Laktokoksin BZ’nin taze sığır etinin mikrobiyolojik kalitesi üzerine etkisi

GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ

Sonuç Raporu

Proje No: 2011/80

Laktokoksin BZ’nin Taze Sığır Etinin Mikrobiyolojik Kalitesi Üzerine Etkisi

Proje Yöneticisi Prof. Dr. Zeliha YILDIRIM

Birimi

Mühendislik ve Doğa Bilimleri Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü

Araştırmacılar ve Birimleri Sabire BATTAL

Mühendislik ve Doğa Bilimleri Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü

ÖZET*

LAKTOKOKSĠN BZ’NĠN TAZE SIĞIR ETĠNĠN MĠKROBĠYOLOJĠK KALĠTESĠ ÜZERĠNE ETKĠSĠ

Bu çalıĢma Lactococcus lactis ssp. lactis BZ tarafından üretilen laktokoksin BZ’nin taze sığır etinin mikrobiyolojik kalitesi üzerindeki etkisini belirlemek ve ete inoküle edilen Listeria

monocytogenes’e karĢı antimikrobiyal etkisini ortaya koymak amacıyla gerçekleĢtirilmiĢtir.

Ayrıca laktokoksin BZ’nin taze sığır etinde stabilitesi de belirlenmiĢtir. Bu amaçla, piyasadan alınan et örneklerinin yüzeyi farklı konsantrasyonlarda laktokoksin BZ (0, 200, 400, 800, 1600 ve 2500 AU/g ) ile muamele edildikten sonra buzdolabı sıcaklığında (4-5°C) 12 gün süreyle depolanmıĢtır. Depolamanın belirli periyodunda alınan et örneklerinde toplam mezofilik aerobik bakteri, toplam psikrotrof aerobik bakteri, toplam koliform, fekal koliform, laktik asit bakterileri ve maya-küf sayımları yapılmıĢtır. Ayrıca laktokoksin BZ’nin et yüzeyine tutunan veya tutunma aĢamasında olan L. monocytogenes’e (yaklaĢık 105

veya 108 kob/mL) karĢı antimikrobiyal etkisi de belirlenmiĢtir. Buna ilave olarak farklı konsantrasyonlarda laktokoksin BZ ile muamele edilerek buzdolabında depolanan et örneklerinin depolamanın farklı zamanlarındaki antilisterial aktivitesi de tespit edilmiĢtir. Laktokoksin BZ’nin taze etin mikrobiyolojik kalitesini toplam mezofilik aerobik bakteri, toplam psikrotrof aerobik bakteri, toplam koliform, fekal koliform ve laktik asit bakteri sayılarında azalmaya neden olarak iyileĢtirdiği belirlenmiĢtir. Taze et örnekleri L.

monocytogenes ile 4,71 veya 7,92 log kob/g düzeyinde inoküle edildiğinde laktokoksin BZ ilk

5 dk içerisinde konsantrasyona bağlı olarak, tutunmuĢ listeria sayısında sırasıyla 1,11-4,71 ve 0,90-7,92 log kob/g düzeyinde azalmaya neden olmuĢtur. Et örnekleri L. monocytogenes ve laktokoksin BZ ile aynı anda muamele edildiklerinde, konsantrasyona bağımlı bir Ģekilde, laktokoksin BZ’nin düĢük tutunmamıĢ listeria içerikli (5,00 log kob/g) örneklerde ilk 10 dk içerisinde 1,93-5,00 log kob/g, yüksek listeria içerikli (7,99 log kob/g) örneklerde ise 1,35-7,99 log kob/g seviyesinde bir azalmaya neden olduğu gözlenmiĢtir. Ayrıca laktokoksin BZ’nin buzdolabı koĢullarında 12 günlük depolama süresince de L. monocytogenes sayısında düĢüĢe sebep olduğu bulunmuĢtur. Laktokoksin BZ’nin antilisteriyal aktivitesinin bakteriyosin konsantrasyonunun artmasıyla ve listeria sayısının azalmasıyla arttığı belirlenmiĢtir. Laktokoksin BZ ile muamele edilip buzdolabında 12 gün depolanan et örneklerinde bile laktokoksin BZ’nin aktivitesini koruduğu ve L. monocytogenes’i etkili bir Ģekilde inhibe ettiği saptanmıĢtır.

Sonuç olarak, laktokoksin BZ’nin taze sığır etinin mikrobiyolojik güvenliğini iyileĢtirdiği, depolama ömrünü arttırdığı ve ette kuvvetli bir antilisteriyal aktiviteye sahip olduğu tespit edilmiĢtir.

Anahtar Kelimeler: Bakteriyosin, laktokoksin BZ, Lactococcus lactis ssp. lactis BZ, Listeria

monocytogenes, sığır eti

(*)GaziosmanpaĢa Üniversitesi Bilimsel AraĢtırma Projeleri Komisyonu tarafından desteklenmiĢtir (Proje numarası 2011-80).

ABSTRACT

The aims of this study were to determine the effect of lactococcin BZ produced by

Lactococcus lactis ssp. lactis BZ on the microbiological quality of fresh beef meat and to

investigate its antimicrobial activity against Listeria monocytogenes inoculated onto the surface of raw meat. The stability of lactococcin BZ in raw beef meat was also evaluated. For this purpose, beef meat samples obtained from markets were treated with various concentration of lactococcin BZ (0, 200, 400, 800, 1600, and 2500 AU/g) and kept at refrigeration temperature (4-5oC) for 12 days. Total mesophilic aerobic bacteria, psycrotrophic bacteria, total coliform, fecal coliform, lactic acid bacteria and yeast-mold counts were determined in beef meat samples at certain storage periods. Furthermore, antilisterial activity of lactococcin BZ on attached and non-attached L. monocytogenes cells (approximately 105 or 108 cfu/g) were examined. Additionally, antilisterial activity of meat samples treated with various concentrations of lactococcin BZ and stored at the refrigerator were determined at certain storage periods.

It was found that lactococcin BZ improved the microbiological quality of beef meat by reducing the counts of indigenous total mesophilic aerobic bacteria, total psycrotrophic aerobic bacteria, total coliform, fecal coliform, and lactic acid bacteria. When meat samples were inoculated with L. monocytogenes at the level of 4.71 and 7.92 log cfu/g, lactococcin BZ depending on concentration reduced the number of attached listeria by 1.11-4.71 log cycles and 0.90-7.92 log cycles, respectively in 5 min. When meat samples were simultaneously inoculated with lactococcin BZ and L. monocytogenes, lactococcin BZ reduced the number of non-attached listeria cells in 10 min by 1.93-5.00 log cycles in the small inoculum (5.00 log cfu/g) and 1.35-7.99 log cycles in the large inoculum (7.99 log cfu/g) compared to control samples. In addition, lactococcin BZ reduced the number of L. monocytogenes during 12 days refrigerated storage. The antilisterial activity of lactococcin BZ increased with an increasing bacteriocin concentration and a decreasing listeria cell count. Even after 12 days of refrigerated storage on meat surfaces, lactococcin BZ retained its activity and reduced listeria counts effectively.

In conclusion, it was observed that lactococcin BZ improved the microbiologiacal safety and storage life of raw beef meat, and had strong anti-listerial activity against L. monocytogenes in meat system.

Keywords: Bacteriocin, lactococcin BZ, Lactococcus lactis ssp. lactis BZ, Listeria

monocytogenes, meat İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET……….……….………... ABSTRACT……….……….……… İÇİNDEKİLER……….……… ŞEKİLLER DİZİNİ…………...……… ÇİZELGELER DİZİNİ………. 1. GİRİŞ…...……….……….. 2. KAYNAK ÖZETLERİ…………..………...………..……. 2.1. Bakteriyosinin Tanımı………... Ġ ii iii iv v 1 5 6

2.2. Bakteriyosinlerin Sınıflandırılması………...…..………... 2.3. Bakteriyosinlerin Antimikrobiyal Etki Mekanizmaları……….……... 2.4. Bakteriyosinlerin Etki Spektrumları………... 2.5. Laktokokların ve Laktokoksin BZ’nin Genel Özellikleri………... 2.6. Et Endüstrisinde Bakteriyosinojenik Laktik Asit Bakterileri ile

Bakteriyosinlerinin Önemi ve Fonksiyonları……….. 2.7. Ette Bakteriyosin Kullanımıyla Ġlgili Olarak Yapılan AraĢtırmalar……..…….…

3. MATERYAL VE YÖNTEM………..………. 3.1. Materyal………..………... 3.1.1. Et Örnekleri……….……….……… 3.1.2. Mikroorganizmalar ve Besiyerleri…….……….. 3.2. Yöntem….……….……….……….. 3.2.1. Bakteriyosinlerin Hazırlanması…….……….……….. 3.2.2. Laktokoksinin Taze Sığır Etinin Mikrobiyolojik Kalitesi Üzerine Etkisi……… 3.2.2.1. Mikrobiyolojik Analizler Ġçin Örnek Hazırlama………….……….. 3.2.2.2. Toplam Mezofil Aerobik Bakteri Sayımı………….………. 3.2.2.3. Toplam Psikrotrof Aerobik Bakteri Sayımı………….………. 3.2.2.4. Toplam Koliform ve Fekal Koliform Sayımı………….………... 3.2.2.5. Laktik Asit Bakteri Sayımı……….………... 3.2.2.6. Maya-Küf Sayımı……….………. 3.2.3. Laktokoksin BZ’nin Ete Tutunan L. monocytogenes Üzerine Ġnhibitör Etkisi 3.2.4. Tutunma Esnasında L. monocytogenes’in Ġnhibisyonu……….…... 3.2.5. Etin Buzdolabında Depolanması Sırasında L. monocytogenes GeliĢimi

Üzerine Laktokosin BZ’nin Ġnhibitör Etkisi……….………... 3.2.6. Depolama ĠĢleminin Bakteriyosin Aktivitesi Üzerine Etkisi

3.2.7. Ġstatiksel Analiz……….……….………..

