İnsan ve rat karaciğer primer hücre kültürlerinde farklı N-nitroso
bileşiklerinin DNA üzerindeki etkileri
Taner PAMUKÇUı, Alexandre SCOTT!
iKırıkkale Üniversitesi. Veteriner Fakültesi. Biyokinıya Anabilim Dalı. Kırıkkale: ~ Straytelyde Cniversite.,i. RiyoloJi Büliimü. Glasgow
Özet: On kanserojen f\-nitroso bileşiği, insan ve rat karaciğer primer hücre billlirlcri üzerinde DNA 'ya h,ısar ıerıci akuvlteleri açısından denendi; alkaline düsyon tekniği kullanılarak DNA bölünmesi ve nicel otoradyografi kullanılarak da programLl1lmaml~ DNA sentezleri ölçüldü. Subtoksik konsantrasyonların aralığında pozitif dozla ilgili cevaplar her iki türün h(lCrelerınden 10-32 mM'lik :"J-nitrosodiethylamine, I,S-IO mM' lik N-nitrosodi-n-propylamine. 1-3.2 mM'lik f\-nitrosomorpholine.
1-3.2 m\-l'lik :"J-nitrosopiperidine. 3.2- i S mM'lik N-nitrosopyrrolidine. 0.32- I.S mM' lik N-nitroso-N-methylurea. O.32-I.S m\t1' lik N nıtrosc-N-ethylurea ve 0.1-0.32 mM' lik N-nitroso-N-butylurea kullanılarak elde edildi. N-nitrosodi-n-butylaminc i mM' Iık doymu~ çÜ/.elusi sabitti. Insan karaciğer hücrelerinin tepkileri nitelik açısından rat karaciğer hücreleriyle benzerdi. Fakat istatıstik ,ıçıdan. N-nıırosodimeıhylamine. :"J-nitrosomorpholine. N-nitrosopiperidine. N-nitrosopYITolidine ve f\-nitnıs\ı-i\-butylurea kullanllal,1k gözlemlenen programlanmamış DNA sentezlerinde ve DNA hasar miktarlarında iki llir arasında önemli f,ırklılıklar görüldü. Diğer taraftan. 20 insan ve 20 r.1t donöründen alınan kültürlerde 5 mM'lik N-nitrosodimethylamine ile uyarılıııı~ genotoksik etkilerdeki mıktarsal farklılıklar bu nitrosamine ve diğer N-nitroso bileşikleriyle ortaya çıkarılan ortalama türler arası farklılıklardan daha bü;'liktü. Ral hepatositlerindeki DNA onarım duyarlılığını i~aret eden bu sonuçlar. insan hepatositlerındekı N-nitroso bıleşıklerinin genotoksik potansiyelini tahmin etmek için geçerli hir modelolduğunu gösterdi.
Anahtar kelimeler: DNA hasarı. insan, karaciğer primer hücre kijItürü. N-nitroso hile~ikleri. rat
The eftccts of dinerent N-nitroso compounds in primary cultures of human and rat hepatocytes on the
DNA
Suınmary: Ten earcinogenic N-nitroso eompounds were examined for DNA-damaging activity in prımary cultures of human '1nd rat h,:patocytes. DNA fragmentation was mcasured hy the alkaline dution techniClue. and unscheduled Df\A synthesis was by qu,ıntitatiıe mıtoradiography. Positive dose-related responses in the range of subtoxic eoncentrations indicated were obtained ın cclls of hoth species with N.nitrosodiethylanııne (I 0-32 mM). :"J-nitrosodi-n-propylamine (ı.s-l O mM). N-nitrosomorpholine (i -3.2 mM). N nıtroscpıperidine (1-3.2 mM). N-nitrosopyrrolidine (3.2-1 S mM). N-nitroso-N-methylurca (O.32-I.S mM). N-nitroso-i\ .ethylurea (0.32-1.8 mM) and N-nitroso-f\hutylurea (O. i-0.32 mM). N-nitrosodi-n-hutylamine was practicaııy inactive at the maximal soluble conccntr,.tion (I mM). The results obtained from human hepatoeytes were Clualitatively similar LO those of rat hepatoeytes. hut staıistieaııy. imp0rlant differenees hetween the two speeies in the amounts of DNA damage and/or unseheduled DNA synthesis were observed wiıh N-nitrosodimethylamine. f\-nitrosomorpholine, N-nitrosopiperidine. N-nitrosopyrrolidine and N-nitroso-f\. huıylıırca. On the other hand, 4uantitative differences in the gcnotoxie effeets indueed hy 5 mM-N-nitrosüdimethylaınine in eultures derived from 20human donors and from 20 rat were greater than average eoınpounds. These results indieate thaı the rat hepatocyte DNA repair assay is a valid lI1terspeeies diflen::nccs displayed hy this nitrosamine and hy other N-niıroso model for predicting the genotoxi" potentıal of N-nitroso compounds in human hepatocytes.
