T.C.
GAZĠOSMANPAġA ÜNĠVERSĠTESĠ
Bilimsel AraĢtırma Projeleri KomisyonuSonuç Raporu
Proje No: 2010/107
DOMATESTE BAKTERĠYEL KANSER HASTALIĞI (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis)’ NA KARġI DAYANIKLI DOMATES BĠTKĠLERĠNDE
GENETĠK KALITIMIN BELĠRLENMESĠ
Yrd. Doç. Dr. Özer ÇALIġ
GaziosmanpaĢa Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bitki Koruma Bölümü
Demet ÇELĠK
GaziosmanpaĢa Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bitki Koruma Bölümü
ÖZET* Yüksek Lisans Tezi
DOMATESTE BAKTERĠYEL KANSER HASTALIĞI (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis)’ NA KARġI DAYANIKLI DOMATES BĠTKĠLERĠNDE
GENETĠK KALITIMIN BELĠRLENMESĠ Demet ÇELĠK
GaziosmanpaĢa Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bitki Koruma Anabilim Dalı
DanıĢman: Yrd. Doç. Dr. Özer ÇALIġ
Domates, toplam ekiliş alanı, üretimi ve ticareti açıdan Türkiye‟de yaş sebze grubunun en önemli ürünlerinden birisini oluşturmaktadır. Domateslerde yetiştiricilik sırasında fungal ve viral hastalık etmenlerinin yanı sıra pek çok bakteriyel etmende önemli ürün kayıplarına neden olmaktadır. Bu bakteriyel hastalıklardan biri olan Clavibacter michiganensis subsp.
michiganensis (Smith) Davis et al.,‟in (Cmm) neden olduğu bakteriyel kanser hastalığıdır. Bu
hastalığın mücadelesinde dayanıklı çeşit kullanımı en etkin, ekonomik, çevre dostu ve insan sağlığını koruyan bir yöntem olarak görülmektedir. Bu hastalığa dayanıklı kültür domates çeşitleri bulunmamakta olup, bakteriyel kanser hastalığına karşı dayanıklılık kaynağı domatesin yabani akrabalarıdır. Çalışmada kültür domatesinin NCEBR3 homozigot hattı, bu domatesin kimyasal mutasyonu ile oluşturalan M3 mutant domatesleri ve yabani domates LA 1579 hattının Cmm‟ nin en virulent ırkı olan Cmm2‟ye karşı patojenisite testlerinde reaksiyonları belirlenmiştir. Testler sonucunda dayanıklı M3 (♀) hattı ile orta derecede dayanıklı LA 1579 (♂) hattı melezlenerek F1 populasyonu oluşturulmuştur. Yapılan
moleküler çalışmalarda ebeveynler arasında polimorfizmi ortaya koyabilmek için 11 adet Simple Sequence Repeats (SSR) markörü kullanılmış olup 8 adet SSR markörü NCEBR3, M3 ve LA 1579 arasında polimorfik bulunmuştur. Test edilen markörlerin ebeveynler üzerinde polimorfizm oranı %73 olarak ortaya konmuştur.
2011, 70 sayfa
Anahtar Kelimeler: Domates, Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Bakteriyel
kanser hastalığı, SSR markörleri
*Gaziosmanpaşa Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu tarafından
desteklenmiştir. (Proje No: 2010/107)
ABSTRACT Master of Science Thesis
IDENTIFICATION OF GENETIC INHERITANCE OF RESISTANT TOMATOES AGAINST BACTERIAL CANKER (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis)
DISEASE By Demet ÇELĠK GaziosmanpaĢa University
Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Plant Protection
Supervisor: Asst. Prof. Dr. Özer ÇALIġ
Tomato is one of the most important product in terms of area, production and trade of fresh vegetable in Turkey. During the tomato production, several fungal and viral pathogens cause diseases, additionally, bacterial diseases result significant crop losses. One of the bacterial diseases is bacterial wilt and canker disease caused by Clavibacter michiganensis subsp.
michiganensis (Smith) Davis et al., (Cmm). The resistant tomato plants are able to use for
controlling the bacterial canker disease because the method is the most effective, economical, environmental, and human frendly. There is no disease-resistant tomato cultivars; however, resistant plants are present in wild tomato accessions. In this study, we used original tomato cultivar NCEBR3, mutant M3 and wild LA 1579 tomato lines to identify resistance reactions to the most virulent isolate (Cmm2) of bacterial canker disease in pathogenicity tests. The pathogenicity test results revaled that resistant M3 (♀) plants and intermediate resistant LA1579 (♂) plants where the two lines were crossed to produce F1 populations. Moleculer
studies conducted to determine polimorphism between the parents, 11 Simple Sequence Repeats (SSR) markers were analysed in PCR reactions. The analyses shown that 6 SSR markers were polymorphic between NCEBR3, M3 and LA 1579 plants. Among tested markers, 73% of them gave polymorphism to use in future studies.
2011, 70 pages
Key Words: Tomato, Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Bacterial Canker
Disease, SSR markers
ÖNSÖZ
Çalışma konumun belirlenmesinde, hazırlanmasında ve yazımında benden hiçbir zaman güler yüzünü, desteğini, ilgisini eksik etmeyen, yapıcı ve yönlendirici fikirleriyle bana her zaman doğru yolu gösteren sayın danışman hocam Yrd. Doç. Dr. Özer ÇALIŞ‟ a sonsuz teşekkürler.
Yüksek lisans tez savunmamın jüri üyeleri olan ve değerli fikirleriyle katkıda bulunan sayın hocalarım Doç. Dr. Yusuf YANAR ve Yrd. Doç. Dr. Çetin ÇEKİÇ‟ e teşekkür ederim. Çalışmalarım sırasında emeği geçen mutlu ve sıkıntılı anlarımın yoldaşları olan değerli arkadaşlarım Arş. Gör. İbrahim SAYGILI, Yük. Zir. Müh. Zeliha Selcen BAYAZIT‟a ve Gaziosmanpaşa Üniversitesi Bitki Koruma Bölümü Öğretim Elemanları, Doktara, Yüksek Lisans ve Lisans öğrencilerine en içten teşekkürlerimi sunarım.
Hayatımın her aşamasında olduğu gibi yüksek lisans çalışmalarım esnasında da benden maddi ve manevi desteğini esirgemeyen, zorluklarla savaştıkça hep daha güçlü olacağımı öğreten sevgili annemcim, babacım ve biricik kardeşim iyi ki varsınız. Sizler benim bu dünyadaki en büyük hazinemsiniz. Girdiğim her yolda beni başarıya odakladınız, her halime katlandınız, destek oldunuz, sabrettiniz size yürekten sonsuz teşekkürler…
Demet ÇELĠK 06/2011 ĠÇĠNDEKĠLER Sayfa ÖZET ……….………. i ABSTRACT ……….……….. ii ÖNSÖZ ……….……….. iii ĠÇĠNDEKĠLER……….. iv ġEKĠLLER DĠZĠNĠ ………... v TABLOLAR DĠZĠNĠ ………...………... vii 1. GĠRĠġ……….. 1
2. LĠTERATÜR ÖZETLERĠ……… 8
3. MATERYAL ve YÖNTEM ……….. 32
3.1. Materyal …………..………. 32
3.1.1. Çalışmada Kullanılan Fitopatojen Bakteriler………. 32
3.1.2. Çalışmada Kullanılan Test Bitkileri………... 32
3.1.3. Kullanılan Çözeltilerin ve Besi yerlerinin Hazırlanışı………... 33
3.2. Yöntem ………..………... 35
3.2.1. Bitkilerin Yetiştirilmesi …………..………... 35
3.2.2.Bakteriyel Hastalık Etmeni Cmm2‟ nin GYCA Besi Ortamında Geliştirilmesi ………... 36
3.2.3. Patojenisite Testi …………..………. 37
3.2.4. Melez Bitkilerin Oluşturulması ………. 39
3.2.5. Bitkilerden DNA İzolasyonu ………...………. 41
3.2.6. PCR Analizleri ……….………...……….. 3.2.7. Agarose Jel Elektroforezi………... 42 44 3.2.8. Moleküler Markörler ………. 48
4. BULGULAR ……….. 49
4.1. Patojeniste Test Sonuçları ……….... 49
4.2. Moleküler Analiz Sonuçları ………. 52
5. TARTIġMA VE SONUÇ ……….……….. 56
6. KAYNAKLAR………... 59
ÖZGEÇMĠġ ………... 70
ġEKĠLLER DĠZĠNĠ
Sayfa ġekil 2.1. Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis‟in
neden olduğu sistemik enfeksiyon sonucu oluşan solgunluk
görünümü ………
9
ġekil 2.2. Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis‟in neden olduğu
yaprak yanıklığı ………..
10
ġekil 2.3. Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis‟in neden olduğu
iletim demetlerinde ki renklenme belirtileri ………..
10
ġekil 2.4. Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis‟in neden olduğu
11
ġekil 3.1. NCEBR3, M3 ve LA1579 hattına ait domates fidelerinin 7 no‟ lu
saksılara aktarıldıktan sonra Biyoteknoloji serasında gelişmeleri ……
36
ġekil 3.2. Bakteriyel etmen Cmm2‟nin GYCA besi ortamındaki gelişimi ……. 37
ġekil 3.3. Steril şartlarda besi ortamında geliştirilen Cmm2 bakteri izolatlarının
steril kürdan yardımıyla domates fidelerinin gövdelerine batırılarak inokulasyonun gerçekleştirilmesi………... 38
ġekil 3.4. İnokule grubu bitkilerdeki bakteriyel etmenin gelişimi ……… ġekil 3.5. Polen ana hücrelerinin dişicik borusuna zarar vermeyecek şekilde pens
yardımıyla uzaklaştırılması………
ġekil 3.6. Yalnız bırakılan dişicik borusuna hassas ebeveynin polenlerinin
değdirilmesi……….
ġekil 3.7. Melez meyvelerin gelişimi……… ġekil 3.8. PCR amplifikasyonu sonunda elde edilen PCR ürünlerinin loading dye
boyası eklendikten sonra (A) %1.5‟ luk agarose jele yüklenmesi (B) ve yükleme sonrası jeldeki görünümü (C)……….