4. BULGULAR ve TARTIŞMA………..……… 4.1. Laktokoksin BZ’nin Taze Sığır Etinin Mikrobiyolojik Kalitesi

Üzerine Etkisi ……….………..….….. 4.1.1. Toplam Mezofil Aerobik Bakteriler Üzerine Etkisi………...……….…. 4.1.2. Toplam Psikrotrof Aerobik Bakteriler Üzerine Etkisi ………. 4.1.3. Toplam Koliform ve Fekal Koliform Bakteriler Üzerine Etkisi.………. 4.1.4. Laktik Asit Bakterileri Üzerine Etkisi…………..……..….………. 4.1.6. Maya-Küf Üzerine Etkisi…………...…….…………..….……….. 4.2. Laktokoksin BZ’nin Ete Tutunan L. monocytogenes

Üzerine Ġnhibitör Etkisi……….. 4.3. Tutunma Esnasında L. monocytogenes’in Ġnhibisyonu…..………. 4.4. Etin Buzdolabında Depolanması Sırasında L. monocytogenes GeliĢimi

Üzerine Laktokoksin BZ’nin Ġnhibitör Etkisi……….……… 4.5. Depolama ĠĢleminin Bakteriyosin Aktivitesi Üzerine Etkisi…………..………... 5. SONUÇ……….. KAYNAKLAR……….. ÖZGEÇMİŞ ………... 6 8 9 9 10 14 20 20 20 20 20 20 21 21 21 21 21 22 22 23 23 23 23 24 24 25 25 25 26 28 29 31 31 33 35 37 39 42 48

ŞEKİLLER DİZİNİ

Sayfa ġekil 2.1. Bakteriyosinlerin antimikrobiyal etki mekanizması……….….

ġekil 2.2. Antimikrobiyal aktiviteye sahip LAB’lerin taze ete uygulanma

Ģekilleri ……….. ġekil 4.1. Laktokoksin BZ’nin taze ette toplam mezofil aerobik bakteri

(TMAB) geliĢimi üzerine etkisi... ġekil 4.2. Laktokoksin BZ’nin taze ette toplam psikrotrof aerobik bakteri

(TPAB) geliĢimi üzerine etkisi... ġekil 4.3. Laktokoksin BZ’nin taze ette laktik asit bakterilerin (LAB) geliĢimi üzerine etkisi... ġekil 4.4. Ete tutunan L. monocytogenes üzerine laktokoksin BZ’nin

inhibitör etkisi... ġekil 4.5. Laktokoksin BZ’nin ete tutunma esnasında L. monocytogenes’e karĢı inhibitör aktivitesi... ġekil 4.6. Laktokoksin BZ’nin buzdolabında depolama sürecinde ette

L. monocytogenes geliĢimi üzerine etkisi...

8 12 27 27 30 32 34 38

ġekil 4.7. Et ortamında laktokoksin BZ’nin buzdolabı koĢullarında stabilitesi... 38

ÇİZELGELER DİZİNİ

Sayfa Çizelge 2.1. Et ve ürünlerinden izole edilen bakteriyosinojenik LAB’leri…...……..

Çizelge 4.1. Laktokoksin BZ’nin taze etin toplam koliform içeriği üzerine etkisi…. Çizelge 4.2. Laktokoksin BZ’nin taze etin fekal koliform içeriği üzerine etkisi……

7 29 29

1. GİRİŞ

Modern teknikler ve güvenlik önlemlerinin (örneğin HACCP) tanımlanması ile gıda biyoteknolojisinde sağlanan geliĢmelere rağmen gıda güvenliği halen daha çözüm bekleyen bir problemdir. Gıda kaynaklı hastalıklar dünya çapında halk sağlığını ilgilendiren en ciddi problemlerden biri olarak kabul edilmektedir. Modern teknolojiler, iyi üretim uygulamaları, kalite kontrol ve hijyen, Tehlike Analizi ve Kritik Kontrol Noktaları (HACCP) ve risk değerlendirmesi gibi güvenlik konseptlerine rağmen geçtiğimiz on yıl içinde gıda kaynaklı hastalık ve zehirlenme sayısında artıĢ görülmektedir. Avrupa Birliği’nde en çok görülen gıda

kaynaklı enfeksiyonlar Campylobacter, Salmonella ve Listeria cinsi bakteriler ile virüslerden kaynaklanmaktadır. Avrupa Gıda Güvenliği Kurumu (EFSA) tarafından her yıl 380.000 kiĢinin Avrupa Birliği ülkelerinde bu enfeksiyonlara yakalandığı tespit edilmiĢtir (Seçkin ve ark., 2010).

Kimyasal bileĢimi ve biyolojik özelliklerinden dolayı et mikroorganizmaların geliĢmesi için mükemmel bir ortam oluĢturmaktadır. Taze et; nem içeriği yüksek (% 70), proteince zengin (nitrojenli gıdalarda % 18–20 protein), geliĢme için gerekli minerallere sahip, yeterli düzeyde karbonhidrat içeren, uygun pH değerine sahip ( ~5,6 ) olan bir gıdadır (Aymeric ve ark., 2008; Biswas ve ark., 2008). Bundan dolayı taze et mikrobiyolojik bozulmalara karĢı en duyarlı gıdalar veya potansiyel olarak en tehlikeli gıdalar arasında yer almaktadır. BaĢlangıç mikroorganizma sayısı ve türü hayvan sağlığı ve üretim parametrelerine bağlı olarak değiĢkenlik göstermektedir. Ette patojen ve bozulma etmeni mezofil ve psikrotrof bakteriler bulunabilmektedir. Etlerin kesim, yüzme, parçalama, taĢıma, depolama ve iĢleme sırasında uygulanan yanlıĢ teknikler sonucunda Salmonella spp., E. coli O157:H7, Listeria

monocytogenes gibi salgınlara neden olan patojen mikroorganizmalarla kontamine olma

ihtimali yüksektir. Bundan dolayı mikrobiyal geliĢimi önlemek veya kontrol altına almak için iyi üretim uygulamaları ve uygun muhafaza yöntemlerinin uygulanması gerekmektedir (Fiorentini ve ark., 2001).

Ette bulunan baĢlıca patojenler, Salmonella spp., Escherichia coli, Listeria monocytogenes,

Campylobacter jejuni, Yersinia enterocolitica, Clostridium perfringenes, Staphylococcus aureus, Aeromonas hydrophila’dır. Ete bulaĢan mikroorganizmalar hızla çoğalır ve et

ürünlerinin gerçek florasını oluĢturur. Bu durumun sonucunda insan sağlığı tehlikeye girmekte ve hatta ölümle sonuçlanan vakalar görülebilmektedir (Biswas ve ark., 2008).

Listeria monocytogenes fakültatif aerobik, gıda kaynaklı fırsatçı patojen olup listeriosis gıda

enfeksiyonuna neden olmaktadır. Kolay geliĢen bakteriler içinde yer alır. Basit besiyerlerinde ve 0-45°C gibi geniĢ bir sıcaklık aralığında geliĢebilen psikrotrof bir bakteridir. GeliĢebildiği pH aralığı 4,1-9,6 arasında değiĢmektedir. Yüksek tuza (%10) ve düĢük sıcaklığa (buzdolabı sıcaklığı) karĢı dayanıklı olduğu gibi nitriti de tolere edebilmektedir (Beresford ve ark., 2001; Zhu ve ark., 2005).

yeni doğan bebekler ve bağıĢıklık sistemi zayıf kiĢiler için oldukça tehlikelidir. Vakaların %25-30’unun ölümle sonuçlandığı belirlenmiĢtir (Doyle ve Montville, 1997; McLauchlin ve ark., 2004; Liu, 2006; Hamon ve ark., 2006; Jemmi ve Stephan, 2006). Listeriosisin belirtileri menenjit, septisemi, gebelerde düĢük ve/veya ölü doğum ve lokal enfeksiyonlardır (McLauchlin ve ark., 2004; Liu, 2006).

L. monocytogenes doğada yaygın (su, toprak, gıda, insan ve hayvan) olarak bulunmakta ve

gıda zincirine taĢıyıcı hayvanların dıĢkıları ve sütleriyle girebilmektedir (Wiedmann ve ark., 1998; Chan ve ark., 2007; Denny ve McLauchlin, 2008). Listeriosis enfeksiyonlarında en çok rol oynayan gıdalar, taze et ve et ürünleri, çiğ süt ve süt ürünleri, sebzeler ve deniz ürünleridir. Bu ürünlerde düĢük sıcaklıklarda bile geliĢebilmektedir. L. monocytogenes düĢük sıcaklıklarda geliĢebildiğinden imhası için hızlı ve uygun bir metot uygulanmadığı sürece gıda endüstrisi için bir tehdit oluĢturmaktadır. L. monocytogenes spor oluĢturmayan bakteriler içinde dondurma, kurutma ve ısıl iĢlemlerin yok edici etkilerine karĢı oldukça dayanıklı ve dirençli olanıdır (Small ve ark., 2003; Chaturongakul ve Boor, 2006; Chan ve ark., 2007). Bu ürünlerde düĢük sıcaklıklarda bile geliĢebildiğinden imhası için hızlı ve uygun bir metot uygulanmadığı sürece özellikle et endüstrisi için bir tehdit oluĢturmaktadır. Diğer patojen mikroorganizmalarla karĢılaĢtırıldığında gıda iĢlenmesi sırasında çevresel ve gıda kaynaklı faktörlerle kontrolü ve imhası biraz zordur. L. monocytogenes’in pastörizasyon sıcaklığı ile imha olduğu belirtilmesine karĢın son zamanlarda bu bakterinin ısıl iĢleme dayanıklılığı hususunda çeliĢkiler bulunmaktadır. Bazı kaynaklarda spor oluĢturmayan bakteriler içinde en yüksek termotolerant bakteri olduğu belirtilmektedir (Jemmi ve Stephan, 2006; Kim ve ark., 2008).

Satın aldıkları ürünlerin bileĢenlerini inceleyen bilinçli tüketici sayısının giderek arttığı bu günlerde tüketiciler az iĢlenmiĢ ve kimyasal koruyucu içermeyen gıdalara yönelmiĢtir (Lopez ve Belloso, 2008). Tüketici talepleri doğrultusunda endüstride; gıda güvenliğini tehlikeye atmadan, gıdanın besin ve vitamin değerlerini, organoleptik özellikleriyle birlikte koruyarak raf ömrünü uzatan biyokoruyucuların kullanımına ilgi artmıĢtır. Gıdaların depolama ömrünü ve güvenliğini artırmak amacıyla laktik asit bakterileri (LAB) veya bunların ürettiği inhibitör maddelerin kullanılmasına biyokoruma tekniği denilmektedir (Soomro ve ark., 2002; Devlieghere ve ark., 2004).

geliĢiminin kontrol edilmesinde doğal bir metot olduğundan en çok tercih ve kabul edilen yöntemlerden birisi biyokorumadır. Gıdaların raf ömrünün uzaması ve gıda güvenliğinin artması yönünde koĢullar yaratan biyokoruma yöntemi ette doğal olarak bulunan mikroorganizmalar veya bu mikroorganizmaların ürettiği antimikrobiyal ürünler vasıtasıyla gerçekleĢmektedir. Ette ve diğer gıdalarda bulunan laktik asit bakterilerinden bazıları bakteriyosin olarak bilinen antimikrobiyal peptitler veya proteinler üretmektedirler. DepolanmıĢ ette doğal flora olarak bulunan laktik asit bakterileri Lactobacillus, Carnobacterium, Leuconostoc, Lactococcus ve diğer cinslerdir. Bakteriyosin üretici laktik asit bakterilerinin Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Lactococcus, Enterococcus ve Carnobacterium olduğu düĢünülürse, söz konusu bakteriyosinojenik laktik asit bakterilerin kullanılması ile koruyucu bir etki yaratılabilir. Bakteriler tarafından üretilen protein yapısındaki bakteriyosinler, duyarlı bakterilere karĢı bakterisidal veya bakteriyostatik etki göstermektedirler. Duyarlı hücrelerin stoplazmik membranı bakteriyosinlerin hedef noktasını oluĢturmaktadır. Doğal kaynaklı olmaları, insan ve hayvan bağırsak sisteminde kolayca parçalanmaları ve korunacak gıdaların fizikokimyasal yapılarında herhangi bir değiĢime neden olmaksızın bozulma ve hastalık etmeni bakterileri inhibe etme özellikleri ile bakteriyosinler, özellikle son yıllarda üzerinde çok fazla çalıĢılan bir konu haline gelmiĢtir (Jack ve ark., 1995; Cleveland ve ark., 2001; O’Sullivan ve ark., 2002; Chen ve Hoover, 2003; Cotter ve ark., 2005; Fimland ve ark., 2005; Deegan ve ark., 2006; Drider ve ark., 2006).

