Micronucleus Testi Kullanılarak Bir Florid Jelinin İnsan Bukkal Mukoza Epitel Hücrelerine Genotoksik Ve/Veya Sitotoksik Etkilerinin İncelenmesi

Cumhuriyet Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi Dergisi Cilt:6 Sayı:1-2003

* Selçuk Üniversitesi, Dişhekimliği Fakültesi, Diş Hastalıkları ve Tedavisi A.D. ** Selçuk Üniversitesi, Meram Tıp Fakültesi, Tıbbi Genetik A.D.

MICRONUCLEUS TESTİ KULLANILARAK BİR FLORİD JELİNİN İNSAN BUKKAL

MUKOZA EPİTEL HÜCRELERİNE GENOTOKSİK VE/VEYA SİTOTOKSİK ETKİLERİNİN

İNCELENMESİ

Doç. Dr. Abdulkadir Şengün*, Dt. Mustafa Ülker*, Prof. Dr.Hasan Acar**, Yrd. Doc. Dr.İsmet Duran*, Prof. Dr. Füsun Özer*

ÖZET

Amaç: Hem sistemik hem de topikal flor uygulamaları

dişlerle sınırlı kalmayacağı için, dişeti ve oropharangial mukozanın olduğu kadar gastric mukozanın da flor ile irritasyonu gözlemlenmiştir. Bu etkiler kısmen florun olası sitotoksik ve/veya genotoksik etkilerine atfedilebilir. Yavru bir hücrenin sitoplazmasında küçük ek bir çekirdek olarak görülen micronucleus (MN), hem bir ajanın sitotoksik etkisine işaret eden bir kromozom olarak, hem de bir ajanın genotoksik etkisine işaret eden bir kromozom parçası olarak görülebilir. Bu öncü çalışmada bir acidulated phosphated fluoride (APF) jelinin (Topex, Sultan) oral bukkal mukoza epitel hücrelerinde mikronucleus görülme sıklığı üzerine etkileri analiz edilmiştir. Gereç-Yöntem: Yaşları 18-22 arasında değişen dört erkek ve dört bayan, topikal APF uygulamasından önce ve uyguladıktan 24 saat sonra analiz edildi. Bireylerin bukkal epitelinde MN insidansı skorlandı. Oral mukozadan toplanan epitel hücreleri temiz bir mikroskop lamı üzerine yayıldı. Hücreler %100 soğuk metanol ile fikse edildi. Lamlar 37 °C de bir gece boyunca bekletildi ve daha sonra Giemsa ile boyandı. Her bir lamda 3000 hücre MN sıklığı için analiz edildi. En son 100× büyütme ile MN teyit edildi. Uygulama öncesi ve sonrasında MN insidansı farklılıklar Wilcoxon Signed Ranks testi kullanılarak karşılaştırıldı.

Sonuçlar ve kararlar: Farklı bireyler arasında geniş

varyasyon aralıkları gözlemlense de, uygulama öncesi ve sonrası MN insidansı arasında belirgin bir farklılık vardı (P<0.05). Bizim bulgularımız APF jelinin oral epitel hücreleri üzerindeki olası sitotoksik ve/veya mutajenik etkilerinin olduğunu desteklemektedir. APF jelinde olduğu gibi diğer florid ajanlarını ile de daha ileri çalışmaların yürütülmesi gerekir.

Anahtar kelimeler: Micronucleus, Sodyum florür,

Sitotoksisite, Genotoksisite

SUMMARY

Purpose: Fluoride irritations of the gingiva and

oropharyngeal mucosa as well as in gastric mucosa are observed since neither local nor systemic application is restricted to the teeth. These effects may be partially attributed to the possible cytotoxic and/or genotoxic effects of fluorides. Micronucleus (MN), which appears in the cytoplasm of a doughter cell as a small addition nucleus is, produced either from a chromosome indicating cytotoxic effects of an agent and a chromosome fragment indicating genotoxic effects of an agent. In this primary study the effects of the acidulated phosphated fluoride (APF) gel (Topex, Sultan) on the incidence of micronucleus was analyzed on buccal epithelial cells. Materials and