ġekil 3.9. PCR ürünlerinin 100 V‟ luk akıma bağlı %1.5‟ luk agarose jelde 2.5-3
saat süreli koşturulması ……….
38 39 40 40 46 47
ġekil 3.10. Koşma işleminden sonra agarose jel içerisindeki DNA bantlarının Bio
Capt programı kullanılarak görüntülenmesi. ………..
ġEKĠLLER DĠZĠNĠ
ġekil 4.1. NCEBR3 bitkisinin patojenisite testinden 28 gün sonraki durumu ve
kontrol bitkisiyle karşılaştırılması………...
ġekil 4.2. M3 bitkisinin patojenisite testinden 28 gün sonraki durumu ve kontrol
bitkisiyle karşılaştırılması………..
ġekil 4.3. LA 1579 bitkisinin patojenisite testinden 14 ve 28 gün sonraki
durumu………
ġekil 4.4. Çalışmada kullanılan SSR38, SSR70 ve SSR349 markörleri
kullanılarak yapılan PCR amplifikasyonun görünümü. SSR70 primeri NCEBR3 ve M3 mutantı ile 119 bp‟lik band verirken LA1579 ile 103 bp‟lik bant oluşturmuştur. SSR349 ve SSR38 markörleri test edilen
47
Sayfa
50
51
DNA lar arasında bir ploymorfizm oluşmamıştır. Çalışmada Ladder olarak 50 bp‟ lik moleküler size markör ve Negatif kontrol olarakta distile steril su kullanılmıştır. (1: M3, 2: LA 1579, 3: NCEBR3)………..
ġekil 4.5. Çalışmada kullanılan SSR47, TOM184, SSR13, TOM210 ve SSR70
markörleri kullanılarak yapılan PCR amplifikasyonun görünümü. SSR47 primeri NCEBR3 ve M3 mutantı ile 189 bp‟lik band verirken LA1579 ile 193 bp‟lik bant oluşturmuştur. TOM210 primeri NCEBR3 ve M3 mutantı ile 216 bp‟lik band verirken LA1579 ile 204 bp‟lik bant oluşturmuştur. SSR70 primeri NCEBR3 ve M3 mutantı ile 119 bp‟ lik band verirken LA1579 ile 103 bp‟lik bant oluşturmuştur. TOM184 primeri NCEBR3 ve M3 DNA‟larıyla amplifikasyon oluşturmamıştır. SSR13 markörü test edilen DNA lar arasında bir polymorfizm vermemiştir. Çalışmada 100 bp‟ lık Ladder kullanılmıştır (1: LA 1579, 2: M3, 3: NCEBR3)………
ġekil 4.6. Çalışmada kullanılan SSR333, SSR45, SSR638 ve SSR306 markörleri
kullanılarak yapılan PCR amplifikasyonun görünümü. SSR333 primeri NCEBR3 ve M3 ile 201 bp‟lik bant ve LA1579 ile 223 bp‟lik bant oluşturmuştur. SSR306 primeri NCEBR3 ve M3 mutantı ile 255 bp‟ lik bant verirken LA1579 ile 273 bp‟lik bant oluşturmuştur. SSR45 primeri NCEBR3 ve M3 mutantı ile 140 bp‟lik band verirken LA1579 ile 149 bp‟lik bant oluşturmuştur. SSR 638 markörü M3 mutantı ile 157 bp‟lik bant veriken LA1579 ile 161 bp‟lik bant oluşturmuştur. Çalışmada 50bp‟ lık Ladder ve negatif kontrol olarak distile steril su kullanılmıştır. (1: NCEBR3, 2: M3, 3: LA 1579)………. 53 54 55 TABLOLAR DĠZĠNĠ Sayfa Tablo 1.1. Dünya Sebze Üretiminde Önemli Ülkeler ve Dünya Üretimindeki
Payları ……… 2
Tablo 1.2. Dünya domates üretimi yapan ülkeler ve üretim miktarları ……… 4
Tablo 3.1. Bakteriyel kanser ve solgunluk (Clavibacter michiganensis
subsp. micgiganensis) hastalığına karsı Amerikan Ulusal
Germplasm Sisteminde (http://www.ars-grin.gov/npgs/)
taranarak laboratuarımıza getirilen tohumlar………..
Tablo 3.2. NCEBR3, M3 ve LA 1579 bitkileri arasındaki polimorfizmi
ortaya koymak için çalışmada kullanılan SSR markörleri ……….
Tablo 4.1. Çalışmada kullanılan NCEBR3, M3 ve LA 1579 domates
hatlarının Cmm2 ile yapılan patojenisite test sonuçları…………..
33
48
1. GĠRĠġ
Asya ile Avrupa kıtalarının birleştiği yerde ve Akdeniz ile Karadeniz arasında yer alan Türkiye asırlar boyunca birçok uygarlıklara ev sahipliği yapmış; çok önemli bir tarım, ticaret ve ulaşım merkezi olmuştur. Türkiye coğrafi yapısından gelen bu avantajlar sayesinde topraklarında güzel bir iklim çeşitliliği bulunan bir ülkedir ve bu çeşitlilik bitkisel üretimine de yansımaktadır. Anadolu‟ da hemen hemen tüm ılıman iklim bahçe ürünleri ile subtropik ürünlerin önemli kısmı ekonomik bir şekilde üretilmektedir. Ürün çeşitliliği ve ekonomik avantajları sayesinde, yağlı tohumlar ve bazı tropik meyveler hariç tutulduğunda, Türkiye temel bitkisel ürünlerde kendisine yeten bir ülke konumunda olup; birçok üründe de üretim fazlasına sahiptir (Abak, 2006).
Bahçe bitkileri yetiştiriciliğinde dünyada önemli bir konuma sahip olan Türkiye; birçok bitki türü açısından gen merkezi konumunda olması nedeniyle büyük bir tür ve çeşit zenginliğine sahiptir (Şeniz ve ark., 2005). Bitkisel çeşitlilik içerisinde sebzeler özellikle dengeli beslenmede insanlar için alınması gerekli olan besin öğeleri olarak oldukça büyük önem taşırlar (Balkaya, 1999).
Dünya nüfusunun yaklaşık % 60-70‟ i az gelişmiş ülkelerde ve bölgelerde yaşamakta ve bu insanlar genellikle gıda olarak bitkilerle yaşamlarını sürdürmektedirler. Bugün dünyada hem kültüre alınmış hem de doğadan toplanarak değerlendirilen sebzeler içerdikleri protein, karbonhidrat, yağ, lif, vitamin, antioksidan ve mineral maddeler bakımından insan beslenmesinde önemli bir etkiye sahiptirler. Sebze olarak değerlendirilen bitkilerin toprak üstü ve toprak altı kısımları değişik şekillerde çiğ veya pişmiş olarak kullanılmaktadır (Eşiyok, 2005).
Dünya içersinde küçük dünya olarak tanımlanan Türkiye, iklim özellikleri ve tabiat örtüsü bakımından bu tanımlamayı gerçekten hak eden bir konumdadır. Çünkü ülkemizde mevcut bulunan hemen hemen bütün iklim özelliklerinin bir arada görülmesi mümkündür. Dolayısıyla her mevsimde birçok sebzenin yetiştirilme kullanılma imkanı ülkemiz koşullarında mevcuttur (Şeniz, 1993). Ülkemizde 1 milyon ha alan üzerinde yaklaşık 25.7 milyon ton kadar sebze üretilmektedir ve bunun 9.8 milyon tonunu domates oluşturmaktadır (Tablo 1.1) (Anonim, 2011a). Ülkemizde toplam domates üretiminin yarısına yakınını sofralık domates, diğer yarısını da sanayi tipi domates oluşturmaktadır (Alan ve ark., 1992).
Tablo 1. 1. Dünya Sebze Üretiminde Önemli Ülkeler ve Dünya Üretimindeki Payları
(FAO, 2008).
Ülkeler EkiliĢ Alanı (ha) EkiliĢte pay (%) Üretim (ton) Üretimde pay (%) Çin 23.717.000 45,0 451.633 49,7 Hindistan 5.905.000 11,2 77.243 8,5 ABD 1.227.000 2,3 38.847 4,3 Türkiye 1.055.000 2,0 25.707 2,8 Rusya Fed. 925.000 1,8 16.576 1,8 Mısır 598.000 1,1 16.040 1,8 İran 640.000 1,2 15.993 1,8 İtalya 526.000 1,0 13.500 1,5 İspanya 369.000 0,7 12.719 1,4 Diğerleri 17.743.000 33,7 240.550 26,4 Toplam 52.705.000 100.0 908.838 100.0
Anavatanı Güney Amerika‟nın orta ve güney kısımları olduğu bilinen domates (Lycopersicum
esculentum L.) dünyada tarımı en fazla yapılan sebzelerden biridir. Kültür domatesi
Amerika‟dan Avrupa‟ ya, oradan da Afrika‟ ya geçmiştir. Bugün kültürü yapılmış olan domateslerin L. hirsitum, L. peruvianum ve L. pimpinellifolium‟ dan faydalanılarak geliştirildiği, ana materyalin ise L. peruvianum olduğu bilinmektedir (Vural ve ark., 2000). Domatesin Orta Amerika ve Güney Meksika‟da çok sayıda tür ve çeşidi bulunmaktadır. Amerika kıtasında, ekvatorun 30o
kuzey enlem ve 30o güney enlem sınırları arasında kalan bölgeler domatesin anavatanı kapsamı içerisinde kalmakta ve Güney Amerika‟nın batı kıyılarının domatesin anavatanının merkezi olduğu bildirilmektedir (Günay, 2005). Peru‟ da
Maya uygarlığı zamanında adı “xtomatl” veya “tomatl” olarak geçen domates, orijini olan Peru, Bolivya ve Ekvator‟dan 16. yüzyılda İspanyollar tarafından Avrupa‟ya getirilerek yetiştirilmeye başlanmıştır (Küçüker, 1994). Avrupa‟ da uzun süre zehirlidir diye çekinilen domates daha sonra kültür bitkisi olarak kabul görmüştür (Ekinci, 1972).