Ke;' words : DNA damage. hepaıocyte. human: N-nitroso compounds. rat
Giri~
N-nİtroso bileşikleri (NOernin birçok hayvan tü-rlimk tü ~llÜr oluşumuna neden olduğu ortaya çıkarılmıştır
(2.9,14.=0). Kuvvetli kanserojen aktiviteleri nedeniyle. NOC un geniş çevresel oluşumları. ön aminlerden ve <ll.otlu maddelerden iııviv() oluşum ihtimali ve önemli öl-çüdeki etkileri. belirli bölgelerdeki artan kanser olayları ilc ilişkilendirilmesini ve insanın maruz kaldığı miktarın tayin e(: ilmesini sağlamıştır (14. 19.29,32). Bartsch ve Monıesano ıi) in viv(J olarak oluşan ya da mesleki ve çevresel nedenlerle ortamda olan NOC'yc maruz kalan
insanların bu bileşiklerin kanserojen t:tkilerine karşı du-yarlılıklarını biyokimyasal. patolojik. deneysel ve epi-demiyolojik incelemelerden elde edilen sonuç'lar ışığında incelemişlerdir. Metabolizmadaki niınmıminler genellik-le karaciğere karaciğer dışı dokulardan daha yliksek oran-da ilgi gösterdiği için. insan karaciğerindeki kimyasal maddelerin biyolojik aktivitelerinin değerkndirilmesi için güvenilir bir modeli olarak gösterilen insan karaciğer dokularının primer kültürleri üzerinde deneyler ya-pılmıştır. (6.8,13.24,34). DNA büllinmesi. alkaline elüs-yon tekniği (I 7) ve nükleon başına net ağırlık olarak
mik-24 Taner Pamukçu - Alexandre Scott
K (ml-I): DNA elüsyonunun ba~langıç oranı fR: filtre üzerinde kalan DNA
V: Elüsyon miktarı (13 mı)
"K" dirckt bir ~ekilde tck zincirkırılma sayısı ile orantılıdır.
Bulgular
Sitotoksisite konusundaki ön veriler, incelenen iO adet NOenin, farklı konsantrasyonlarına 20 saat süre ile serumsuz WME uygulanan rat karaciğer hücrelerinelen arta kalan fraksiyonların ölçülmesiyle elele edileli. Trypan bl uc excluding'1i hücrelerin %60 oranından daha fazlası. 100 mM NDMA, NDEA ve NPYR; 18 mM NDD1\, 10 mM NMOR, NPIP ve NMU: 3,2 mM NEU ve i mM
DNA onarım sentezleri ve otoradyografik deneme
UDS, Williams'a göre (36) hiçük değişikliklerle otoradyografik olarak izah edilir (21). Hem insan hem de ratlarda yüzer adet hücre üzerinden değerlendirme ya-pıldı. Nükleus üzerindeki gümü~ taneciklcr eksi otop-lazma içinde eşit boyuttaki bir saha üzerindeki taneciklcr hcr bir ni.jklcus ba~ına net ağırlık olarak hesaplandı. Nük-leusları gümüş taneciklcri ile çok yoğun hir şekilde i~a-retli olan S safhasındaki hücreler kolay bir şekilde fark edildi.
Bu çalışma, Straytdyde Üniversitesi Biyoloji Bö-lümü Laboratuvarıarında gerçeklc~tirildi
Kullanılan N-nitroso bile~ikleri
10-32 mM'lik N-nitrosodiethylamine (NDEA), 1.8. lO mM'lik N-nitrosodi-n-propylamine (NDPA). 1-3,2 mM'lik N-nitrosomorpholine (NMOR). 1-3,2 mM'Jik N-nitrosopiperidine (NPIP), 3,2-18 mM'lik N ..nitrosopyrro-lidine (NPYR), 0,32- 1.8 mM'lik N-nitroso-N-methylurea (NMU), 0,32- 1.8 mM'lik N-nitroso-N-ethylurea (NEU), 0,1-0,32 mM'lik N-nitroso-N-hutylurea (NBU), i mM'lik doymuş çözeltisi sabit N-nitrosodi-n-hutylamine (!'ıDBA), 5 mM' lik N-nitrosodimethylamine (NDMA).
DNA bölünmesi ve alkalin elüsyon tekniği
DNA bölünmesi, daha önce tarif edildiği gibi (4) al kalin elüsyon tekniği ile değerlendirildi. Bu teknikle. tck zincir kırıkları olan DNA' nın ve/veya alkaliye dayanıksız bölgelerin mevcudiyeti, kontrollerle kar~ıla~tırı)dığı gihi. hızlandırılmı~ DNA elüsyonu ilc ortaya çıkanldı. So-nuçlar hcm filtreden yıkanıp giderilmi~ DNA' nın yüzde oranı olarak hem de kontroller (Kt-Kc) üzerinden el~isyon oranı olarak ifade edildi. Denklem aşağıdaki gihi olu~-turulur.
(-In fR) V
K=
Karaciğer primer hücre kültürleri
Çalı~manın materyalini operasyon sonrası atılacak olan laze insan karaciğer dokuları ve Sprague-Dawley erkek alhino ratlarından alınan karaciğer dokuları oluş-llIrdu. Karaciğcr donörlerinin sonuçları Tablo 1'de su-nuldu. Karaciğer hücreleri, daha önce Strcm ve ark. (33) tarafından tarif edildiği gihi kesik yüzeydeki büyük kan damarlarına sokulan sondalar sayesinde kollajen per-füzyonla sağlıklı dokudan ayrıldı. Çe~itli donörlerden elde edilen karaciğer hücreleri, 5x 106'dan lOx 109'a kadar
sulandırıldı. Trypan hlue exclusion'la ülçüldüğü gibi per-füzyondan sonra kullanılabilir hücre oranları Tablo l' de sunuldu.
Rat karaciğer hücreleri, Williams (35) tarafından tarif edildiği gibi kollajen perfüzyon yoluyla, Sprague-Dawley erkek alhino ratlarından (2OG'den 250 g'a kadar) elde edildi. Kullanılahilir hücre oranları lk80'den Cj(l95'e kadar sınıflandırıldı.
