T.C.
GAZĠOSMANPAġA ÜNĠVERSĠTESĠ
Bilimsel AraĢtırma Projeleri Komisyonu
Sonuç Raporu
Proje No: 2011/54 Projenin BaĢlığı
ANKĠLOZON SPONDĠLĠT’LĠ ve ROMATOĠT ARTRĠT’LĠ HASTALARDA MEFV MUTASYONLARININ SAPTANMASI
Proje Yöneticisi Yrd. Doç. Dr. Serbülent YĠĞĠT
Birimi
Tıp Fakültesi/ Tıbbi Biyoloji ABD
AraĢtırmacılar ve Birimleri
Yrd. Doç. Dr. Serbülent YĠĞĠT Tıp Fakültesi /Tıbbi Biyoloji ABD
Yrd. Doç. Dr. Ahmet ĠNANIR Tıp Fakültesi/ Fiziksel Tıp ve Rehabilitasyon ABD AraĢ. Gör. Dr. Nihan BOZKURT Tıp Fakültesi/ Tıbbi Biyoloji ABD
T.C.
GAZĠOSMANPAġA ÜNĠVERSĠTESĠ
Bilimsel AraĢtırma Projeleri Komisyonu
Sonuç Raporu
Proje No: 2011/54 Projenin BaĢlığı
ANKĠLOZON SPONDĠLĠT’LĠ ve ROMATOĠT ARTRĠT’LĠ HASTALARDA MEFV MUTASYONLARININ SAPTANMASI
Proje Yöneticisi Yrd. Doç. Dr. Serbülent YĠĞĠT
Birimi
Tıp Fakültesi/ Tıbbi Biyoloji ABD
AraĢtırmacılar ve Birimleri
Yrd. Doç. Dr. Serbülent YĠĞĠT Tıp Fakültesi /Tıbbi Biyoloji ABD
Yrd. Doç. Dr. Ahmet ĠNANIR Tıp Fakültesi/ Fiziksel Tıp ve Rehabilitasyon ABD AraĢ. Gör. Dr. Nihan BOZKURT Tıp Fakültesi/ Tıbbi Biyoloji ABD
(Nisan/2012)
ANKĠLOZON SPONDĠLĠT’LĠ ve ROMATOĠT ARTRĠT’LĠ HASTALARDA MEFV MUTASYONLARININ SAPTANMASI
Ailevi Akdeniz Ateşi (FMF) serositis, karın ağrısı, artrit ve plörit atakları ile karakterize otozomal resesif bir hastalıktır. AAA sıklıkla, doğu Akdeniz kökenli populayonu özellikle Sefardik Yahudi, Ermeni, Türk, Arap ve Yunanlıları etkilemektedir. Hastalığa Pyrin/Marenostrin adlı bir proteini kodlayan MEFV geni mutasyonları neden olur. Infever veritabanına göre MEFV geninde 180'den fazla polimorfizm/mutasyon saptanmıştır.
Bu çalışmaya 103 AS hastası, 100 RA hastası ve 120 sağlıklı kontrol dahil edilmiştir. Bütün hasta ve kontrol grubunda MEFV geninin 2. ve 10. eksonundaki E148Q, P369S, M680I, M694V ve V726A değişimleri incelendi. Polimeraz Zincir Reaksiyonu sonucu elde edilen amlifikasyonlar HinfI, AluI, HphI, PvuII enzimiyle kesildi.
Hasta grubunda E148Q, P369S, M680I, M694V and V726A AA allele değişimleri kontrol grubundan yüksek saptandı. AS/RA hastalarıyla MEFV arasında allel frekansı açısından önemli bir ilişki olduğu bulundu (Pc: <0.0001, OR: 0,37, 95% CI: 0.23–0,67). Bu çalışma MEFV allelik değişimlerin bu hastalıklar için bir risk faktörü olabileceğini gösterdi. Bizim çalışmamız Türk toplumunda AS yada RA hastalığının oluşumundaki pekçok genetik faktörden biri arasında MEFV mutasyon/polimorfizmlerinin olabileceğini yansıtmıştır.
