Türk Mikrobiyol Cem Derg (2005) 35: 256-259
256 G‹R‹fi
Eucalyptus camaldulensis floras› Cryptococcus neoformans’›n do¤al kaynaklar›ndan biridir (1). Akdeniz havzas›nda birçok bölgedeki E. camaldu-lensis floras›nda C. neoformans varl›¤› bildirilmifl-tir (2-7). Türkiye ve Ürdün’de yap›lan taramalar-da ise beklenenin aksine yo¤un izolasyon yap›la-mam›flt›r (8, 9). Çevresel flartlardan olan kimya-sal yap›n›n C. neoformans’›n kolonizasyonunu et-kileyen önemli bir faktör olabilece¤i belirtilmifltir (8). Çevresel ortamda antifungal madde salg›la-yan küflerin bulunmas› durumunda C. neofor-mans’›n ve di¤er mayalar›n ço¤almas›n›n inhibe olabilece¤i de belirtilmifltir (10-11).
Çevresel ortamlardan al›nan örneklerde C. neoformans’›n varl›¤›n›n kültür yöntemi ile ta-ranmas› s›ras›nda besiyeri yüzeyinde çok say›da küf mantarlar› üremektedir. Bu küf mantar› kon-taminasyonu inhibitör madde kullan›lmas›na
ra¤-men engellenememektedir. Bu küflerin ve ortama salg›lad›klar› maddelerin C. neoformans’›n üremesine etkisi bilinmemektedir. Antikriptokok-kal aktiviteye sahip mikofloran›n bulunmas› besi-yerinde daha az say›da C. neoformans izo-lasyonuna yol açacakt›r. Bu çal›flmada, çevresel maya taramalar› s›ras›nda okaliptus debrislerinin do¤al ortam›ndan izole edilen küflerin antikripto-kokkal aktivitelerinin varl›¤› araflt›r›lm›flt›r. GEREÇ VE YÖNTEM
Çal›flmada kullan›lan küfler 2004 y›l› Haziran ay›nda izole edilmifltir. Mu¤la Gökova bölgesin-deki Eucalyptus camaldulensis Dehn a¤açlar› he-def bölge olarak seçilmifltir. Bu bölge ülkemiz-deki okaliptus floras› kökenli çevresel C. neofor-mans var. grubii izolasyonunun yap›ld›¤› bölgedir (8). Bölgedeki 70 farkl› a¤ac›n çiçek ve tohum-lar›ndan dökülen yap›lar 3-5 gr olacak flekilde toplanarak steril kaplarda ayn› gün içerisinde
la-Eucalyptus debris Küf Mantar› Floras›nda Antikriptokokkal
Aktivitenin Araflt›r›lmas›
Ça¤r› ERG‹N, Mustafa fiENGÜL, ‹lknur KALEL‹, Melahat GÜRBÜZ Pamukkale Üniversitesi T›p Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dal›, Denizli
ÖZET
Cryptococcus neoformans’›n do¤al kayna¤› olarak gösterilen Eucalyptus camaldulensis floras› ülkemizde genifl bölgelerde bulunmas›na ra¤men çevresel Cryptococcus neoformans izolasyonu çok azd›r. Bu çal›flmada; Eucalyptus camaldulensis flo-ras›ndan izole edilen küflerin antikriptokokkal aktivitelerinin varl›¤› agar difüzyon yöntemi ile araflt›r›lm›flt›r. ‹ncelenen küf-lerde antikriptokokkal aktif madde varl›¤› bulunamam›flt›r. Sonuç olarak Cryptococcus neoformans’›n az oranda izole edil-mesinin farkl› nedenlerden kaynakland›¤›na karar verilmifltir.
Anahtar kelimeler:Cryptococcus neoformans, Eucalyptus camaldulensis, antifungal, küf SUMMARY
Investigation of Anticryptococcal Activity on Eucalyptus debris’ Mould Flora
Although wide Eucalyptus camaldulensis plantation as a natural niche of Cryptococcus neoformans has been present in our country, the isolation of the yeast is lower than expected. In this study, anticryptococcal activity of the mould isolated from Eucalyptus camaldulensis flora was investigated by agar diffusion method. No anticryptococcal activity had been found. It was concluded that another factor should be present for low isolation rate of the yeast.
