EMBRİYO DEĞERLENDİRMESİNDE İSTANBUL KONSENSUSU WORK-SHOP TOPLANTISI:
UZMANLAR BULUŞMASI
Alpha Scientists in Reproductive Medicine and ESHRE Special Interest Group of Embryology ( Human Reproduction,2011,26:1270-1283)
The Alpha Executive ve ESHRE Special Interest Group of Embryology üyelerinden gelen istekler doğrultusunda embriyonun morfolojik değerlendirilmesine ilişkin olarak 26-27 Şubat 2010’da İstanbul Türkiye’de 2 günlük bir work-shop düzenlendi.
Work-Shop Sunumları:
ESHRE Embriyoloji SIG Atlas Projesi: 2000 yılında Gianaroli ve ekibince hazırlanıp basımı yapılan Atlas of Embryology ‘nin yenilenerek embriyologlar için yeni bir embriyo skorlama sistemi içeren hale getirilmesi projesini içermektedir.
ASEBIR Consensus Scheme:
İspanya’nın IVF sikluslarında ve embriyo değerlendirmesinde kullandığı skorlama sistemidir.Bu sisteme göre gebelik oranları Day-2 ye göre Day -3 embriyo transferinde daha yüksek bulunmuştur.
(Torello et al.2005) Day-4’de embriyoların kompaktlaşması açısından kontrol edilmesi önerilir.Çünkü blastokist gelişiminde gecikmiş sıkışma (Ör.Day-7 veya Day-8) implantasyon için kötü prognoz sayılmaktadır.
The UK/ACE Grading Scheme:
Bu evreleme şeması Association of Clinical Embryogists(ACE) ve de The British Fertility Society (BFS) tarafından oluşturulmuş embriyo morfolojisini değerlendirmek üzere kullanılan bir şemadır.
The USA Scheme:
Bu şema sistemi ABD’de IVF kliniklerinde 1992’den 2007 yılına kadar , kliniklerin gönüllü olarak Society for Assisted Reproductive Technology (SART)’a gönderdikleri bilgiler ışığında
oluşturulmuştur.Basit bir evreleme sistemi esas alınmıştır.Evreleme tanımlamaları Good(iyi),Fair(kabul edilebilir),Poor(zayıf) şeklindedir ve tüm embriyolara uygulanabilir niteliktedir. Bölünme evresindeki embriyolar fragmentasyon ve simetrilerine göre basit bir skala ile değerlendirilirler. Blastokist ise inner cell mass(ICM) iç hücre kitlesi ve trofoektoderm (TE) morfolojisine göre değerlendirilir.
Amerika’da yapılan 2 çalışmada, Vernon ve ekibi (2009) embriyo değerlendirmesinin (70000 transfer edilmiş embriyoda)canlı doğumla sonuçlanan gebelikte anlamlı olduğunu,Racowsky ve ekibi
ise(2009)yaptığı çalışmada Day-3(üçüncü gün) embriyo fragmentasyon ve simetrisinin canlı doğum ile sonuçlanan gebelikle korelasyon gösterdiğini bulmuştur.
Oositlerin Değerlendirilmesi (Day-0):
IVF sikluslarında insan embriyosunun gelişimini tamamlamasında preovulatuar peryotta nükleer mayotik ve stoplazmik maturasyonun normalliği önemlidir.
Üzerinde durulan yegane dismorfizm düz(mRNA içermeyen,smooth) endoplazmik retikulum(sER) agregasyonudur.Bunun erken fetal kayıp ve ciddi gelişimsel defektlere (ör.Beckwith-Wiedeman Sendromu) neden olduğu gösterilmiştir.(Otsuki ve ekibinin çalışması 2004)sER’de bu anormalliğin intrastoplazmik kalsiyum artışı ve buna bağlı organogenezdeki anormalliklerden kaynaklandığı düşünülür.
Oositlerin Değerlendirme ve Evrelenmesi:
Oositlerin değerlendirmesinde özellikle 2 anomali dikkate alınmalıdır: 1.Dev oositler:Anormal genetik içeriğe sahip olabilirler ve 2. sER agregasyonu içerebilirler ki bu da lethal sonuçlara neden olabilir.
Fertilizasyon ve Zigotun Değerlendirilmesi(Day-1):
Fertilizasyonun Değerlendirilmesi:
Fertilize bir oosit 2 pronukleus ve 2 polar cisim içermelidir.İnseminasyondan 16-18 saat sonra , ICSI’dan ise 1 saat sonra kontrol edilebilir.
