VISION COVID-19 EASYPREP-FAST REAL TIME PCR TEST KİTİ KULLANIM KLAVUZU
Yayın Tarihi: 01/04/2020
Bu ürünün kullanmadan önce bu kılavuz dikkatlice ve tamamen okunmalıdır. Herhangi bir sorunla karşılaşırsanız, lütfen yardım için Teknik Servis Merkezimizle iletişime geçiniz.
İÇİNDEKİLER
ÖRNEKLERİN TOPLANMASI, MUHAFAZA EDİLMESİ VE TAŞINMASI ... 2
NUMUNE TOPLAMA, AMBALAJLAMA VE SAKLANMASI ... 2
ÖRNEK TOPLAMA ... 2
NUMELERİN SAKLANMASI... 2
KİTLERİN SAKLANMASI ... 2
9. PROSEDÜR... 2
9.1 RNA Ekstraksiyonu... 2
9.2 RT-PCR Protokol’ü ... 2
NÜKLEİK ASİT ŞABLONU EKLEME ... 3
TAHLİL KONTROL ÇÖZÜMLERİ ... 4
GERÇEK ZAMANLI PCR DÖNGÜ PROGRAMI ... 4
Örneklerin Toplanması, Muhafaza edilmesi ve Taşınması
Numune Toplama, Ambalajlama ve Saklanması
Numunelerin yetersiz veya uygun olmayan bir şekilde toplanması, depolanması ve taşınması muhtemelen yanlış test sonuçlarının elde edilmesine yol açacaktır. Numune toplama eğitimi, numune kalitesinin önemi dolayısıyla şiddetle tavsiye edilir. CLSI MM13-a uygun bir kaynak olarak referans verilebilir.
Örnek Toplama
Uygun toplama yöntemleri için numune toplama cihazı üreticisinin talimatlarına takip edin.
Numuneler, sadece naylon veya sentetik kumaş gibi bir uç ve bir alüminyum veya plastik sap ile Eküvyon çubuğu kullanılarak toplanmalıdır. Kalsiyum aljinattan üretilmiş eküvyon çubuğu kabul edilemez ve ahşap saplı pamuklu çubuklar önerilmez. Eküvyon çubukları (2-3 ml virüs içeren) hemen steril tüplerin içine koyunuz.
Numelerin Saklanması
Numuneler, toplandıktan sonra 72 saate kadar 2-8°C'de saklanabilir. Ekstraksiyonda bir gecikme bekleniyorsa, numuneleri -70°C veya daha düşük bir sıcaklıkta saklayın. Ekstrakte edilen nükleik asit -70°C veya daha düşük bir sıcaklıkta saklanmalıdır.
Kitlerin Saklanması
Vision Covid-19 Easyprep-Fast RT-PCR kitinin saklanması -10 ile -30 °C arasında olmalıdır.
9. Prosedür
9.1 RNA Ekstraksiyonu
Kit içeriğindeki enzim ekstraksiyon tamponu içerdiği için ön işlem olarak izolasyon gerektirmez.
9.2 RT-PCR Protokol’ü
Reaksiyon Karışımı 1,8 ml X2
Oligo Karışımı N1 150 ul
Oligo Karışımı N2 150 ul
Oligo Karışımı RP 150 ul
Negatif Kontrol N1-N2 100 ul
Nükleaz İçermeyen Su 400 ul
Control Positive N1- N2
100 ul
Pozitif Kontrol RP 50 ul
Negatif Kontrol RP 50 ul
Rox Boyası 100 ul
Şekil 2
1. Reaktifleri laboratuvarda kurun ve Kabini temizleyin, reaksiyon karışımlarını, Oligo karışımlarını ve kontrol gruplarını buz veya soğuk bloğa yerleştirin. Hazırlarken ve kullanma sırasında karışımları soğuk tutun.
2. Başlamadan önce karışımları çözün .
3. Reaksiyon karışımı ve Oligo karıştırılıp bulundukları tüp uygun biçimde pipetlenir.
4. Santrifüj reaksiyon karışımı ve Oligo karışımları tüpün altındaki içeriği toplamak için 5 saniye boyunca karışır ve daha sonra tüpü soğuk bir rafa yerleştirir.
5. Her hedef için (N1,N2,RP) bir 1,5 mL’lik mikrosantrifüj tüpü etiketlenir.
6. Test başına ayarlanacak reaksiyon sayısını (N) belirlenir. Negatif Kontroller, Pozitif Kontroller ve RP reaksiyonları ve pipetleme hatası için fazla reaksiyon karışımı yapmak gereklidir. N’yi belirlemek için aşağıdaki kılavuzu kullanın:
Kontroller dahil örnek sayısı (n) 15 veya daha fazlaysa, N = n + 2
7. Her hedef için, her reaksiyon karışımına eklenecek her reaktifin miktarını hesaplanır (N=reaksiyon sayısı)
8. Reaktifler daha önce etiketlenen ilgili 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne dağıtılır. Reaktifler eklendikten sonra karışım aşağı yukarı pipetaj yapılarak karıştırılır. VORTEKS
YAPILMAZ.
