Yrd.Doç.Dr.Yosun MATER
DNA ARAÇLARI ve BİYOTEKNOLOJİ
DNA Düzenlenmesi
•İnsan DNA’sı ile yapılan ilk çalışmalar için yani çalışma yöntemi geliştirilmesi için
yaklaşık 1 milyon dolar harcandı.
•Bugün bu teknoloji kullanılarak yaklaşık 900 dolar’a insan DNA’sı okunabiliyor.
•DNA kalıtım materyali olarak izole edilebildikten sonra, DNA üzerinde uygulamalar,
DNA teknolojileri adını aldı ve 2 şekilde yapıldı (Şekil 20.2).
• 1970’lere kadar iki farklı kaynaktan elde edilen DNA’ları karıştırarak kullanıldı.
•Sonra bu teknoloji 1970’lerden sonra geliştirildi ve BİYOTEKNOLOJİ adını aldı.
•Günümüzde biyoteknoloji; bitki geliştirilmesinden, hayvan ıslahına, kriminolojiden,
klonlamaya ve tedaviye yönelik araştırmalara kadar pek çok alanda uygulanmaktadır.
•Restriksiyon Endonükleazlar denilen ve DNA’yı belli bölgelerden kesen enzimlerin
geliştirilmesi ile DNA’yı istediğimiz bölgelerden istediğimiz zaman kesebilmeye
başladık.
•Bu tip restrüksiyon enzimlerine Tip II restrüksiyon endonükleazlar denir.
•Bunlar fiziksel olarak DNA’nın haritalanmasına izin verir.
•DNA hibridasyonunda Standart
makineler 120.000 nükleotidi
yaklaşık 10 saatte sentezlerken ve
bunlar kısa diziler halinde DNA
sentezlenirken,
•Günümüzde kullanılan yeni nesil
dizileme
makineleri
700-900milyon nükleotidi yaklaşık 10
saatte sentezlemekte ve uzun
zincirli DNA parçaları üretmeyi
mümkün kılmaktadır.
•DNA hibridizasyonu, DNA çoğaltılması ve/veya DNA dizilenmesi denilen bu yöntem
ilk kez Frederick Sanger tarafından geliştirilmiş ve 1980’de araştırıcıya Nobel ödülü
kazandırmıştır.
•Bu yöntemde ilk adım DNA’nın tek iplikli hale getirilmesidir.
•DNA’yı oluşturan iplikleri tamamlayacak olan nükletidlerden her biri normal ve
floresan işaretli dideoksinükleotid veya dideoksi (dideoxyribonucleotide, dideoxy)
şeklinde karışıma konur.
•Bu karışıma ayrıca, küçük sentez başlatacak DNA parçaları yani primerler (primers)
konur.
•Zincir uzaması (chain termination sequencing) sırasında normal nükleotitler eklenir.
Didioksi nükleotitler eklenince o parçacığın sentezi durur.
•Böylece parçalar farklı büyüklüklerde işaretli nükletidler yardımıyla belli bir noktaya
kadar yeniden yapılanır.
•Jel üzerinde yürütülerek ortaya çıkan zincir işaretli nükleotidler sayesinde okunur
•DNA hibridizasyonu son
10 yılda yeni nesil
dizileme aletleri ile
yapılmaktadır .
•Gerçek zamanlı
(Real-time) olarak eklenen
400-1000 nükleotitte bir
bilgisayar ekranından
dizilemeyi araştırıcıya
göstermektedir (Şekil
DNA ve Restriksiyon Endonükleazlar
•DNA teknolojilerinde ve/veya biyoteknolojide ilk adım nükleik asit hibridizasyonu yani DNA’nın tamamının ve/veya belli kısımlarının çoğaltılması olmuştur.
•Bu amaçla kullanılan en önemli basamaklardan biri DNA’nın Restriksiyon endonükleaz (RE) enzimleri vasıtasıyla kesilmesidir.
•Bu enzimler, kısa DNA dizilimlerini özgül olarak tanıyan ve bu dizilimlere yakın bölgelerden veya bu dizilimler içindeki spesifik bölgelerden DNA’yı kesen enzimlerdir.