Izole insan ve rat karaciğer hücreleri, % 10 fötal dana serumu ve 50 mg/ml'lik gentamisin içinde mu-hafaza edildi. Bu süspansiyon eşit miktarlarda aşağıda tarif edildiği gihi plastik kapların içine yerleştirildi. DNA hölünmesi üzerine yapılacak deney için 60 mm'lik açık kapların içine 2x 10" hücrc ve UDS'nin helirlenmesi ama-cıyla yapılacak dency için ise kollajen ile kaplanmış 3,5 mm 'lik kaplar içine 1x iO" hücre ycrleştirildi. %95'i hava,
'kSi CO,'den olu~an hir atmosferdc 37°C'lik ısı altında 3 saaılik ek hir süreden sonra, karaciğcr hücrcleri serumsul. Williams hücre kültürü medyumu (W ME) içinde test hi-le~iği ile 20 saat süreyle inkübasyona bırakıldı. NOC kul-lanıından hemcn önce direkt olarak ortamından ayrıldı ve i()pCi/ml
i
metill- 'Hı
tinlİdin İIıkühasyon ortamına ilave edildi.Bu işlemin bitiminde hücreler, tryparı blue exclusion yoluyla sitotoksisite, DNA hölünmesi ve UDS için de-nemli .
Materyal
ve Metot
ıarsa! ntoradyngrafi (36) yoluyla programlanmamış DNA sentezi (UDS) kullanılarak değerlendirilmiştir. Model olarak rat ın kullanılmasının doğruluğunu kontrol etmek, risk miktarlarındaki değerler konusunda daha iyi hilgi sağlamak ve NOC'nin potansiyel kanserojen özelliklerini hulmak amacıyla. rat ın karaciğer hücrelerinin primer kül-ıürlerimleki aynı uç noktalar ölçülerek hir karşılaştırma yapıl1111~tır (3.15,37).
Bu çalışmada. insandaki NOC'nin potansiyel ge-notoksik aktivitesi konusunda ek hilgi edinmek için insan hücrelerindeki DNA'nın onarım ve hasarı ile ilgili sen-tezlcri ve kist olu~um kapasiteleri konusunda on kimyasal madde incelenmiştir.
Tablo i. Karaciğer hücrelerinin izolasyonund.!Il elde edilen mırnunelerin hastalarına ait veriler. Table ı. Dctai!s of patients from whorn liver sarnples were obtained for the isolation of hepatocytes.
2 3 4 5 6 7
Cınsiyet Erkek Kadın Erkek Erkek Erkek Kadın Kadın
Ya~ (yıl) 58 47 71 54 70 39 SO
Kriter i,;in tanı (Safra kanalı Kavernöz Kavenıöz Karaciğer Kistik kanal llidatid kist Safra kesesı
karsinornu) heınanjiom hernanjiorn karsinoınu stenoıu adcnokarsi ndınu
Bılınıbin (ıng/dı) 0.5 ı.ı 9.7 13.7 0.3 16.7 ALP
n
100 425 (U/L) /\ST' (U/L) 31 24 36 551 63 32 156 ALT (lI/L) 29 3130 41 1131 55 64 158 y-GT (IJ/L) 42 386 59 CpK (lI/L) 22 2026 34 73 LDH ([;ıL) 260 574 163 207 256Canlı h;jcre (Ok) 91 91 95 87 53 82 95
8 9 LO i i 12 13 14
Cınsiyet Erkek Kadın Kadııı Erkek Erkek Erkek Erkek
Ya~ (yl.l) 68 66 67 66 52 65 75
Aıneliyat için belirti Kolon Kolon Kolon Karaciğer Safra Mide Karacığer
karsinoımımın korsinornunun karsinornunun karsinoınu kanalı adenokarsino- .ıdenomu
karaciğer karaciğer karaciğer karsinoınu ımımın karaciğer
ınetastazlan metastazlan metastazları metastazı
Bilirubin (ıng/dı) 0.3 OA 0.9 4.7 0.5 lA ALP (L'/L) 154 115 152 iSi 103 136 ASP (U/Ll 40 37 15 142 93 51 73 ALT (llL) 30 37 167 92 43 12 y-GT (U/L) 40 42 589 234 153 CpK (lI/L) 79 34 LDH (U/L) 209 374 197 165 123
Canlı hıiere ('Ye) 71 95 85 SO 82 86 Si
15 16 17 18 19 20
Cınsiyeı Erkek Kadın Erkek Erkek Kadın Erkek
Ya~ (yıl) 74 70 35 57 66 56
Allleliy.Jt için belirti Karaciğer Karaciğer Mide Hidatid kist Hidatid kist Yaygııı safra kanalı
karsi noıııu karsinornu karsinomunun tıkaıııklığı ve
Norna karaciğer karaciğer apsesi
metastazı Bılinıbin (mg/dı) 0.9 0.6 0.6 0.7 0.5 0.9 ALP (U/L) 94 136 104 69 421 289 ASTA (U/L) .. 27 28 36 21 3i 48 ALT (LlL) 96 22 47 79 32 159 y-GT (WL) SS 131 32 178 353 CpK (U/L) 33 79 34 23 24 84 LDH (U/Ll 275 549 21 i 142 126 182 Cınlı !ııiere (%) 73 77 91 76 86 67
ALP. alkalen fosfataz:ASTa. aspartat aminotransferaz; ALT, alanine aminotransferaz: y-GT. gaınrna glutaıııiltransfcral.: CPK. kre-alin fosfokinaz: LDH. laktat dehidrogenaz.