Methods: Four males and four females with aged 18-22

undergone APF topical application was analyzed before and after 24 hours exposure. The MN incidence was scored in the buccal epithelial of each participants. Epithelial cells collected from oral mucosa were smeared on to clean microscope glass slides. The cells were fixed with cold % 100 methanols. The slides were aged at 37°C overnight and than stained with Giemsa. The slides were screened and 3000 nucleated cells were analyzed for the presence of MN at a final 100× magnification for each participant. The difference in the pre- and post-treatment incidence of MN was compared by using Wilcoxon Signed Ranks test. Results and conclusion: There was a significant difference of MN incidence between pre treatment and post treatment (P<0.05), although wide range of variations were seen in different individuals. Our primary findings support the presence of possible cytotoxic and/or mutagenic effects of APF gel on oral epithelium cells. Further studies should be carried out with APF gel as well as other fluoride agents.

Key Words: Micronucleus, Sodium fluoride, Cytotoxicity,

Cumhuriyet Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi Dergisi Cilt:6 Sayı:1-2003

20

Flor bileşikleri toprakta, suda ve yiyeceklerde doğal olarak bulunur. Bu bileşikler çürük insidansını azaltmak için diş macunlarına, gargaralara ve içme sularına yıllardan beri eklenmektedir. Bu bileşiklerin muhtemel sitotoksik ve genotoksik etkileri mutlaka göz önünde bulundurulmalıdır.

Kimi araştırma grupları flor bileşiklerinin sitotoksik etkilerini bildirmiştir. Sodyum floridin (NAF) kültür ortamında insan diploid hücrelerinin büyümesini engellediği,1 _{ayrıca NaF muamelesinin, rat kemik iliği}

hücrelerinde kromozomal sapmalara neden olduğu bildirilmiştir.2 _{Bunun ötesinde floridin insan pulpa}

hücrelerinin protein sentezi ve mitokondriyal aktiviteleri üzerinde baskılayıcı bir etkisin olduğu gösterilmiştir.3

Ayrıca oral epitelin keratinize olması, gingival dokuların dış zararlı etkenlerden korunmasına ve periodontal sağlığın idamesine katkıda bulunur. Yakın zaman önce florid preparatlarının doza bağlı bir artış içinde insan gingival keratinositlerine de sitotoksik etkilerinin olduğu rapor edilmiştir.4

Jeng ve ark.5 _{NaF ile protein sentezi}

engellenmesinin oral mukozal fibroblastlara toksik etkiye neden olduğunu in vitro olarak göstermişlerdir. Bunun yanında NaF sitotoksisitesi DNA, RNA ve protein biosentezindeki genel bir azalma ile de ilişkilidir.6 _Ayrıca

kültüre edilmiş HL-60 hücrelerinde, NaF’in DNA ve protein biyosentezi kapasitesini azalttığı ve böylece hücrelerin yaşayabilirliklerine olumsuz etkilerinin olduğuna işaret edilmiştir.7

Ancak flor bileşiklerinin genotoksik etkileri hala tartışmalı bir konudur. Li ve ark.8 _{maksimum tolere}

edilebilir doza kadar florun polikromatik eritrositlerde Micronucleus (MN) sıklığını artırıcı bir etkisinin olmadığını bildirmişlerdir. Florun relatif olarak düşük konsantrasyonu (5-10 ppm) ile muamele sonunda insan diploid fibroblast hücrelerinde kromozomal sapmalara rastlanmamıştır9 _{ve 10-150 ppm NaF insan EUE}

hücrelerinde mutajenik etkilere neden olmamıştır.6

Bu çelişkili deliller ışığında, biz acidulated phosphated fluoride (APF) gel (Topex, Sultan) ile muamelenin, insan bukkal oral mukoza epitel hücrelerinde, sitotoksik ve/veya genotoksik etkilerin olduğuna işaret edecek olan MN insidansında bir artışa neden olup olmadığını inceledik.

