu durum ise düşük verimli yerli çiftlik hayvanı ırklarının sahip olduğu genetik çeşitliliğin ortadan kalkmasına neden olmaktadır.
Artan Dünya nüfusuna bağlı olarak hayvansal kökenli gıdalara talep de gittikçe artmaktadır. Bu durum da yetiştirilen hayvan başına alınan ürün miktarının artırılmasını gerekli kılması nedeniyle, birkaç tür ve ırk hayvan yetiştiriciliği tüm dünyada kullanılmaya başlanmıştır. Bunun sonucu olarak yerli ırklar ya tamamen ortadan kalkmış ya da soyu tükenme tehlikesiyle karşı karşıya kalmışlardır. Dünya’da 2009 yılı
7
itibariyle sayısal mevcudu bilinen 309 keçi ırkının 18’inin soyu tükenmiş, 81 ırk ise soyu tükenme tehlikesiyle karşı karşıya oldukları bildirilmiştir. Benzer şekilde 199 sığır ırkının, 183 koyun ırkının, 91 at ırkının ve 6 eşek ırkının soyu tükenmiştir (10). Bu durum Türkiye’deki yerli çiftlik hayvanı ırklarını da etkilemektedir. Örneğin Türkiye yerli sığır ırklarından Doğu Anadolu Kırmızısı, Yerli Kara, Boz ırk ve Kilis sığırı yok olma tehlikesiyle karşı karşıyadır. Bunun yanında Çukurova sığırı, Dörtyol sığır ve Kırım sığırı ise tamamen ortadan kalkmıştır (10). Benzer şekilde önemli koyun ırklarımızdan Kıvırcık, Dağlıç, Herik, Tuj, Hemşin ve Çine Çaparı koyun ırkları soyu tükenme tehlikesi ile karşı karşıya bulunurken, Sakız ve Norduz koyun ırklarımız ağır yok olma tehdidi ile karşı karşıyadır (10). Keçi ırklarımızdan da Türkiye ile özdeşleşmiş olan Ankara keçisi ile Honamlı keçisi soyu tükenme tehdidi ile karşı karşıya iken Norduz ve Malta keçileri ağır yok olma tehdidi ile karşı karşıyadır (10).
Yerli çiftlik hayvanlarında, önemli verim özelliklerinin düşüklüğünün yanında, yüzyıllarca insanlar tarafından kullanılan çiftlik hayvanı türlerinden elde edilen ürün ve hizmetin önemini yitirmiş olması da bu tür ve ırkların ortadan kalkmasına zemin hazırlamaktadır. Örneğin artık tarla sürmek veya ulaşım için deve, at ve eşek kullanılmamaktadır. Kalitesiz yapağıya sahip olan yerli koyun ırklarımızdan elde edilen yün artık yatak-yorgan yapımında kullanılmadığı için yetiştiriciler için ekstra maliyet getiren bir angarya olmuştur. Bu durum yüz yıllardır yetiştiriciliği yapılan keçi, manda, deve, eşek ve at gibi önemli çiftlik hayvanı türü ve bu çiftlik hayvanlarındaki yerli ırkların hızla yetiştirme dışı bırakılması sonucunu doğurmuştur. Ancak bir çiftlik hayvanı türünün sahip olduğu üstünlüğün gelecekte nasıl kullanılacağı bilinmemektedir.
Örneğin uzun yıllar hiçbir ekonomik değeri olmadığı için horlanan eşek son yıllarda eşek sütü üretimi için kurulan çiftliklerde değerli bir çiftlik hayvanı olmuştur. Benzer çiftlik hayvanları türlerindeki düşük verimli yerli ırkların, tür içi genetik çeşitliliğin sürdürülebilmesi için varlıklarını devam ettirmeleri , yetiştiricinin de bu ırkları elinde tutarak verimlerinin artırılması için çaba göstermesi gerekmektedir.
8
Keçi, Dünyanın en soğuk bölgesi olan Sibirya’dan Dünyanın en sıcak çöllerine kadar çok farklı iklime ve coğrafik şartlara uyum sağlayabilen, bu nedenle de yetiştiriciliği en yaygın olan çiftlik hayvanı türüdür (11,12). Yüksek adaptasyon kabiliyeti nedeniyle keçi; eti, sütü, kılı ve derisi için yetiştirilen kıymetli bir çiftlik hayvanıdır (13,14). Keçi medeniyetin kurulmaya başlandığı ilkel devirlerden beri insanoğlu için beslenme yanında kültürel ve dinsel anlam yüklenmiş çok önemi bir türdür (12). Ülkemizin de içinde bulunduğu “Verimli Hilal” olarak adlandırılan bölge, keçinin ilk evcilleştirildiği bölge olduğu düşünülmektedir (15). Avrupa-Asya-Afrika geçişinde bir köprü vazifesini gören Anadolu, keçinin yanında birçok çiftlik hayvanın da ilk kez evcilleştirildiği bölge veya evciltme bölgelerine çok yakındır. Bu nedenle de ülkemiz çiftlik hayvanları ve diğer evcil hayvanlar için dünyanın çok önemli gen merkezlerinden birisidir.
Tablo 2.1. Dünya Keçi Popülasyonu, Kıta Bazında (16)
Sıra Kıta Sayı (Milyon Baş) Dünya Keçi
Sayısına oranı%
1 Asya 553 273 677 56,8
2 Afrika 364 338 248 37,4
Amerika (Kuzey, Güney, Orta
Amerika ve Karaipler 35 631 898 3,7
4 Avrupa 16 799 674 1,7
5 Okyanusya 3 992 930 0,4
Dünya toplamı 974 036 427 100
Dünya Gıda Örgütü (FAO) 2014 verilerine göre Tablo 2.1’de de görüldüğü gibi Dünya keçi varlığının en büyük kısmı Asya ve sonrada Afrika kıtasında nüfus yoğunluğunun fazla, gelir düzeyi düşük ve olumsuz çevre şartlarının hüküm sürdüğü yerlerde yetiştirilmektedir (16). Dünya keçi varlığının sadece %5,8’si gelişmiş ülkelerin
9
bulunduğu Amerika, Avrupa ve Okyanusya kıtalarında bulunurken, dünya keçi varlığının %94,2’i ise az gelişmiş veya gelişmekte olan ülkelerin bulunduğu Asya ve Afrika kıtalarında yetiştirildiği görülmektedir (Tablo 2.1.) (16). “Fakir Adamın Sığırı”
olarak tanımlanan keçi düşük kaliteli meraları değerlendirerek et, süt, tiftik, kıl, deri ve hatta iş gücüne dönüştüren çok farklı yetiştirme yönü olan değerli bir çiftlik hayvanıdır.