NBV seviyesinde elde edildi. NDBA'da ise; düşük çö-zülchilirlik özelliğinden dolayı sitotoksik bir kon-santrasY'.Jl1a ulaşamadı. Her bir NOe için, sitotoksisite denemelerinde test edilen en yüksek doz, ilk denemede hücre büyümesini C'j{l30'dan daha aşağıya çekmek için, maksimum seviyedeydi. Benzer bir duyarlılığı elde etmek için, insan karaciğer hücrelerindeki UDS ve DNA
bö-1ünmesini sağlayan NOe kapasitesi. aynı sınıf kon-santrasyonlara maruz bırakıldıktan sonra incelendi. fakat. insan ve rat karaciğer hücreleri arasındaki \eya aynı türün farklı donörlerinden elde edilen hepatosit primer kültürü arasındaki sitotoksisitenin muhtemel farklılıklarının bu-lunması için canlı kalan hücre parçaları her bir denemede ölçüldü. NDMA 5 mM'lik konsantrasyon halinde pozitif
26 Taner Pamukçu - Alexandre Scott
kontrololarak kullanıldı. Incelenen NOCnin genotoksik
etkilerinin karşılaştırılması, NDEA'nın rat karaciğer
hüc-rekri ic,:in daha toksik olmasına karşın. MMDR'nin
sü-rekli hir şekilde insan karaciğer hücrelerindeki hücre bü-yümcsi üzerinde azaltıcı hir etki sağladığını
göstermek-tedir. Diğer tüm NDClerin, canlı kalan hücre parçaları
ac,:ısından iki tür arasında önemli bir fark oluşturmadığı ortaya c,:ıkmıştır. Sitotoksisite test sonuçları, DNA elüs-yon oranındaki hir artışın, örneğin; DNA böli.inmesi gihi
ve UDS'nin NDEA, NDPA, NMOR. NPIP, NPYR.
NMC. NEU ve NBU tarafından hem insan hem de rat
ka-raciğer hücrelerinde uyarıldığında, bunların 0,1'den 10
nı M' ye kadar sınıflandırılabilecek en küçük efektif
kon-santrasyonlar olduğunu göstermiştir. Bunun aksine; DNA
hasar ve tamirinin ya düşük derecede ya da her iki türün,
hepatosit primer kültürünün ve NOCnin çözülebilirlik
li-mitini gösteren 1 mM' lik NDBA'ya maruz
bırakıldıkla-rında hemen hemen hiç mevcut olmadıkları görüldü.
Aktif NOCde DNA hülünme miktarının doza bağlı
01-masll1<l karşın, zaman zaman daha yüksek
konsantras-yonlarda toksisite uyarımıl'la DNA onarım sentezlerinin
kısmi olarak engellenmesiyle karşılaşıldı.
Genellikle aynı türün farklı donörlerinden alınan
kültürlere uygulanan NOe ilc uyarılan DNA hasar ve
tamir miktarında, hem insan hem de rat karaciğer hücre
miktarlarında farklılıklar gözlendi. Tüm denemelerde 5
mM'lik NDMA positif kontrol için kullanıldığından
(ör-neğin; 20 insan ve 20 ratın hepatosit primer kültüri'll1de). NDCnin sitotoksisitisinde olası lUr ic,:i değişiklikler ko nusunda bilgi edinmenin en iyi yolu. hu yolla elde edilen
verilerdir.
Kı-Kc
olarak ölçülen DNA hiilünme miktarı.insan karaciğerinde 5 katı iken rat hepatosit primer
kül-türünde 7 katıdır.
Bu büyük tür ic,:i değişikliğe rağmen iki tür ara
sındaki DNA' nın hasarı ve NDMA. NMOR. NPIP.
NPYR ve NBU'lllın UDS etkisi konusunda istatistik
ola-rak önemli farklılıklar gözlemlendi (Tah lo 2).
Tartışma ve Sonuç
Hayvanlarda uygulanan kısa ve uzun süreli
de-neylerden elde edilen sonuçların insana uygulanması.
kanser araştırmalarında önemli bir aşamadır (16.30). Esas
problemlerden biri ksenohiyotik metaholizmadaki türler
arası farklılıkların varlığını ortaya koymaktır (13.1 X.25).
Gerçekte kimyasalların kanserojenik etkisi brmaşık hir
süreç olmasına karşın, kanser süreci esnasındakı
me-taholik aktivasyonu n ve daha sonraki DNA hasarlarının.
tümör oluşumunda önemli ilk adımlar olduğuna inanılır
Tahlo 2. NOCnin insan ve rat hepatositlerintkki DNA parçalanması ve programlanmamı~ DNA sentezı potansiyelı Tahıl' 2. Potency of NOC in inducing DNA fragmentation and unprogrammed DNA ~ynthesis in human and r~tl her~\lücyıe.'.