Anahtar Kelimeler: Ankilozan Spondilit, Romatoit Artirit, MEFV
(*)Bu çalışma Gaziosmanpaşa Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu tarafından desteklenmiştir. (Proje No: 2011/54)
ABSTRACT
ANKILOZON SPONDYLITIS and ROMATOIT ARTHRITIS with PATIENTS DETERMINING MEFV
Familial Mediterranean Fever (FMF) is an autosomal recessive disease characterized by recurrent attacks of serositis, abdominal pain, arthritis and pleuritis. FMF frequenty affects populations around the eastern Mediterranean origin, especially Sephardic Jews, Armenians, Turks, Arabs and Greeks. Disease is caused by mutations in MEFV gene, which encodes a protein named Pyrin/Marenostrin. In the Infever Database, more than 180 gene alterations polymorphisms/mutations located in the MEFV gene.
In the present study, we used 103 AS patients, 100 RA patients and 120 healthy controls. We detected E148Q, P369S, M680I, M694V and V726A alterations at exon 2-10 of the MEFV gene in Turkish AS, RA patients and healthy controls. We tested the existence of the alterations by HinfI, AluI, HphI, PvuII restriction enzyme digestion after PCR amplification of the exon 2-10.
The E148Q, P369S, M680I, M694V and V726A allelic frequency was higher in AS, RA patients than healthy controls and, significant association was found between patients and alterations (Pc: <0.000, OR: 2.16, 95% CI: 1.44–3.28). The present study demonstrats that polymorphisms/mutations located in the MEFV gene could be a risk factor for FMF. Our results reflect that MEFV polymorphisms/mutations may be one of the many genetic factors for AS and RA susceptibility in Turkish population.
Key words: Ankylosing Spondylitis, Rheumatoid Arthritis, MEFV
ÖNSÖZ
Bu çalışmaya destek veren Gaziosmanpaşa Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu’na en içten teşekkürlerimizi bir borç biliriz.
Nisan, 2012 Yrd.Doç.Dr.Serbülent YĠĞĠT
İÇİNDEKİLER
ÖZET…….……….……..…..i ABSTRACT……….…..…...ii
ÖNSÖZ……….….…...iii İÇİNDEKİLER DİZİNİ…………..………...……..…..iv ŞEKİLLER DİZİNİ ………...v TABLOLAR DİZİNİ………..……….…...vi 1.GİRİŞ………..………....…...1 2.GENEL BİLGİLER ………..…….5 3.MATERYAL VE YÖNTEM ...5 3.1. Çalışma Grubu ... 5 3.2. Yöntem ... 5
3.2.1. Genomik DNA İzolasyonu ... 5
3.2.2. DNA’nın Kalitatif Tayini ... 7
3.2.3. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR)………...…….………….7
3.2.3.1. Primerler………..………7
3.2.3.2. DNA Polimeraz Enzimi ve Tamponu………8
3.2.3.3. PZR Karışımları………..….9
3.2.3.4. PZR Programları……….…9
3.2.4. Agaroz Jel Elektroforezi………10
3.2.5. İstatitiksel Analizler ………..……….………10
4.BULGULAR ………11
4.1. Genomik DNA İzolasyonu ………..11
4.1.1 DNA’nın Kalitatif Tayini………..11
4.1.2 DNA’nın Kalitatif Tayini ……….11
4.2. İstatistiksel Bulgular ……….12
5. SONUÇ VE TARTIŞMA ………..15
6. KAYNAKLAR………..17
ŞEKİLLER DİZİNİ ŞEKİL4.1. Genomik DNA’ların % 1’lik Agaroz Jel Görüntüsü ………11
TABLOLAR DİZİNİ
Tablo 2.1. AAA hastalarında MEFV geni mutasyonları ile ilgili bazı yayınlar………..……….4 Tablo 3.1. AS, RA ve kontrol gruplarının demografik özellikleri...5 Tablo 3.2. Primer İsimleri, Baz Dizileri ve RFLP Enzimleri………….……..………...8
Tablo 3.3. PCR Karışımı………..…….….…...9
Tablo 3.4. PCR ………..9
Tablo 4.1. AS ve kontrol grubuna ait genotip verileri. ………...……12
Tablo 4.2. AS çalışma grubuna ait demografik ve klinik bilgiler……….……...13
Tablo 4.3. RA ve kontrol grubuna ait genotip verileri……….14
Tablo 4.4. RA çalışma grubuna ait demografik ve klinik bilgiler………...14