Dünya keçi varlığının %56,8’ü Asya, %37,4’ü Afrika kıtasında bulunurken sadece
%1,7’si de Avrupa kıtasında bulunmaktadır (Tablo 2.1.). Asya kıtasında da en fazla keçi 187,8 milyon baş ile Çin’de bulunmaktadır (Tablo 2.2). Asya kıtasında Çin’i 133 milyon baş ile Hindistan ve 66,6 milyon baş ile Pakistan izlemektedir (Tablo 2.2).
Afrika kıtasında ise en büyük keçi varlığı 71 milyon baş ile Nijerya’da bulunurken, bu ülkeyi 31 milyon baş ile Sudan ve 29,1 milyon baş ile Etiyopya takip etmektedir (Tablo 2.2.).
10
Tablo 2.2. Dünya Keçi Popülasyonu Ülke Bazında (16) Sıra Ülkeler Sayı, milyon baş
1 Çin 187 869 000
2 Hindistan 133 000 000
3 Nijerya 71 000 000
4 Pakistan 66 600 000
5 Bangladeş 55 900 000
6 Sudan 31 029 000
7 Etiyopya 29 112 963
8 Kenya 25 430 058
9 Iran 22 120 000
10 Mali 20 083 130
11 Endonezya 19 216 300
12 Tanzanya 16 250 000
13 Nijer 14 883 559
14 Uganda 14 011 000
15 Burkina Faso 13 891 000 16 South Sudan 13 550 000
17 Somali 11 600 000
18 Türkiye 10 347 159
19 Nepal 10 177 531
20 Brezilya 8 851 879
Avrupa kıtasında ise 4,4 milyon baş ile Yunanistan en büyük keçi popülasyonuna sahip ülke iken, bu ülkeyi 2,7 milyon baş ile İspanya, 2 milyon baş ile Rusya takip etmektedir (16). Türkiye 10,3 milyon baş keçi varlığıyla 2014 yılı itibariyle dünya keçi varlığı içindeki payı %1,06 düzeyindedir (16). FAO verilerine göre dünya nüfusu artış hızı ile
11
doğru orantılı olarak tüm dünyada özellikle yoğun keçi yetiştiriciliği yapılan ülkelerde ki keçi sayısında da artış görülmektedir (16). Dünya’daki insan nüfusu artışı ve keçi sayısındaki artış karşılaştırıldığında, son 40 yıl içinde dünya nüfusu her 5 yılda ortalama
%9,03 oranında artmıştır. Buna karşılık, dünya keçi varlığı aynı periyotlarda %9,92’lik bir artış ile insan nüfus artışını geçmiştir (17).
Sayısal olarak az gelişmiş veya gelişmekte olan Asya ve Afrika kıtalarındaki ülkeler önde bulunmalarına rağmen, keçi başına alınan verimlerle karşılaştırıldığında tam tersi olarak gelişmiş ülkelerde daha yüksek ürün elde edilmektedir. Bunun nedeninin de sayısal olarak üstün olan az gelişmiş ve gelişmekte olan ülkelerde keçi başına elde edilen ürün miktarının artırılması için herhangi bir ıslah çalışması yapılmamış ve bakım beslemenin minimum maliyette olduğu yerli ırklardan oluşmaktadır. Buna karşılık Orta ve Batı Avrupa ülkelerinde ise modern yetiştiriciliğin tüm imkanlarının kullanılarak yapılan bakım, besleme ve barındırma koşullarında Saanen, Alman Alaca, Fransız Alpini gibi yüksek süt verimine sahip keçi ırkları geliştirilmiştir (18,19). Bu ırklar günümüzde düşük verimli keçi ırklarında verim artışı için melezleme çalışmalarında kullanılmaktadır (20).
Az gelişmiş ülkelerde ve bölgelerde keçi yetiştiriciliği insanların büyük bir kısmı için tek geçim kaynağıdır (17). Bunda keçinin sığıra göre daha ucuz olması, zor arazi şartlarında yaşayabilmesi, kalitesiz meraları koyundan daha iyi değerlendirebilmesi, yem konusunda seçici olmaması bu nedenle de ottan, çalıya ve hatta ağaç kabuğu gibi selülozca çok zengin besleyici değeri çok düşük olan birçok ürünü tüketerek et ve süte çevirmesi etkilidir (17). Diğer taraftan keçi kaliteli kaba yemler dışında, tarla ve bahçe artıkları ile mutfak artıklarını değerlendirebilen dolayısıyla bakım besleme maliyeti çok düşük bir çiftlik hayvanıdır.
Keçi, ülkemizde çoğunlukla sulu tarıma uygun olmayan yerler ile dağlık arazilerde yetiştirilmektedir. Son yıllarda keçi sütüne olan talep eldeki düşük verimli Kıl keçilerinde süt verim artışı için Saanen ırkı keçiler ile melezlenmektedir. Benzeri bir
12
uygulamada daha önce tiftiğe olan talebin azalması nedeniyle düşük et verimine sahip Ankara keçisi sürülerine, et veriminin artırılması için Kıl keçisi tekeler katılmıştır. Bu şekilde bilinçsizce yapılan melezleme uygulamaları mevcut keçi ırklarının saf örneklerinin yok olmasına neden olabilir. Diğer taraftan, Türkiye’de son yıllarda yaşanan hızlı şehirleşme ve kırsal nüfustaki azalma ile tüketici alışkanlıklarının değişmesi neticesinde Türkiye yerli keçi ırklarından et verimi için yetiştirilen Kıl keçisi ve sütçü Kilis keçisi dışındaki aralarında Türkiye’nin Kangal köpeği ile birlikte sembolü olan Tiftik keçisini de dahil olduğu birçok keçi ırkı yok olma tehlikesiyle karşı karşıyadır. Mevcut piyasa şartları, düşük verimli ve ürün kalitesi düşük olan yerli çiftlik hayvanı ırklarının yetiştirici tarafından elde tutulmasını gittikçe imkansız hale getirmektedir. Bu nedenle yerli çiftlik hayvanı ırklarının önemli verim özellikleri ile ilişkili olan markır genler yönünden genetik karakterizasyonları yapılarak, bu genler ile verim ve ürün kalitesinin artırılması için çalışmaların planlanması gereklidir.