Daha önce bozadan elde edilen Lactococcus lactis ssp. lactis BZ’nin bakteriyosin üreticisi olduğu tespit edilmiĢ ve bakteriyosini karakterize edilmiĢtir. Laktokoksin BZ’nin Gram pozitif bakterilerden L. plantarum, E. faecium, E. feacalis, E. dissduens, Leu. mesentereoides,

L. cremoris, Listeria monocytogenes, L. ivonovi, Bacillus cereus, B. subtilis ve B. treungesis

ssp. plasteni ile Gram negatif bakterilerden Enterobacter cloaceae, E. coli, Rhodococcus equi,

Salmonella ssp., Salmonella enteritidis, Yersinia enterocolitica O:9 ve Citrobacter freundii’ye

karĢı inhibitör aktiviteye sahip olduğu belirlenmiĢtir (ġahingil ve ark., 2011). Laktokoksin BZ tek baĢına besiyerinde oldukça geniĢ bir antimikrobiyal spektruma sahiptir. Ancak laktokoksinin et ürünlerinde patojen bakteriler üzerine inhibitör etkisi bilinmemektedir. Dolayısıyla bu araĢtırmanın gerçekleĢtirilmesi durumunda laktokoksinin biyokoruyucu olarak taze et endüstrisinde kullanım olanakları ortaya konulmaya çalıĢılacaktır.

bakteriyosininin taze sığır etinin mikrobiyolojik kalitesi üzerine etkisinin belirlenmesi, (ii) taze ete inoküle edilen gıda kaynaklı patojen bakterilerden Listeria monocytogenes üzerine laktokoksin BZ’nin antibakteriyal etkisinin tespit edilmesidir.

2. KAYNAK ÖZETLERİ

Laktik asit bakterileri (LAB); gram pozitif, hareketsiz, spor oluĢturmayan, çubuk ve koklar Ģeklinde, katalaz negatif, mikroaerofilik, aerotolerant, fakültatif anaerobik, aside dayanıklı, nitratı indirgemeyen, karbonhidratları ve yüksek alkolleri fermente ederek baĢlıca son ürün olarak laktik asit üreten doğal bir gruptur (Beasley, 2004).

LAB grubu içerisinde; Lactococcus, Carnobacterium, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Tetragenococcus, Streptococcus, Weissela, Vagococcus, Enterococcus ve Lactosphaera cinsleri yer almaktadır (Kuipers ve ark., 1997; O’Sullivan ve ark., 2002; Galvez ve ark., 2007). LAB ekosistemde yaygın olup toprak, su, bitki ve hayvanlarda bulunur. Ayrıca fermente olmayan süt ürünleri, et ürünleri, su ürünleri, meyve ve sebzelerde, insan ve hayvan bağırsak ve solunum sistemlerinde doğal olarak bulunur (Beasley, 2004; Thevenot ve ark., 2006). Et ve et ürünlerinden izole edilen laktik asit bakteri cinsleri Lactobacillus (Lactobacillus sakei, Lb. curvatus ve Lb. plantarum), Pediococcus (P. acidilactici, P.

pentosaceus), Leuconostoc (Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides, Leu. gelidum, Leu. carnosum), Carnobacterium ( C. piscicola, C. divergens), Weissella, Enterococcus (E. faecalis, E. faecium)’dur (Hugas 1998). Vakum paketlenmiĢ et ürünleri gibi fermente

Laktik asit bakterilerinin baskın olmasının et ürünlerinde bozulmaya neden olduğu belirtilmektedir. Fakat aynı zamanda laktik asit bakterilerinin et ürünlerinin duyusal özelliklerini depolama boyunca koruduğu da ifade edilmektedir (Budde ve ark., 2002).

LAB, fermentasyon sırasında oluĢturdukları metabolitleriyle gıda kaynaklı patojenleri ve gıdalarda bozulmaya neden olan bakterileri inhibe ederek antagonistik aktivite göstermektedir (Chen ve Hoover, 2003; De Vuyst ve Leroy, 2007). Laktik asit bakterileri antagonistik aktivitelerini, ortamda besin maddeleri için rekabet ederek ya da ürettikleri metabolitleriyle sağlamaktadırlar. Laktik asit bakterilerinin ürettiği antimikrobiyal aktiviteye sahip metabolitler organik asitler, diasetil, asetaldehit, reuterin, hidrojen peroksit, CO2, yağ asitleri,

etanol, enzimler ve bakteriyosinlerdir. Bu bileĢiklerden uygulama alanına sahip olanlar bakteriyosinler, organik asitler ve reuterindir. Bu antimikrobiyal metabolitler içinde en önemlilerinden birisi bakteriyosinlerdir (Khalid ve ark., 1999; Soomro ve ark., 2002).

2.1. Bakteriyosinin Tanımı

Laktik asit bakterileri tarafından üretilen bakteriyosinler, ribozomal olarak sentezlenen, küçük katyonik, hidrofobik veya amfifilik karakterli antimikrobiyal peptidler ve/veya proteinlerdir. Aynı veya farklı cins veya türdeki suĢlar üzerinde antimikrobiyal aktiviteye sahiptir. LAB’lerinden Enterococcus, Lactococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, Corynebacterium cinslerinin bakteriyosin üretme yeteneğine sahip olduğu birçok araĢtırmacı tarafından ortaya konmuĢtur (Klaenhammer 1993; Cleveland ve ark., 2001; Chen ve Hoover, 2003; Rodriguez ve ark., 2003). Et ve ürünlerinden izole edilen bakteriyosinojenik LAB’lerine bazı örnekler Çizelge 2.1’de verilmiĢtir.

Bakteriyosinler, bakteriler tarafından üretilen protein yapısında bakterisidal veya bakteriyostatik etkiye sahip doğal antimikrobiyal bileĢiklerdir. Antimikrobiyal etkilerinden dolayı gıda kaynaklı patojenleri ve bozulma etmeni mikroflorayı inhibe etmede önemli rol oynamaktadırlar. Bu özelliklerinden dolayı bakteriyosin üreten laktik asit bakterileri veya saflaĢtırılmıĢ bakteriyosinleri gıda muhafaza sistemlerinde biyolojik koruyucu olarak büyük bir kullanım potansiyeline sahiptir (De Martinis ve ark., 2002).

Bakteriyosinler doğal antibiyotik olarak nitelenmekle birlikte, klasik antibiyotiklerden farklı olarak mide ve ince bağırsaktan geçerken proteazlar tarafından aminoasitlere

parçalanmaktadırlar. Bu nedenle vücutta absorbe edilmezler ve kalın bağırsak florasına ulaĢamazlar. Dolayısıyla bakteriyosinler doğal olmaları, insan ve hayvan bağırsak sisteminde kolayca parçalanmaları ve korunacak gıdaların fizikokimyasal yapılarında herhangi bir değiĢime neden olmaksızın bozulma ve hastalık etmeni bakterileri inhibe etme özellikleriyle son yıllarda üzerinde çok fazla çalıĢılan bir konu haline gelmiĢtir.

2.2. Bakteriyosinlerin Sınıflandırılması

Yapısal, fizikokimyasal ve moleküler özellikler temelinde laktik asit bakterileri tarafından üretilen bakteriyosinler 4 ana gruba ayrılmaktadır. Sınıf I lantibiyotikler lanthionin gibi anormal amino asit içerirler. Ribozomda sentezlendikten sonra sitoplazmada dehidrasyon gibi reaksiyonlara uğrarlar. Molekül ağırlıkları düĢüktür (5kDa’dan küçük) ve ısıya dayanıklıdırlar. Bu grubun en önemli bakteriyosini nisindir. Sınıf II bakteriyosinleri sınıf I’e benzer ancak anormal amino asitleri içermemektedirler. Molekül ağırlıkları 10 kDa’dan küçüktür. Güçlü antilisterial aktivite gösteren pediosin benzeri bakteriyosinler bu grupta yer alır. Sınıf II bakteriyosinleri 3 alt grup altında toplanmaktadır. Sınıf IIa pediosin benzeri veya Listeria’ya karĢı aktif olup N-terminalinde Try-Gly-Asn-Gly-Val-Xaa-Cys amino asit dizisi içermektedir. Grup IIb bakteriyosinlerinin aktivite gösterebilmeleri için genellikle iki farklı peptid gerekmektedir. Grup IIc bakteriyosinlerine thiol’la aktif olan peptidler denilmektedir. Sınıf III bakteriyosinleri büyük moleküllü ve ısıya karĢı dayanıklılıkları değiĢkendir. Enzimatik aktiviteyle hücre duvarını parçalayarak inhibitör etki gösterir. Sınıf IV bakteriyosinleri proteine ilave olarak esansiyel lipit ve karbonhidrat içerir, kompleks ve halkalı peptidlerdir. Bu grupta yer alan glikoproteinler ya da lipoproteinler aktiviteleri için protein doğasında olmayan yapılara ihtiyaç duymaktadırlar (Klaenhammer, 1993).