•Bu dizilere palindromik diziler adı verilir.
•RE’ların doğal biyolojik fonksiyonu, bakteriyel savunma mekanizmasında oynadıkları roldür. •Bakteriye giren yabancı DNA’ları da kesebildiklerinden, intraselüler bakteriyel patojenleri inaktive edebilmekte böylece bakteriyi virüslerden ve yabancı DNA’lardan korumaktadırlar.
•Mikroorganizmalar kendi RE’larının kendi DNA’larını kesmemesi için çeşitli modifikasyonlar kullanmaktadırlar (Metilasyon v.b.).
RESTRÜKSİYON ENDONÜKLEAZLAR NERELERDE
KULLANILIR?
*DNA haritası çıkartılmasında
*Populasyon polimorfizminin analizinde
*DNA molekülünün yeniden düzenlenmesinde
*Probların hazırlanmasında
*Mutant organizmaların meydana getirilmesinde
*DNA’nın modifikasyon statülerinin analizinde
DNA
Ligazlar
Rekombinant
Molekülün
Yeniden
Yapılanmasını Sağlar
•Buna DNA rekombinasyonu denir.
•DNA ligaz nukleotidler arasındaki fosfodiester bağlarını katalizleyerek,
nukleotidlerin birleşmesini sağlar ve yeni formda bir DNA-Rekombinant DNA
oluşturur.
Agaroz Jel Elektroforezi
•İzole edilen genomik DNA ve kesim sonucu elde edilen bant profilleri agaroz
jel elektroforezi ile incelenebilmektedir.
•DNA negatif yüklü bir moleküldür.
•Elektrik alanda yer alan bir jel matriksin içinde, elektrostatik yüküne ve
büyüklüğüne bağlı olarak hızlı veya yavaş hareket eder (Şekil 20.7).
•DNA örneklerine 1 µl 6x boya (agaroz için) eklenir, karıştırılır ve birkaç saniye santrifüj
edilir.
•Boya sukroz içeriğinden DNA örneklerinin Tris-Borat-EDTA (Tris-Borate-EDTA, TBE)
tampondan ağır olmasını, dolayısıyla kuyularda kalmasını sağlar.
•Aynı zamanda içerdiği Bromofenol mavisi boya nedeniyle elektroforezin ve DNA
moleküllerinin hareketinin gözlenmesini yardımcı olur.
Agaroz Jel Elektroforezinin Yapılışı;
•DNA örnekleri bir DNA belirteç ile birlikte pipet yardımıyla jele yüklenir.
•Elektrotlar güç kaynağına uygun şekilde bağlanır, 80 V’a ayarlanır ve çalıştırılır.
•Kullanılan boyanın pozisyonuna göre yeterince yürütüldüğüne karar verildiğinde güç
kaynağı kapatılarak, jel UV transilluminatörde incelenir.
•İstenirse jelin fotoğrafı çekilebilir.
•Böylece istenen DNA kesildiği parçaların boyutlarına göre incelenip, seçilebilir. (Şekil
E.coli Kendi İçine Yabancı DNA Aktarılmasına İzin Verir
•Yapay transformasyon teknikleri ilk önce E.coli bakterisi kullanılarak
çalışılmıştır.
•Böylece ilk kez Transgenik terimi ortaya çıkmıştır.
Moleküler Klonlama
•Konukçu (Host) – Taşıyıcı (Vektör) sistemleri bakterilerde yabancı DNA’lar
topluluğu taşımasına izin verir (Şekil 20.5).
•Plazmitler ve yapay kromozomlar taşıyıcı olarak kullanılabilir.
•Yabancı DNA restriksiyon endonükleaz ve ligaz enzimleri kullanılarak bakteri
DNA’sına yerleştirilebilir (Insertion).
•Bir kere taşıyıcı konukçuya yerleşti mi, her hücre döngüsünde yerleştirilen
yabancı genide çoğaltır.