Türkiye İstatistik Kurumu (TÜİK) verilerine göre 2003 yılında Türkiye’de toplam 6516088 baş Kıl keçisi varken bu rakam 2015’de yaklaşık %56,7’lik bir artışla 10 210 338 başa çıkmıştır (21). Halk arasında “Kara Keçi” olarak da tanınan Kıl keçisi, tüm bölgelerimizde az çok bulunmakla birlikte bölgesel dağılımında en fazla sayının 2 738 525 baş ile Akdeniz Bölgesi’nde olduğu gözlemlenmektedir. Akdeniz Bölgesi’ni sırasıyla, 2 337 093 baş ile Güneydoğu Anadolu, 1 643 757 baş ile Doğu Anadolu bölgeleri takip etmektedir (21). Ota Anadolu ise toplam 402 939 baş Kıl keçisi varlığı ile en az Kıl keçisi yetiştiriciliğinin yapıldığı bölgelerden biridir. Yine 2015 verilerine göre Kayseri illinde toplam 64 125 baş Kıl keçisi bulunmaktadır (21).Türkiye’de popülasyon büyüklüğü bakımından üç keçi ırkı önde bulunmaktadır. Bunlardan Kıl keçisi, zor iklim ve kötü kaliteli meralarda yaşabilen, çoğunlukla orman ve dağ köylerinde yetiştirilen kombine verimli bir keçi ırkıdır (22). İkinci sırayı ise sütçülük özelliği ile ön plana çıkan Halep (Şam, Damascus) keçisi ile Kıl keçisi melezi olan Kilis keçisi almaktadır. Kilis keçisi daha çok Hatay, Gaziantep, Kilis ve Şanlıurfa illerinde olmak üzere Güneydoğu Anadolu bölgesinde yetiştirilmektedir (22). Popülasyon
13
büyüklüğü bakımından üçüncü sırada Tiftik keçisi olarak da adlandırılan Ankara (Angora) keçisi gelmektedir. Ankara keçisi, adından da anlaşılacağı üzere en çok İç Anadolu’da Ankara, Kırıkkale, Sivas, Eskişehir ve Çankırı civarı ile Güneydoğu Anadolu’da ırkın siyah renkli olanlarının da bulunduğu Siirt, Mardin ve Bitlis illerinde yetiştirilmektedir (22).
Bu üç yerli keçi ırkı dışında sayıları az olmakla birlikte Batı Anadolu kıyı şeridinde yetiştirilen Malta ve bunların melezleri, Hatay-Kilis civarında Halep (Damascus);
Burdur, Antalya, Isparta ve Konya civarında Honamlı keçisi; Van ve civarında Norduz keçisi; Kars, Ardahan, Artvin ve Erzurum’da Gürcü ve Abaza keçileri az olmakla birlikte hala varlıklarını sürdürmektedirler. Son yıllarda ise Saanen ve melezlerinin sayıları da Türkiye keçi varlığında gittikçe artmaktadır (22).
Türkiye yerli keçi ırklarının verimleri, ırkın yetiştirildiği yerlerin iklim şartları, meraların florası ve işletmelerde ekstansif yetiştiriciliğin uygulanması ile Türkiye’de önemli verim özellikleri yönünden ıslah çalışmaları yapılmaması nedeniyle çok düşüktür. Keçi Türkiye ekonomisi için önemli bir çiftlik hayvanıdır.
Ekonomik değeri olan özelliklerin büyük çoğunluğunun ortaya çıkmasında çevre faktörlerinin de rol oynadığı bilinmektedir. Kantitatif özellik olup birçok gen tarafından kontrol edilmektedir. Döl verim özellikleri çiftlik hayvanları yetiştiriciliğinde ki en önemli ekonomik özelliklerden biridir. Gün uzunluğundaki yıllık farklılıklar sezonal üreme aktivitesi gösteren türlerde değişen bir östrus dönemi ve ovulasyonun olmadığı anöstrus dönemi olarak adlandırılan iki dönemin oluşmasına neden olur (2423).
Sığırların aksine küçükbaş havanlar genellikle sezonal östrus gösterirler. Koyun, keçi gibi sezonal üreme gösteren türlerde yıllık gün uzunluğundaki farklılıklar üremenin düzenlenmesinde önemlidir (2524). Türkiye’nin de bulunduğu ılıman iklim kuşağında yetiştirilen koyun, keçi gibi küçükbaş hayvanların üreme aktiviteleri yaz sonu başlayarak, sonbahar sonuna kadar sürer devam eder. Sezonal östrus gösteren tüm çiftlik hayvanlarında üremenin başarısı, fotoperyodun ilk sırayı aldığı bazı çevresel
14
faktörlerden büyük ölçüde etkilenirler (2625). Yapılan çalışmalarda melatonin reseptör 1A (MTRN1A) geninin çiftlik hayvanlarında döl verimi üzerine etkisi olan önemli bir gen olduğu bildirilmiştir (2326).
Koyun ve keçi gibi mevsimsel östrus gösteren çiftlik hayvanı türlerinde gözlenen mevsimsel kuzulama, koyun ve keçi yetiştiriciliği için önemli bir kısıtlayıcı faktördür.
Mevsimsel östrus gösteren türler, bahar ayları da dahil yılın büyük bir kısmı anöstrusta geçirirler. Mevsimsel östrus gösteren koyun, keçilerde anöstrusun görülmesi ve süresi ırk içinde ve ırklar arasında oldukça büyük farklılıklar gösterir (50). İlkbaharda yavrulayabilmek için son baharda kızgınlık gösterirler (25). Ancak belirli sezonlarda östrus gösteren türlerde, gerek ırk içi gerekse ırklar arası farklılık gösteren sezon dışı yavrulama görülebilmektedir. Sezonal östrus gösteren koyun ırklarında, anöstrus döneminde bazı bireylerin ovaryum aktiviteleri tamamen biterken, bazılarında yıl boyu devam edebilmektedir (28). Bu özelliğin ortaya çıkmasında, besleme ve sürüde erkek hayvan bulunması gibi çevresel etkenlerin yanında, kısmen genetik faktörler de etki etmektedir (29). Koyun ve keçinin mevsimsel üreme kontrolünü etkileyen major genlerin veya kantitatif özellik lokuslarının araştırılması bu nörofizyolojik süreçleri anlamada önemli bir faktör olabileceği düşünülmektedir (50). Ancak çiftlik hayvanlarında bu özellikten sorumlu pek az gen identifiye edilmiştir. Bu özellik üzerine etkili olan markır genlerin yardımıyla koyun, keçi gibi sezonal östrus gösteren türlerde ki sezon dışı üreme özelliği için daha etkili ve yoğun seleksiyon programlarının geliştirilebileceği düşünülmektedir (23).
Sezonal östrus gösteren türlerde, bu mekanizmanın düzenlenmesinde, hipotalamustan gonodotropik hormon salgılatan hormonun (GnRH) salgılanmasında rolü olan melatonin hormonunun önemli etkisi vardır (51). Bu nedenle, melatoninin seksüel siklusları ve sezonal üremeyi düzenlemesindeki rolü nedeniyle hayvan fizyolojisinde önemli bir hormondur (51). Bunun dışında melatonin hormonu, retinadan dopamin salgılanmasının inhibisyonu, vasoregülatör aktivite, bağışıklığın düzenlenmesi ve hücre
15
büyümesi gibi bazı fizyolojik olaylar üzerine de etkisi olan çok önemli bir hormondur (51).
Epifiz bezinden salgılanan melatoninin vücuttaki salgılanması ritmiktir. Canlının gece veya gündüz aktif olmasından bağımsız olarak tüm omurgalıların vücutlarındaki hormon seviyesi gece boyunca pik düzeyde olduğu görülmüştür (30). Hormonunun salgılanmasında ışığın önemli rolü vardır. Retina tarafından algılanan ışık sinyalleri melatonin salgılanmasını uyarır, salgılanan melatonin ise epifiz bezini uyararak üreme ile ilgili hormonların salgılanması için uyarır (31).