Anadolu‟ya 150 yıl önce getirilmiş olup günümüzde yaygın olarak yetiştirilmekte ve sevilerek tüketilmektedir (Yazgan ve Fidan, 1996).
Oldukça kuvvetli kök sistemine sahip olan domates, dallanmış kazık kökler ve buradan çıkmış sekonder kökler şeklinde gelişir. Yapraklar bileşik şekilde ve tüylerle kaplıdır. Kendine döllenen bir bitki olup, toprak isteği yönünden çok seçici değildir. Besin maddelerince zengin her toprakta başarı ile yetiştirilir (Vural ve ark., 2000).
Domates, bugün beslenme programlarında önemli yeri olan bir sebzedir. Domatesin 100 gr‟ında 0.55 mg vitamin B6, 1700 IU vitamin A ve 0,10 mg vitamin B1 ile 21 mg C vitamini bulunmaktadır. Bu değerler bir yetişkinin günde 4-5 domates yemesi halinde günlük vitamin gereksinimini karşılayabileceği gerçeğini ortaya koymaktadır (Sevgican, 1999). Kalori değerinin düşük olması taze domatesi iyi bir rejim besini haline getirmiştir. Domatesin beyin hücrelerinin yaşlanmasını yavaşlattığı, bağışıklık sistemini güçlendirdiği, kireçlenmeyi önlediği, saçları ve cildi güzelleştirdiği, kalp hastalıkları ve kansere karşı koruyucu etkisinin olduğu yapılan çalışmalarla ortaya konmuştur (Sevgican, 1999).
Domates, dünyada en çok üretilen, tüketilen ve ticarete konu olan tarım ürünlerinin basında gelmesi, insan beslenmesinde vazgeçilmez ürünlerden olması ve gıda sanayinde dondurulmuş, konserve, salça, ketçap, tursu gibi çok çeşitli kullanım alanlarına sahip olması nedeniyle önemli sebzelerin basında gelmektedir. Domates dünyada birçok ülkede yetiştirilmekle birlikte, Türkiye uygun iklim koşulları nedeniyle üretiminde önemli ülkelerden biridir (Anonim 2011b).
Domates, Doğu Anadolu‟ nun iklimsel olarak uygun olmayan kısımları hariç, Türkiye‟ nin hemen hemen her yerinde, sera ve açık tarla koşullarında yetiştirilmektedir. Meyve şekli (yuvarlak, basık, konik, armut şeklinde vs.) ve bitki görünüşü (cüce veya uzun) bakımından farklılık gösteren çeşitli varyetelerinin kültürü yapılmaktadır (Davis, 1978).
Ülkemizde hem sofralık hem de sanayiye yönelik domates üretimi yapılmaktadır. Ülkemizin her bölgesinde üretilmekle birlikte, sofralık domates Adana, Mersin, Antakya, Antalya, İzmir,
Çanakkale, Konya ve Tokat‟ta yoğun olarak üretilirken, turfanda üretim genellikle örtü altında Akdeniz kıyısında Mersin ve Antalya illerinde yapılmaktadır. Sanayi için domates üretimi Marmara ve Ege bölgelerinde Balıkesir, Bursa, Manisa ve Çanakkale illerinde yapılmaktadır (Bayrak ve Kaya, 2009). Ülkemizin yaş meyve sebze ihracatında ilk sırada yer alan domates, yurt dışına hem taze sofralık, hem de işlenmiş halde ihraç edilmektedir. Akdeniz İhracatçılar Birliği‟nin 2009 raporuna göre 2007 yılında taze domates ihracatı yapan ülkeler arasında Türkiye 370.613 ton ile Meksika, İspanya, Hollanda ve Ürdün‟den sonra 5. sırada yer almıştır. Ülkemiz domates salçası ve kurutulmuş domates ihracatında lider ülkeler arasındadır (Bayrak ve Kaya, 2009).
Türkiye kendi başına her türlü tarımsal üretimi gerçekleştiren, kendisi için yeterli tarımsal ürünleri üreten ve ürettiği tarımsal ürünlerden yurt dışına ihracat edebilen Dünyanın sayılı tarım ülkelerinden biridir (DPT, 2009). Ülkemiz Dünya domates üretiminde 10 985 400 ton üretim ile en çok domates üretimi yapan ülkeler olan Çin ve A.B.D‟ den sonra içerisinde 3. sırada yer almaktadır (Tablo 1.2) (FAO, 2008). İçerisinde bulunduğumuz Tokat bölgesi ise yıllara göre değişmekle birlikte 600-650 bin tonluk domates üretimi ile Türkiye'nin domates üretiminin %6 sını karşılamaktadır (Anonymous, 2009).
Tablo 1. 2 . Dünya domates üretimi yapan ülkeler ve üretim miktarları (FAO, 2008).
Ülke Üretim (ton)
Çin 33.811.702 USA 12.575.900 Türkiye 10.985.400 Hindistan 10.260.600 İtalya 5.976.912 İran 5.000.000 Mısır 4.204.039 Brezilya 3.934.275 İspanya 3.847.800 Meksika 2.936.773
Tokat ili Türkiye‟ de domates tarımı yapılan illerden en önemlilerden birini oluşturmaktadır. 2007 yılında Türkiye domates üretiminde yaklaşık %7‟ lik, Dünya domates üretiminde yaklaşık %0.5‟ lik sahip olan ilimizde 8571.2 ha alanda yaklaşık 510 bin ton üretim gerçekleştirilmiştir (Anonim, 2007). Özellikle 1994 yılından itibaren başlatılan çalışmalarda dış Pazar isteklerine uygun çeşitlerin üreticilere kazandırılmış olması günümüzde Tokat ilinde gerçekleştirilen üretimi elde edilen verim miktarını sonucunda Dünya ve Türkiye ortalamasının üzerine çıkarmıştır. Ilık ve sıcak iklim meyvesi olan domates, sıcaklık değerleri açısından minimum 16 ºC, maksimum 35 ºC‟ de normal gelişimini sürdürebilir. Tokat‟ ın sahip olduğu sıcaklık ve yağış değerleri domates tarımına oldukça müsaittir. Tokat‟ ın uygun doğal koşulları hemen her ilçede bu sebzenin üretimine olanak sağlamış olsa da pazarla sorununun çözüldüğü, sulanabilen ovalık alanlarda yoğun bir üretim gerçekleştirilmektedir (Yürüdür ve Akkurt, 2008). 2007 yılında 8571.2 ha olan domates üretim alanlarının yaklaşık %97‟ si ve üretiminin yaklaşık %99‟ u Merkez, Erbaa, Niksar, Pazar, Turhal ilçeleri tarafından karşılanmıştır.
Türkiye‟de domates üretiminin % 1,5-2,0‟ si yurt dışına ihraç edilmekte, geri kalan bölüm ise yurt içinde kullanılmaktadır. Yurtiçi kullanımında taze tüketim oranı % 70-75 civarında bulunmaktadır. Üretimin yaklaşık 1/4‟ lük bölümü ise işleme sanayinde salça, konserve, doğranmış domates gibi çeşitli ürünlere işlenmektedir (Anonim, 2011c).
Gerek örtü altı gerekse tarla koşullarında domates üretiminde ekonomik kayıplara neden olan faktörlerin başında bitki hastalıkları gelmektedir. Domateste fungal ve viral hastalık etmenlerinin yanı sıra pek çok bakteriyel etmende önemli ürün kayıplarına neden olmaktadır (Karaca ve Saygılı, 1982). Domateste hastalık oluşturan bakteriler Pseudomonas,
Xanthomonas, Clavibacter, Erwinia, Agrobacterium ve Ralstonia cinsleri içerisinde yer
almaktadır (Üstün, 2008). Bu bakteriyel hastalıklardan biride Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al.‟in (Cmm) neden olduğu bakteriyel solgunluk hastalığıdır. Bakteriyel solgunluk hastalığı tohum kaynaklı olması nedeniyle savaşımı güç hastalıklardandır (Erkan, 1988). Etmen domates dışında fasulye, bezelye, mısırda da ürün kayıplarına neden olmaktadır. Patojen 1910 yılında A.B.D‟ de ilk rapor edilişinden bu yana tüm Dünya‟ya yayılmış, tarla ve seradaki domateslerde ciddi kayıplara neden olmuştur (Hayward ve Waterson, 1964). Çalışmanın yürütüldüğü Tokat bölgesinde bakteriyel hastalık etmeni Cmm domates üretimi yapılan alanlarda bulunmuş ve domates üretimi yapılan alanların %8 nin bu etmen ile bulaşık olduğu ortaya konmuştur.
Bakteriyel Kanser Hastalığı domatesin tohum kaynaklı en önemli hastalıklarındandır. Cmm tarafından oluşturulan, hastalık tablosunda ilk göze çarpan, iletim dokularının bakterilerce işgal edilmesi sonucu oluşan, ilk görünür belirti diyebileceğimiz solgunluktur. Solgunluk gelişmiş bitkilerde yavaş ve dereceli olarak ilerler. Sistemik olarak enfekte olmuş bitkilerde ilk belirti yaşlı yapraklarda görülür. Bu yapraklar solar ve aşağı doğru sarkıp asılı kalır. Bu hastalıkta, bitkinin bir tarafı solduğu halde diğer tarafı sağlıklı görülebilir. Bazı durumlarda aynı yaprak sapına bağlı olan yaprakçıkların bir kısmı solgun gözükürken diğer yaprakçıkların turgorunu koruduğu ve sağlıklı görüldüğü durumlara da rastlanabilir. Etmen meyve de ise ortası kahverengi ve çevresi beyaz bir hale ile çevrili kuş gözü lekeleri olarak bilinen simptomlar gösterir (Özaktan ve Bora, 1991). Bakteriyel etmen köpek üzümü gibi Solanaceae familyası üyelerinde de yaşayabilir. Nem, etmenin bitkiyi hastalandırabilmesi için önemli bir etkendir (Fatmi ve Schaad, 1988).