1.GİRİŞ
Ailesel Akdeniz Ateşi (AAA) tekrarlayan karın ağrısı, ateş, peritonit, pleurit ve artrit ile karakterize resesif kalıtımlı genetik bir hastalıktır. AAA klinik olarak dönem dönem tekrarlayan ve 1-3 gün devam eden 38-40 dereceye varan ateşin yanı sıra, özellikle diz, bilekler ve dirsekleri tutan akut sinovite neden olmaktadır. Ataklar arası hasta asemptomatiktir (The French FMF Consortium;1997). AAA hastalığı özellikle Doğu Akdeniz’e kıyısı olan ülkelerde Türk, Yahudi, Ermeni ve Arap popülasyonunda sık görülür (Akkoç ve ark., 2010). Türkiye’de hastalık prevalansı yaklaşık 1:1000 olarak belirtilmektedir (Ozen ve ark., 1998). Erkeklerde kadınlara oranla 3 kat daha fazla görülmektedir. Genellikle 20’li yaşlarda hastalık başlamaktadır. AAA hastalarının çoğunluğu inflammasom kompleksinin fonksiyonunda bozuklukla sonuçlanan MEFV geninde missense değişimler taşımaktadır ((Pras ve ark. 1992; The French FMF Consortium 1997; The International FMF Consortium 1997,Coşan ve ark., 2010).
AAA gibi hemen hemen aynı yaş grubunu etkileyen Ankilozan Spondilit (AS) ise primer olarak sakroiliyak eklemleri ve aksiyel iskeleti tutan sebebi bilinmeyen sistemik inflamatuvar bir hastalıktır. Hastalık genellikle sinsi başlangıçlı, istirahatte artan, aktiviteyle azalan bel ağrısı ve sabah tutukluğu ile ortaya çıkmaktadır (Gümüşdiş ve ark., 2003). AS etiyolojisinde genetik faktörler etkili olabilmektedir. Türkiye’deki hastalık prevelansının 1/1000 olduğu ve bu hastaların da yaklaşık %20’sinin ise MEFV mutasyonu taşıdığı bildirilmiştir (Durmuş ve ark., 2009). Birçok eklemi aynı anda tutabilen Romatoid Artrit (RA) ise kronik seyirli, etiyolojisi tam olarak bilinmeyen, sistemik, inflamatuvar, otoimmün bir hastalıktır. Karakteristik özelliği el ve ayağın küçük eklemlerini simetrik olarak tutmasıdır. Eklemler dışında cilt, göz, akciğer, kalp, nörolojik ve vasküler tutulum görülebilir. Genel prevelansı 1:100’dür. En çok 30-50 yaşlarında başlamakta ve kadınlarda 3 kat daha fazla görülmektedir (Lightfoot ve ark., 1993).
Bu çalışma, Türk toplumunda MEFV mutasyonları ile RA ve AS hastalıkları arasındaki ilişkiyi araştırmak amacıyla yapılmıştır.
2.GENEL BİLGİLER
AAA; Ermeni, Türk, Yahudi ve Orta Doğu Araplarında yaygın görülen, tekrarlayan ateş ve serositis ataklarıyla karakterize otoinflamatuar bir hastalıktır (Akkoç ve ark., 2010). Ailesel Akdeniz Ateşi (AAA) hastalığından sorumlu olan MEFV geni 16. kromozomun kısa kolunda bulunur. MEFV geni 781 aminoasitten oluşan ve nötrofil aktivitesinde rolü olan bir protein olan pyrin/marenostrin kodlamaktadır sürülmektedir (The French FMF Consortium, 1997; The International FMF Consortium, 1997).
MEFV geni 10 ekson içeren büyük bir gendir. Bu gene ait literatürde yaklaşık 20 farklı mutasyon tanımlandığı halde gene ait mutasyonlarin özellikle 10. eksonda bulunan küçük bir alana lokalize olduğu bilinmektedir (Yalçınkaya ve ark., 2004). Pyrinin fonksiyonu henüz tam olarak anlaşılamamış olmakla birlikte olgun nötrofillerin sitoplazmalarında ve mikrotübülledle yerleşim gösterir ve bunların stabilizasyonunda ve iltihabın baskılanmasında etkilidir. İnflamasyon ve apoptozis regülasyonunda görevli proteinlerle ilişkili olan Pyrin domaini olarak adlandırılan bir ölüm domaini içerir. Doğal pyrin inflammasom regülasyonunda anti inflamatuar etki sağlar ve MEFV gen mutasyonları AAA hastalarında kesintisiz bir kaskada neden olur.