Ortalama :tstandart sapma
Hıle~iklcr
DNA-hasar verme etkisi
(X mM'I)"
Insan Rat Insan
lJDS-oluşturma etkisi (X mM'l)h Rat NDMA NDEA "DI'A \lMOR NpıP i\pYR "Ml'
"Eli
NUt' io.m
:t3.76 2.21 :t 0.58 5.19:t 333 14.0! :t 1.78 6.27 :t 1.29 1.33 :t 0.43 27.23 :t6.41 16.88:t 936 71.78:t2676 18.37 :t 4.24e 3.02:t 1.26 7.48:t3.43ı
4.95 :t 626 2.43:t ı.74e 3.ı
9 :t 1.96e 31.88 :t 12.09 iı
.34:t4.03 31.03 :tı
4.00e 4.05 :t I.S5 1.89:t0.61 4.11 :t 2.33 10.97:t6.26 2.14:t 2.63 4.60:t 3.R3 20.5 .• :t 9.60 7.58 v 5.53 54.26:t 19.52 4.4~ :t2.57 1.6l):t 0.80 (ı,:lS :t375 ~.53:t 1.8~d IO.17:t 452d 175 \ 1.12e ~O.2X :t 15.14 7.X4 :t3.l)O 1l).l)O:t i025c aL DNA hasar \erme etkısi a~ağıdaki formül ile hesaplanmıştır:(Kı-Ke)
X iO(){)
Yo~unluk (mM)
Bu torıııülde "(Kt-Kc)" koııtrolUzerinde filtreden geçme oraıııdır. De~erler 3 de~işık yo~unluk seviyesındc te't edılen D\lA-I"~\Sar \crme kııvvetlerinin averajıdır.
h) UDS,olu~LLırıııa etkisi a~ağıdaki formülü kullanarak hesaplanmışLLr: (NGt-NGc)
Yoğunluk (mM)
Rıı Inrmülde (:"IGt-NGc) her çekirdekteki net parçaeıkIarın koııtro i üzerindeki artı~ıdır. Bu değerler de~işık yoğunlıık sevıyelerınde ılerleyen hır neı niikil'er parçacık artışına neden olan UDS meydana getirme kuvvetlerinin avcraJıdır. Bu "Doz-Cevap" eğri,ıniıı yUk-'elen höllimiidür.
e) p<O.O() I-t-testi (Student t testi) d) p<().O!-l-testi (SıudenttıeSll) e) p<O.OS-t-ıestİ (Student t testi)
(11.22). Harris (10) tarafından son zamanlarda in-celendiğı gibi. laboratuvar hayvanlarından ve insan do-nörlerden alınan hücrelerdeki sitotoksisite ve kimyasal metaboliıma üzerinde yapılan araştırmalar in vitro olarak da karşılaştırma yapmak için eşsiz fırsatlar sunar (13,26-n) Özellikle, izole edilmiş insan karaciğer hüc-relerindeki, kimyasal kanserojenlerin metabolik ha-n:ketleri ve hareketsizliklerindeki tür içi ve türler arası değışikliklerin değerlendirilmesi büyük değere sahiptir. NOe, birçok çeşit hayvan türünde tümör yapan kuvvetli bır kanserojen grubumı temsil ettiği için, insanlardaki kanser ri:;kinin tayininde ek bilgi elde etmek adına, insan ve rat karaciğer hücrelerinin primer kültürlerindeki uya-rıcı DNA hasar ve tamir sentezlerinin LO adet NOCsinin kapasitesini karşılaştırmanın faydalı olacağı düşünüldü. Bu sitotoksisitenin uç noktalarının seçimi metabolik ola-rak yeter miktardaki primer karaciğer hücre kül-türlerimieki UDS' nin ve ON i\ böliinmesinin birçok smıf kanserojen madde için potansiyel olan kanserojen gös-tergelerinİn doğruluğunu gösteren birçok deneysel kanıtla gö/lcndi (3136-38). Elde edilen sonuçlar, incelenen
Lo
NOCnin. (NDMA, NDEA. NDPA, MMOR, NPIP, NPYR. NMLJ. NEU. NBU. NDBA) karaciğer hüc-relcrinde DNA tamir sentezleri oluşturduğunu gös-ternıiştir. DNA'da, az çözülebilirliği nedeniyle test edi-lebilen maksimum konsantrasyondaki (I mM) NDBA, her iki türün hepatosit primer kültüründe zaman zaman az aktivite g:istermiş. bazen de hiç aktivite göstermemiştir. 010Cnİn incelenen test sonuçlarının bir kısmı aşağıda be-lirtilen teq sonuçlarıyla uyunıludur. İnsan karaciğer hüc-relerinin primer kültürleri NDMA'ya (5-7,33) ve NDEA (3334)'y,1 maruz bırakıldıktan sonra UDS'nin in-düksiyom; fark ethldi ve aynı NOCnin ikinci kez kültürü yapılmış insan fibroblastlarımn nHIlasyonuna sebep olan ürünlere tepki vermesi için insan karaciğer hüereleriyle harekete geçirildiği ortaya çıkmıştır (13,34). İnsan ka-raciğerind.~n elde edilen örneklerin. ND MA, NDPA, NPIP. NPYR ve N-nitrosomethylethylamine (27,28) için yapılan Ames testinde etkin bir mutagenik aktivator ol-duğu görülmüştür. Nükleik asit metilasyon ve invim/ daki insan karaciğer dilimleriyle NDMi\' nın me-taholizma~:ı i97()'te Montesana ve Magee (23) tarafından tarif edildi ve yeni metiııenmiş pürinlerin NDMA ze-hirlenmesinden sonra insan karaciğer DNA'sında mevcut olduğu farkedilmiştir (12). İnsan ve rat karaciğer hi.ic-rclerinde UDS'nin meydana çıknıası ve DNA'nın hasar görnıesimk roloynayan 9 aktif NOCnin ortalama etkisi. T:.ıblo 2' de gösteriınıiştir. Iki tür :.ırasınd:.ı istatik olarak önemlı bi.r fark olduğu NDMA, NMOR, NPIP, NPYR ve NBU İle onaya konulmuştur. DNA'nın hasar verici oranı