Çizelge 2.1. Et ve ürünlerinden izole edilen bakteriyosinojenik LAB’leri

Üretici SuĢ Bakteriyosin Kaynak

L. lactis BB24 Nisin Fermente sosis

Lb. brevis SB27 Brevisin 27 Fermente sosis

Lb. sakei LTH673, 674 Sakasin K, P Ġnek eti

Lb. curvatus CRL705 Lactosin 705 Fermente sosis

Leu. gelidum UAL187 Leukosin A VakumlanmıĢ et

Leu. mesenteroides TA33a Leukosin A VakumlanmıĢ et

P. acidilactici PAC1.0 Pediosin PA-1/AcH Amerikan tip sosis

C. divergens 750 Divergisin 750 VakumlanmıĢ et

E. faecium CTC492 Enterosin B Fermente sosis

E. casseliflavus IM416K1 Enterosin 416K1 Fermente sosis

Cleveland ve ark., 2001; McAuliffe ve ark., 2001; Chen ve Hoover, 2003; Rodriguez ve ark., 2003; Cotter ve ark., 2005; Heng ve Tagg, 2006).

2.3. Bakteriyosinlerin Antimikrobiyal Etki Mekanizmaları

Bakteriyosinlerin çoğu duyarlı bakterilerin membranlarında gözenekler oluĢturarak (Barrel Stave, Wedge veya Lipit II mekanizmalarla) potasyum ve inorganik fosfat sızmasına ve buna paralel olarak membran iyonik dengesinin bozulmasına, proton itici gücün yok olmasına neden olmaktadır (ġekil 2.1). Bunun sonucunda ATP sızması olur transmembran potansiyeli ve/veya pH gradienti kısmen veya tamamen yok olur, proton itici güç ortadan kalkar (Cleveland ve ark., 2001; Papagianni, 2003; Chen ve Hoover, 2003). Hücre içinde iyonların ve metabolitlerin birikmesi ile ATP sentezi gibi sitoplazmik membranda enerjiye bağlı birçok hayati iĢlemleri yürüten proton itici gücün ortadan kalkması veya bozulması direkt olarak hücrenin lize olmasına neden olmaktadır (McAuliffe ve ark., 2001). Bu Ģekilde antimikrobiyal aktivite gösteren bakteriyosinlere sınıf I, sınıf II bakteriyosinleri örnek olarak gösterilebilir. Bunun yanı sıra bazı bakteriyosinler özellikle sınıf I tip Ib hücre duvarı (peptidoglukan) sentezini önleyerek (Diep ve ark., 2007), sınıf III bakteriyosinleri ise hücre duvarını parçalayarak bakterileri lize etmektedir. Sınıf I bakteriyosinlerinden nisin hem lipid II’ye bağlanarak sitoplazmada sentezlenen peptidoglukan ünitelerinin taĢınmasına engel olarak bakteri hücre duvarı sentezini önleyerek hem de membranda gözenekler oluĢturarak duyarlı bakterileri inhibe etmektedir (ġekil 2.1) (Cotter ve ark., 2005; Lopez ve Belloso, 2008).

ġekil 2.1. Bakteriyosinlerin antimikrobiyal etki mekanizması

2.4. Bakteriyosinlerin Etki Spektrumları

Bakteriyosinlerin etki spektrumları çok geniĢ olmayıp suĢ spesifik özellik göstermektedirler (O’Sullivan ve ark., 2002). Laktik asit bakterileri tarafından üretilen bakteriyosinler genellikle Gram pozitif bakteriler (Listeria, Staphylococcus, Clostridium, Enterococcus, Bacillus, Micrococcus, Leuconostoc, Lactobacillus vb.) üzerinde inhibitör aktiviteye sahiptirler (Soomro ve ark., 2002; Mojgani ve ark., 2006). Ancak, son yıllarda Enterococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc’un bazı suĢları tarafından üretilen bazı bakteriyosinlerin Gram pozitif bakterilerinin yanı sıra Gram negaif bakterilere karĢı inhibitör aktivite gösterdikleri belirlenmiĢtir (Ivanova ve ark., 2000; Lee ve Paik, 2001; de Kwaadsteniet ve ark., 2005; Todorov ve Dicks, 2005; Todorov ve Dicks, 2006; von Mollendorff ve ark., 2006; Todorova ve ark., 2007; ġahingil ve ark., 2011).

Gram negatif bakteriler dıĢ membranlarından dolayı antimikrobiyal maddelere karĢı daha az geçirgendir. Duyarlı olmayan Gram negatif bakterilerin ĢelatlaĢtırıcı maddeler, ısı ve donma iĢlemlerine maruz bırakıldıkları zaman bakteriyosinlere karĢı duyarlı hale geldiği tespit edilmiĢtir (Galvez ve ark., 2007).

2.5. Laktokokların ve Laktokoksin BZ’nin Genel Özellikleri

Streptococcaceae familyasında yer alan Lactococcus cinsi L. garvieae (E. serolicida), L. piscium, L. plantarum, L. raffinolactis (S. raffinolactis) ve L. lactis olmak üzere 5 farklı tür

içermektedir. L. lactis türü de L. lactis ssp. cremoris, L. lactis ssp. hordniae (Lactobacillus

hordniae) ve L. lactis ssp. lactis (Lactobacillus xylosus, Streptococcus lactis) suĢlarından

oluĢmaktadır. L. lactis iki alt tür ( L. lactis ssp. lactis, L. lactis ssp. cremoris) ve bir biyovaryete (L. lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis)’ye sahiptir (Samarzija ve ark., 2001; Sakala ve ark., 2002).

Laktokoklar bakteriyosin üreticileridir. Laktokoklar tarafından üretilen bakteriyosinler genellikle sınıf I ve sınıf II bakteriyosinleri içinde yer alır ve bunlara örnek olarak nisin, laktokoksin R, laktokoksin 140, laktokoksin MMT24 ve laktisin 3147 verilebilir (Parente et al., 1994; Yıldırım ve Johnson 1998; Hill et al., 1999; Ghrairi et al., 2005). LAB bakteriyosinleri içinde en iyi tanımlanmıĢ ve en yaygın kullanım alanına sahip olan, bazı L.

lactis ssp. lactis suĢları tarafından üretilen nisindir. Nisinin antimikrobiyal spektrumu oldukça

geniĢ olup Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc, Micrococcus, Staphylococcus, Clostridium ve Listeria cinslerinin birçok türü ve suĢu üzerinde antimikrobiyal aktiviteye sahiptir (Hauben ve ark., 1996).

Laboratuarımızda Tokat piyasasında satıĢa sunulan Boza’dan izole edilen L. lactis ssp.

lactis’in ürettiği laktokoksin BZ papain, pepsin, tripsin ve β-merkaptoetanole karĢı duyarlı,

ancak pankreatin, katalaz, amilaz ve lipaz enzimlerine, organik çözücülere (etanol, metanol, hegzan, kloroform, aseton, etil eter, isopropil alkol, formaldehit), deterjanlara (sodyumdodesil sülfat, üre, tween 80, triton X-100) ve EDTA’ya karĢı dayanıklıdır. Laktokoksin BZ’nin antimikrobiyal spektrumu geniĢ olup birçok Gram-pozitif ve Gram-negatif patojen bakterilere karĢı inhibitör aktiviteye sahiptir. Laktokoksin BZ Lactobacillus, Enterococcus, Leuconostoc,

Listeria, Bacillus, Enterobacter, Esherichia, Rhodococcus, Hafniai, Salmonella, Yersinia, Camphylobacter ve Citrobacter’in bazı suĢlarına karĢı inhibitör etki göstermektedir.

Laktokoksin BZ yüksek ısıl iĢleme (90°C’de 30 dk), asidik ve nötral pH’lara (pH 2,0-9,0) karĢı dayanıklı olup -20 ve -80°C’de depolama koĢullarında uzun süre aktivitesini korumaktadır. Laktokoksin BZ’nin molekül ağırlığı yaklaĢık 5500 Da’dur. Besiyeri olarak MRS broth, inokülüm miktarı %0,1, besiyeri baĢlangıç pH’sı 6,0-7,0 ve inkübasyon sıcaklığı 25°C olduğu zaman L. lactis ssp. lactis BZ’nin maksimum düzeyde laktokoksin BZ ürettiği belirlenmiĢtir. Laktokoksin BZ, üretici bakterinin logaritmik geliĢme fazında üretilmeye baĢlanmakta ve durgun fazın baĢında üretimi maksimum düzeye ulaĢmaktadır (ġahingil ve ark., 2011)

2.6. Et Endüstrisinde Bakteriyosinojenik Laktik Asit Bakterileri ile Bakteriyosinlerinin Önemi ve Fonksiyonları

LAB’leri et ve et ürünlerinde bozulmaya neden oldukları gibi fermente et ürünlerinde starter ve koruyucu kültür olarak da kullanılmaktadırlar. Ticari et starter kültürlerinde yer alan LAB türleri; Lactobacillus sakei, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus

pentosus, Lactobacillus casei, Pediococcus pentosaceus ve Pediococcus acidilactici’dir.

LAB’leri son ürünün duyusal özellikleri ve güvenirliğini iyileĢtirmede önemli rol oynamaktadırlar. Fermantasyon iĢlemi sonucunda oluĢan asitlik ve diğer antimikrobiyal bileĢenler bozulma etmeni ve patojen mikrofloranın geliĢimini önleyici etkiye sahiptir. GeliĢen asitlik rengin stabilizasyonu ve tekstürü iyileĢtirici etkilere de sahiptir. Fermantasyon sırasında oluĢturdukları organik asitler, uçucu (alkol, keton, aldehit ve furanlar) ve uçucu olmayan bileĢikler (amino asitler, peptitler vb.) ile lezzet, tat ve koku üzerinde etkilidirler (Hugas and Monfort, 1997; Lucke, 2000; Olaoye ve Onilude, 2009).

Et ürünlerin asidifikasyonu sırasında LAB’leri et proteinlerinin koagulasyonuna neden olarak son ürünün kesme stabilitesi ve sertliğinin artmasına neden olmaktadır. Nitritin nitrik aside indirgenmesine neden olarak etin tipik kırmızı-pembe renginin korunmasında rol oynar. Nitrik oksit miyoglobulinle reaksiyona girmektedir. pH değerinde hızlı bir azalıĢ sosis ve sucukta biyojen aminlerin birikmesini de önlemektedir. Ancak, aĢırı asit oluĢumu renk hatalarına (koagulaz-negatif Staphylococ’lar) ve bazen de gaz oluĢumuna neden olabilmektedir (Hugas and Monfort, 1997; Lucke, 2000).

LAB’lerin taze et ve ürünlerinde neden oldukları önemli bozulmalar: Lactobacillus,

Enterococcus, Weissella’nın neden olduğu mukoz madde (yapıĢkan yüzey); Weisella,

Leuconostoc, Enterococcus, Lactobacillus’un neden olduğu H2O2 yeĢillenmesi; Lactobacillus,

Enterococcus, Leuconostoc’un neden olduğu ekĢime; heterofermantatif LAB’lerin (bazı

Lactobacillus’lar ve Leuconostoc’lar) neden olduğu gaz oluĢumudur (Nychas ve ark., 2008).