Kandaki melatonin seviyesi gündüz düşük seviyede iken karanlıkta ise yüksek konsantrasyonda bulunur (32). Bu nedenle melatonin hormonu mevsimsel östrus gösteren canlılar için kızgınlığın görülmesi ve çiftleştirilme için iyi bir organik indikatördür (32). Bu nedenle koyun, keçi gibi küçük ruminatlarda sonbahar aylarında kanlarındaki yüksek melatonin seviyesi üreme üzerine pozitif etkisi vardır (25). Doğal olarak son baharda artmaya başlayan kandaki yüksek melatonin seviyesi küçük ruminatlarıdaki üreme üzerine pozitif bir etkiye sahiptir (33,34). Melatonin hormonu, içlerinde üremeyi de düzenleyen merkezleri de kapsayan merkezi sinir sisteminin farklı bölgelerinde bulunan özel reseptörleri vasıtasıyla görevini yapar (25,35). Memelilerde melatonin hormonu, MTRN1A ve MTRN1B olarak adlandırılan iki tip reseptörü vasıtasıyla görevini yapar (37). Bu reseptörlerden MTRN1A reseptörü, GnRH’ın aralıklı salınımını düzenleyen gonadotropik sistem üzerine melatoninin etkisine aracılık ederek, ovulasyon üzerine etki eder (36,37).
İki ekzon ve bir introndan oluşan MTRN1A reseptörü protein tabiatında bir reseptördür (38) ve bu reseptörü kodlayan gen birçok çiftlik hayvanında haritalanmıştır (39).
MTRN1A geni insanlarda 4. kromozomda, farelerde 8. kromozomda (40), domuzlarda 17. , koyunlarda 26., keçilerde ve sığırlarda 27. kromozomlarda bulunmaktadır (39).
Koyunlarda MTRN1A reseptör genin ikinci ekzonunda bir MnlI ve RsaI enzimleri ile kesilen iki polimorfizm bulunduğu bildirilmiştir (28,39,41) ve bu ekzonun 612.
16
pozisyonunda meydana gelerek, ekzonun 605. pozisyonunda bulunan MnlI enzim kesim bölgesinin ortadan kalkmasına sebep olan mutasyon ile sezonal östrus arasında ilişki olduğu bildirilmiştir (28,42). Bu kesim enziminin kestiği bölgenin bulunmaması “m”
veya “-“ ile ifade edilerek farklı koyun ırklarında bu mutasyon yönünden “MM” veya
“+/+”, “Mm” veya “+/-“ ve “mm” veya “-/-“ olarak adlandırılan üç farklı genotipinin bulunduğu bildirilmiştir (28).
Koyunlarda, MTRN1A reseptörünü kodlayan genin MnlI enzimi tarafından 605.
pozisyonundan kesilmesi sonucu elde edilen polimorfizmler ile fotoperyodik üreme aktivitelerinin düzenleme rolü olduğu bildirilmiştir (28,42). Keçilerde yapılan çalışmalarda aynı sezona östrus gösteren veya yıl boyu östrus gösteren keçi ırklarında MnlI polimorfizmi yönünden monomorfik oldukları bildirilmiştir (43,44).
İlk olarak Asya keçi ırklarında, MTRN1A reseptörünü kodlayan genin 53.
pozisyonunda RsaI kesim enzimi ile belirlenen bir polimorfik bir bölgenin bulunduğu ve bu bölge ile keçilerde sezonal üreme özellikleri arasında ilişki olduğu bildirilmiştir (25, 45). Daha sonra Avrupa orjinli Sarda, Saanen, Chamois Coloured ve Maltız keçileri ile Afrika orijinli Nubian keçilerinde aynı polimorfizmin bulunduğu bildirilmiştir (25).
Bu nedenle sezonal östrus gösteren çiftlik hayvanları türlerinde MTRN1A geninin sezon dışı kuzulama için bir genetik markır olabileceği düşünülmektedir.
Bu tez çalışmasında Türkiye’de yerli keçi ırklarından en büyük popülasyon büyüklüğüne sahip Kıl keçisi ve Halep keçisinde ruminantlarda sezon dışı üreme için önemli bir markır gen olabileceği düşünülen MTRN1A geninin allelik yapısının araştırılması amaçlanmıştır.
3. GEREÇ ve YÖNTEM
17
3.1. ÖRNEKLERİN SEÇİMİ
Çalışmada Türkiye’nin önemli keçi ırklarından Kıl keçisi ve Halep keçisi kullanılmıştır.
Kıl keçisi ırkından 110 baş (dişi/erkek) ve Halep keçisinden (dişi/erkek) ise 55 baş incelenmiştir. Bu tez çalışmasında kullanılan keçi ırklarına ait örnekler ırka özgü fenotipik özelliklerini gösteren, ırkın saf ve bireylerin akraba olmamasına dikkat edilerek seçilmiştir. Örneklerin alındığı sürülerde Avrupa orijinli Saanen ırkına ait örneklerin bulunmamasına özen gösterilmiştir.
3.2. KAN ÖRNEKLERİN ALINMASI
Çalışmada kullanılan kan örnekleri, steril ve tek kullanımlık iğneler yardımıyla vakumlu 10 ml’lik EDTA’lı tüplere Vena jugularis’ten alınmıştır. Kan alındıktan sonra hemoliz ve pıhtılaşma oluşmasını engellemek için tüpler yavaşça alt üst edilerek karıştırılmıştır.
Alınan kanlar, soğuk zincirde laboratuara getirilmiştir. Laboratuara getirilen kanlardan DNA izolasyonu yapılana kadar tüpler -20 °C de saklanmıştır.
16
3.3. FENOL:KLOROFORM: İZOAMİL ALKOL YÖNTEMİYLE DNA İZOLASYONU
Bu tez çalışmasında kullanılan DNA’lar tam kandan fenol-kloroform-izoamil alkol yöntemi ile izole edilmiştir.
DNA izolasyonunun ilk basamağı olarak, daha önce alınarak -20 °C de muhafaza edilen çalışma materyali keçilere ait kanlar oda ısısında çözdürülmüştür.
Tüplerde bulunan çözülmüş tam kandan otomatik pipet yardımıyla 100 µl alınarak daha önceden otoklavlanmış ve etiketlenmiş 1,5 ml’lik plastik tüplere konulmuştur.
Daha sonra alınan bu 100 µl kan üzerine, daha önceden hazırlanmış olan 1 X Tris- NaCI-EDTA solüsyonundan 300 µl, Tris-HCI’den (pH 8.0) 30 µl, proteinaz K’dan (10 mg/ml) 5µl ve %20’lik SDS solüsyonundan 10µl eklenerek vorteksle iyice karıştırılmıştır.