Etmenin farklı yerlerde yaşamını sürdürebilme özelliğinden dolayı mücadelesinde zorluklar yaşanmaktadır. Sertifikalı tohum ve fide kullanımı bakteriyel solgunluk hastalığının mücadelesi için önemlidir. Ancak bu etmenle epifitik olarak bulaşık olan tohumların sertifika alabilme olasılığı bulunmaktadır. Bu şekildeki tohumlar ve yine bu tohumlardan elde edilen fidelerin kullanımı ile hastalık yayılabilmektedir (Chang ve ark., 1992). Ancak uygulanabilirliği kabul edilmiş olan tohum uygulamaları da Cmm‟e karşı her zaman etkili olmayabilir (Thyr ve ark., 1973). Aynı zamanda kültürel önlemlerin tek balına yetersiz oluşu çiftçileri yoğun olarak kimyasalların kullanımına yöneltmektedir.
Bitki hastalıkları ile mücadelede yoğun biçimde kullanılan kimyasalların insan sağlığı ve doğa üzerine olan olumsuz etkilerinin üzerine tüketicilerdeki bilinçlenme ve çevre kirliliğine karşı duyarlılığın artması üreticileri daha az kimyasal kullanmaya yönlendirmiştir. Özellikle bakteriyel patojenlerin kimyasallara karşı dayanıklılık oluşturmaları, bunlara karşın bakteriyel solgunluk hastalığına karşı yeterli ve etkili bir mücadele yönteminin olmayışı dayanıklı çeşit kullanımını da kapsayan alternatif yöntemlerin çalışılmasını öncelikli konular haline getirmiştir.
Bu projenin amaçları; bakteriyel kanser hastalığına karşı ümitvar olarak bulunan NCEBR3 domates mutantlarının M3 populasyonundaki patojenisite testlerini gerçekleştirmek, orijinal NCEBR3 domates bitkileri, M3 domates mutant bitkileri ile yabani domates bitkisi Solanum
pimpinellifolium (LA 1579) bitkileri arasındaki polimorfizmi SSR markörleri ile belirlemek,
M3 mutant bitkileri ile yabani S. pimpinellifolium (LA 1579) bitkilerini melezleyerek F1
popülasyonunu oluşturmaktır. Bu çalışma ile NCEBR3 orijinal ve bunların M3 mutantları ile yakın akrabaları olan S. pimpinellifolium (LA 1579) bitkileri arasındaki genetik kalıtım ortaya konmaya çalışılacaktır.
2. LĠTERATÜR ÖZETLERĠ
2.1. Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al., Hakkında Genel Bilgiler
Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis; Prokaryota alemi, Firmicutes bölümü, Thallobacteria sınıfı, Microbacteriaceae familyası, Clavibacter cinsi içerinde yer almakta
(Agrios, 2005) ve dünya çapında domates üretimini kısıtlayan en önemli bakteriyel etmenlerden biri olarak bilinmektedir (Saygılı ve ark., 2006).
Etmen bakteri, Erwin F. Smith tarafından ilk olarak Bacterium michiganense daha sonra
Aplanobacter michiganense olarak isimlendirilmiştir. İlerleyen zamanlarda Pseudomonas michiganensis, Phytomonas michiganensis ve Mycobacterium michiganensis olarakta
isimlendirilmiş, ancak terminolojik isimlendirmenin kabul edilmesiyle yaklaşık 50 yıl
Corynebacterium michiganense olarak adlandırılmıştır. 1980‟lerde patojenin hücre duvarı
yapısı ile ilgili yeni bilgilere dayanılarak Clavibacter sınıfı içerisinde yeniden sınıflandırma yapılmış ve Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al. olarak isimlendirilmiştir (Gleason ve ark., 1993).
Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, domates (Solanum lycopersicum Mill.),
biber (Capsicum annum L.), patlıcan (Solanum melongena) ve Lycopericium hirsutum,
Lycopericium pimpinellifolium gibi bazı Solanaceae familyasına ait türlerde hastalık oluştursa
da, domates ekonomik anlamda önemli olduğu tek kültür bitkisidir (Çetinkaya-Yıldız ve Aysan, 2008).
Hastalık belirtileri, etmenin bitkiye giriş yoluna göre farklılık göstermektedir. Enfeksiyon tohumdan gelişirse veya yaralar yoluyla patojen direkt iletim demetlerine giriş yapmışsa sistemik enfeksiyondan söz edilir. Sistemik enfeksiyonlar bitkilerde solgunlukla başlar (Şekil 2.1). Tek taraflı solgunluk, renk değişimi ve yanıklık (Şekil 2.2) tipik hastalık belirtileridir. Sistemik enfeksiyonlar fide döneminde meydana gelmişse genç fideler hızla solar, çöker ve ölür. İlerleyen dönemde ise hasta bitkilerin gövdeleri boyuna kesildiğinde iletim demetlerinde başta sarımsı renklenme daha sonra
kızılımsı kahverengiye dönen renk değişimi (Şekil 2.3) gözlenir. Solmuş bitkilerin iletim demeti tıkandığından ileri dönemde yapraklara besin ve su taşınması gerçekleşmez bunun sonucunda da yanıklıklar hatta kavrulmuş gibi görünümler ortaya çıkar (Çetinkaya-Yıldız ve Aysan, 2008).
Eğer patojen hidatodlar gibi doğal açıklıklar veya tüylerin kırılmasıyla açılan yaralardan bitkiye girdiğinde ise, lokalize olmuş enfeksiyondan söz edilir. Yaprakçıkların kenar nekrozları genellikle lokalize olmuş enfeksiyonların ilk simptomlarıdır (Şekil 2.4). Lokalize olmuş bir enfeksiyon zamanla, iletim demetlerine ilerleyerek uygun koşullar altında sistemik bir enfeksiyonu başlatabilir. Hastalıktan dolayı meydana gelen kayıplar esas olarak bitkilerin solması ve çökmesi ile oluşmakta, domates meyveleri üzerinde KUŞ GÖZÜ lekesi olarak bilinen 3-6 mm çaplı, ortası kahverengi ve çevresi beyaz bir hale ile çevrili yüzeysel
simptomlar şeklinde kendini gösteren lekeler de meyvenin pazar değerini düşürmektedir (Çetinkaya-Yıldız ve Aysan, 2008).
ġekil 2. 1. Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis‟in neden olduğu sistemik
enfeksiyon sonucu oluşan solgunluk görünümü.
yanıklığı
ġekil 2.3. Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis‟in neden olduğu iletim
demetlerinde ki renklenme belirtileri
Etmen gövde, meyve ve iletim demetlerinde renk değişikliği, gövdede çatlama şeklindeki
‘KANSER’ lere, bitkinin öz kısmında boşluklar oluşumuna ve sonunda bitkinin ölümüne
neden olmaktadır (Özaktan ve Bora, 1991). Yapraktaki belirti genelde yaprakların kenar kısımlarında gözlenir. Hastalığın bu dönemine „ Yanıklık Dönemi‟ adı verilir .
ġekil 2.4. Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis‟in neden olduğu lokalize
enfeksiyon sonucu oluşan lokal yaprak yanıklıkları
Domateste ekonomik zarar meydana getiren bu bakteriyel etmenin inokulum kaynakları, bulaşık toprak, yabancı otlar, hastalıklı bitkiler, hastalıklı bitki artıkları ve özellikle bulaşık tohumlardır (Çetinkaya Yıldız ve Aysan, 2008). Bu hastalıkla mücadelede; hastalıksız tohum kullanımı, fiziksel ve kimyasal tohum uygulamaları (Fatmi ve ark., 1991), koruyucu bakır uygulamaları (Özaktan, 1991), toprak solarizasyonu (Tokgönül, 1998), biyolojik mücadele (Tokgönül ve Çınar, 1999), bitki aktivatörleri (Çetinkaya Yıldız ve Aysan, 2005) ve çinko gübrelemesi (Çakmak ve Aysan, 2009) önerilmektedir. Ancak istenilen düzeyde hastalık önlenememektedir. Mücadelede en etkin ve çevreci yöntem olanak varsa dayanıklı çeşit kullanılmalıdır.
2.2. C. m. subsp. michiganensis (Smith) Davis et al., ‘in Epidemiyolojisi Ġle Ġlgili Yapılan ÇalıĢmalar
Bakteriyel etmen Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis ilk kez 1909 yılında Amerika Birleşik Devletlerinin Michigan eyaletinde domates üretim alanlarında
saptandığından beri dünyanın domates yetiştirilen bütün bölgelerinde rapor edilmiştir (Gleason ve ark.,1993).
Cmm domates bitkisinde hem kalite hemde kantite de azalmaya neden olmaktadır. Sherf ve Macnab (1986) bakteriyel solgunluk hastalığını domatesin en korkulan ve yıkıcı hastalıklarından biri olarak tanımlamakta ve 1960 yılında Kuzey Carolina, Kenya ve Ontario‟da %60-80‟nin üzerinde ürün kayıpları ile sonuçlanan epidemiler oluşturduğunu bildirmektedirler. Chang (1992a) fidelerin tarlaya şaşırtılması esnasında enfektelenen domates bitkilerinde %31-83 oranında enfeksiyon oluştuğunda, ortalama meyve ağırlığında 13 g, toplam ürün miktarında ise %46 oranında azalma olduğunu bildirmiştir. Etmen Amerika Birleşik Devletlerinin Midwest (1930‟lu ve 1980‟li yıllar), Ontario (1960‟lı ve 1980‟li yıllar) ve Kuzey Carolina (1960‟lı yıllar) eyaletlerinde çeşitli yıllarda meydana getirdiği epidemilerde üretici bazında %80‟nin üzerinde, bölgesel olarak ise %5-10 oranında ürün kaybına neden olmuştur (Gleason et al., 1993). Ricker ve Riedel (1993) yaptıkları çalışmada, fideler tarlaya şaşırtılmadan önce etmen tarafından enfektelendiğinde çevre şartlarına bağlı olarak ürün miktarının %63-93 oranında azaldığını bildirmişlerdir.