Taze ette antimikrobiyal aktiviteye sahip laktik asit bakterileri ġekil 2.2’de görüldüğü gibi koruyucu kültür olarak, fermantat olarak ya da bu fermantatın saflaĢtırılmasıyla elde edilen bakteriyosin gibi antimikrobiyal bileĢiklerin ilave edilmesi Ģeklinde kullanılır.

ömrünü uzatmak amacıyla katılan antagonistik kültürlere koruyucu kültür denilmektedir. Taze et için koruyucu LAB kültürleri oluĢtururken göz önünde bulundurulması gereken hususlar;

ġekil 2.2. Antimikrobiyal aktiviteye sahip LAB’lerin taze ete uygulanma Ģekilleri

a) Et kaynaklı laktik asit bakterilerinin koruyucu kültür olarak kullanılmaları daha uygundur. Çünkü, ortama daha kolay adapte olup çoğalarak doğal flora ile rekabet edebilirler. b) GRAS statüsünde olup sağlık riski oluĢturmamalıdır.

c) Soğukta muhafaza sırasında yeterli miktarda laktik asit ve bakteriyosin gibi antimikrobiyal bileĢikler oluĢturarak patojen ve bozulma etmeni bakterilerin geliĢimini önleyen psikrotrof laktik asit bakterileri seçilmelidir.

d) Et ve ürünlerinin duyusal özelliklerinde hiç veya çok az değiĢime neden olmalıdır. e) Sürekli koruyucu aktiviteye sahip olmalıdır.

f) Ġstenmeyen mikroorganizmalarla rekabet edebilmelidir.

Et endüstrisi için geliĢtirilmiĢ ticari biyokoruyucu kültürlere örnek olarak Lactobacillus

sakei, Lactobacillus curvaticus, Leuconostoc carnosum’u içeren SafePro kültürleri (Chr.

Hansen, Danimarka) (Anonim, 2012a), Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus crispatus,

Pediococcus acidolactici, Lactococcus lactis’den oluĢan Bovamine kültürleri (NPC, USA)

verilebilir (Anonim, 2012b).

LAB’lerinin üretmiĢ oldukları antimikrobiyal aktiviteye sahip bileĢiklerden uygulama alanına sahip olanlar; organik asitler, bakteriyosinler ve reuterindir. Bu antimikrobiyal bileĢikler saf, yarı saf veya saflaĢtırılmamıĢ Ģekilde koruyucu madde olarak ete veya ambalaj materyaline ilave edilerek kullanılabilir. Ancak, saf ya da yarı saf halde kullanılmaları durumunda yasal

düzenlemeler gerektiğinden çok tercih edilen bir yöntem değildir. En çok tercih edilen yöntem gıda bazlı ortamda (dektroz, Ģeker pancarı melası, süt, peynir altı suyu vb.) laktik asit bakterilerini geliĢtirip antimikrobiyal madde içeren fermantatı sıvı veya toz halde kullanmaktır. Ticari olarak üretilen MicroGARD® (Danisco, Danimarka) antimikrobiyal fermantata örnek olarak verilebilir. Et için uygun MicroGARD® 730’dur.

Propionobacterium shermani’nin fermantatı olup antimikrobiyal maddelerden asetik asit,

propiyonik asit ve bakteriosin içermektedir. Gram-pozitif ve Gram–negatif bakteriler, mayalar ve küfler üzerinde etkilidir. FDA tarafından onaylanmıĢtır. Avrupa ve Amerika’da kullanımına izin verilmiĢtir (Anonim, 2012c).

Gıdalarda bakteriyosin uygulaması; raf ömrünü uzatması, uygun olamayan sıcaklık koĢullarında ekstra koruma sağlaması, gıda zincirinde patojenlerin yayılımını azaltması, bozulmalardan kaynaklanan ekonomik kayıpları iyileĢtirmesi, kimyasal koruyucuların kullanımını azaltması, yüksek sıcaklık uygulamaları olmadığı için gıdaların besin değerlerini ve vitaminlerini, organoleptik özellikleriyle birlikte daha iyi koruması gibi avantajlar sağlamaktadır (Galvez ve ark., 2007).

Laktik asit bakterileri tarafından üretilen bakteriyosinlerin; doğal ve güvenli (GRAS statüsü) olmaları, ökaryotik hücreler üzerinde toksik etkiye sahip olmamaları, sindirim sisteminde proteolitik enzimler vasıtasıyla inaktif olmaları, genel olarak geniĢ pH ve sıcaklık aralığında biyolojik aktivitelerini korumaları, birçok gıda kaynaklı patojenleri ve bozulma etmeni mikroorganizmalara karĢı antimikrobiyal aktiviteye sahip olmaları ve korunacak gıdaların fiziko-kimyasal yapılarında herhangi bir değiĢime neden olmadıkları için önemli biyokoruyuculardır (Galvez ve ark., 2007). Bakteriyosinlerin doğal gıda koruyucuları olarak kullanımını sınırlayan faktörler; genelde bozulma etmeni Gram-negatif bakteriler ile maya ve küflere karĢı etkisiz olmaları veya çok az etkili olmaları ve söz konusu bakteriyosine duyarlı olmayan suĢların ortamda geliĢerek baskın hale geçmesi Ģeklinde sıralanabilir. Sonuncu faktör özellikle uzun süre depolanan gıdalar için önemli bir sorun olarak değerlendirilmektedir (O’Sullivan ve ark., 2002).

Kullanımına yasal açıdan bir gıda katkı maddesi olarak izin verilen ilk bakteriyosin nisindir. 1928’de bulunan nisin bugün yaklaĢık 50 ülkede birçok gıdada biyokoruyucu olarak kullanılmaktadır. Nisin çoğu laktik asit bakterileri ile gıda kaynaklı patojen ve bozulma etmeni bakteriye örneğin S. aureus, L. monocytogenes, Bacillus ve Clostridium karĢı

bakterisidal etkiye sahiptir (Soomra ve ark., 2002; Uehara ve Toride, 2006; Lopez ve Belloso, 2008; Ruiz-Larrea ve ark., 2010).

2.7. Ette Bakteriyosin Kullanımıyla İlgili Olarak Yapılan Araştırmalar

Yasal açıdan ilk kullanımına izin verilen bakteriyosin Lactoccocus lactis ssp. lactis tarafından üretilen nisin bugün günümüzde yaygın olarak bir çok gıdada kullanılmaktadır (Delves-Broughton ve ark., 1996). Ticari ismi nisaplindir. Bunun dıĢında Pediococcus acidilactici’nin sentezlediği pediosin PA-1/AcH’de ticari olarak üretilmekte (Alta) ve Avrupa’da yaygın olarak kullanılmaktadır. Nisinin taze ette uygulanabilirliği ile ilgili birçok çalıĢma mevcuttur. AraĢtırma sonuçları arasında çeliĢkiler mevcuttur. El-Khateib ve ark. (1993) ile Fang ve Lin (1994) et yüzeyine nisin uygulandığında L. monocytogenes sayısını etkili bir Ģekilde azalttığını belirtmesine karĢın bir çok araĢtırmacı nisinin ette L. monocytogenes dahil olmak üzere patojen ve bozulma etmeni mikroorganizmalar üzerinde çok etkili olmadığını ifade edilmektedirler (Scott ve Taylor, 1981; Deegan ve ark., 2006; Taylor ve ark., 2007). Etin pH değerinde nisinin çözünürlüğünün düĢük olması ve hidrofobisitesinin yüksek olması nisinin ette kullanımını sınırladığı (Stiles ve Hastings, 1991) ve hatta taze ette doğal olarak bulunan glutatiyon S-transferaz enzimi ve proteazların nisini inaktif ettiğinden bu bakteriyosinin taze ette kullanımını sınırladığı bazı araĢtırmacılar tarafından ortaya konulmuĢtur (Rose ve ark., 2000). Nisin dıĢında pentosin 31-1 (Lactobacillus pentasus 31-1)’in domuz etinde (Zhang ve ark., 2010), plantarisin UG1 (Lactobacillus plantarum UG1)’in sığır etinde (Enan ve ark., 2002) L. monocytogenes ve diğer mikroorganizmaların geliĢmesini biraz yavaĢlatmalarına karĢın etkin bir Ģekilde azaltmadığı da ortaya konmuĢtur.

L. monocytogenes ve Cl. perfringens’e karĢı Pediococcus acidilactici tarafından üretilen

bakteriyosinin inhibitör etkisinin araĢtırıldığı bir çalıĢmada 21oC’de 72 saat depolama sonrasında bakterilerin sayısında sırasıyla 1,2 ve 3 log’luk, 4o_{C’de 21 gün depolama}

sonununda ise 2,5 ile 3,5 log’luk bir azalma olduğu belirtilmektedir (Lozano ve ark., 2005).

Nielsen ve ark. (1990) küp Ģeklinde kesilen (0,5 cm kalınlığında) ve gama ıĢını ile radrasyona (42 kGy) tabi tutulup sterilize edilen taze etleri, L. monocytogenes ile inoküle (yaklaĢık 104 ve 107 kob/g) edip Pediococcus acidiactici’nin ürettiği bakteriyosinin bakterinin ete tutunma aĢamasında ve tutunduktan sonraki aĢamada inhibisyon etkisi araĢtırmıĢlardır. AraĢtırma sonucunda bakteriyosinin 10 dk içerisinde 107

500 AU/mL kullanıldığında 1 log’dan az, 1000 AU/mL’de 1 log’dan biraz fazla, 5000 AU/mL’de ise 2 log azalttığı bulunmuĢtur. Listeria sayısındaki azalmanın ilk 2 dk içerisinde gerçekleĢtiği belirtilmiĢtir. YaklaĢık 104

kob/g düzeyinde L. monocytogenes içeren et örneklerinde ise bütün bakteriyosin konsantrasyonlarında 1 ile 2 log düzeyinde azalma olduğu ifade edilmiĢtir. Bakteriyosinin ete tutunma aĢamasında 107

kob/g düzeyde listeria içeren et örneklerinde düĢük (500 AU/mL) düzeyde uygulandığında yaklaĢık 1 log, yüksek düzeyde (1000 ve 5000 AU/mL) uygulandığında ise 2 log’luk bir azalmaya neden olduğu belirlenmiĢtir. DüĢük düzeyde listeria (105

kob/g) ile muamele edilen et örneklerinde bakteriyosin 500 AU/mL uygulandığında 1 log’dan fazla, yüksek düzeyde uygulandığında ise listeria sayısını tespit edilemeyecek düzeyin altında düĢürdüğü belirlenmiĢtir. Bakteriyosinin antilisteriyal aktivitesinin bakterinin ete tutunma aĢamasında daha yüksek olduğu sonucuna varılmıĢtır. Ayrıca çalıĢmada, bakteriyosin ete listeria inokülasyonundan önce uygulandığında antilisteriyal aktivitesinin daha yüksek olduğu da belirlenmiĢtir. Bakteriyosin 5000 AU/mL düzeyinde ete katıldığında depolamanın 21. gününde 2,7 log, 28. gününde ise 1,2 log’luk, 500 AU/mL kullanıldığında ise yalnızca depolamanın 14. gününde 0,5 log’luk azalmaya neden olduğu gözlenmiĢtir.