9. İçeriği tüpün altında toplamak için 5 saniye santrifüjlenir ve ardından tüp soğuk bir rafa yerleştirilir.
10. Reaksiyon strip veya 96 kuyucuklu plate’e yerleştirilir.
11. Her PCR Mix'in 15 μL'si aşağıda gösterildiği gibi sıra boyunca ilerleyen uygun kuyulara dağıtılır (Şekil 2).
ADIM Reaktif Reaksiyon Başına Eklenen
Reaktif Hacmi
Tavsiye
1 Oligo Karışımı 1.5 µL Reaktifleri 10 test PCR çalışması için pipetleme hatalarına karşı
1 test daha fazla hazırlayın.
2 Reaksiyon Karışımı 10.0 µL
3 Nükleaz İçermeyen Su 3.50 µL Yüksek hacimli Rox boyası ihtiyacı olan cihazlar için: 1 µL
Rox boyası ekleyin ve Nükleaz içermeyen su 2,5 µL ekleyin
Düşük hacimli Rox boyası ihtiyacı olan cihazlar için: 0,50 µL Rox boyası ekleyin Nükleaz içermeyen su 3 µL ekleyin
4 Rox Boyası 1 µL/ 0.5 µL
Toplam Hacim 15.0 µL
Şekil 3
12. Nükleik asit işleme alanına taşınmadan önce negatif Kontrol ve pozitif kontrolü hazırlanır.
Negatif kontrol için A1'i seçerseniz, kontaminasyon riski nedeniyle pozitif kontrol için A12 kullanılmalıdır.
13. NTC numune kuyularına (A1) 3,5 μL nükleaz içermeyen su pipetlenir. Devam etmeden önce NTC kuyuları güvenli bir şekilde kapatılır.
Nükleik Asit Şablonu Ekleme
1. Nükleik asit örnek tüpleri yaklaşık 5 saniye hafifçe vortekslenir.
2. İçeriği tüpün altında toplamak için 5 saniye santrifüjlenir.
3. Santrifüjlemeden sonra, ekstrakte edilmiş nükleik asit numune tüpleri soğuk plakaya yerleştirilir.
4. Örnekler, Şekil 2'de gösterildiği gibi test edilmekte olan spesifik teste 2-11 numaralı sütunlara (sütun 1 ve 12 kontroller içindir) eklenmelidir. Bu örnek için etiketlenmiş tüm kuyucuklara ilk örnekten 5.0 μL'yi dikkatlice pipetlenir (örn. Örnek "S1" aşağı sütun # 2).
Ekleme sırasında diğer örnek kuyuları kapalı tutulur. Her eklemeden sonra pipet uçları değiştirilir.
5. Çapraz kontaminasayonu önlemek ve numune takibini sağlamak için numunenin eklendiği sütun güvenli bir şekilde kapatılır.
6. Kontaminasyonu önlemek için eldivenler sık sık ve gerektiğinde değiştirilir.
7. Kalan örnekler için 4. ve 5. adımlar tekrarlanır.
8. Tüm reaksiyon plakası kapatılır ve reaksiyon plakası pozitif şablon kontrol işleme alanına taşınır.
Tahlil Kontrol Çözümleri
1. Sütun 12'nin örnek kuyularına 5 μL pozitif kontrol solüsyon pipetlenir (Şekil 2). Kontrol RNA'sının eklenmesinden sonra kuyular güvenli bir şekilde kapatılır. NOT: 8 tüplü şeritler kullanılıyorsa, numune konumunu belirtmek için her şeridin TAB'ı etiketlenir.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A N1 N1 N1 N1 N1 N1 N1 N1 N1 N1 N1 N1
B N2 N2 N2 N2 N2 N2 N2 N2 N2 N2 N2 N2
C RP RP RP RP RP RP RP RP RP RP RP RP
D E F G
Şekil 4:
2. Reaksiyon tüpü şeritleri kısa süre 10-15 saniye santrifüjlenir. Santrifüjlemeden sonra soğuk plakaya geri dönülür. NOT: 96 kuyulu plakalar kullanılıyorsa, plakalar 30 saniye boyunca 500 x g, 4 ° C'de santrifüjlenir.
Gerçek Zamanlı PCR Döngü Programı
VISION COVID19 EASYPREP
Sıcaklık °C Süresi Döngü Sayısı
Reverse Transcription
45 10 Min. 1
Initial activation
95 2 Min. 1
Denaturation 95 5 Sec. 40
Annealing / Extension *
60 20 Sec.
Şekil 5: Vision Covid19 Easyprep Realtime-PCR Kurulumu