Erken Klivajın Değerlendirilmesi:
Zigotun ilk hücre klivajının zamanı embriyo kalitesi ve implantasyonun önemli bir göstergesidir.Ayrıca erken klivaja giren embriyolarda kromozomal defektler daha düşük insidansta izlenir.Normal klivaj zamanı, inseminasyon sonrası 24 saattir. 20 saatten önce izlenen klivaj kötü prognoz göstergesi olabilir. Kromozomal anormallikleri gösterebilir. Pronükleer skorlamanın da prognozu etkilediği gösterilmiştir.Pronukleuslar benzer büyüklükte, fertilize oositte merkez yerleşimli ,yakın ve karşılıklı ,pronukleusta nükleolar prekürsör cisimcikler(NPBs) bulunmalı ve sayısı 5-7 tane olmalıdır.NPBs’ler normal embriyo gelişiminde önemlidir.
Klivaj evresindeki embryoların değerlendirilmesi (Day-2 ve Day-3) Fragmentasyon:
Fragment anükleer, membrana bağlı bir ekstraselüler sitoplazmik yapı olarak tanımlanabilir.
Fragmentlerin hücrelerden ayrımı öncelikle yapılmalıdır. Fragmentasyon insidansı ,değerlendirmek için zordur. Johnson ve ekibi (2003) fragmentleri Day-2 embriyoda <45 µm’lik ve Day-3 embriyoda
>40µm’lik hücreler olarak tanımlamıştır. Day-3 embriyoda <%10 fragmentasyonun , implantasyon oranları üzerine etkisi ihmal edilebilir düzeyde bulunmuştur (Van Royen 2001).Fragmentasyon seviyesi artışı ile anoploidi birlikte olabilir.
Multinükleasyon:
Bir blastomer birden fazla interfaz nukleus içeriyor ise bu multinuklear blastomer olarak adlandırılır.
Multinüklear blastomer anormal olarak nitelendirilir. Multinükleasyona neden olan etkenler,kültür medianı veya uygun olmayan ortam sıcaklığı olabilir. Multinükleasyon düzensiz klivaja neden olabilir.
Multinükleasyonun yüksek dereceli kromozomal anormalliklerle ilişkili olduğu gösterilmiştir.Ayrıca düşük implantasyon ihtimalini arttırır ve gebelik-canlı doğum oranlarını azaltır.
Klivaj:
Düzensiz Klivaj: İnvitro insan embriyolarında daha sık izlenir. Blastomerlerin 1/3’den fazla boyutta farklılık içermesi olarak tanımlanmıştır. Multinükleasyon ve yüksek dereceli kromozomal anormallik ile koreledir.
Klivaj hızı: Çok hızlı veya çok yavaş oluşan klivaj, implantasyon üzerine negatif etkilidir.”Normal hücre sayısı” ile kromozomal yapı arasında korelasyonun olduğu da bildirilmiştir.
Morfoloji ve Kromozomal Anormallikler:
Klivaj Evresi:
En sık görülen dismorfizmler (fragmentasyon, multinükleasyon, asimetri vs)’in aynı embriyoda görülmesi post-mayotik anormallik örneğin mozaisizm, monospermik poliploidi ve haploidi ile ilişkilidir. ”Arrested embryo” 24 saatlik periyodda klivaj göstermeyen,”slow embryo” Day 3 te ( postinseminasyon 68±1 saatte) 6 veya daha az sayıda hücre içeren ancak 24 saatte bölünme göstermiş olandır. ”Normal embryo”lar Day-3’de 7-9 hücreye erişirler , <%15 fragmentasyon gösterirler ve multinükleasyon içermezler.”Accelerated embryo” Day 3’de >9 hücre içerir.
Blastokist Evresi:
Zayıf morfolojiye sahip, Day-3 embryolardan gelişen blastokistlerde kromozomal anomali ihtimali yüksektir. Blastokist evresindeki kültürlerde post-mayotik anomaliler ekarte edilirken, aneuploidi ayırt edilemez. Kromozomal anomaliler ancak preimplantasyon genetik tanı yoluyla belirlenebilir.
Embriyo morfoloji hiyerarşisinin değerlendirilmesi:
Sjoblom ve ekibi(2006) implantasyon ilekuvvetli korelasyon gösteren 5 parametre tanımlamışlardır.
Bunlar sitoplazmik görünüm, pronukleus ve nukleus, sitoplazmik defisit ve hücre sayısı ile Day-2’de multinükleer blastomer varlığıdır. Ayrıca Scott ve ekibi(2007) pronüklear simetri yoksa ve uygun olmayan boyutta Day-2 blastomer ve multinükleasyon varsa implantasyon başarısızlığı ve fetal gelişim anormalliği beklendiğini belirtmişlerdir. İmplantasyon başarısızlığının erken parametreleri ; pronüklear morfoloji, her bir nükleus için NPBs sayısı ve Day-2 embryo morfolojisidir.