Yapılan bir araĢtırmada yaklaĢık 7 log kob/g düzeyinde L. monocytogenes Scott A ile inoküle edilen sığır etleri nisin ve nisin-EDTA karıĢımından oluĢan çözeltiye 10 dk daldırılmıĢ ve 4°C’de 30 gün vakum altında depolanmıĢlardır. Depolama sonunda Listeria sayısının 7 log kob/g’dan 2,01 ve 0,99 log kob/g’a düĢtüğü belirtilmiĢtir (Zhang ve Mustapha, 1999).

Pediosin PA-1/pediosin AcH (P. acidolactici), karnobakteriyosin (Carnobacterium piscicola L103), laktosin 705 (Lactobacillus casei) bakteriyosinlerinin ette L. monocytogenes geliĢimini kontrol altına aldığı, 4ºC’de 28 gün depolama sonunda bakteri sayısında 3-4 log’luk bir azalmaya neden oldukları ve depolama süresince et örneklerinde bakteriyosin aktivitesinin korunduğu belirlenmiĢtir (Schöbitz ve ark., 1998).

Biftek etler (8 cm uzunluğunda, 1 cm kalınlığında) vakum poĢetine konulduktan sonra yaklaĢık 103

kob/mL/cm2’ye L. monocytogenes ve 100 AU/mL C. piscicola L103 tarafından üretilen bakteriyosinle inoküle edilmiĢtir. Daha sonra vakum paketlenip 4o_{C’de 21 gün}

depolanmıĢtır. Bakteriyosinin ette L. monocytogenes geliĢimini etkili bir Ģekilde inhibe ettiği görülmüĢtür. L. monocytogenes sayısının depolamanın 7. gününde 3,3 log kob/cm2_{’den 0,6}

Ancak, söz konusu bakterinin ette doğal olarak bulunan laktik asit bakterileri üzerinde etkili olmadığı ve dolayısıyla bakteriyosin içeren örneklerin renginde ve tadında 14 gün süresince bir değiĢimin olmadığı, bu süreden sonra sayıları hızla artan laktik asit bakterilerinden dolayı duyusal özelliklerinin olumsuz yönde etkilendiği bildirilmiĢtir (Schöbitz et al., 1999).

Vignolo ve ark. (1996) yaptıkları bir çalıĢmada ısıl iĢlem uygulanmıĢ (120°C’de 15 dk) ve uygulanmamıĢ stomacherde parçalanan et örneklerini 104

ve 107 kob/mL düzeyinde Listeria

monocytogenes ile inokule ettikten sonra 4200, 8400 ve 16800 AU/mL laktosin 705 ile

muamele etmiĢler ve 20oC’de 24 saat inkübasyon iĢlemine tabi tutmuĢlardır. Analiz sonucunda laktosin 705’in ısıl iĢlem uygulanmıĢ ve düĢük düzeyde listeria içeren et örneklerinde daha etkili olduğunu bulmuĢlardır. Bakteriyosinin inhibitör etkisinin inoküle edilen bakteri düzeyi ile bakteriyosin konsantrasyonuna bağlı olduğunu bulmuĢlardır. Laktosin 705’in konsantrasyonu arttıkça L. monocytogenes sayısındaki azalma oranının da o kadar çok arttığını gözlemlemiĢlerdir. L. monocytogenes düzeyi 107 olan örnekte en yüksek laktosin 705 konsantrasyonun 1 log (%44,74), 104 kob/mL düzeyinde listeria içeren örnekte %93,43 düzeyinde azalma olduğunu bulunmuĢtur. Laktosin 705’in ısıl iĢlem uygulanmıĢ ette daha etkili olmasının nedeni ette bulunan proteazların inaktif olmasından kaynaklandığı belirtilmiĢtir.

L. monocytogenes ile inoküle edilen taze domuz etine 500, 1000 ve 5000 AU/mL Pediococcus acidilactici’nin ürettiği bakteriyosinin uygulandığında 15°C’de 72 saat

depolanan et örneklerinde listeria sayısında 1, 2 ve 3 log kob/ml düzeyinde azalma olduğu belirlenmiĢtir. 1000 ve 5000 AU/mL bakteriyosin uygulanan ve 4°C’de 21 gün depolanan örneklerde ise L. monocytogenes sayısında 2,5 ve 3,5 log kob/mL düĢme olduğu saptanmıĢtır (Nieto-Lozana ve ark., 2006).

Pediosin AcH ile yapılan bir çalıĢmada söz konusu bakteriyosinin ette L. monocytogenes geliĢimini kontrol altına aldığı, 4ºC’de 28 gün depolama sonunda bakteri sayısında 3 log’luk bir azalmaya neden olduğu ve depolama süresince et örneklerinde bakteriyosin aktivitesinin korunduğu belirlenmiĢtir (Motlagh ve ark., 1992).

Laktosin 705 (L. casei CRL705, 17000 AU/mL), enterosin CRL35 (E. faecium CRL35, 17000 AU/mL) ve nisin (2000 IU/mL)’in parçalanmıĢ (kıyma haline getirilmiĢ) et örneklerinde L.

monocytogenes (5,89 log kob/mL) üzerindeki antimikrobiyal etkisinin belirlendiği bir

bulunmuĢtur. Ancak, bakteriyosinler kombine olarak kullanıldıklarında daha fazla inhibitör etki gösterdikleri saptanmıĢtır. En yüksek inhibitör etkiyi içinde nisin bulunan kombinasyonun olduğu ifade edilmiĢtir. Üç bakteriyosin birlikte kullanıldığında 24 saatlik inkübasyon sonrasında örnekte patojen bakterilere rastlanılmadığı belirtilmiĢtir (Vignolo ve ark., 2000).

Pediosin PA-1/AcH ve PO2 et yüzeyine uygulandığında L. monocytogens ve Clostridium

perfringenes’i inhibe ettiği saptanmıĢtır. Ġnek karkas yüzeyine nisin uygulandığında aerobik

mikroorganizma sayısında 2-2,5 log kob/ml düzeyinde azalmaya neden olduğu ifade edilmiĢtir (Siragusa, 1995).

Brochothrix thermosphacta, Carnobacterium divergens ve Listeria innocua ile 4 kob/cm2

düzeyinde inoküle edilen taze parça etler su ve nisin püskürtülerek yıkama iĢlemine tabi tutulmuĢtur. AraĢtırma sonucunda, nisin (5000 AU/cm2_{) uygulanan örneklerde 0. günde}

1,79-3,54 log kob/cm2, 1. günde ise 1,97-3,60 log kob/cm2 azalma olduğu, suyla muamele edilen örneklerde ise bakteri sayısında önemli azalmanın olmadığı (1 log kob/cm2_{’den daha az)}

tespit edilmiĢtir (Cutter ve Siragusa, 1994).

Psikrotrofik ve mezofil bakteri sayısı 3,56 ve 5,34 log kob/mL olan taze parça et

Lactobacillus plantarum BN tarafından üretilen bakteriyosin ile muamele edildiğinde mezofil

ve psikrotrof bakteri sayısının kontrol altına alındığı ve %6 laktik asit çözeltisine daldırılan örneklere göre daha düĢük olduğu tespit edilmiĢtir. Kontrol ve laktik asit çözeltisiyle muamele edilen et örneklerinin 9. günde bozulma noktası olarak kabul edilen mezofil bakteri sayısının 7 log kob/mL’den daha yüksek bir düzeye ulaĢtığı ancak bakteriyosin çözeltisi ile muamele edilen örneğin 15. günde bile bu düzeye ulaĢmadığı belirlenmiĢtir. Bakteriyosin uygulamasının etin raf ömrünü 9 gün arttırdığını saptamıĢlardır (Fiorentini ve ark., 2001).

Zhang ve ark. (2010) Lactobacillus pentosus 31-1 tarafından üretilen pentosin 31-1’in domuz etinin mikrobiyolojik kalitesini belirlemek amacıyla yaptıkları bir çalıĢmada et örneklerini L.

monocytogenes ve Pseudomonas fluorescens (5x105 kob/mL) ile kontamine ettikten sonra

bakteriyosin çözeltisine (40 ve 80 AU/mL) daldırmıĢlardır. Analiz sonucunda, depolamanın ilk 6 günü içinde pentosinin söz konusu bakterilerin geliĢimini düĢük düzeyde inhibe ettiği, 18 günlük depolama süresince bakteriyosin uygulanan örneklerde kontrol örneğine göre bakterilerin geliĢiminin çok yavaĢ olduğu bulunmuĢtur. AraĢtırmacılar pentosinin 80 AU/mL

düzeyinde uygulandığında domuz etinin mikrobiyolojik kalitesini iyileĢtirdiği sonucuna varmıĢlardır.

Lactobacillus sakei tarafından üretilen sakasin P’nin tavuk etinde L. monocytogenes

geliĢimini inhibe ettiği belirlenmiĢtir. Sakasin P yüksek dozda (3,5 µg/g) kullanıldığında 4 haftalık depolama süresince inhibitör etkisinin bakteriyostatik, düĢük dozda (12 ng/g) kullanıldığında ise L. monocytogenes’in düĢük oranda et örneklerinde geliĢme gösterdiği belirlenmiĢtir (Katla ve ark., 2002).

Yapılan baĢka bir çalıĢmada nisin tek baĢına veya ticari olarak mevcut olan et bağlama sistemine (Fibrimex) katılıp inek karkas yüzeyine uygulandığında bozulma etmeni

Brochothrix thermosphacta’nın geliĢimini önlediği ve karkasın buzdolabı koĢullarında

depolama süresini arttırdığı tespit edilmiĢtir (Cutter, 1998).

Ariyapitipun ve ark. (2000) nisin (400 IU/ml), düĢük moleküler ağırlıklı polilaktik asit (%2, PLA) ve laktik asit (%2, LA) tek baĢlarına ve nisinle kombine olarak L. monocytogenes Scott A ile kontamine edilen inek etine uygulayıp vakum ambalajlamıĢlar ve 4o_{C’de 42 gün}

depolamıĢlardır. AraĢtırma sonucunda PLA, LA, PLA-nisin, LA-nisin ve nisinin L.

monocytogenes Scott A’ya karĢı hemen bakterisidal etki gösterdiği ve sırasıyla kontrol

örneğine (5,33 log kob/cm2_{) kıyasla 1,22, 1,56, 1,57, 1,94, ve 1,64 log’luk azalmaya neden}

olduğu belirlenmiĢtir. Depolamanın sonunda söz konusu örneklerde canlı L. monocytogenes Scott A sayısının 1,21, 0,36, 2,21, 0,84 ve 0,89 log kob/cm2

olduğu gözlenmiĢtir.