GEREÇ-YÖNTEM

Bu çalışmaya oral hijyeni iyi olan ve periodontal olarak sağlıklı dört erkek ve dört bayan birey gönüllü oldu. Yaşları 18 ile 22 arasında değişen bireylerden hiçbirinin sigara içme alışkanlığı yoktu ve herhangi bir neden ile ilaç tedavisi altında değillerdi. Bireyler APF uygulamasından hemen önce ve uygulandıktan 24 saat sonra analiz edildi. Katılımcıların bukkal epitelinde MN insidansı skorlandı. Oral bukkal mukozadan toplanan epitel hücreleri temiz mikroskop lamları üzerine yayıldı. Hücreler %100 soğuk metanol ile fikse edildi. Lamlar 37 °C de bir gece boyunca bekletildi ve daha sonra Giemsa ile boyandı. Her bir lamda 3000 hücre MN sıklığı için analiz edildi. Işık mikroskobu altında (Olypus, Japan) en son 100× büyütme ile MN teyit edildi. Micronucleus barındıran hücreler kayıt edildi. Micronucleus skorlamasında Countryman ve Heddle’ın10 _{tarif ettiği micronucleus kriteri kullanıldı.}

Buna göre; ışık kırılganlığı olmayan, çekirdeğe temas etmeyen ve çekirdekle aynı renkte veya daha açık renkte, çapı esas çekirdeğin çapının 1/3 den daha azdı. Uygulama öncesi ve sonrasında MN insidansı farklılıklar Wilcoxon Signed Ranks testi kullanılarak karşılaştırıldı.

BULGULAR VE TARTIŞMA

Bu çalışmada APF jel uygulamasının insan oral bukkal mukoza epitel hücrelerinde MN insidansında artışa yol açtığı (P<0.05) dolayısı ile uygulamanın sitotoksik ve/veya genotoksik olduğu görülmüştür (Tablo 1, Resim 1).

Tablo 1: Bukkal mukozada APF jel uygulama öncesi ve sonrasında görülen MN sayısı (1/1000) ve istatistiksel değerlendirmesi.

Uygulama Öncesi İstatistik Uygulama Sonrası Ort± SS Min - Maks Z = -2.240 Ort ± SS Min – Maks

Cumhuriyet Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi Dergisi Cilt:6 Sayı:1-2003

21

epitel hücrelerinde oluşan mikronukleuslar.

Micronucleus test yöntemi ilk defa 1970’lerin ortalarında tanıtılmıştır.10 _{Bu prosedür, anafaz}

safhasındaki kromatin dağılımının bozulması sonrasında oluşmuş mitotik hücrelerin incelenmesi temeline dayanır. Telefaz safhasından sonra, bu yer değiştirmiş kromatin, yavru hücre stoplazması içinde çekirdekten ayrı, tekli veya çoklu micronuclei olarak gözlenir. Micronucleus görülmesindeki sıklık kromozom kırılmalarına veya kayıplarına ve hücre bölünme oranına bağlıdır.11,12

Etkinliği ve kolaylığından dolayı MN testi, kromozom hasarlarının incelenmesi için popüler ve kullanışlı bir yöntem haline gelmiştir. Biz de bu öncü çalışmada bir APF jelinin sitotoksik ve/veya genotoksik etkisini MN testini kullanarak inceledik ve APF muamelesinin oral epitel hücrelerinde MN sıklığını belirgin oranda arttırdığını gözledik.

Günümüze kadar yapılmış olan çalışmalarda çelişkili sonuçlar elde edilmiştir. Bizim bulgularımıza zıt olarak Li ve ark,8 _{fare kemik iğlinde MN testi kullanarak}

yaptıkları çalışmada florun kromozomlar üzerinde yıkıcı bir etkisinin ve bu yüzden mutajenik etkisinin olmadığını bildirmiştir. Ancak hayvanlardan farklı olarak, kimyasalların insanlar üzerinde genotoksik aktiviteleri, daha karmaşık biyolojik faaliyetler ile gerçekleşmektedir. İnsan hücreleri kullanılarak yapılan çalışmalarda ortaya konan pozitif bulguların muhtemel nedeni bu olabilir. İnsan diploid fibrolastları, toplumsal su kaynaklarındaki değere eş olan düşük dozlarda uzun süreli NaF’e maruz bırakıldıklarında, kromozomal sapmalarda bir artış gözlenmemiştir.9 _{Bununla birlikte 2}

mmol/L (40 ppm) in üzerindeki NaF konsantrasyonlarının oral mukoza fibroblastlarında sitoksik etkiye neden olduğu gösterilmiştir. Bu sitotoksik etki, dozun artması ile birlikte azalan protein sentezi ve mitokondriyal fonksiyonlar ile gerçekleşmektedir.5 _{Topikal flor uygulamalarında ise}

bu dozların çok üzerine çıkılmaktadır.