İyice karıştırılan bu karışım önceden 55 °C’ye ayarlanmış etüve konarak bir gece bekletilmiştir.
Ertesi gün 55 °C’lik etüvden çıkarılan tüplerin üzerine önceden katı fenolden hazırlanan sıvı fenolden 445 µl eklenmiş ve bu karışım oda ısısında hafifçe aşağı - yukarı çevrilerek 10 dakika karıştırılmıştır.
Karıştırma işleminden sonra, karışım 10 dakika 3000 devirde +4 °C’de ilk santrifüj işlemi yapılmıştır.
İlk santrifüj işleminin sonunda tüpün üstündeki sıvı kısım otomatik pipet ile dikkatlice alınarak, yine daha önceden otoklavlanarak etiketlenmiş yeni bir 1,5 ml’lik plastik tüpe konulmuştur.
Yeni tüpe konulan süpernatantın üzerine 445 µl fenol-kloroform (1/1) karışımı ilave edilmiştir.
Hazırlanan bu karışım tekrar yavaşça alt üst edilerek 10 dakika +4 °C’de karıştırılmıştır.
Karıştırma işlemi bittikten sonra tüpler tekrar 3000 devirde 10 dakika +4 °C’de santrifüj edilmiştir.
Santrifüjün bitiminden sonra tüpün üstünde bulunan supernatant kısım alttaki kısımla karışmaması için dikkatli bir şekilde alınarak otoklavlanarak etiketlenmiş yeni bir 1,5 ml’lik plastik tüpe konulmuştur.
Alınan bu süpernatant üzerine kloroform-izoamil alkolden (24/1) 445 µl konularak tekrar 10 dakika yavaşça alt üst edilerek karıştırılmıştır.
17
Karıştırma işlemi bittikten sonra tüpler tekrar 10 dakika 3000 devirde +4 °C’de santrifüj edilmiştir.
Santrifüj sonunda üsteki süpernatant kısım otomatik pipet yardımıyla alttaki kısmı karışmayacak şekilde dikkatlice alınıp daha önce otoklavlanmış olan yeni bir 1,5 ml’lik etiketli plastik tüpe konulmuştur.
Yeni tüpe konulan bu süpernatant üzerine 890 µl daha önceden -20 °C’ye konularak soğutulmuş olan %100’lük etil alkol’den eklenmiştir.
Etil alkol eklenmesinden sonra plastik tüpler, içindeki DNA iplikçikleri kümeleşinceye kadar hafifçe alt-üst edilmiştir.
Kümeleşen DNA iplikçiklerinin tüpün dibine çökmesi için tüpler 10 dakika 10000 devirde +4 °C’de santrifüj edilmiştir.
Santrifüj sonunda üstteki alkol kısım tüpler ters çevrilerek dökülmüştür.
Tüplerde bulunan DNA peletinin üzerine bu sefer yine daha önceden hazırlanarak -20
OC’de saklanan %70’lik etil alkol’den 890 µl eklenmiştir.
Alkol eklendikten sonra tüpler tekrar 10 dakika 10000 devirde +4 °C’de santrifüj edilmiştir. Santrifüj sonunda tüplerin üzerinde bulunan alkol dökülmüştür.
Tüplerin içinde bulunan alkolün tamamının uzaklaştırılması için tüpler etüvde kurumaya bırakılmıştır.
İçinde DNA bulunan tüpler tamamen kuruduktan sonra tüplerin üzerine daha önceden hazırlanan Tris:EDTA (TE buffer, 10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8.0) karışımından 100 µl ilave edilmiştir.
Ertesi gün DNA izolasyonunun başarısının kontrolü için örneklere ait DNA’lardan 2 µl alınarak %0,5’lik agoroz jelde 15 dakika elektroforez yapılmıştır.
Elektroforez sonunda, DNA izolasyonunun başarılı olduğu, örneklere ait elektroforez görüntüsünde jelde fluoresan parıldamanın gözlenmesi ile anlaşılmıştır.
Elde edilen DNA’lar polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) işleminde kullanılana kadar +4
°C de saklanmıştır.
3.3.1. DNA İzolasyonu Aşamasında Kullanılan Tampon Solüsyonlar Toplam Hacmi 30 ml olan 1 X TNE’nin Hazırlanması 1,5 ml Tris-HCI pH 8.0
3 ml 1 M NaCl
300 µl 0,5 M EDTA pH 8.0 25,2 ml bidistile su
18
1 Litre pH 8.0 Tris-HCI’nin Hazırlanması 12,1 g Tris
800 ml distile su
HCI ile pH ayarlandıktan sonra distile su ile 1 litreye tamamlanır.
3.4. POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU (PCR)
Çalışmada incelenen keçi ırklarında MTRN1A/ MnlI ve RsaI polimorfizmlerinin belirlenmesi amacıyla yapılan PCR işleminde forward: 5'–TCC CTC TGC TAC GTG TTC CT –3'; reverse: 5'– GTT TGT TGT CCG GTT TCA CC –3' olan bir primer seti kullanılmıştır. Çalışmada kullanılan “reverse” ve “forward” primerler liofilize olarak alınarak, primeri üreten firmanın prospektüste belirttiği oranlarda sulandırılmıştır.
MTRN1A geni için yapılan PCR işlemi için kullanılan karışım, yapılması, hesaplanması ve diğer tüplere dağıtılmasının kolaylığı nedeniyle 10’ar örneklik hazırlanmıştır. Her bir örnek için PCR işlemi; 1,5 mM MgCl2, 50 M dNTP, 0,2 M forward ve revers primerler, 1 X PCR tampon solüsyonu, 1U Taq polimeraz (5 U/l) ve 100 ng genomik DNA konulduktan sonra ddH2O ile toplam reaksiyon hacmi 25 l’ye tamamlanarak hazırlanan karışımla yapılmıştır.
PCR karışımları buz üzerinde hazırlandıktan sonra, tüpler ısı düzenleme cihazına (Bioneer Inc., South Korea) konularak PCR işlemi başlatılmıştır.
PCR işlemi, PCR karışımların bulunduğu tüplerin PCR makinesinde 95 oC’de 5 dakika tutularak örneklere ait DNA’ların tek iplikçik haline getirilmesinden sonra her bir siklusu;
94 oC’de 1 dakika 62 oC’de 1 dakika 72 oC’de 1 dakika,
olacak şekilde üç farklı ısı derecesinde tutulduğu toplam 34 siklus yapılmıştır. Son siklusu takiben tüpler 72 oC’de 10 dakika tutularak PCR işlemi sonlandırılmıştır. PCR sonunda, %2’lik agaroz jel ektroforezi ile PCR işleminin başarısı kontrol edilmiştir.
PCR’nin başarısı 824 baz çifti (bç) uzunluğunda PCR ürünlerinin görülmesi ile doğrulanmış ve elde edilen PCR ürünleri restriksiyon endonükleaz enzimleri ile kesilene kadar +4 oC de saklanmıştır.