Lactococcus lactis subsp. lactis tarafından üretilen laktokoksin R 800, 1600 ve 3600 AU/mL

düzeyinde Listeria monocytogenes ile inoküle (6,5 log kob/g) edilen tavuk göğsü etine uygulandığında bakterisidal etki gösterdiği saptanmıĢtır. Buzdolabı koĢullarında muhafaza edilen 800 AU/mL laktokoksin uygulanan et örneklerinde 0. ve 21. günde listeria sayısının 1,62 ve 3,62 log azaldığı, 1600 ve 3200 AU/mL uygulanan et örneklerinde ise depolamanın 21 ve 28. günlerinde belirlenemeyecek seviyenin altına düĢtüğü bulunmuĢtur. Ayrıca, oda sıcaklığında muhafaza edilen et örneklerinde de listeria sayısında önemli düzeyde azalmaya neden olduğu belirlenmiĢtir (Yıldırım ve ark., 2007).

3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1. Materyal

3.1.1. Et Örnekleri

Bu çalıĢmada kullanılan taze sığır eti Tokat’ta bulunan marketlerden temin edilmiĢ ve aseptik koĢullarda mikrobiyoloji laboratuarına getirilmiĢtir. AraĢtırma GaziosmanpaĢa Üniversitesi Mühendislik ve Doğa Bilimleri Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü Gıda Mikrobiyolojisi Laboratuarında yapılmıĢtır.

3.1.2. Mikroorganizmalar ve Besiyerleri

Bakteriyosin üretici bakteri olarak daha önce laboratuarımızda Boza’dan izole edilen

Lactococcus lactis ssp. lactis BZ (ġahingil ve ark., 2011) kullanılmıĢtır. Lactococcus lactis

ssp. lactis BZ’nin geliĢtirilmesinde ve bakteriyosin üretiminde de Mann Rogosa (MRS) (Fluka, Almanya) besiyeri kullanılmıĢtır. Test bakterisi olarak Listeria monocytogenes ve bakteriyosin aktivitesinin belirlenmesinde indikatör bakteri olarak Lactobacillus plantarum kullanılmıĢtır. Her iki bakteri de Refik Saydam Hıfzıssıhha Enstirüsü’nden temin edilmiĢtir.

monocytogenes ise Brain Hearth Infusion (BHI) (Merck, Almanya) sıvı besiyerinde

35-37°C’de geliĢtirilmiĢtir. ÇalıĢmada kullanılan bakteriler -80°C’de %20 gliserol içeren besiyerinde muhafaza edilmiĢtir.

3.2. Yöntem

3.2.1. Bakteriyosinin Hazırlanması

Lactococcus lactis ssp. lactis BZ %0,1 oranında MRS besiyerine inoküle edilip 32°C’de

inkübasyona bırakılmıĢtır. Ġnkübasyon iĢleminden sonra bakteri kültürü 7000 x g’de 20 dk süre ile santrifüj edilip filtrat kısmı toplanıp 0,45 µm gözenek çaplı membran filtresi ile steril edilmiĢtir. Hücre içermeyen süpernatantın pH’sı 10 N NaOH kullanılarak ayarlandıktan sonra dondurularak liyofilizatörde kurutulmuĢtur. Hazırlanan bakteriyosin örneği -80°C’de muhafaza edilmiĢtir.

3.2.2. Laktokoksinin Taze Sığır Etinin Mikrobiyolojik Kalitesi Üzerine Etkisi

Laktokoksin BZ’nin taze sığır etinin mikrobiyolojik kalitesi üzerine etkisini belirlemek amacıyla marketten temin edilen etler aseptik koĢullarda Gıda Mühendisliği Mikrobiyoloji laboratuarına getirilmiĢtir. Aseptik koĢullarda yaklaĢık 5 g ağırlığında (1 cm3

büyüklüğünde) kesildikten sonra steril stomacher poĢetlerine konmuĢtur. Daha sonra et örneklerine farklı konsantrasyonlarda (0, 200, 400, 800, 1600 ve 2500 AU/mL) hazırlanan laktokoksin BZ çözeltisinden 1 mL ilave edilip, buzdolabı koĢullarında 12 gün muhafaza edilmiĢlerdir. Depolamanın belirli periyotlarında örnekler alınıp toplam mezofil ve psikrotrof aerobik bakteri, toplam koliform, fekal koliform, laktik asit bakterisi ve maya-küf analizleri yapılmıĢtır.

3.2.2.1. Mikrobiyolojik Analizler İçin Örnek Hazırlama

Steril stomacher poĢetlerinde bulunan et örneklerine 20 mL peptonlu su eklenip stomacher cihazı (IUL707/470 Instruments, Ġspanya) kullanılarak 200 devirde 1 dk süreyle homojenize edilmiĢtir. Elde edilen bu homojenizattan peptonlu su (%1,0) kullanılarak dilüsyonlar hazırlanmıĢtır.

Besiyeri olarak Plate Count Agar (PCA) (Merck, Almanya) kullanılmıĢtır. Hazırlanan dilüsyonlardan petri kutularına 0,1 mL aktarılıp yayma plak yöntemiyle ekim yapılmıĢtır. Petriler 30°C’de 24-48 saat süre ile inkübe edilmiĢ ve inkübasyon sonunda geliĢen koloni sayımı yapılmıĢ ve sonuçlar kob/g olarak verilmiĢtir (AOAC, 2000).

3.2.2.3. Toplam Psikrotrof Aerobik Bakteri Sayımı

Hazırlanan dilüsyonlardan PCA besiyeri içeren petrilere 0,1 mL aktarılıp yayma plak yöntemiyle ekim yapılmıĢtır. Petriler buzdolabı sıcaklığında 10 gün inkübe edilmiĢ ve inkübasyon sonunda geliĢen koloniler sayılmıĢtır (AOAC, 2000).

3.2.2.4. Toplam Koliform ve Fekal Koliform Sayımı

Toplam koliform ve fekal koliform analizi en muhtemel sayım (EMS-3’lü tüp) yöntemi kullanılarak gerçekleĢtirilmiĢtir. EMS yönteminde, durham tüpü içeren Lauryl Sulphate Tryptose Broth (LSTB) (Merck, Almanya) bulunan 3 tüpe, daha önce hazırlanan örnek dilüsyonlarından 1 mL ilave edilmiĢ ve tüpler 37°C’de 24-48 saat inkübasyona bırakılmıĢtır. Ġnkübasyon iĢlemi sonunda gaz pozitif tüpler belirlenmiĢ ve EMS tablosu kullanılarak koliform bakteri sayısı hesaplanmıĢtır. Olasılık testi sonuçlarını kanıtlamak için tüm gaz pozitif tüplerden durham tüpü içeren Brilliant Green Bile Broth (Merck, Almanya) besiyerine öze ile inokülasyon yapılmıĢ ve tüpler 37°C’de 24-48 saat inkübasyona bırakılmıĢtır. Bu sürenin sonunda EMS tablosu kullanılarak ilk dilüsyonun 1 mL’sinde bulunan kanıtlanmıĢ koliform bakteri sayısı saptanmıĢtır. Bu değer ilk seyreltmenin dilüsyon faktörü ile çarpılarak örneğin 1 gramında bulunan kanıtlanmıĢ koliform bakteri sayısı hesaplanmıĢtır. Fekal koliform sayımı yapmak için, toplam koliform analizinde pozitif sonuç veren LSTB tüplerinde içinde durham tüpü bulunan Escherichia coli (EC) Broth’a öze ile ekim yapılan tüpler 45±0,5°C’de 24-48 saat inkübasyona bırakılmıĢtır. Bu sürenin sonunda gaz oluĢumu gözlenen tüpler belirlenmiĢ, EMS tablosu kullanılarak ilk dilüsyonun 1 mL’sinde bulunan olası fekal bakteri sayısı saptanmıĢtır. Bu değer ilk dilüsyon faktörü ile çarpılarak gıdanın 1 gramında bulunan olası fekal koliform bakteri sayısı hesaplanmıĢtır (Feng ve ark., 1998).

3.2.2.5. Laktik Asit Bakteri Sayımı

Bu analiz için besiyeri olarak MRS agar kullanılmıĢtır. Hazırlanan dilüsyonlardan 0,1 mL alınarak MRS agar içeren petrilere yayma plak yöntemiyle ekim yapılmıĢ ve 30°C’de 24-48

saat inkübasyon iĢlemine tabi tutulmuĢtur. Ġnkübasyon iĢleminin sonunda petri kutularındaki koloniler sayılarak sonuç kob/g olarak verilmiĢtir (Lee ve ark., 2006).

3.2.2.6. Maya-Küf Sayımı

Maya-küf sayımı için sterilize edilmiĢ %10 tartarik asit ilave edilen Patato Dextrose Agar (PDA) (Merck, Almanya) besiyeri kullanılmıĢtır. HazırlanmıĢ dilüsyonlardan 0,1 mL alınıp PDA içeren petri kutularına aktarılmıĢ ve 28°C’de 4-5 gün süre ile inkübe edilmiĢtir. Ġnkübasyon sonunda geliĢen tüm koloniler maya-küf olarak sayılıp ifade edilmiĢtir (Halkman, 2005).

3.2.3. Laktokoksin BZ’nin Ete Tutunan L. monocytogenes Üzerine İnhibitör Etkisi Her bir yüzeyi ekim kabininde UV altında yaklaĢık 1’er saat sterilize edilen et örnekleri (yaklaĢık 5 g) yaklaĢık 107

kob/mL ve 104 kob/mL düzeyinde L. monocytogenes içeren fosfat tamponun içerisine konulup 4 saat süre ile oda sıcaklığında bekletilmiĢtir. Bu sürenin sonunda örnekler 0, 400, 1600, 3200 AU/mL düzeyinde steril bakteriyosin içeren solusyonlarda 0, 5, 10, 30 dk tutulmuĢtur. Örnekler steril stomacher poĢetine konulup üzerine 20 mL fosfat tamponu ilave edilip stomacher’da 1 dk parçalanmıĢtır. Yayma plak yöntemi ile Oxford Listeria Selective Agar (Merck, Almanya) besiyerine ekim yapıldıktan sonra 35-37°C’de 24-48 saat inkübe edilmiĢtir.