•DNA kütüphaneleri bir organizmanın genom içeriklerinden oluşur
•Bir DNA kütüphanesi için karmaşık yapıdaki karışım DNA taşıyıcılarda toplanır.
•Bu aşamada ilginç dizileri belirlemekte mümkün olur. •Bir kütüphanede DNA’nın çoğaltılan parçalarını RNA olarak da elde edebiliriz.
•Reverse transkriptaz enzimi yardımıyla RNA’nın DNA kopyasını yapabiliriz(Şekil 20.11).
•In situ Hibridizasyon (In-situ hybridization) adını alan bu yöntemle, her tamamlayıcı mRNA probu florasan ile işaretlenerek canlı içinde yer alan bu proteinlerin tam yerlerini belirlemek ve bu parçaları cDNA’ya
(Complementary DNA, Tamamlanmış DNA)
Karmaşık Karışımlardaki Özel DNA’ların Tanımlanması
Hibridizasyonla (Hybridization) Gerçekleşir
•DNA çözülüp (Denature)- birleşebilen (Nature) bir yapıdır.
•Yani tek veya çift iplikli şekilde olabilir. Tek iplikli şekilde DNA farklı
kaynaktan gelen azotlu bazlar ile eşleştirilebilir.
•Buna hibridizasyon denir. Böylece DNA’nın bilinen bir parçası
işaretlenebilir.
Özel Klonların Kütüphaneden İzolasyonu
•Hibridizasyon bir kütüphane içinde, tek bir gen ile ilgilenenler için çok sık
kullanılan bir yöntemdir.
DNA Analizi
Restrüksiyon Haritalarının Moleküler “İşaretleyiciler” ile Desteklenmesi
•DNA’nın yapılan ilk haritası restrüksiyon endonükleazlarla kesim haritası olmuştur (Şekil 20.6).
Southern Blot DNA’daki Farklılıkları Açığa Çıkarır
•Southern Blot’ta karmaşık karışım elektrik yardımıyla ayrılır ve bir filtre kağıdına geçirilir. •Böylece özel DNA dizileri hibridizasyon için hazır hale getirilir.
•Benzer teknik mRNA’ya uygulanırsa Northern Blot, proteine uygulanırsa Western Blot adını alır.
•Uzun Kesilmiş Parçalar (Restiction Fragment Length Polymorphisms, RFLPs)
tanımlamalarında DNA Southern Blot uygulamasından geçer ve DNA’daki farklılıklar parmak izlerindeki farklılıklar gibi açığa çıkar.
•Buna DNA parmak izi analizi denir ve işaretli polimorfik DNA’lar kullanılarak yapılır.
DNA Dizisi Gen ve Genom Bilgisi Hakkında Ayırtedici Bilgi Verir
•DNA dizisi zincir reaksiyonu kullanılarak, DNA’nın baz dizisi, şekli ve parçacıkları hakkında tanımlayıcı bilgiler verir.DNA’ya Uygulanan Polimeraz Zincir Reaksiyonu (=PCR) Analizi
Hızlandırır
•PCR, DNA’nın iki kısa öncü dizi (primer) ile tek iplikli şekline dönüştürülerek çoğaltılması esasına dayanır.
•Bu sayede sadece çoğaltmak istenilen bölgenin de çoğaltılması mümkün olabilir.
•Dairesel replikasyon, ısının kontrol edilmesi, Taq polimeraz enziminin eklenmesi ile gerçekleşir
(Şekil 20.8).
•Eğer bu yöntemde PCR’ı yapılan molekül mRNA molekülü ise bu durumda bu PCR yöntemine Reverse Transkriptaz ile PCR anlamında RT-PCR adı verilir (Şekil 20.12).
•Protein etkileşiminin belirlenmesinde hibritli sistem, mayalarda da kullanılan bir sistemdir. • Bir füzyon proteini ve bir gen habercisi arasında olur, bu Protein –Protein etkileşimi şeklinde bir çalışmadır.