19
3.5. GENOTİPLEME İÇİN ELEKTROFOREZ İŞLEMİ
Elektroforez işlemi Tris-BorikAsit-EDTA (TBE) kullanılarak hazırlanan tampon solüsyonu ile yapılmıştır. Tampon solüsyon, stok olarak 5X yoğunluğunda hazırlanmış, elektroforez ve jel dökümünde 1 X’e seyreltilmiştir. Elektroforez tampon çözeltisinin 5X olarak hazırlanmasında; 54 g tris base, 27,5 g borik asit ve 0,5 M pH 8,0’lik EDTA’dan 20 ml alınarak bir litre distile suda çözdürülmüştür. Hazırlanan 5 X elektroforez tampon solüsyonu koyu renkli şişelerde oda ısısında saklanmış, kullanılacağı zaman alınan bir ölçek 5 X stok solüsyonu distile su ile beş katı sulandırılarak 1 X’lik kullanma solüsyonu hazırlanmıştır. Hazırlanan 1 X’lik kullanma solüsyonu hem agaroz jelin hazırlanmasında hem de elektroforez elektrolit çözeltisi olarak kullanılmıştır. Jelin hazırlanmasında, laboratuarda bulunan mini elektroforez tankının jel teknesi için yeterli olan 35 ml, elektrolit çözeltisi olarak da 300 ml 1X TBE kullanma çözeltisi kullanılmıştır. Elektroforez tankında elektrolit solüsyonu olarak kullanılan 1 X TBE çözeltisi bant kalitesinin düşmemesi için her 7-8 elektroforezde bir yenilenmiştir.
3.5.1. Agaroz Jel Hazırlaması
PCR ürünlerinin ve restriksiyon enzimlerinin kesim ürünlerinin görüntülenmesinde PRONA® Basica le agaroz kullanılmıştır. Agaroz jel, PCR ürünlerinin görüntülenmesinde %2’lik, RsaI kesim ürünlerinin görüntülenmesinde ise %3’lük yoğunlukta hazırlanmıştır. İstenen yoğunlukta agaroz jel hazırlanmasında, PCR için 0,7 g agaroz, RFLP için 1,05 g agaroz tartılmış ve 250 ml’lik erlenmayere konulmuştur.
Erlenmayer üzerine konulan agaroz üzerine 1 X TBE tampon solüsyonundan 35 ml eklenerek, hazırlanan karışımın homojen ve hava kabarcıksız bir jel olması için karışım mikro dalga fırında şeffaflaşıncaya kadar ısıtılmıştır. Mikrodalga fırında şeffaflaşan agaroz jel üzerine PCR ve RFLP ürünlerinin ultra viyola (UV) görüntüleme sisteminde görüntülenebilmesi 0,5 µl/ml oranında ethidium bromide eklenmiştir. Ethidium bromide’in jel içine homojen dağılması için erlenmayer hafifçe karıştırılmış ve akan su altında erlenmayerin dış yüzeyi eli yakmayacak kadar soğutulmuş daha sonra jel tekneye dökülmüştür.
20
Bu tez çalışmasında, PCR ve RFLP ürünlerinin koşturulmasında elektrotlar arasındaki mesafesi 10 cm olan Owl® marka mini elektroforez sistemi kullanılmıştır. Jel teknesi olarak, 9 x 8 x 0,5 cm boyutlarındaki UV ışık geçiren jel teknesi kullanılmıştır. Kıl ve Halep keçilerinde MTNR1A geni yönünden genotipleme için yapılan PCR sonunda elde edilmesi beklenen 824 bç’lik tek bandın varlığının belirlenmesi amacıyla yapılan
%2’luk ilk elektroforez sonunda 824 bç’lik bantların göründüğü PCR ürünleri önce MnlI ve RsaI restriksiyon endonükleaz enzimleri ile kesilmiştir. Erlenmayerde hazırlanan jeller hava kabarcığı olmamasına dikkat edilerek jel teknesine dökülmüş, tarak jele yerleştirilerek, jelin katılaşması beklenmiştir. Saydam olarak jel teknesine dökülen jel, opak bir görünüme dönüşmesi jelin katılaştığını göstermiştir. Jel katılaştıktan sonra, örneklerin yükleneceği kuyucukların oluşmasının sağlayan jel tarağı, katılaşan jelden, jeli yırtmamaya özen gösterilerek çıkarılmıştır. Örneklerin yüklenmesi için hazır hale gelen jel elektroforez tankına konulmuştur.
3.5.2. Örneklerin Kuyucuklara Yüklenmesi
PCR ve RFLP işlemleri sonunda elde edilen ürünler kuyucuklara yüklenirken her örnek için 0,5 µl yükleme çözeltisinin (loading buffer) ile her örneğe ait PCR ve RFLP ürünlerinden 3,5 µl eklenmiş ve pipetle iyice karıştırıldıktan sonra kuyucuklara yüklenmişlerdir. PCR ve RFLP ürünlerinden elde edilen bantların büyüklüklerinin belirlenmesinde 100 bç’lik (MBI Fermentas® SMO241) DNA merdiveni (DNA Ladder) kullanılmıştır. Hem PCR hem de RFLP için yapılan elektroforez işlemi 35 dakika 80 volt elektrik gerilimi uygulanarak yapılmıştır. Jele yüklenen örneklerin ilerleyişleri takip edilerek elektroforez işleminin bitmesiyle tanktan çıkarılarak UV ışık veren jel görüntülenme sisteminde incelenmiştir. PCR işlemi ve incelenen bireylerin genotiplemeleri yapılmıştır.
3.6. BANTLARIN GÖZLENMESİ VE FOTOĞRAF ÇEKİLMESİ
Ethidium bromide ile boyanan PCR ve RFLP ürünlerinin UV ışıkta görülmeleriyle bireylerin genotiplemeleri yapılmıştır. Bu amaçla PCR ve RFLP ürünlerinin elektroforez ile koşturulmaları sonunda, jel UV ışık geçiren jel teknesi ile beraber elektroforez tankından çıkarılarak Kodak Gel Logic 200 Imagine (Kodak, Rochester, NY) görüntüleme sisteminin jel görüntülenme sehpasına konulmuştur. Sehpanın UV
21
ışığı açılarak, PCR ve RFLP ürünleri görüntülenerek bireylerin genotiplerinin kayıt altına almak için jel fotoğrafları çekilmiştir. Fotoğraf çekimi Kodak Gel Logic 200 Imagine görüntüleme sistemi ile yapılmıştır. PCR örneklerinin elektroforezi sonunda PCR’ın başarılı olduğu örneklerden 824 bç’lik tek bant elde edilmiştir. Bu tek bandın elde edildiği örneklere ait PCR ürünleri MnlI ve RsaI endonükleaz enzimleriyle kesilmiş ve örneklerin MTNR1A yönünden genotiplerinin belirlenmesinde kullanılmıştır.