3.2.4. Tutunma Esnasında L. monocytogenes’in İnhibisyonu

UV ile sterilize edilen et örnekleri 0, 400, 800, 1600, 3200 AU/mL konsantrasyonlarında hazırlanan bakteriyosin çözeltileri içinde 10 dk bekletilmiĢtir. Örnekler daha sonra yaklaĢık 104 ve 107 kob/mL L. monocytogenes bakteri solusyonunda 0, 5 ve 10 dk tutulmuĢtur. Bu sürelerin sonunda örnekler alınıp steril stomacher poĢetine konularak ve 20 mL fosfat tamponu ilave edildikten sonra stomacher’da 1 dk parçalanmıĢtır. Yayma plak yöntemi ile Oxford Listeria Selective Agara ekim yapıldıktan sonra 35-37°C’de 24-48 saat inkübe edilmiĢtir.

3.2.5. Etin Buzdolabında Depolanması Sırasında L. monocytogenes Gelişimi Üzerine Laktokosin BZ’nin İnhibitör Etkisi

Ekim kabininde UV altında sterilize edilen et örneklerine (yaklaĢık 5 g) farklı konsantrasyonlarda L. monocytogenes (0, 102, 103, 104, 106 kob/mL) içeren kültürlerden 1 mL

inoküle edilmiĢtir. Ġnokülasyondan yaklaĢık 30 dk sonra örneklere 0, 200, 400, 800, 1600, 3200 AU/mL konsantrasyonlarında hazırlanan bakteriyosin çözeltisinden 1 mL ilave edilip buzdolabı koĢullarında muhafaza edilmiĢtir. Depolama iĢleminin belirli periyotlarında (0., 1., 4., 8., 12. gün) örnekler alınıp steril stomacher poĢetlerine konulmuĢtur. Bunu takiben et örneklerine 20 mL fosfat tamponu ilave edilmiĢ ve stomacher’da 1dk parçalandıktan sonra dilüsyonlar hazırlanmıĢtır. Oxford Listeria Selective Agar besiyerine yayma plak yöntemi ile ekim yapıldıktan sonra 35-37°C’de 24 saat inkübe edilmiĢtir.

3.2.6. Depolama İşleminin Bakteriyosin Aktivitesi Üzerine Etkisi Steril stomacher poĢetlerine konulan et örneklerine (yaklaĢık 5 g, 1 cm3

) fosfat tamponunda hazırlanan 0, 400, 800, 1600 ve 3200 AU/mL bakteriyosin çözeltilerinden 1 mL ilave edilmiĢ ve buzdolabında muhafaza edimiĢtir. Depolamanın 0., 1., 4., 8. ve 12. günlerinde rastgele et örnekleri alınıp yaklaĢık 104

-105 kob/mL düzeyinde L. monocytogenes içeren kültürden 1 mL ilave edilmiĢ ve 10 dk bekletilmiĢtir. Daha sonra et örneklerine 20 mL fosfat tamponu katılıp stomacher’da 1 dk parçalanmıĢ ve dilüsyonlar hazırlanmıĢtır. Oxford Listeria Selective Agar besiyerine yayma plak yöntemi ile ekim yapıldıktan sonra 35-37°C’de 24 saat inkübe edilmiĢtir. Ġnkübasyon iĢleminin sonunda geliĢen koloniler sayılıp sonuç kob/g olarak verilmiĢtir.

3.2.7. İstatistiksel Analiz

Her bir analiz üç kez yapılıp, ortalamaları hesaplanmıĢtır. Bakteri sayıları log kob/g olarak ifade edilmiĢtir. Ortalamaların karĢılaĢtırılması için Tukey testi kullanılmıĢtır. Veri analizleri SAS istatistiksel paket programı kullanılarak gerçekleĢtirilmiĢtir.

4. BULGULAR ve TARTIŞMA

4.1. Laktokoksin BZ’nin Taze Sığır Etinin Mikrobiyolojik Kalitesi Üzerine Etkisi

Laktokoksin BZ’nin taze sığır etinin mikrobiyolojik kalitesine etkisini ortaya koymak amacıyla yaklaĢık 5 g ağırlığında küp Ģeklinde kesilen etlere farklı konsantrasyonlarda 0, 200, 400, 800, 1600 ve 2500 AU/mL düzeyinde bakteriyosin uygulanmıĢ ve buzdolabı sıcaklığında (4-5°C) 12 gün depolanmıĢtır. Depolamanın belirli periyotlarında örnek alınıp canlı toplam mezofilik aerobik bakteri (TMAB), toplam psikrotrof aerobik bakteri (TPAB), toplam koliform (TK), fekal koliform (FK), laktik asit bakteri (LAB) ve maya-küf sayısı belirlenmiĢtir. Bakteriyosin uygulanmayan et örneği de kontrol olarak kullanılmıĢtır.

4.1.1. Toplam Mezofil Aerobik Bakteriler Üzerine Etkisi

Analiz sonucunda laktokoksin BZ içermeyen kontrol örneğinde TMAB sayısının 12 günlük depolama süresince arttığı ve bu artıĢın depolamanın 1. gününden itibaren istatistiki olarak önemli (P<0,001) olduğu belirlenmiĢtir (ġekil 4.1). Kontrol örneğinin TMAB sayısı 7,23 log kob/g’dan 12,58 log kob/g’a yükseldiği gözlenmiĢtir. Laktokoksin BZ içeren örneklerde ise uygulanan konsantrasyona bağlı olarak TMAB sayısının azaldığı ve geliĢiminin kontrol altına alındığı belirlenmiĢtir (ġekil 4.1). TMAB sayısındaki azalmanın laktokoksin BZ konsantrasyonunun artmasıyla arttığı belirlenmiĢtir. Depolamanın birinci gününde 200, 400, 800, 1600 ve 2500 AU/mL uygulanan örneklerde sırasıyla 1,42, 1,52, 1,86, 2,73 ve 3,952 log’luk azalma olduğu ve bu azalmaların da istatistiki olarak önemli (P<0,001) olduğu tespit edilmiĢtir. Laktokoksin BZ düzeyi 200 AU/mL olan et örneklerinde istatiksel olarak önemli olmasa da (P>0,05) TMAB sayısındaki azalmanın depolamanın 4. gününe kadar, 400 ve 800 AU/mL düzeyinde laktokoksin içeren örneklerde ise 8. gününe kadar devam ettiği, ancak bundan sonraki depolama süreçlerinde TMAB sayısının et örneklerinde düĢük düzeyde de olsa arttığı (P>0,05) tespit edilmiĢtir. Depolamanın 12. gününde 200 AU/mL laktokoksin

uygulanan örnekte TMAB sayısının 6,95 log kob/g, 400 ve 800 AU/mL içeren örneklerde 6,11 ve 5,37 log kob/g’a ulaĢtığı görülmüĢtür. Verilerden de anlaĢılacağı üzere söz konusu örneklerde TMAB sayısının baĢlangıçtaki et örneklerinin TMAB sayısına (7,23 log kob/g) ulaĢmadığı görülmektedir. Laktokoksin düzeyi 1600 ve 2500 AU/mL olan et örneklerinde ise istatiksel olarak önemli (P>0,05) olmasa da TMAB sayısındaki azalmanın depolama süresince devam ettiği saptanmıĢtır. Depolamanın 12. gününde 1600 AU/mL bakteriyosin içeren örnekte 3,65 log; 2500 AU/mL bakteriyosin içeren örnekte ise 4,87 log’luk azalma olduğu belirlenmiĢtir.

Mezofil bakteri sayısı 5,34 log kob/g olan taze parça et Lactobacillus plantarum BN tarafından üretilen bakteriyosin ile muamele edildiğinde mezofil bakteri sayısının kontrol altına alındığı belirtilmiĢtir. Kontrol ve laktik asit çözeltisiyle muamele edilen et örneklerinin 9. günde bozulma noktası olarak kabul edilen mezofil bakteri sayısının 7 log kob/g’den daha yüksek bir düzeye ulaĢtığı ancak bakteriyosin çözeltisi ile muamele edilen örneğin 15. günde bile bu düzeye ulaĢmadığı belirlenmiĢtir. Bakteriyosin uygulamasının etin raf ömrünü 9 gün arttırdığını saptamıĢlardır (Fiorentini ve ark., 2001).

4.1.2. Toplam Psikrotrof Aerobik Bakteriler Üzerine Etkisi

TMAB’ye benzer Ģekilde bakteriyosin içermeyen et örneklerinde buzdolabında depolama süresince TPAB sayısının arttığı belirlenmiĢtir (ġekil 4.2). BaĢlangıç TPAB sayısı 6,12 log kob/g olan kontrol örneklerinde depolamanın 12. gününde 12,21 log kob/g’a ulaĢtığı belirlenmiĢtir. Depolamanın 1. gününden itibaren TPAB sayısında görülen artıĢların istatiksel olarak önemli olduğu bulunmuĢtur (P<0,01). Ġstatiksel olarak önemli olmasa da 200 AU/mL laktokoksin içeren et örneklerinde depolamanın 4. gününe, 400 ve 800 AU/mL içeren örneklerde ise 8. gününe kadar TPAB sayısının azaldığı, bundan sonraki periyotlarda ise önemsiz düzeyde arttığı bulunmuĢtur. Depolamanın 12. gününde TPAB sayısının 400 AU/mL laktokoksin BZ içeren örnekte 6,198 log kob/g, 800 AU/mL bakteriyosin içeren örnekte ise 5,196 log kob/g olduğu gözlenmiĢtir. Laktokoksin BZ’yi 1600 ve 2500 AU/mL içeren et örneklerinde TPAB sayısının depolama süresince azaldığı belirlenmiĢtir. Depolamanın 0. ve 1. gününde TPAB sayısında görülen azalma istatiksel olarak önemli (P<0.01) olmasına karĢın bundan sonraki süreçte gözlenen azalmanın önemsiz (P>0,05) olduğu bulunmuĢtur. Buzdolabı koĢullarında depolamanın 12. gününde 1600 AU/mL’li örnekte sırasıyla 3,20 log; 2500 AU/mL bakteriyosin içeren örnekte ise 3,50 log’luk azalma olduğu belirlenmiĢtir.

0 2 4 6 8 10 12 14 0 1 4 8 12 Depolama (gün) TMAB Say ısı (log kob /g) Kontrol 200-LBZ 400-LBZ 800-LBZ 1600-LBZ 2500-LBZ

ġekil 4.1. Laktokoksin BZ’nin taze ette toplam mezofilik aerobik bakteri (TMAB) geliĢimi üzerine etkisi.

0 2 4 6 8 10 12 14 0 1 4 8 12 Depolama (gün) TP AB Say ısı (log kob /g) Kontrol 200-LBZ 400-LBZ 800-LBZ 1600-LBZ 2500-LBZ

ġekil 4.2. Laktokoksin BZ’nin taze ette toplam aerobik psikrotrofik bakteri geliĢimi üzerine etkisi.