NPIP ve NBU insan karaciğer hücreleri karşısında daha aktif olmasına karşın. NDMA ve NPYR'nin rat karaciğer hücreleri karşısında daha aktif olduğu görülmüştür. UDS. NMOR. NPYR ve NBU'yu uyarma oram insanda daha çok iken. NPIP ratlarda daha kuvvetlidir. NPIP' nin. ins:.ın karaciğer hücresinin DNA'sına daha büyük iilçüde hasar vermesi ve bunun aksine ratlarda DNA onarımını teşvik etmede daha aktif olması ve tam tersinin de NPYR'de oluştuğu dikkate değerdir. UDS nıiktarı sadece DNA ıcı. yonlarımn sıklığma değil aynı zanıanda iki tür için farklı olabilecek olan DNA onarım sentezlerini içeren enzinı sistemlerinin aktivitelerine de bağlı olduğu için yukarı daki farklılıklar şaşırtıcı değildir. Her bi.r N-nitroso hi-leşiğinin genotoksik aktivitesini değerlendirnıck için kul lanılan iki türün az sayıdaki donıirleri IH:deniyle. göı lemlcnen türler arasındaki DNA' nın hasar verici \e UDS'nin uyarıcı gücündeki farklılıklar. istatistik açıdan önemli olsa bile, tedbirli bir şekilde yorumlanmaııdır. Bazı NOCler için insan ve rat karaciğer hücreleri ara-sında miktarsal farklılıkların bunların hareketlerini ve dc-toksikasyonlarını içeren mctabolik süreçlerinin randıına-nıyla oluşabilme olasılığı bir iirnektir. Bu yönüyle bul-gularımızın. NOCnin duyarlılığı açısından tür içi fark-lılıkların gcrçekte iki tür arası farklılıkt~1l1 daha büyük ola. bilmesi olasılığını göstermesi açısından önemlidir. /'aıen. iki türün birçok donikü üzerinde (20 insan-20 rat) yapılan tck NOe testi olan NDMA' dan clde edilen sonuçlar. bu bileşiğin ortalama DNA hasar gücü. insanda rattan sadece
i,5 kat daha büyük olduğunu göstermiştir. Buna karşııı. aynı parametre. sözü edilcn ilk türün farklı donıirleri ~ıra-sında 2,5 kat, ikinci türün farklı donörleri arasında ıse 6 kat gibi bir değişkenlik giistcrdi. Farklı insan do nörlerinden elde edikn hepatasit primer küllüründeki NOe ile uyarılan UDS ve DNA böliinıne miktarlarında ölçülebilir variyasyonlar tespit edildi. Bu varyasyonlar, DNA onarım sentezlerinin etkinliğindeki farklılıklardan olduğu kadar patolojik şartlardan. ilaçlardan. gıda mild delerinden, cinsiyetten. yaştan da etkilendıği bilincn. ka-raciğer detoksifikasyon enzinıkrinin hareketlerindeki farklılıkları da yansıtabilir.
Fakat. bu çalışmadaki veriler. donörlerin yaş ve cin-siyetkrinin kalıtsal bir ctkisi olduğumı giisterıııedi. Ay-rıca, karaciğer fonksiyonlarını değerlendirmek için öl çülen biyokimyasal parametrelerdeki değişiklikler ile UDS ve DNA hasar miktarları arasında d:.ı herh~l11gi hir ilişki saptanamadı. Sadece. hirçok deney sayesinde elde toplanan verilcr. bu variyasyonların nedenleri konusunda ayrıntılı analizlcr yapılmasını sağladı.
Sonuç olarak. rat karaciğer hücrelerinin 010Cnin gemıtoksik etkisini anlamak için çalışmaııın uygun hir modelolduğunu gösterdi.
28 Taner Pamukçu - Alexandre Scott
Kaynaklar
i. Bartseh H, Montesano R (I 984): Rl'levaııce ot ııiı-roswlıiııt'S lo human (;(IIICl'r. Carcinogenesis (Lond). 5.
nx 1- i 393.
2. Bogovski P, Bogovski S (I 98 1):Animal species iıı which N-niımso compounds in du ct' umcer. Int J Caneel'.
27,471-474.
3. Bradley MO, Dysart G, Fitzsimmons K, Harhach P, Lcwin .I, Wolf G (I9XO): MnlSUrl'melılS hy/ilıer eluliOlI of DNA singıt' and doııiJle sımnd hrwks iıı ral hepatocyll's: el/pcls ot niırosaminn aııd y-irradiaıiOll. Caneel' Res. 42,
2592-2597.
4. Bramhilla G, Cavanna M, Parodi S, Sciaba L, Pino A, Rohhiano L(197g): DNA damage iıı /ivl'r, CO1011, sıomac/ı. Iııng wıd kidlıl'Y of BALB/c mia ıreaıed wiıh 1,2-dilllt'ıhylh\'dmz.iııl'. Int J Caneer, 22. 174- i80.
5. Butterworth BE, Bermudez E, Smith-Oliver T, EarIe L, Cattley R, Martin .f, Popp .fA, Strom S, .firtle R, Mic-haIopouIos G (1984): Lıı<:k ot Kenoıoxic aclivily of di(2-t'lhrlhexvl)phıhala1t' (DLHP) iıı ral and humaıı he-jJulOcyın Careinogencsis (tond), 5. 1329- 1335.