3.7. PCR ÜRÜNLERİNİN MnlI ve RsaI ENDOKNÜKLEAZ ENZİMLERİYLE KESİMİ
Yapılan PCR işlemi sonunda 824 bç’lik tek bandın görüldüğü PCR ürünleri önce MnlI sonrada RsaI restriksiyon enzimiyle kesilmiştir. Kesim işlemi daha önce Genetik ABD laboratuarında başarılı bir şekilde uygulanan toplam hacim 25 μl olacak şekilde hazırlanan karışımla yapılmıştır. Enzim kesim karışımı, örnek başına 16 μl dH2O, 3 μl enzim tampon solüsyonu ve her örnek için 5 U MnlI ve RsaI endonükleaz enzimi konarak hazırlanan karışım üzerine 5 μl PCR ürünü eklenerek hazırlanmıştır.
MnlI enzimi ile kesimi, hazırlanan kesim karışımının daha önceden +37 oC’ye ayarlanmış etüve konarak dört buçuk saat bekletilmesini takiben, kullanılan kesim enziminin inaktive edilmesi için etüv +65 oC’ye çıkarılarak, tüpler bu sıcaklıkta 20 dakika tutulmuştur.
RsaI enzimi ile kesimi, hazırlanan kesim karışımının daha önceden +37 oC’ye ayarlanmış etüve konarak dört buçuk saat bekletilmesini takiben, kullanılan kesim enziminin inaktive edilmesi için etüv +80 oC’ye çıkarılarak, tüpler bu sıcaklıkta 20 dakika tutulmuştur.
MnlI enzim kesimi sonunda incelenen örneklerin genotiplerinin belirlenmesinde 610, 582, 560, 324, 254 ve 221 bç uzunluğunda altı bandın görülmesi beklenmiştir. RsaI enzim kesimi sonunda incelenen örneklerin genotiplerinin belirlenmesinde 411, 267, 70, 53 ve 23 bç uzunluğunda beş bandın görülmesi beklenmiştir.
Elektroforez sonunda jellerin fotoğrafları çekilerek sonuçlar kayıt edilmiş ve incelenen keçi ırklarına ait bireylerin MTRN1A/MnlI ve MTRN1A/RsaI polimorfizmleri yönünden genotipleri ve allel frekansları gen sayımı ile belirlenmiştir.
4. BULGULAR
Çalışmada Kayseri ve civarında yetiştirilen 110 baş (dişi/erkek) Kıl ve 55 baş (dişi/erkek) Halep keçisi incelenmiş olup bu örneklere ait kanlar -20 OC’de muhafaza edilmiştir. Alınan kanlardan fenol-kloroform-izoamil alkol yöntemi ile başarılı bir şekilde DNA’lar izole edilmiştir. DNA izolasyonunun başarısı, 15 dakika yapılan
%0.5’lik agaroz jel elektroforezi kontrol edilmiştir. DNA izolasyonu başarılı bir şekilde yapılan örneklerin DNA’ları kullanılarak PCR işlemi yapılmıştır. PCR işlemi sonunda elde edilen 824 bç’lik PCR ürünleri %2’lik agaroz jel elektroforezi ile görüntülenmiştir.
Yapılan %2’lik agaroz jel elektroforezi sonunda genotiplenen keçi örneklerine ait 824 bç’lik PCR ürünlerinin resimleri Şekil 4.1.’de görülmektedir.
Şekil 4.1. MTNR1A geninin PCR ürünleri 1-8: PCR ürünleri (a: 824 bç’lik bant), M: 100 bç’lik DNA merdiveni
23
Elde edilen 824 bç’lik PCR ürünleri MnlI restriksiyon enzimi tarafından kesilmemiştir.
Dolayısıyla tez çalışmasının başında görülmesi beklenen 610, 582, 560, 324, 254 ve 221 bç uzunluğundaki altı RFLP ürünlerinin hiç biri görülememiştir.
Elde edilen 824 bç’lik PCR ürünlerinin RsaI restriksiyon endonükleaz ile kesilmesi sonunda hem Kıl hem de Halep keçilerinde “RR” ve “Rr” genotipinin bulunduğu, fakat her iki ırkta da “rr” genotipine rastlanılmadığı görülmüştür.. İncelenen keçi örneklerinde ki “RR” genotipindeki bireylerde 411, 267 ve 53 bç uzunluğunda üç bandın görülmesi beklenmiştir. Ancak agaroz jel elektroforezi için çok küçük olan 53 bç’lik bant görülmemiştir. Fakat bireylerin genotiplerinin belirlenmesinde bu durum bir sorun teşkil etmemiştir. İncelenen keçi örneklerinde ki “Rr” genotipindeki bireylerde ise 411, 320, 267 ve 53 bç uzunluğunda dört bandın görülmesi beklenmiştir. Aynı şekilde 53 bç’lik bant RR genotipindeki gibi görülememiştir. İncelenen keçi ırklarının MTRN1A geni yönünden RsaI enzimi yönünden kesim profili Şekil 4.2’de görülmektedir.
Şekil 4.2. RFLP görüntüsü. 1, 3, 4, 5, 6, 8, 10 ve 11 numaralı kuyucuklar RR genotipli bireylere ait RFLP görüntüleri: 7 ve 9 numaralı kuyular Rr genotipindeki bireylere ait RFLP görüntüleri:
M: 100 bç’lik DNA merdiveni, (a; 411 bç’lik bant: b; 267 bç’lik bant: c; 320 bç’lik bant).
RsaI enzimi ile kesim sonucunda elde edilen kesim ürünlerinin koşturulduğu %3’lük agaroz jel elektoforezinde 53 bp’lik bant görülememiştir. Ancak RR ve Rr genotipindeki bireyler 267 ve 320 bp’lik bantların birlikte veya ayrı görülmeleriyle bireylerin genotiplerinin belirlenmesi mümkün olmuştur.
24
MTRN1A/RsaI polimorfizmi yönünden incelenen Kıl (%94,55) ve Halep (%96,36) keçilerinde RR genotipinin en yaygın genotip olduğu ve her iki yerli keçi ırkında da rr genotipinin bulunmadığı görülmüştür. Kıl keçilerinde incelenen 110 keçinin 104’ünün RR genotipinde, 6’sının ise Rr genotipinde oldukları görülmüştür. Kıl keçilerindeki genotipik görünüme benzer şekilde Halep keçilerinde de genotiplenen 55 keçinin 53’ünün RR, ikisinin ise Rr genotipinde oldukları gözlenmiştir. İncelenen örneklerde R allelinin frekansı Kıl keçilerinde 0,973, Halep keçilerinde ise 0,982; r allel frekansı Kıl keçilerinde 0,027, Halep keçilerinde ise 0,018 olarak hesaplanmıştır. İncelenen her iki keçi ırkının da MTRN1A/RsaI polimorfizmi yönünden Ki-kare analizine göre istatistiksel olarak dengede oldukları gözlenmiştir (Tablo 4.1).