Ülkemizde ise bakteriyel solgunluk hastalığının varlığı Tokgönül (1998)‟ün bildirdiğine göre ilk olarak İç Anadolu bölgesinde (Bremer ve Özkan, 1950) saptandıktan sonra , Güney Doğu Anadolu (Bremer ve ark.,1952), Marmara (Karahan, 1965) ve Ege bölgesinde (Karaca ve Saygılı, 1977) tespit edilmiştir. Daha sonra yapılan çalışmalarda etmen Doğu Akdeniz (Çınar, 1980), Çukurova bölgesi (Öktem, 1985) Batı Akdeniz (Basim ve ark., 2004) ve Doğu Anadolu (Sahin ve ark., 2002) bölgelerinde domates üretim alanlarında belirlenmiştir.
Hastalığın Ankara ilinde %0.5 ile %23 arasında bir yaygınlık gösterdiği tespit edilmiştir, ancak bazı ilçelerde %100 bulaşık tarlalara da rastlanmıştır. Yapılan çalışmalarda patojenin kurumuş domates gövdesinde 5 ay, kurumuş yaprakta (saplı) ise 4 ay süre ile yaşadığı tespit edilmiştir ( (Öktem, 1985).
Orta Anadolu Bölgesi‟nde 14 ilde (Afyon, Ankara, Bolu, Burdur, Çankırı, Eskişehir, Isparta, Kayseri, Kırşehir, Konya, Nevşehir, Niğde, Yozgat ve Zonguldak) domates ekim alanlarında 354 örnekleme noktasında domates bakteriyel hastalıkları surveyi yapılmıştır. Surveyler sonucunda Afyon dışındaki 13 ildeki 97 tarlada Domates Bakteriyel Kanser Hastalığına rastlanmıştır. Hastalık sırayla Isparta (% 5,25),Yozgat (% 4,67), Ankara (% 3,71), Çankırı
(%1,8) ve Niğde (%1,4) illerinde oldukça yüksek oranda görülmüş, diğer illerde ise % 0,07 – 0,71 arasında değişen oranlarda saptanmıştır (Öktem ve Benlioğlu, 1993).
Kahveci ve Gürcan (2003) yaptıkları çalışmada Antalya (Alanya, Elmalı, Kaş, Korkuteli, Kumluca, Manavgat, Merkez ve Serik ilçeleri) ilinde incelenen sera ve tarla domateslerinde solgunluk gösteren bitkilerden izole edilen 72 adet bakteri izolatını yaptıkları testler sonucunda Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis olarak tanılamışlardır.
Şahin ve ark., (2002) yapmış oldukları bir çalışmada Doğu Anadolu Bölgesinde Oltu, İspir ve Yusufeli ilçelerinde Target çeşidi ticari domates üretimi yapılan 6 farklı üretim alanında hastalık yaygınlığının %100 olduğunu bildirmişlerdir. Yapılan biyokimyasal testler ve yağ asit metil ester analizleri sonucunda elde ettikleri izolatları Clavibacter michiganensis susp.
michiganensis olarak tanılamıştır.
Basım ve ark., (2004) Isparta‟ ya bağlı Keçiborlu, Çandır ve Şeyhler ilçeleri ile Antalya‟ ya bağlı Serik, Aksu, Kumluca, Demre ve Kınık ilçelerinde örtü altı domates yetiştiriciliği yapılan alanların %26 ve %65 arasında değişen oranlarda Cmm ile bulaşık olduklarını saptamışlardır.
Yıldız (2007)‟ ın Çukurova bölgesinde yaptığı arazi sürveyleri sonucu hasta domates bitkilerinden yapılan izolasyonlarda domates bitkilerinin yoğun bir biçimde Cmm etmeni ile bulaşık olduğunu tespit etmiştir. Çalışmada Adana, Mersin, Antalya, Bursa, Artvin ve İzmir illerinde domates üretim alanlarında sürveyler yapılmıştır. Sürvey yapılan üretim alanlarında simptomolojik olarak yapılan gözlemler sonucunda bakteriyel kanser hastalığının görüldüğü yıllarda %15-25 arasında değişen oranlarda yaygınlık gösterdiği belirlenmiştir. Özellikle bir önceki üretim sezonunda hastalık saptanmış ve yaygınlık oranının %70-80‟lere ulaştığı tespit edilmiştir.
2.3. C. m. subsp. michiganensis (Smith) Davis et. al.,’ in BulaĢma Yolları
Bakteriyel solgunluk etmeni Cmm toprakta, bitki artıklarında, yabancı otlarda, sera konstrüksiyon malzemeleri, çeşitli tarımsal aletler (fide saksısı, oluk, budama makası vb), üzerinde ve tohumlarda yaşamını sürdürebilmektedir (Blancard, 1988). Tokgönül (1998)‟ün bildirdiğine göre Grogan ve Kendrik‟in 1953‟de, Thyr‟ın ise 1969‟da yaptığı çalışmalarda
Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis ile bulaşık domates tohumlarının hastalığın
en önemli inokulum kaynağı olduğu ve etmenin tohumda taşınma oranının %0.25 ile %100 arasında değiştiği bildirilmiştir. Ayrıca Tokgönül (1998)‟ün bildirdiğine göre, Öktem (1985) Türkiye‟de domates üretiminin periyodik artışına paralel olarak tohumluk probleminin ortaya çıktığını ve çok sayıda çeşidin ülkeye girişi ile domates bakteriyel hastalıklarında artış görüldüğünü bildirmiştir.
Chang (1992) fidelerin tarlaya şaşırtılması esnasında enfektelenen domates bitkilerinde %31 -83 oranında enfeksiyon oluştuğunda, ortalama meyve ağırlığında 13 g, toplam ürün miktarında ise %46 oranında azalma olduğunu bildirmiştir. Ricker ve Riedel (1993) yaptıkları çalışmada, fideler tarlaya şaşırtılmadan önce etmen tarafından enfektelendiğinde çevre şartlarına bağlı olarak ürün miktarının %63 -93 oranında azalma görüldüğünü saptamışlardır. Nedumaran ve Vidhyasekaran (1982) Hindistan‟ın farklı bölgelerinden elde ettikleri domates tohumları ile yaptıkları çalışmada Cmm ile doğal bulaşıklılığın ciddi bir tehlike oluşturduğunu saptamışlar ve bununla ilgili geniş çalışmaların acil olarak başlaması gerektiğini bildirmişlerdir. Ayrıca enfekteli domates tohumlarından etmenin elde edilmesi ve tanılanması için çeşitli yöntemleri araştırmışlardır. Etmenin tohumdan fideye taşınmasının epidemi oluşumundaki öneminin belirlenmesi için yapılan bir çalışmada ise tohumdan fideye %0.01 oranında taşınan Cmm‟in tarlada önemli bir epideminin başlangıcı olabileceği belirlenmiştir (Chang ve ark., 1991). Özaktan (1991)‟ın bildirdiğine göre Byran (1930) etmenin iletim sistemi yardımı ile tohumları sistemik olarak enfekte ettiğini ve embiryoda bulunduğunu belirlemiştir. Ayrıca çalışmada doğal enfekteli tohumlarda bakterinin tohuma geçiş oranının %1 -5, yapay enfekteli tohumlarda ise %21 -40 oranında olduğu belirlenmiştir. Patino-Mendez (1964) yaptığı çalışmada Cmm‟in tohumları tohum kabuğu veya tohum zarından geçerek enfekte ettiğini, tohum zarının en içte bulunan hücrelerine doğru hareket ettiğini, ancak embriyoya giremediğini saptamıştır. Walker (1969) ise etmenin enfekteli meyve etinin ekstraksiyon işlemi sırasında tohumları yüzeysel olarak bulaştırabildiğini ve tohum kabuğundan kotiledon yapraklara daha sonra ise iletim sistemine yayıldığını belirtmiştir.
Cmm‟in sebep olduğu Domates Bakteriyel Solgunluğunun primer inokulum kaynağının tohum olduğu bilinmektedir (Tsiantos, 1987).
Bu etmenin embriyoda bulunduğu ve vasküler sistem yardımıyla tohumları sistemik olarak infekte ettiği (Bryan, 1930) ve etmenin tohumları tohum kabuğu ya da tohum zarından geçerek infekte ettiği, tohum zarının en içteki hücrelerine doğru hareket ettiği fakat embriyoya girmediği saptanmıştır (Pantino-Mendez, 1964). Etmenin infekteli meyve etinin ekstraksiyon işlemi sırasında tohumları yüzeysel olarak bulaştırabildiği ve tohum kabuğundan kotiledonu, daha sonra da vasküler sistemi işgal ettiği bilinmektedir (Özaktan ve Bora, 1991).
Birçok araştırıcı ise Cmm‟in bir diğer inokulum kaynağının toprak olduğunu ve bu etmenin toprakta belirli koşullarda canlılığını sürdürebildiğini belirtmişlerdir (Grogan and Kendrick, 1953) .
Cmm‟in topraktaki yaşam süresinin belirlenmesi için yapılan bir çalışmada inokulasyondan 8 ay sonra hava ile kurutulmuş topraktan etmen geri izole edilemezken, 2oC‟deki nemli toprakta 18-30 ay süre ile canlı ve virülent kalabildiği saptanmıştır (Strider, 1967). Ayrıca Ciccarone ve Carili (1948)‟de yaptıkları çalışmada İtalya‟da etmenin toprakta dört yıl süreyle yaşayabildiğini belirlemişlerdir.
Grogan and Kendrick (1953), etmenin tarladaki kalıntısının önemli olmadığını belirtmiştir, Dick (1981) ise kışı toprakta geçiren bakterinin meyve üzerinde lekelenmelere sebep olduğunu saptamalarına rağmen; Ciccarone ve Carili (1948) İtalya‟ da bu etmenin toprakta 4 yıl süreyle canlı kalabildiğini belirtmiştir. Bulaşık kalıntılarda da bu etmen bir yıldan uzun süre canlılığını sürdürebilmektedir (Farley and Miller, 1973). Basu (1966)‟ nun yaptığı bir çalışmada ise; – 20 º C‟ de domates yaprakları inkube edilmiş ve etmenin 36 hafta süreyle canlı kalabildiği saptanmıştır.