6. Butterworth BE, Earle LL, Strom SC, .firtle RL, Mic-halopoulos G (1983): Mwsurt'/Ileııl otchemical/y induced DNA rl'pair iıı humuıı hepaıocvıes. Proe Aın Assoc Cancer Res. 24. 69.
7. Butterworth BE, EarIe 1., Strom S, .firtle R, Mic-halopoulos G (I 983): !lıdııerion ot DNA repair iıı humwı und ml hepulOclNS h\' 1,6-diniımpyreıw Mutat Res. 122. n-gO
8. CoIe KE, Hsu IC, Trump BF (1 9g6): Compamlivl' ulı-msıruclural I:'.tfpcıs ot atluıoxin BI Iili mouse, ral, und hWIlWI hepaıocyın iıı primar\, culııırl', Cancer Res, 46,
1290- i296.
9. Druckrey H, Preussmann R, Ivankovk S, Schmahl D
(1967): OrgwllJımpl' curCIIllJKl'nt' WirkUlıgt'/1 hei (i5 vers-chiedeııı'ıı N-NITmso- Vt'rhindwıgen aıı BD-Rallen Z Kreb ..;for.sch, 69, Im-201.
iO Harris CC (I 987): Himıwı ıissııl's aııd cel/s in car-cinoKt'Ilesis rl'swrch C<ınccr Res, 47, 1-iO,
i i HcideIberger C (1975): Chemieal carcinoKenesis. Annu Rev Bioeheın. 44, 79-i21.
12..Hcrron De. ShankRC (1980): Ml'lhylaıed pıırines iıı hıımwı /iver DNA atin' ıımhahle dimeıhylııiımsamiııl' po-ısoniııg. Cmecr Res. 4().31 16-3117.
13. Hsu IC, Harris CC, Lipsky MM, Snyek" S, Trump BI'
(19X7): Ct'LL and spl'cies dil/prences in meıaho/ic acıimıimı ofehl'mıeal (;(lrcinoKelıs. \1utal Res. 177, 1-7.
ı
4. International Ageney for Research on Cancer (1978):IARC MflllIJgraphs 011 i/lt' EVlIlııaıion ot ıhe Carciııogmic Rısk rf Cht'micals lo HillillillS, Some N-Nilmso Com-l}(Jwıds. Vol. 17. Lyon. France: IARe.
15 Joncs CA, Huherman E (1980): A sl'ıısiıive hl'paıocvle-I>lt'diuın/ ussay {(ır ıhl' ml'laholism ot ııiımsamiııes to mu-ıugt'nsji,r mumma/iwı al/s. Cancer Res, 40,406-41 I. i(ı. Kilo K, Kihana T, Sugita A, Murao S, Akehi S, Sato M,
Taehibana \1, Kimura S, Ueda N (1996): Iııcidma ot
p53 aııd Hu-ras 1:1'111'mulaıimıs in eht'lIlIuı/lI' ıııduenl ml
mammary carciııomas. Mol Carcinog. 17. 78-83.
17. Kohn KW, Erickson LC, Ewig RAG, Friedman CA
(1976): FracıiOllilıiml ot DNA Fom IIlIımmo/iwl cdls hı, ul.
kaliııe eluliOlI. Bioeheınistry. 15,4629-4()37.
ı
8. Langehach R, Nesnow S, Rke .ıvııı
983): Org(lıı uııd Species SpI'Cilicity iıı C!ıl'miUlI Caniııııgt'ııesıs. PJenııın Press. New Yark.19. Lu SH, Ohshima H, Fu HM, Tian Y, Li FVI, B1ettner M, Wahrendorf .I, Bartseh H (1986): Uriııurl' ('XiJt'!iml oL N-ııiımsu/lliııo ucid~ aııd ııiırale hy ııllU/hlıOllls ol hıgh-aııd low.risk art'as ./iır t'.l'IJphagl'lt/ cuııct'r iii Nonhaıı Chiııu: eııdogeııııııs jinmaıiOlI O/lıl1rosııpmllılt' a1l(1 iıs
111-hihiıioıı lıy vilu/lliıı C Cmcer Res. 46. 14X5-1491.
20. Magee PN, Barnes ,ıvı (ı 967): Carciııol:t'Ilu' ııilmso CO/ll-pOUlıds. Adv Caneel' Res. lO. 163-24.
2
ı.
MartcIli A, Robbiano L, Ghia 1\-1, GiuIiano L, Angelini G, Bramhilla G (1986): A sıudı' oL ıht' plllt'IIIWI gt'-ııoloxicily ol cillll'lidiııe usiııg huıııaıı !ıt'POlllcYlt' prillUln' CIlIIUrl's: discTt'l)(IIlCl' Film rl'SuIıs ohluiıınl iii ml he-palocyıes. Caneel' Leıı. 3(). iı-
16.22. Miller EC (197g): Some CWTt'1I1 perıpl'clIl't'S 011clw11ical carciııogeııesis iıı humaııs wıd npaill7t'/llal uııill7uls.
C<ın-eel' Res. 38. 1479- 1496.
23. Montesano R, Magee PN (I 970): Mt'!uho/isll7
"i
di-meıhylııiII'llSw/1iııt' lıY hUIllWI /irer s/ict's iıı I'iım. :\aıure(Land), 228. 173- 174.