SONUÇLAR VE KARARLAR

Farklı bireyler arasında geniş varyasyon aralıkları gözlemlense de, uygulama öncesi ve sonrası MN insidansı arasında belirgin bir farklılık vardı (P<0.05). Bizim bulgularımız APF jelinin oral epitel hücreleri üzerinde olası sitotoksik ve/veya mutajenik etkilerinin olduğunu desteklemektedir. Ancak florun genotoxic etkileri konusunda kesin bir yargıya varabilmek için bir veya iki test metodu ile elde edilen verilerle yetinmek uygun olmayacaktır. APF jelinde olduğu gibi diğer florid ajanları ile de daha ileri çalışmaların yürütülmesi gerekir. Bununla birlikte gelecekte florid ajanların periodonsiyumdaki özellikle dişetindeki fibroblastlar ve diğer hücreler üzerindeki etkileri de araştırılmalıdır.

KAYNAKLAR

1. Oguro A, Cervenka J, Horii E. Effect of sodium fluoride on growth of human diploid cells in culture, Pharmacol Toxicol. 67: 411-414, 1990.

2. Khalil, A.M. Chromosome aberrations in cultured rat bone marrow cells treated with inorganic fluorides, Mutat Res. 343: 67-74, 1995.

3. Chang Y.C., Chou M.Y. Cytotoxicity of fluoride on human pulp cell cultures in vitro.Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod.91(2):230-234, 2001.

4. Tsutsui T., Tanakara Y., Ushimura T., Ide T., Matsumura M., Barrett J.C. In vitro cytotoxicity of diverse preparations used in dental practice to human gingival keratinocytes, Toxicology in vitro, 11:393-398, 1997.

5. Jeng J.H., Hsieh C.C., Lan W.H., Chang M.C., Lin S.K., Hahn L.J., Kuo M.Y. Cytotoxicity of sodium fluoride on human oral mucosal fibroblasts and its Mechanisms, Cell Bio Toxicol. 14: 383-389, 1998.

6. Slamenova D., Gabelova A., Ruppova K. Cytotoxicity and genotoxicity testing of sodium fluoride on Chinese hamster V79 cells and human EUE cells, Mutat Res. 279: 109-115, 1992.

Cumhuriyet Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi Dergisi Cilt:6 Sayı:1-2003

22

Cytotoxicity and apoptosis induction of sodium fluoride in human promyeloctic leukemia (HL-60) cells, Environmental toxicology and pharmacology 11: 85-91, 2002.

8. Li Y., Dunipace A.J., Stookey G.K. Lack of genotoxic effects of fluoride in the mouse bone marow micronucleus test, J Dent Res. 66: 1687-1690, 1987.

9. Tsutsui T., Tanaka Y., Matsudo Y., Uehama A., Someya T., Hamaguchi F., Yamamoto H., Takahashi M. No increases in chromosome aberrations in human diploid fibroblasts following exposure to low concentrations of sodium fluoride for long times, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, 355: 15-20, 1995.

10. Countryman P., Heddle J. The production of micronuclei from chromosome aberrations in irradiated cultures of human lymphcytes. Mutat Res 41,321-332, 1976.

11. Acar H., Caliskan U., Demirel S., Largaespada D.A. Micronucleus incidence and their chromosomal origin related to therapy in acute lymphoblastic leukemia (ALL) patients: detection by micronucleus and FISH techniques. Teratog Carcinog Mutagen. 21(5):341-347, 2001.

12. Peace E.B. An investigation of chromosomal content and origin of micronuclei, Doctorate in philosophy in the department of environmental health of the collage medicine.1998.

Yazışma adresi:

Doç. Dr. Abdulkadir Şengün

Selçuk Üniversitesi, Dişhekimliği Fakültesi Diş Hastalıkları ve Tedavisi Anabilim Dalı 42075 Konya

Tel: +90 332 2410041/1245 Faks: +90 332 2410062 E-Posta: asengun@selcuk.edu.tr