Türk Mikrobiyol Cem Derg (2005) 35: 256-259
257
boratuvara ulaflt›r›lm›flt›r. Örneklerin üzerine 50 cc serum fizyolojik ilave edilmifltir. fiiddetli bir flekilde çalkalanan örnekler oda s›cakl›¤›nda 45 dakika bekletilmifltir. Süpernatan eküvyon yard›m› ile %0.1 bifenil ve %1 kloramfenikol içeren Sta-ib (=Guizotia abyssinica agar, Niger tohumu agar) besiyerine ekilmifltir. Karanl›kta 30°C’da 15 gün süre ile inkübe edilen örnekler gün afl›r› küf man-tarlar› ve C. neoformans varl›¤› yönünden de¤er-lendirilmifltir. ‹nkübasyon süresi sonunda çok sa-y›da üreyerek besiyerine hakim olan küf kolonile-ri tarama amaçl› kullan›lan Staib besiyekolonile-rine sub-kültüre edilmifltir. Pasaj› yap›lan küf kolonileri laktofenol pamuk mavisi ve selofan bant yöntemi ile cins düzeyinde tan›nm›flt›r.
Agar difüzyon testinde kullanmak üzere taraman›n yap›ld›¤› bölgeden kuru okaliptüs tohumlar› top-lanm›flt›r. Tohumlar›n üzerine yüzeylerini örtecek kadar distile su ilave edilmiflve 30 dakika sürey-le kaynat›lm›flt›r. Solüsyon süzüsürey-lerek kaba parti-küller uzaklaflt›r›lm›flt›r. Kuru yap› a¤›rl›¤›n›n son konsantrasyonu %1 olacak flekilde distile su ile seyreltilen infüzyona, %1.5 oran›nda agar ve %0.1 oran›nda bifenil ilave edilmifltir. Otoklavda 121°C’da 15 dakika süreyle steril edildikten son-ra Petri kutular›na yaklafl›k 6 mm kal›nl›¤›nda dö-külmüfltür. Steril cam Pasteur pipeti yard›m› ile 5 mm çap›nda kuyucuk aç›larak kuyucu¤un dibi ay-n› besiyeri ile 1 mm kal›nl›¤›nda kapat›lm›flt›r. Çal›flma bafllang›c›nda Sabouraud dekstroz agar besiyerine C. neoformans ATCC 90112 köke-ninden pasaj al›nm›flt›r. 30°C’de 3 gün süreyle in-kübe edilen C. neoformans ATCC 90112 serum fizyolojik içinde 1.0 Mac Farland (≈106 maya/ml)
bulan›kl›k standard›nda haz›rlanm›flt›r. Süspansiyon eküvyon yard›m› ile haz›rlanan kuyucuklar haricin-deki besiyerlerinin yüzeylerine yay›lm›flt›r. Yukar›da tarif edilen okaliptüs tohumu infüzyon solüsyonundan agar ve bifenil içermeyen s›v› be-siyeri haliyle 5 cc. hacimde tüplerde haz›rlanarak ayn› yöntemle steril edilmifltir. Test edilecek çev-reden elde edilen saf küf kolonilerinden tüpteki besiyerine ekim yap›lm›flt›r. Besiyerleri 30°C’de 5
gün süreyle inkübe edilmifltir. Süre sonunda yü-zeyde oluflan küf üreme tabakas› besiyerinden al›nm›fl ve santrifüj edilerek kaba partiküller uzak-laflt›r›lm›flt›r. Her küf kökeninin üretildi¤i besiye-rindeki süpernatandan 75 μl hacim steril pipet yar-d›m› ile aç›lan kuyucuklara aktar›lm›flt›r. Bir haf-ta süre ile 30°C’de inkübe edilen besiyerlerinde C. neoformans ATCC 90112 kökeninde üreme in-hibisyonunun varl›¤› araflt›r›lm›flt›r.
BULGULAR
‹ncelenen bölgede okaliptüs a¤açlar›ndan C. neoformans izolasyonu yap›lamam›flt›r. Antikrip-tokokkal tarama için 70 farkl› debrisden elde edi-len 154 küf mantar› kökeni çal›flmaya al›nm›flt›r. Taranan 70 adet tohum debrisinden 60 köken Cla-dosporium sp, 22 köken Alternea sp, 16 köken Exophilia sp, 9 köken Penicillium sp, 9 köken Ulacladium sp, 6 köken Aspergillus sp, 3 köken Stemphilum sp, 3 köken Rhizopus sp, 3 köken Au-reobasidium sp olarak tan›mlanm›flt›r. ‹zole edilen küflerden 19 farkl› çevresel köken için cins düze-yinde tan›mlama yap›lamam›flt›r. Bu kökenler de çal›flmaya dahil edilmifltir. Do¤al ortamlar›ndan ayr›lan küf kökenleri tan›mlanan okaliptüs s›v› be-siyerinde kolayl›kla üreyebilmifltir. Test edilen küf mantarlar›n›n hiçbirinde C.neoformans ATCC 90112’nin üreme bölgelerinde inhibisyon alan› gö-rülmemifltir.