Morula ve blastokistlerin değerlendirilmesi (Day 4-6):
Blastokist gelişimi ile Day-3’deki embriyo hücre sayısı arasında kuvvetli ilişki mevcuttur. Bir embriyo gelişmeye başlamış ise bu durumda ICM ve TE ayrı ayrı skorlanabilir. Bu bir sonraki evreleme adımında inverted mikroskop kullanılır.
ICM için: Grade A,sıkı şekilde bir araya gelmiş , pek çok hücreden oluşan ; Grade B, pek çok hücreden oluşmakla birlikte gevşek olarak bir arada bulunan; Grade C, az sayıda hücreden oluşan ICM’i tanımlar.
TE için: Grade A, pek çok hücrenin oluşturduğu kohesif epitelyum ; Grade B, az sayıda hücreden oluşan gevşek epitelyum ; Grade C, az sayıda hücre varlığını tanımlar.
Konsensusa Ait Önemli Noktalar:
Yukarıda anlatılan sunumlar ışığında aşağıda anlatılacak konsensusa ait önemli noktalar
çıkartılmıştır.Ancak bu oosit ve embriyonun değerlendirilmesine yönelik ilk konsensus öneri yayınıdır ve düzenli aralıklarla bu bilgilerin güncellenmesi gerekecektir. Bu belirlenen hususlar embriyo ve oosit değerlendirilmesinde minimum standartlardır ve farklı laboratuarlarda belirlenecek ek
değerlendirme kriterlerine kısıtlama getirmez.Başka bir şekilde ifade ile farklı laboratuarlar ek değerlendirme kriterleri getirseler de ,her ART hizmeti veren merkez bu konsensusa ait bilgileri uyguluyor olmalıdır.
Fertilize oosit ve embriyonun incelenme ve bildirilme zamanı
İnceleme zamanının standardizasyonu farklı laboratuarlar arası sonuçların karşılaştırılmasında önemlidir. Bu zamanlama inseminasyon zamanına göre belirlenecektir.Bu zamanlama inseminasyon sonrası saat olarak ifade edilir.Tüm biyolojik süreçlerde genetik olarak izlenebilecek bir variabilite söz konusudur ki pek çok hasta veya vakada bu variabiliteye rastlanır.Embriyolar için araştırmanın 2 bölümü vardır,hücre sayısı/evreleme ve grade.Post-inseminasyon ile alakalı olarak embriyo değerlendirmesi ayrıca yapılmalıdır.
Oosit Skorlaması:
Konsensusa göre,bir oosit daire şeklinde,uniform bir zona pellusidaya sahip,inklüzyon içermeyen translüsen bir stoplazması uygun boyutta bir polar cisim içermelidir.Ayrıca oositler hem nüklear hem de sitoplazmik maturasyon içermelidir ancak bu özellik her oosit için aynı olmamakla birlikte senkron da göstermeyebilir.
Kumulus-Oosit Kompleks(COC) Skorlaması:
İki değerli bir skorlama sistemidir(0 veya 1).İyi COC skorunu “1” tanımlar. Genişlemiş bir kumulus ve radial koronadan oluşur
Zona-pellusida Skorlaması:
Zona pellusida kalınlığını ölçmenin belirlenmiş bir faydası yoktur. Ancak hastaya spesifik etki olabilir ve bu gözleme göre zona pellusida kalınlığı veya rengi belirtilebilir.
Perivitellin Aralık:
Perivitellin aralıkta inklüzyon varlığı anormaldir. İnklüzyonların varlığı not edilir ancak ,boyut veya sayı belirtmek gerekmez. Ayrıca perivitellin aralık ancak çok genişse not edilir.
Polar cisim skorlaması:
İnsemine olmamış oositte polar cisim varlığı veya yokluğu not edilmelidir. Polar cisim boyutu çok büyük olmadıkça not etmeye gerek yoktur.Geniş polar cisme sahip oosit insemine edilmemelidir çünkü aneuploidik olabilir.
Stoplazmanın skorlaması:
Stoplazmanın homojen olması beklenir.Homojen olmayan bir stoplazmanın bilinmeyen biyolojik önemi vardır.
Organellerin kümelenmesinin dışında stoplazmada granulasyon , hastalık belirtisidir Ayrıca sER diskleri belirgin olarak anormal sonuçlarla ilişkilidir. Bu tipteki oositler insemine edilmemelidir.sER varlığında kardeş oositler de sER açısından incelenmelidir.
Vakualizasyon
5-10 µm boyutlu birkaç vakuolün varlığı önemli olmasa da >14µm’den büyük vakuol varlığı fertilizasyon başarısızlığı ile seyreder.
Fertilizasyonun kontrolü
Optimal fertilize oosit daire şeklinde, iki polar cisim içeren, uygun boyutta sıralı pronükleuslu ve farklı membranlara sahiptir. Pronukleuslar eşit sayıda olmalı ve NPBs ‘lar ideal olarak ekvatoral alanda sıralı ve membrana bitişik yerleşmelidir.Hem pronüklear boyut hem de lokalizasyon fertilizasyon
kontrolünde önemlidir.Pronukleusdaki anormal bulgular: genişçe birbirinden ayrılmış pronukleuslar,birbirinden çok farklı boyutta pronukleuslar ve mikronukleus.