Gleason ve ark. (1991) toprak yüzeyinde kalan bulaşık bitki artıklarında etmenin en az 24 ay boyunca canlı kalabildiğini fakat toprağa gömülen bulaşık bitki artıklarında sadece 7 ay boyunca canlılığını sürdürdüğünü belirlemişlerdir. Ayrıca araştırıcılar kışı bulaşık bitki artıklarında geçiren epifitik Cmm populasyonunun primer inokulum kaynağı olarak rol oynayabileceğini bildirmektedirler. Chang ve ark., (1992) patojenin toprak yüzeyinde kalan bulaşık bitki artıklarında, toprağa gömülen bulaşık bitki artıklarına göre daha uzun süreyle canlılığını koruyabildiğini belirlemişlerdir. Gitaitis ve ark., (1989) domates bakteriyel solgunluk hastalığının esas inokulum kaynaklarının topraktaki artıklar, yabancı otlar, bulaşmış odunsu parçalar, enfekteli bitkiler ve enfekteli tohumlar olduğunu bildirmişlerdir. Etmenin
latent peryodunun uzun olması, hasta ve sağlıklı fide ayrımının yapılmasını güçleştirmektedir. Bu yüzden araştırıcılar hızlı tanıda yarı seçici besi yeri kullanımını önermekte ayrıca akşamsafası (Mirabilis jalapa) bitkisinde etmen tarafından oluşturulan aşırı duyarlılık reaksiyonunun hızlı tanıda güvenilir bir kriter olabileceğini bildirmektedirler.
Trevors ve Finnen (1990) ise organik maddeler içeren kumlu, killi yapıdaki steril olmayan toprağa 12 patojenik Cmm izolatı inokule etmişlerdir. 30 gün boyunca yaptıkları izolasyonlarda başlangıçta etmeni %90 seviyelerinde geri izole ederken 30. günde bu oran %10‟un altına düşmüştür. Araştırıcılar patojenin bazı izolatlarının toprakta canlılığını devam ettirebildiğini bir kısmının ise zayıf canlılık gösterdiğini saptamışlardır. Patojenin düşük yoğunlukta elde edilmesinin, etmenin izolasyonundaki zorluklardan kaynaklanabileceğini bildirmişlerdir.
Cmm‟in seconder bulaşma kaynağının ise; budama, koltuk alma gibi kültürel işlemlerin yanı sıra yağmur, su ve pestisit damlacıklarının olduğu belirtilmektedir (Sasaki, 1987).
Fatmi ve Schaad (2002) farklı coğrafik bölgeler de Cmm‟in bulaşık bitki artıklarında canlılığının belirlenmesi üzerine araştırmalar yapmışlardır. Çalışmalarını Amerika Birleşik Devletlerinin California ve Ohio eyaletlerinde Fas‟ın ise Melk Zhar ve Ait Melloul bölgelerinde sürdürmüşlerdir. Araştırıcılar patojenin toprak yüzeyine bırakılan domates gövdelerinde Ohio ve California‟da 314 gün boyunca, Melk Zhar ve Ait Melloul‟da sırası ile 194 ve 132 gün boyunca canlılığını devam ettirdiğini saptamışlardır. Toprağa gömülen gövdelerde ise etmenin Ohio‟da 314 gün, California‟da 240 gün, Ait Melloul ve Melk Zhar‟da 60 gün boyunca yaşamını sürdürdüğünü belirlemişlerdir. Araştırıcılar elde ettikleri bu bilgiler ışında Cmm‟in bitki artıklarındaki yaşam süresinin hem coğrafik bölgeye göre, hem de bitki artıklarının toprak yüzeyinde veya toprak içerisinde gömülü olmasına bağlı olarak değiştiğini bildirmişlerdir.
2.4. C. m. subsp. michiganensis (Smith) Davis et. al., Ġle Mücadele
Primer enfeksiyonların önlenmesinde tohum bulaşıklığının giderilmesi öncelikli bir konudur. Tohumla taşınan bakteriyel etmenlerin mücadelesinde tohum uygulamaları olarak;
1. Genel olarak üretim materyaline (tohum, fide, fidan vb) uygulanan antagonistlerin (Bacillus
Streptomyces griseoviridis (Mycostop), Gliocladium virens, Agrobacterium radiobacter ve Trichoderma spp.) yer aldığı, biyolojik mücadele yöntemi,
2. Tohum partilerinde patojenlerin enfeksiyonları nedeni ile rengi, şekli ve görünümü değişmiş, zarar görmüş tohumların mekanik olarak ayrılması esasına dayanan, mekanik mücadele yöntemi,
3. Tohumlara zarar vermeden, sıcaklıkla (sıcak su uygulaması, sıcak hava uygulaması, havalı buhar uygulaması ve radyasyon uygulaması) patojenlerin ortadan kaldırılması prensibi ile çalışan fiziksel mücadele yöntemi,
4. Streptomisin sülfat, Streptomisin, Kasugamisin, Na hipoklorit (NaOCl), Bronopol, Captafol, Mancozeb, TCMTB, Thiram, Hidroklorik asit (HCI), Sodyum hidroksit (NaOH) ve Sodyum fosfat (Na3PO4) gibi kimyasalların kullanıldığı kimyasal mücadele yöntemi uygulanmaktadır (Karsavuran ve ark., 2005).
Tohum uygulamaları, tohum ve toprak kökenli mikroorganizmaların zararını önlemek veya azaltmak için düşünülmüş yöntemlerdir (Karsavuran ve ark., 2005). Sodyum hipoklorit, hidroklorik asit, bakır asetat, sıcak su uygulamaları Clavibacter michiganensis subsp.
michiganensis‟e karşı etkili bulunan fiziksel ve kimyasal tohum uygulamalarıdır (Özaktan,
1991). Hastalık ile mücadelede yoğun biçimde kullanılan kimyasalların insan ve çevre sağlığı üzerine olan olumsuz etkilerinin ortaya çıkması, düşük dozlarda ve çevreye dost kimyasal kullanımının hızla artmasına neden olmuştur. Bunun yanında bakteriyel solgunluk hastalığına karşı yeterli ve etkili bir mücadele yönteminin olmayışı insanları yeni mücadele yöntemlerinin arayışına sürüklemiştir.
Bu patojeni elimine etmek için kullanılan birçok mücadele yöntemi vardır. Bu mücadele yöntemlerine ilişkin literatür özetleri aşağıda verilmiştir.
İnfekteli tohumda bulunan bakteriyi yok etmek için önerilen mücadele yöntemleri içinde kuru sıcaklık ve sıcak su uygulamaları ile ilgili literatür bilgilerini özetlemek gerekirse; Fatmi ve Schaad (1988), 0.6 M HCl de 5 saat, % 0.5 asitli bakır asetatta 20 dakika, 52 º C sıcak suda 20 dakika veya 56 º C sıcak suda 30 dakika tohum uygulaması kullanarak patojenin tohumdan eradikasyonunu sağlamışlardır. Uygulanan blotter testlerinde, 56 0 C de sıcak su uygulaması
toprağa ekildiğinde ise sadece HCl ve 52 º C‟ de ki sıcak su uygulaması çimlenmeyi önemli ölçüde düşürmüştür.
Ark (1944), infekteli bitkilerden elde edilen domates tohumlarını 24 saat süreyle 60-68 ºC de kuru sıcaklığa bırakmak suretiyle tohumda bulunan bakterinin kontrol edilebileceğini ve bu sıcaklık derecelerinin tohum çimlenmesi için de toksik olamayacağını kanıtlamıştır. Özaktan ve Bora‟nın, (1991), yaptığı bir çalışmada Cmm ile bulaşık tohumlara, ekimden önce sıcak su uygulaması yapılmıştır ve buna göre en etkili sıcaklık uygulamasının; 54-56 º C olduğu saptanmıştır. En etkili kuru sıcaklık uygulaması ise bulaşık tohumların 75 °C‟ de 16 saat bekletilmesinden elde edilmiştir. Yapılan başka bir araştırmada ise 53 °C sıcak su uygulamasının (Orth, 1937) , 56 °C‟de 30 dakika süreyle sıcak su uygulamasının, Goode and Sasser (1980) ise; 50-56 °C‟ de 25 dakika süreyle sıcak su uygulamasının infekteli domates tohumunda bulunan Cmm‟ yi başarılı şekil elimine ettiğini saptamışlardır.
Domates tohumlarının % 0-6‟ lık HCl ile 30 -45 dakika süreyle ekstrasyonundan sonra 66 °C‟ de 3 saat kurutulmasının sistemik infekteli domates tohumlarındaki Cmm‟ nin elimine edilebileceği saptanmıştır (Thyr et al., 1973). Blood (1937), yeni ekstrakte edilmiş tohumların % 0,8‟lik asetik asit içinde 24 saat süre bekletilmesi sonucunda Cmm‟ nin elimine edildiğini belirtmiştir. Shoemarker and Echandi (1976) ise, tohumların % 1,05‟ lik sodium hypocholorit içinde 40 dakika, % 5‟lik HCl‟ de ise, 5 saat süreyle tutulması sonucunda hastalığın önemli ölçüde engellendiğini saptanmıştır.
Dhanvantari (1989), tohumlar 0,6 M HCl, % 0,6 sodium hypocholorit içinde 15 dakika süreyle bekletilmesi sonucunda etmenin önemli ölçüde engellendiğini saptamıştır.