TARTIfiMA
Cryptococcus neoformans özellikle immünsüprese hastalarda hayat› tehdit eden infeksiyonlar oluflturmaktad›r. Mayan›n yaflam döngüsü ile ya-p›lan çok say›da araflt›rman›n önemli bir k›sm›n› da çevresel ortamlarda kolonizasyon için risk fak-törü araflt›rmalar› kapsamaktad›r. Bilinen en önem-li risk faktörleri güvercin d›flk›s› ile bulaflm›fl or-tamlar ve bitki kaynakl› yap›lard›r (12). Ancak dünyan›n çeflitli ülkelerinden benzer sonuçlar bil-dirilirken, farkl› bölgelerden çok say›da örnek ile yap›lan farkl› çal›flmalarda da risk faktörü olarak kabul edilen ortamlarda kolonizasyonun bulunma-d›¤›na dair veriler elde edilmifltir (9, 13).
Ülke-Ç. Ergin ve ark, Eucalyptus debris Küf Mantar› Floras›nda Antikriptokokkal Aktivitenin Araflt›r›lmas›
258 mizde yap›lan ökaliptus floras› iliflkili C.
ne-oformans var grubii izolasyonu, 1175 a¤ac›n ta-rand›¤› sahalar içinde en düflük pH aral›¤›na sa-hip (6.4-7.0) olan Gökova bölgesinden tek köken olarak izole edilebilmifltir (8, 14).
Alkalen yap› yan›nda farkl› faktörlerin de bulun-mas› C. neoformans’›n ço¤albulun-mas›nda bask›lay›c› rol oynayabilmektedir. Taramalar için kullan›lan bifenil içeren Staib besiyerinin ayn› zamanda çe-flitli küflerin üremesini engelleyememesi taramalar s›ras›nda besiyerinde yo¤un üreyebilen küf koloni-lerinden anlafl›lmaktad›r. Besiyeri yard›m› ile ya-p›lan bu taramalarda küflerin ortama antifungal salg›lama ihtimali, zaten alkalen do¤al yap› nede-ni ile az kolonede-nizasyonun beklenece¤i do¤al ortam-dan C. neoformans’›n izolasyonunu olumsuz etki-leyecektir. Bu çal›flmada kullan›lan besiyerini olufl-turan okaliptüs tohum içeri¤i C. neoformans ve çevresel küfler için besleyici fak-törleri sa¤lamaktad›r (15).
Bu çal›flmada, küf kolonilerinde antikriptokokkal maddelerin varl›¤› bulunamam›flt›r. Farkl› bir hi-potez olarak, çevresel küflerin kriptokoklar›n var-l›¤›n› farketmeleri (quarum sensing) ve antikripto-kokkal aktivite göstermeleri fleklinde olabilir. An-cak hedef al›nan okaliptüs alan›n›n büyüklü¤ü, or-tam›n tuz, pH ve nem gibi de¤iflimleri benzer me-kanizmalar›n tüm alan üzerinde “quarum sensing” mekanizmas›na engel oluflturacakt›r.
Bugün için kabul edilen veriler C. neoformans’›n ekolojik odaklar›n›n ço¤unlukla kanatl› ç›kart›lar› ve bitki kaynakl› oldu¤udur. Yap›lan çevresel ça-l›flmalarda predispozan faktörlerin varl›¤›na ra¤men mayan›n izole edilememesi, mayan›n kolonizasyo-nuna ve üremesine engel beklenmeyen faktörlerin varl›¤›n› düflündürmektedir. Bu faktörlerin a盤a ç›kar›lmas›, çevreye uygulanabilir hale getirilmesi, özellikle insan yerleflim yerlerinde maya koloni-zasyonu için risk oldu¤u düflünülen bölgelerin de-kontaminasyonu aç›s›ndan önemlidir. Ayn› zaman-da bu faktörlerin bulunmas›, insanzaman-da C. neofor-mans enfeksiyonu varl›¤›nda korunma ve tedavi aç›s›ndan yarar sa¤layabilir. Sonuç olarak C.
ne-oformans’›n çevresel uygun ortamlar›n varl›¤›na ra¤men izole edilmesindeki engellerin araflt›r›lma-s›n›n, C. neoformans’›n yaflam döngüsünün ö¤re-nilmesine yard›mc› olaca¤›n› düflünüyoruz.