Periferik sitoplazmik translusensinin (halo) değerlendirilmesinin prognostik değerine ilişkin yeterli veri yoktur.
İkinci bir “Day-1 değerlendirmesi “ yapmak incelemeyi yapan laboratuarın sağduyusuna bırakılır. İkinci bir kontrol syngami veya erken-klivajın belirlenmesi amacıyla yapılabilir.
Pronüklear skorlama:
Fertilizasyon kontrolü ile aynı zamanda yapılmalıdır. Fertilizasyon kontrolü açısından ek bilgi
verir.Pronüklear skorlama, simetrik, non-simetrik ve anormal şeklinde yapılabilir. Anormal kategorinin içinde hiç NPBs içermeyen pronukleus da vardır ki bu yapıya “hayalet pronukleus”denir. Eğer tek bir nüklear prekürsör cisim(NPB) içeriyor ise bu yapıya da “bulls-eye pronukleus” denir.
Klivaj evresindeki embriyolar:
Hücre Sayısının Belirlenmesi:
Post-inseminasyon zamanına göre Day-2’de 4 hücre ve Day-3 ‘de 8 hücre konsensus tarafından önerilen ideal hücre sayısıdır.
Fragmentasyon:
Fragmentasyon derecesi ; hafif (<%10), orta (%10-25) ve ciddi (>%25) şeklindedir.Fragmentasyon yüzdeleri hücre değerlerine bağlıdır.Örneğin 4 hücreli bir embriyoda %25 fragmentasyon volumde bir blastomere eşittir. Fragmentasyonun lokalizasyonunu belirtmek gereksizdir.
Multinükleasyon:
Multinükleasyon değerlendirmesi Day-2’de(post-inseminasyon 44±1 saatte )yapılmalıdır. Laboratuar her bir embriyo için multinukleasyon varlığını belirtmelidir.İdeali ise Day-2 bir embriyoda her bir blastomerin nukleasyon paterninin belirtilmesidir. Day-3’de yapılan multinukleasyon
değerlendirmesi,daha küçük boyutlu hücreler ile karıştırılabileceği için uygun bir değerlendirme olmaz.İki tanımlama şeklinde multinukleasyon şemalanır; var veya yok.
Hücre Boyutu:
2,4 veya 8 hücreli evrelerde blastomerler daima eşit boyutta olmalıdır.Hücrelerde boyut farkı varsa klivaj evresi tamamlanmamış demektir.Evreleme şeması iki tanımlamalıdır; hücreler uygun ve eşit boyuttadır veya değildir.
Klivaj-evre embriyo skorlama sistemi:
İdeal bir Day-2 embriyo 3 boyutlu olarak tetrahedral yapıda olup, birbirine eşit 4 adet mononüklear blastomer içerir ve <%10 fragmentasyon gösterir.
İdeal bir Day-3(post-inseminasyon 68±1 saat) embriyo ise 8 adet birbirine eşit mononüklear blastomer içerir ve <%10 fragmentasyon gösterir. Skorlama formatı hücre sayısı,grade ve fragmentasyon şeklinde olmalıdır.
Day-4 değerlendirme (Morula evresi)
Bu evredeki bir embriyo post-inseminasyon 92±2 saattedir. Kompakt şekilde veya kompakt şekle geçmektedir ve klivajın 4. rounduna girmektedir. Day-4 embriyo morfolojisindeki varyasyonlar görünüşe göre dışlanacak hücreleri içerir, etkisi açık değildir. Bunun istisnası yarıdan fazla embriyonun dışlanmış olmasıdır ki böyle bir durum zayıf prognoza işaret eder.
Day-5 değerlendirme (Blastokist evresi):
Post-inseminasyon 116±2 saatlik dönemdir. ICM ve TE içerir. ICM’in implantasyon açısından yüksek prognostik değeri vardır, aynı zamanda fonksiyonel TE de elzemdir. Blastokist değerlendirilirken hem evreleme hem de skorlama kullanılır.Her bir gelişim evresinde Gardner A-C skalasına göre ICM ve TE sınıflanmalıdır.Fakat evreleme 1-3 arası yapılır ve evre 1, Gardner A ‘ya karşılık gelir. Bir blastokistin regüler siklik kollapsı ve sonrasında re-ekspansiyonu normaldir.
Non-viable embriyo tanımı:
Bir embriyoda gelişim her hangi bir evrede 24 saat durursa non-viable embriyo tanısı konur. Böyle bir durumda tüm hücreler dejenere olur veya lizise uğrar.