25
Tablo 4.1. Kıl ve Halep keçilerinde MTNR1A geninin allel ve genotip frekansı
ns: İstatistiksel olarak önemsiz; χ2: Ki-Kare değeri; Sd: Serbestlik değeri
Irk n Genotip Frekansı (%) Allel Frekansı
χ2 İstatistik Önem Kontrolü (Sd=1)
RR Rr rr R r
Kıl Keçisi
110 Gözlenen 104 (%94,55) 6 (%5,45) 0 (%0,00)
0,973 0,027 0,09 ns
Beklenen 104,08 5,84 0,08
Halep
Keçisi 55 Gözlenen 53 (%96,36) 2 (%3,64) 0 (%0,00)
0,982 0,018 0,02 ns
Beklenen 53,02 1,96 0,02
27
5. TARTIŞMA ve SONUÇ
Türkiye’de 2003 yılında 6 516 080 baş olan Kıl keçisi varlığı 2015 yılında 10 210 338 başa çıkmıştır (21). Bu durum genel olarak Türkiye’de ki diğer çiftlik hayvanlarındaki popülasyon büyüklüğündeki değişimle örtüşmektedir. Bu artışa Gıda, Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı’nın hayvancılıkta uyguladığı destek ve ıslah projelerinin etkili olduğu düşünülebilir. Son yıllarda keçi sütünün kaliteyi artırması nedeniyle dondurma yapımında kullanılması ve içme sütü olarak ta tüketimi üretimini yaygınlaştırmıştır.
Laktasyon süresinin koyundan uzun ve sağımın koyuna göre kolay olması nedeniyle keçi yetiştiriciliğine olan ilgi her geçen gün artmaktadır. Ayrıca çocukların beslenmesinde önemli bir besin maddesi olan sığır sütü yerine, süt alerjisi olan çocukların keçi sütünün rahatlıkla kullanılabilmesi gerek dünyada gerekse ülkemizdeki keçi sütüne olan talebi artırmıştır (46).
Türkiye’de yetiştirilen diğer yerli çiftlik hayvan ırkları gibi yerli keçi ırklarında gerek süt gerekse döl verimi yönünden planlı ıslah çalışmaları yapılmamıştır. Ülkemizde keçi, sığır ve koyunun gerisinde kalmış bir türdür. Ancak laktasyon süresinin uzunluğu , yıllık süt veriminin koyundan yüksek, sağımın koyundan kolay ve makineli sağıma uygun olması, sütünün de pazarlamasının kolay olması nedeniyle son yıllarda keçi yetiştiriciliğine bir yöneliş olmuştur. Bunun sonucu da yüksek süt verimine sahip keçi ırklarının yetiştirilmesine olan talebi artırmıştır. Yüksek süt verimine sahip ırkların elde edilme isteği yerli keçi ırklarının yüksek verimli Avrupa orijinli ırklarla değiştirilmesine ya da bu ırklarla melezlenmesi sonucunu doğurmuştur. Ancak bu uygulamalar yetiştiricinin kısa vadede istediği süt verim artışına imkan vermesine rağmen, uzun vadede önemli keçi ırklarımızdan Kıl keçilerinin ve hatta Tiftik keçilerinin saf örneklerinin ortadan kalkmasına neden olabileceği unutulmamalıdır. Türkiye keçi varlığının en büyük kısmını oluşturan Kıl keçileri 80’li ve 90’lı yıllarda ülkemizdeki ormanlar için en büyük tehlike olarak ilan edilmiş ve özellikle dağ ve orman köylerinde
28
kıl keçisinin varlığı hızla azaltılmıştır. Türkiye Kıl keçisi sayısı 1980 yılında 15 milyon baş iken, 2009 yılında 4 981 299 başa kadar düşmüştür (17, 21).
Keçi sütüne olan talepteki artış, daha fazla süt elde etmek için hem Kıl keçisi sayısında artışa hem de süt verimi daha yüksek olan Avrupa orijinli Saanen ve Halep keçileriyle melezlemelere yöneltmiştir.
Genel olarak çiftlik hayvanlarında verimlerin artırılması amacıyla yapılan ıslah ve seleksiyon çalışmalarında, moleküler genetik alanında elde edilen gelişmeler yeni bakış açısı doğurmuştur. Özellikle 2000’li yıllardan sonra çiftlik hayvanları yetiştiriciliğinde ki ıslah ve seleksiyon çalışmalarında moleküler markırların kullanılmasına yönelik araştırmalarda büyük bir ivme kazanmıştır. Bu sayede genel olarak düşük verimli yerli ırkların önemli verim özellikleri yönünden daha kısa sürede ıslah edilebilmesi ve önemli gen kaynağı olan yerli ırkların varlıklarının sürdürebilmeleri için umut ışığı olmuştur.
Bu yöntemler kullanılarak önemli verim özellikleri yönünden istenen seviyeye sahip olmayan ve çeşitlilik gösteren yerli ırkların korunacağı ve yerli ırklarda ıslah çalışmalarının yapılabileceği düşünülmektedir.
Ortaya çıkmasında aditif genlerin görev aldığı kantitatif özellikler yönünden damızlık adayların genotipleri, fenotiplerinden yüksek doğrulukta tahmin edilememektedir. Bu nedenle çiftlik hayvanlarının kantitatif karakterler yönünden ıslah edilmeleri için yapılan seleksiyon uygulamalarında bireylerin ebeveynlerinin fenotipik verileri yeterli olmamaktadır. Sadece fenotipik verilere bakılması, yapılan seleksiyonun isabet derecesini ve başarısını düşürecektir. Ayrıca birçok verim özelliği için damızlık adayının fenotipi, bir cinsiyette veya pubertadan sonra veya kesimden sonra belirlenebilmektedir. Dolayısıyla iyileştirilmesi istenen özellik açısından bir damızlık adayının genetik değerlerinin yüksek doğrulukta tahmin edilmesi yapılacak ıslah çalışmasından elde edilecek başarı için çok önemlidir. Bu sayede yapılacak seleksiyon uygulamaları sonunda, yüksek genetik değere sahip damızlık adayları seçilebilecektir.
Yüksek genetik değere sahip damızlık adaylarının seçimi ise ıslah edilmesi istenen özellik için eldeki sürüde hızlı bir genetik ilerleme elde edilmesine olanak verecektir.
Sığır, koyun ve keçi gibi jenerasyon aralığı uzun çiftlik hayvanlarında klasik ıslah yöntemleri ile elde edilecek başarı düşük ve bu ıslah yöntemleri uzun, kararlı çalışmayı gerektirmektedir. Bu nedenle, çiftlik hayvanlarında ıslahın etkinliğinin artırılması ve hedeflenen başarıya ulaşmada moleküler markırların kullanılması bir umut olmuştur.