KAYNAKLAR
1. Ellis DH, Pfeiffer TJ: Ecology, life cycle and infec-tious propagule of Cryptococcus neoformans. Lancet 336: 923 (1990).
2. Baró T, Torres-Rodriguez JM, Morera Y, Conception A, López O, Mendez R: Serotyping of Cryptococcus neoformans isolates from clinical and en-vironmental sources in Spain. J Clin Microbiol 37: 1170 (1999).
3. Viviani MA, Esposto MC, Cogliata M, Montagna MT, Wickes BL: Isolation of a Cryptococcus neofor-mans serotype A MATa strain from the Italian envi-ronment. Med Mycol 39: 383 (2001).
4. Passo LC, Pernice I, Gallo M, Barbara C, Luck FT, Criseo G, Pernice A: Genetic relatedness and diversity of Cryptococcus neoformans strains in the Maltese Is-lands. J Clin Microbiol 35: 751 (1997).
5. Criseo G, Gallo M: Serotyping of Cryptococcus ne-oformans isolates from environmental and clinical so-urces in extreme southern Italy (Calabria and Sicily, central Mediterranean area). Mycoses 40: 95 (1997). 6. Velegraki A, Kiossess VG, Pitsouni H, Toukas D, Daniilidis VD, Legakis NJ: First report of Cryptococ-cus neoformans var. gattii serotype B from Greece. Med Mycol 39: 419 (2001).
7. Mahmoud YA: First environmental isolation of Cryptococcus neoformans var. neoformans and var. gattii from the Gharbia Governorate, Egypt. Mycopat-hologia 148: 83 (1999).
8. Ergin Ç, ‹lkit M, Hilmio¤lu S, Kaleli ‹, Gülbaba AG, Demirci M, Kaya S: The first isolation of Cryptococ-cus neoformans from Eucalyptus trees in South Aege-an Aege-and MediterrAege-aneAege-an regions of Anatolia despite Ta-urus Mountains alkalinity. Mycopathologia 158: 43 (2004).
9. Hamasha AMS, Y›ld›ran fiT, Gönlüm A, Saraçl› MA, Do¤anc› L: Cryptococcus neoformans varieties from material under the canopies of Eucalyptus trees
Türk Mikrobiyol Cem Derg (2005) 35: 256-259
259
and pigeon dropping samples from four major cities in Jordan. Mycopathologia 158: 195 (2004).
10. Boekhout T, Scorzetti G: Differential killer toxin sensitivity patterns of varieties of Cryptococcus neofor-mans. J Med Vet Mycol 35: 147 (1997).
11. Stumm C, Hermans JM, Middelbeek EJ, Croes AF, de Vries GJ: Killer-sensitive relationships in yeasts from natural habitats. Antonie Van Leeuwenhoek 43: 125 (1977).
12. Casadevall A, Perfect JR: Ecology of Cryptococ-cus neoformans. “Casadevall A, Perfect JR (eds): Cryptococcus neoformans”, p41, American Society of Microbiology, Washington DC (1998).
13. Kielstein P, Hotzel H, Khaschabi D, Glawischnig W: Occurrence of Cryptococcus spp. in excreta of
pi-geons and pet birds. Mycoses 43: 7 (2000).
14. Avc›o¤lu E, Gürses MK, Gülbaba AG, Genç A, Özkurt N, Özkurt A: Türkiye’de okaliptüslerin yetifle-bilece¤i bölgelerde tür ve orijin seçimi üzerine araflt›r-malar. Teknik Bülten No: 1, Tarsus, (1994).
15. Ergin Ç, fiengül M, Kaleli ‹, Mete E: Cryptococcus neoformans serotipleri için büyüme dinamiklerinin in-celenmesinde okaliptüs infüzyon besiyerinin kullan›m›. 4. Ulusal Mantar Hastal›klar› ve Klinik Mikoloji Kongresi, 3-6 May›s 2005, Konya: Çat› Grafik, (2005).