Hastalıklı domates tohumları % 0,5‟ lik ethyl mercury phosphate solüsyonu içinde 5 dakika süreyle tutulması sonucunda, in vivo testlerde % 98-100 arasında hastalıktan arı tohum elde edildiği ve fitotoksisite görülmediği saptanmıştır. Özaktan ve Bora‟nın (1991), Metoksietil civaklorür‟ ün değişik dozlarıyla yaptığı tohum ilaçlamasında, domates tohumlarında Cmm‟ e etkisinin en yüksek olduğu dozun, 10- 30 ppm olduğu saptanırken, Streptomycin uygulamasında ise bu dozun, 100 -300 ppm olduğu in vitro testlerde saptanmıştır. Karahan (1969) ve Çınar (1980)‟ ın yaptığı çalışmada % 15 Hg içeriğine sahip olan phenyl mercury acetate preparatının Cmm‟ye karşı etkinli olduğunu saptamışlardır. Tohumların % 0,1‟lik civa klorid süspansiyonuna daldırmanın etmeni elimine etmekte başarılı olduğu belirtilmiştir
(Mathai, 1984). Bogatsevska et al. (1989) ise; infekteli tohumların 52 º C sıcaklıkta 25 dakika % 0,25‟ lik phenyl mercury acetate süspansiyonuna daldırılması sonucunda tohum kaynaklı olan bu hastalığın önemli ölçüde azaltıldığını ve sıcaklık olmaksızın yapılan tohum uygulamasının daha az etkili olduğunu bildirmiştir. Yapılan başka bir çalışmada ise streptomycin‟in, etkili bir tohum ilacı olduğu in vivo ve in vitro testlerle saptanmıştır (Waksman, 1949). Köhler (1950) ise; hastalıkla bulaşık tohumların % 0,01‟lik streptomycin süspansiyonunda 20 dakika süreyle bekletilmesinin, kontrolde % 60 oranında hastalık gözlenmesine karşın, uygulama görmüş tohumlardan gelişen bitkilerde bakteriyel kansere rastlanmadığını saptamıştır. Yapılan diğer bir çalışmada ise Cmm ile yapay infekteli domates tohumlarının 24 saat süreyle antibiyotik süspansiyonuna bırakılması sonucunda kontroldeki hastalık şiddetinin % 84,6 olduğu saptanırken, Penicilin dışında Streptomycin, Bacitracin ve Polymycin B gibi antibiyotiklerin bakteriyel solgunluğu etkili biçimde kontrol ettiği saptanmıştır. Streptomycin‟ in 4 saat içinde tohum gömleğini geçtiği ve Cmm için etkili bir tohum ilacı olduğu belirtilmiştir.
Tohumda bulunan patojenin elimine edilmesinde kullanılan bir diğer mücadele yöntemi ise; meyve etli tohumların fermentasyona tabi tutulmasıdır. Bu alanda yapılan çalışmalarda (Blood, 1937), meyve etli tohumların 72-76 saat süreyle yapılan fermentasyonunda tohumdaki inokulumun kontrol edilebildiği; bunun nedeninin ise fermente olan meyve eti içinde laktik ve asetik asitlerin varlığı ve infekteli tohumların bu asitlerle ıslatılması sonucunda bu etmenin gelişiminin engellemesi sonucuna varılmıştır. Krüger ise (1959) ; fermente olmuş meyve etinin Cmm‟ ye karşı engelleme aktivitesinin yüksek olduğunu ve fermentasyon sırasında üretilen antibiyotiklerin tohum gömleğinden embriyoya geçme yeteneğini kanıtlamıştır. Mathai (1984) ise; 30 ° C‟de 2 -3 gün süreyle yapılan fermentasyonun bakteriyi engelleme konusunda başarılı olduğunu saptamıştır. Özaktan ve Bora (1991) ise, katkı yapılmaksızın sadece meyve etli tohumlar, toprak katkısı ve çürük meyve kullanılarak yaptıkları fermentasyon işlemi sonucunda oluşan mikroorganizmaların fermente olmuş meyve suyu örneklerinden izole edilmiş ve bu bakterileri antagonistik yetenekleri açısından değerlendirmiştir. Sonuç olarak; her üç uygulamada da hastalığın önlenmesine karşın toprak katkılı fermentasyonun patojeni daha iyi elimine ettiği saptanmıştır.
Bu hastalığı elimine etmekte kullanılan bir diğer yöntem de tohum uygulamalarının, kimyasal mücadele ile desteklenmesidir.
Krüger (1960), domates fidelerinin Cmm ile infeksiyonundan önce köklerin albamycin, albamycin + terramycin ile uygulama görmesinin hastalık şiddetinde önemli bir azalmaya neden olduğunu saptamıştır. Strider (1969), fungisid uygulaması ve nemli hava koşullarında hastalığın yayılım hızının arttığını ve bakteriyel etmenin kullanılan fungisidlerde canlı kalabildiğini belirtmiştir. Bunun dışında standart fungisid programına (Maneb + Zineb) tribazik bakır sülfat‟ ın veya streptomycin katılmasının meyve ve yaprak simptomlarını azalttığı sonucuna varılmıştır. Congleton and Huisingh (1970), gövde inokulasyonundan önce 14 saat süreyle kökleri 10 μg/ml Vancomycin veya Ristocetin içine daldırılarak uygulama gören ve bulaşık toprağa dikilen bitkilerdeki hastalık şiddetinde % 60– 70 oranında azalma olduğu belirtilmiştir.
Farley and Miller (1973) ise, etmenin budama ile yayıldığını belirterek, budama öncesi ve sonrasında 4,5 g/l tetracycline püskürtmekle sera koşullarında hastalığın kontrol edildiğini, aynı şekilde tarlada da etkili sonuç verdiğini belirtmişlerdir. Pilavcı ve Ulukuş (1987), fide köklerine yaptıkları 3 saatlik antibiyotik uygulaması sonucunda; 5,0 g/l dozundaki troleandomycin‟ in etkililiğinin % 29,36 olduğunu, 1,0 g/l dozundaki streptomycin uygulamasının ise % 94 – 97 oranında etkinlik sağladığını saptamışlardır.
Etmenin tohumda taşınma oranı % 0,25 – 100 olmasına karşın (Agarwal and Sinclair, 1997) bazı alanlarda bulaşık topraklardan kaynaklanan infeksiyonlar da önem taşımaktadır.
Strider (1967), organizmanın toprakta 18 ay süreyle canlı kalabileceğini ve toprağa yapılacak olan methyl bromide uygulamasıyla bakterinin elimine edilebileceğini
saptamıştır. Upstone (1971) ve Docea and Marinescu (1977), Metham-sodium gibi bir fumigant uygulamasının bulaşık toprağı dezenfekte etmede etkili olduğunu belirtmişlerdir. Schuster and Wagner (1972) ve Pena (1982), şaşırtma yastıklarına uygulanan formalin, topraktaki patojenin elimine edilmesinde etkili olduğunu bildirmişlerdir.
Bu çalışmaların dışında bakteriyel solgunluk ve kanser hastalığını önlemede diğer bir mücadele yöntemi ise, bazı zararsız kimyasalların bitki eksratlarının ve eterik yağların kullanımına yönelik çalışmalardır. Bu alanda yapılan literatür bilgilerini özetlemek gerekirse; Soylu et all., (2003), %50 (WP) Acibenzolar-S- methyl (ASM) etkili maddesini distile edilmiş su içinde çözdürülerek fidelere içirme yöntemiyle uygulamıştır. Bu uygulama sonucunda
oluşan Superoxide dismutase ve Glutathione S17 transferase enzimlerinin patojen bakteri populasyonunda % 68,2, hastalık şiddetinde ise % 75 oranında azalmaya neden olduğunu saptanmıştır. Basım et all (2005), polen ve propolis ekstraktı kullanımının, patojen bakteriye etkisini araştırmıştır. Polen ve propolis ektraktının farklı konsantrasyonları besin ortamına karıştırılmış ve 48 saatlik inkubasyondan sonra oluşan engelleme zonları ölçülmüştür. Araştırıcı, bu konsantrasyonlar içinde 1/5 oranında yapılan polen ekstraktı uygulamasında en yüksek engelleme zonunun uygulamada 10 mm olduğunu, propolis ekstaktının ise en yüksek engelleme zonunu yine 1/5 oranında yapılan uygulamada 11 mm olarak ölçüldüğü belirtilmiştir.
Slusarski (2004), Peracetic acid + Hydrogen peroxide, Alkyldimethylbenzylammonium chloride + glutaraldehyde, Alkyldimethylbenzylammonium + biguanidine türevi ve greyfurt ekstraktını kaya yününde yetiştirilen domates bitkisine damla sulama yöntemiyle uygulamıştır. Bunun sonucunda, dezenfektanlar hastalık şiddetinde önemli ölçüde düşüşe neden olurken, pazarlanabilir üründe % 2-15 oranında artış sağlandığı saptanmıştır; greyfurt ekstraktının ise dezenfektanlar gibi Cmm‟ e karşı etkili olmasına sağlamasına rağmen meyve veriminde ise önemli ölçüde düşüşe neden olduğu belirtmiştir. Türküsay ve Tosun (2005), bitki aktivatörü olarak kullanılan HuwaSan TR -50 (Hidrojen Peroksit 580 g/L ve kolloid gümüş 0.36 g/L) isimli preparatın Cmm‟ e karşı in vivo ve in vitro etkileri değerlendirmiştir. In vivo test sonuçlarına göre; HuwaSan TR -50‟ nin Cmm‟ nin koloni gelişimini % 61 oranında engellediği saptanmıştır. Yapılan in vivo testlerde ise yapay olarak infekteli tohumlara uygulanan bu preparatın ise Cmm‟ e karşı % 75‟lik bir etki sağladığı saptanmıştır. Araştırıcılar, kimyasal preparat olan Champ Formula (Bakır hidroksit, 361,1 g/l) ile HuwaSan TR -50‟ yi birlikte uyguladıklarında ise bu etkinin % 81,7 oranında olduğunu saptamışlardır.
Dimitra et all (2002), mercanköşk, kekik, yer fesleğeni, lavanta, adaçayı, yabani fesleğen, kuşburnu ve geyik otu gibi çeşitli bitkilerden elde edilen eterik yağları in vitro koşullarda değerlendirmiştir. Araştırıcı, eterik yağları King B besi ortamına farklı konsantrasyonlarda (85- 300 μg/ml) karıştırmış, Cmm‟ i ise petri kabına yayma şeklinde vermiş ve petride oluşan koloni sayılarına göre değerlendirme yapmıştır. En etkili sonucun kekik ve gazel otundan alındığını belirtmiştir. Kekik bitkisinde 100 μg/ml uygulama dozunda Cmm‟ in koloni sayısında % 100 oranında düşüş sağlandığı, gazel otunda ise 150 μg/ml dozda patojen bakterinin sayısının koloni sayısı % 100 oranında düştüğü belirtmiştir.