•Benzer şekilde bir diğer PCR temelli sistem DNA mikro-dizileme (micro-array) sistemidir. •Bu şekilde bir mRNA’nın başka hangi genlerde olduğu taranabilir (Şekil 20.13).
Genetik Mühendisliği
Ekspresyon Vektörleri Özel Gen Ürünlerinin Üretimine İzin Verir (Şekil 20.6,
20.9)
•Ekspresyon vektörleri, içlerinde yer alan yabancı DNA’yı okutmak için Promotor ve
tanımlanan kıymetli bölgeler (Enhancers) içerirler.
•Genler Türlere Ait (=Özgü) Özel Engellerden (=Bariyer) Geçebilirler
•Transgenik organizmalar içlerinde yer alan yabancı genleri çoğaltabilirler ve bunları
farklı türlere geçirebilirler veya farklı mutasyonlara yol açıp, fenotiptede
görülebilecek morfolojik farklara yol açabilirler.
•Klonlanmış Genlerin Yapılandırma Çalışmalarında “Knockout” Fareler de
Kullanılabilir
•Knockout farelerde yaban tipi gen tarafından tekrar onarılabilecek bir geçiçi cevap
vermeyen mutant bir gen oluşturulur (Şekil 17.15).
Biyoteknolojik Çalışmaların Farklı Uygulamaları
İnsan Proteinlerinin Bakterilerde Üretilmesi
•İnsülin gibi insan proteinlerinin bakterilerde üretilmesi çok iyi sonuçlar vermiştir ve böylece başka proteinlerin üretilmesinde öncülük etmiştir.
Rekombinant DNA ile Bulaşıcılığın Azaltılması
•Kültürlerle üretilen bazı hastalık etkenleri belli dozlarda hayvanlara verildiğinde hastalığın daha hafif geçtiği gözlenmiştir.
•DNA aşıları hücresel bağışıklığı harekete geçirip, tedavide rol oynamıştır. • Denemeleri devam etmektedir.
Genetik Hastalıklarda Doğrudan Genetik Tedavi Uygulanması
•Gene terapisi kusurlu genin yerine doğrusunun konmasını içerir.
•Ne yazık ki bu şekilde denenmiş iki tedaviden birinde işe yaramamış, diğerinde hastaların %15’de ölümle sonuçlanmıştır (Şekil 20.22).
•Benzer şekilde DNA teknolojilerine dayalı yöntemler, sağlıkla doğrudan ilişkili olmayan Kriminoloji gibi alanlarda da (Şekil 20.24) yoğun olarak kullanılmaktadır.
•Hayvanlarda ve insanlarda son yıllarda DNA araçları ile yapılan geliştirme çalışmaları ve kök hücre çalışmaları büyük öneme sahiptir.
Yrd.Doç.Dr.Yosun MATER
Ziraatte Uygulamaları
•Tümör uyarıcı (Ti=Tumor inducing) Plasmitleri Geniş Yapraklı Bitkilere
Transforme Edilebilir
•Tümör uyarıcı plasmitleri, geniş yapraklı bitkilere aktarılabilmektedir.
•Böylece bitki içine yabancı gen sokmak mümkün olmaktadır.
•Sayısız uygulaması günümüzde kullanılmaktadır.
•Otçul parazitlere karşı kullanılan ilaca (=Herbisid) dayanıklı mısır bitkisi
türleri,
•Böceklere karşı kullanılan ilaca (İnsektisit) dayanıklı mısır bitkisi türleri,
•Bitkisel ilaçların eldesinde kullanılan bitkilerde kullanılmaktadır.
•Günümüzde bu çalışmalarda transgenik bitki ve hayvanlar beraber
•Günümüzde DNA teknolojileri kullanılarak yapılmış klonlama (Şekil 20.15, 20.16 ve 20.17) ve kök hücre çalışmaları (Şekil 20.19) oldukça gelişmiştir.
•Özellikle kök hücrelerin canlıda çalışma sistemleri (Şekil 20.20), farklılaştırılmaları (Şekil 20.21) ve tedavide kullanılmaları üzerine yapılan araştırmalar önemli bir yer tutmaktadır.