24. Moorc Cl, GouId MN (19X4): Mduhıılısm III Iwıızo (u)pyrt'ııe hı'cUIILl/'ed humuıı lıt'jJuIIICl'lnJmll7 /lııılııple
do-lion. Carcinogenesis (Lond). 5. 1577-15gı
25. MuIIer D, NeIIes .f, Deparade E, Arni P (1':J80): T!ıt' ac-ıiı'iıy oL SfJ-/iver ji-aclioııs ji'O//1 Sel'l'lıspnil's iıı ı!ıt' Sul. moııella/mamıııaliaıı-micmsoıııt' mUlagnıeiclly ıni. \1l1lal Res, 70, 279- 300.
26. Neis .IM, RoeIofs HM.f. van Gemert P.ıL, Hendcrson PT
(ı 986): Mu/(/geııicily ıawards Solmoııel/u np!ıimuriull1 ol SO/llt' klıOWIl gt'ııoloxic agt'III.I, ocıiı'uınl hı' isoliller!
!ıı'-paıocyıes ol moııkel' (Macauı jiısciculuris.) Compurisoıı wiıh isolatt'd !ııııııaıı hepaıocyles. Mııldl Re.s. 164. 139-143. 27. Neis .IM, YapSH, van Gemert P.lL, Roclofs HM.I, Bos
RP, Henderson 1'1' (I 9g6): Assuy lll IIIUlage!l\ hı, ht'-palocyıl'S and /ivt'/' fJOOOxg 'supenıaıwllji'om hW/1WI origiıı iıı ıhe Salmoııt'l/u nphiıııuriull7 117UIOgt'IIICIIYassa,l'- Cıım-parisoıı wiıh mılivl'r prt'jJuraIİlJlls. Muı<ı! Res. 164.41-56.
2g. Phillipson CE, loannides C (1984): A COIl7IHımlil't' slıalr ıılıhe hiııaelivUlilJIlıılııiırllSall7iııes ıo 117ulugl'JlS /'.'1' ,'orious aııimal spl'cin i/ıe/udillK maıı. Carcinogencsıs (Lond). 5.
1091 -1094.
29. Preston-Martin S, Yu MC, Benton B, Hcnderson BE
(ı982): NilmSı! cıımpııuııds aııd childhood Imıiıı ILimors: u Ulsl'-ClJlılml sıı/dy. Cancer Res. 42. 5240-5245.
30. Qin X, Zarkovic
:"1,
Nakatsuru Y, Arai M, Oda H, Is-hikawa l' (1994): DNA adduct Jim11uıiolı uııd u.';wssmt'lll of uhermııı cnpıjiıci iıı ı'ivo iiiıhe ral coloıı mucosu ulıer Irealmt'1I1 wiıh N-II7t'1hl'l-N-ııiımsoureo. Cırcınogenesis.31. Sina .JF, Bcan CL, Dysart GR, Taylor Vi, Bradley MO
(1983): I:\'aluaıioıı or ıhe alkaliııe eluıioıı/raı hepaıocyle assu': as a prediclor oj' carcilıol{l'llic!muıagelıic pnıeıılia/. Mut;;t Res.
ıı3.
357-391.32. Singer GM, Chuan .1, Roman .I, Min-Hsin L, Lijinsky
\'" (1986): Niımsamiııes aııd llill'(}Samilıe precursors in /(}(id; ji-om LiIlXiwl, Chiııa. a hil{h ilıcidelıCf' area for esop-hügeu/ ulllcf'i'. Careinogcnesis (Lond), 7. 733-736. 33. Strom SC, JirUe RL, Jones RS, Novicki DL, Rosenherg
MR, :'oiovotny A, Irons G, McLain JR, Michalopoulos G
(ı 982): Iso/aıioıı. cu/ıure. and Irwısp/aıılalioıı oj' humaıı IwpalOcyıl'S. J Natl Caııecr Ins!, 68. 77
ı
-778.34. Strom
sc,
Novicki OL, Novotny A, JirUe RL, Mic-halopoulos G (ı9~B): Humaıı hepalocyle-mediaıed mu-I((t:eııesis aııd DNA repair acıiviıl'. Careinogcnesis (Lond). 4.66]-686.35 Williams GM (ı976): Primw'\' aııd lOIlI{-lenn cu/lUre (!i.
((dıılı ral /iı'er epiıhe/ia/ cells. Mcthods Ceıı Biol. 14, 357-364.
36. Williams GM (ı977): The deıecıioıı or chemiUl/ wr-cillOl{ellS hr 1IIlschedu/ed DNA smıhesıs III ral lil'l'r pri-mary ce// CUllUres.Caııecr Rcs. 37. ı 845-
ı
85ı.
37. Williams GM, Laspia MF (ı979): The deıectirııı or va-rious llilroswl1ilıl'S iıı ıhe hepalOn'le l'rilll({n' cu/ıul'dDNA repair lesI, Canecr Let!, 6. ı 99-206
38. Williams GM, Laspia MF, Dunkel
ve
(ı 982): R"/lUhilill' orıhe hepaıocyıl' prima,,' cUllUre/DNA rejJııir les/11l lesllllt: nf coded wrcilıol{f'Ils IIlld llolluırClll0t:f'IlS Mutat Res. 97. 359-370.Geli,l' ıarihi.' 20.0.2001/ Kahu/ !ilrlhi. 24.JO.2001
Yazışma adresi: Doç. Dr. Taııt!/' Pwnukçu Ktnkkıı/e Ülliversilesi, Veıeriııf'l' FakülIl'Si.
7J450 Kampüs Yahşihwı Kırıkkal"