Bu hastalığı önlemedeki diğer bir mücadele yöntemi ise özellikle son yıllarda oldukça önemli sonuçların alındığı canlı organizmalar ile (biyolojik mücadele) hastalığın elimine edilmesi yöntemidir. Özaktan ve Bora (1991); fermantasyon sırasında domates meyve etinin fermantasyon sıvısından, fermantasyon sırasında izole ettikleri bir antagonistik bakteri ile uygulama gören Cmm ile % 100 bulaşık tohumlardan yapılan reizolasyonlarda ve ELİSA testi ile yapılan kontrollerde, %6 gibi çok düşük bir patojen bakteri populasyonu saptamışlar, tarla denemesinde ise; bu bakteri ile uygulama gören domates fidelerinde solgunluk çıkışının % 75 oranında engellendiğini belirtmişlerdir. El- Abyad et all (1992) ; invitro testlerde
Streptomyces pulcher ve S. citrefluorescens’ in etkisini araştırmıştır. Bu antagonist
bakterilerin farklı dozdaki filtrat konsantrasyonları Cmm ile petride karşı karşıya getirilmiş ve patojen bakterinin oluşturduğu koloni sayıları saptanmıştır. Kontrolde koloni sayısı 200 olarak hesaplanırken, her iki antagonist bakteri içinde % 80 filtrat konsantrasyonunda koloni sayısı 0 olarak hesaplanmıştır. Ayrıca Streptomyces pulcher’ in tohum kaplama, tohum daldırma ve toprak inokulasyon yöntemleri ile inokulum kaynağıyla bulaşık etmene uygulanması sonucunda toprak inokulasyonu ve tohum daldırma uygulamalarında hastalık şiddeti % 100 oranında engellenirken tohum çimlenmesinin ise % 95-96 oranında olduğu saptanmıştır. Tohum daldırma uygulamasında ise hastalık şiddetinin % 57,1 oranında, tohum çimlenmesinin ise % 96 oranında olduğu sonucuna varılmıştır. Boudyach et al (2001), domates bitkisinin rizosfer ve rizoplane‟ inden izole ettikleri 178 bakteriyel strainden özellikle 3‟ünün tohum uygulamasını takiben fide uygulaması şeklinde sisteme sokulması durumunda, Cmm infeksiyonunu başarıyla engellediğini ve etkili antagonist bakterilerinin genelde flourosent Pseudomonas‟ lar olduğunu belirtmiştir. Bacillus subtilis (Quadra 136),
Trichoderma harzianum (Root Shield), rizozom, kompost sıvısı, Rhodosporidium diobovatum
(533) ve B.subtilis (Quadra 137) domates bitkilerine pulverize edilerek uygulandığında, sera kosullarında, domates bitkilerinde Cmm‟den kaynaklanan bakteriyel solgunluk ve kanseri, inokule edilmiş kontrol bitkileriyle karşılaştırıldığında başarıyla engellemiştir (Utkhede and Koch, 2004). Slusarski, 2004‟nin 4 farklı antagonist bakterinin Cmm‟e etkisini testlediği bir çalışmada, bakteriler kaya yününe damla sulama sistemiyle verilmiş ve bunun sonucunda hastalık şiddetinde düşüş, pazarlanabilir ürün miktarında ise % 7- 17 oranında artışın elde edildiği belirlenmiştir. Umesha (2001), antagonistik P. flourescens ile tohum uygulamasının laboratuvar koşullarında tohum kalitesini ve çıkışını başarıyla engellediğini saptamıştır.
2.5. C. m. subsp. michiganensis (Smith) Davis et. al., ‘ın Moleküler Yöntemler Kullanılarak Tanısı Ġle Ġlgili ÇalıĢmalar
Çaplık ve Basım (2009) yapmış oldukları bir çalışmada domates bakteriyel solgunluk ve kanser hastalık etmeni Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm) ile domates ve biber bakteriyel yaprak lekesi hastalık etmeni Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria (Xav)‟nin tanısı ve tespiti için hassas ve seçici bir Taqman Real-Time PCR yöntemi geliştirilmişlerdir. Cmm‟ye ait pat-1 gen dizisi ve Xav‟ ye ait hrp gen dizisini kullanarak geliştirmiş oldukları yeni bir primer ve TaqMan prob setinin hassasiyeti, Real-Time PCR yöntemiyle farklı Cmm ve Xav strainlerine, farklı cins ve türe ait bitki patojeni bakterilere ve domates ile biber genomik DNA‟sına karşı test etmişlerdir.. 73 bp ve 69 bp‟lik PCR ürünleri sırasıyla tüm Cmm ve Xav strainlerinin genomlarından çoğaltılabilirken, Cmm ve Xav dışındaki diğer bakteri strainlerinden ve domates ile biber total genomik DNA‟sından çoğaltılamamıştır. Bu çalışmada geliştirilen TaqMan Real-Time PCR yönteminin Cmm ve Xav‟ nin tespitindeki hassasiyeti, Cmm ve Xav‟ nin saf genomik DNA‟ları florumetrik spektrofotometre kullanılarak picogram (pg) düzeyinde belirlenmiştir. İçsel dizi kontrolünün sağlanması için TaqMan probu kullanılarak geliştirilen bu Real- Time PCR yöntemi Cmm ve Xav‟ nin tanısı ve tespitinde seçici, hassas ve tekrarlanabilir bir yöntemdir. Bu yöntemin, Cmm ve Xav strainlerinin direkt hücreden hızlı ve hassas bir şekilde tanısında, domates ve biber tohumlarından ve hastalıklı bitki dokularından tespitinde yaygın olarak kullanılabileceğini belirtmişlerdir.
Patojenik olan izolatların PCR testi ile saptanması amacı ile Santos ve ark., (1997) tarafından CM3 -5‟CCT CGT GAG TGC CGG GAA CGT ATC 3‟ ve CM4 - 5‟ CCA CGG TGG TTG ATG CTC GCG AGA T 3‟ primer çifti, Louws ve ark., (1999) tarafından ise CMM-5 (GCGAATAAGCCCATATCAA) ve CMM-6 (CGTCAGGAGGTTCGCTAATA) primer çifti geliştirilmiştir. Ömer (2002) Bio- PCR testi ile hastalık simptomu görülmeden bile patojenin tespit edilebileceğini bildirmiştir. Bitkinin erken gelişme devrelerinde özellikle bitki simptom göstermediğinde ve ürün tohum üretimine yönelik olduğunda patojenin tespit edilmesi için BIO-PCR yöntemini önermiştir. Hadas ve ark., (2005) ise 10.000‟de 1 bulaşık tohumun Bio-PCR tekniği ile saptanabileceğini bildirmişlerdir. Benzer şekilde Burokiene (2006) domates fidelerinde Cmm‟in neden olduğu enfeksiyonun erken dönemde tanılanabilmesi için Bio-PCR‟ın kullanım olanaklarını araştırmıştır. Araştırıcı CMM-5 ve CMM-6 primerlerini kullandığı Bio-PCR çalışması sonucunda bu tekniğin seçiciliğinin yüksek, hızlı ve güvenilir olduğunu, sağlıklı domates bitkilerine patojenin yayılmasını erken dönemde önlemede kullanılabileceğini bildirmiştir.
Jahr ve ark., (1999) yaptıkları çalışmada Cmm‟in patojenik özelliklerinin yaklaşık 1500 nükleotid‟den oluşan pat-1‟geni üzerinde toplandığını belirlemişlerdir. Pa-t1 genine sahip olan Cmm izolatları virülent, sahip olmayanlar ise avirülent olarak ayrılmıştır. Tanı çalışmalarında virülent Cmm izolatlarını ayırt etmek için PCR testinde kullanılan primer dizilerinin pat-1 geni üzerinde bulunan baz dilimlerine göre dizayn edildiğini bildirmişlerdir. Garterman ve ark., 2003 yılında yaptıkları çalışmada pCM1 ve pCM2 plazmidine sahip olan Cmm izolatlarının virülenslik gösterebildiklerini diğerlerinin ise virülent izolatlar olmadığını ortaya koymuşlardır. pCM1‟de selülazı kodlayan celA geni, pCM2 üzerinde ise serin proteazı kodlayan pat-1 geni yer almaktadır. Bach ve ark., (2003) ise fitopatojenik C. michiganensis alt türlerinin farklılıklarının ve niteliklerinin belirlenmesi için TaqMan-PCR protokolü oluşturmuşlardır.
Geylani (2005), çeşitli firmalardan temin edilen 75 tohum örneğini ISTA (International Seed Testing Association) prosedürlerine göre testlemiş ve elde ettiği izolatları biyokimyasal testler, PCR testi ve Immunofloresan boyama testi ile Cmm olarak saptamıştır.
Özdemir (2005) Cmm ve Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria için sırası ile pat-1 genlerinden elde edilen 614 bp‟lik CMM5 ve CMM6 primer çifti ile hrp genlerinden elde edilen 840 bp‟lik RST2 ve RST3 primer çiftlerini kullanarak multiplex-PCR kullanımı olanaklarını araştırmıştır. Bu çalışma ile tek bir PCR tüpünde Cmm ile Xanthomonas
axonopodis pv. vesicatoria‟nın sırası ile CMM5 ve CMM6 ile RST2 ve RST3 primerlerinin
en iyi 0.2:0.4 μM primer konsantrasyonlarında çoğalabilecekleri ve en iyi bağlanma sıcaklığının da 58.5 ile 59.5 oC olduğu belirlenmiştir. Ayrıca araştırıcı multiplex-PCR kullanılarak zamandan, iş gücünden ve reaksiyon maliyetlerinden tasarruf edilebileceğini bildirmektedir.
Rep-, Eric- ve Box-PCR kullanılarak C. michiganensis‟in beş alt türü olan C. m. subsp.
michiganensis, C. m. subsp. nebraskensis, C. m. subsp. tesellarius, C. m. subsp. sepedonicus ve C. m. subsp. insidiosum‟un genetik farklılıkları ortaya konmuştur. Ayrıca Rep-PCR
kullanılarak, DNA polymorfizmine göre C. m. subsp. michiganensis‟in en az dört tipi (A, B, C ve D) olduğu saptanmıştır (Louws ve ark., 1998).