Ayrıca MEFV gen mutasyonları çeşitli inflamatuar hastalıklara yatkınlığı da artırmaktadır. Yapılan çalışmalarda bu mutasyona sahip bireylerin hem AS, Behçet, Multiple Sklerozis (MS) ve Ülseratif Kolit gibi bazı inflamatuar hastalıklara daha yatkın olabildiklerini hem de bu mutasyonun hastalık şiddetini etkilediğini desteklenmektedir (Durmuş ve ark., 2009; Koca ve ark., 2010).
AAA, Türkiye’de 1/1000 sıklıkta görülen bir hastalıkken MEFV mutasyon oranı yaklaşık % 20 olarak bildirilmiştir. MEFV gen mutasyonları pyrin ekspresyonunda azalmaya neden olmaktadır. Pyrin ekspresyonunun azalması uygunsuz nötrofil aktivasyonunu tetiklediği ve AAA atakları sırasında görülen sebepsiz kısa süreli sistemik inflamasyon ataklarına neden olduğu düşünülmektedir.
Ankilozon Spondilit (AS); özellikle sakroiliak eklemleri ve omurgayı etkileyen, etiyolojisi tam olarak bilinmeyen inflamatuar, romatoid bir hastalıktır (Durmuş ve ark., 2009; Coşan ve ark., 2010). İnflamatuar sırt ağrısı, omurilik sertliği ve sinsi hareket kaybı bu hastalığın temel semptomlarıdır ve aksiyel iskelette yapısal hasara neden olur. AS etiyolojisinde genetik faktörler önemli bir yer tutmaktadır (Coşan ve ark., 2010). Human lökosit antijen B27 (HLA-B27), AS etiyolojisinin en önemli genetik markırlarındandır. Ancak yapılan ikiz ve aile çalışmaları HLA-B27 yanında non-major histocompatibility (non-MHC) genlerinin de AS’ye yatkınlıkta ve hastalık şiddetinde önemli bir rolü olduğunu göstermektedir. (Durmuş ve ark., 2009).
Romatoid Artrit; öncelikle eklemleri etkileyen ve dünyadaki sıklığı yaklaşık %0.8 olan sistemik otoimmün bir hastalıktır. En önemli risk faktörleri arasında genetik faktörlerden ve özellikle de immün sistem genlerinden söz edilmektedir (Rabinovich ve ark., 2005). Genomçapı çalışmalar major histocompatibility kompleks (MHC) bölgesi en önemli genetik risk faktörünü içerdiğini desteklemektedir (Koca ve ark., 2010). İnflamatuvar artrit ve amyloidozlu Hindistanlı hastalarda E148Q mutasyonunun çok yaygın olduğunu bulan Booth ve ark tarafından MEFV mutasyonları ve artritik hastalıklar arasında bir bağlantı olduğu bildirilmiştir. Aynı zamanda yapılan son çalışmalarda erken dönem RA hastalarında M694V mutasyonları gösterilmiştir. FMF’in yaygın klinik tablosu olan artrit özellikle M694V homozigot bireylerde görülmektedir (Rabinovich ve ark., 2005).
Üzerinde çok çalışılan M680I, M694V ve V726A mutasyonları çeşitli çalışmalarda hastaların % 40-65’inde saptanmıştır (Akar ve ark., 2000; Ben-Chetrit ve ark., 2001; Majeed., 2005). Major mutasyonlar olarak kabul edilen özellikle E148Q, M680I, M694V, M694I ve V726A mutasyonlarını saptamaya yönelik moleküler testler geliştirilmiştir (Eisenberg ve ark., 1998; Touitou, 2003). Bu mutasyonlar AAA hastalarındaki MEFV allelerindeki yüzdelerini gösteren bazı çalışmalara ait bilgiler Tablo 2.1.de verilmektedir.
Tablo 2.1. AAA hastalarında MEFV geni mutasyonları ile ilgili bazı yayınlar M694V (%) M694I (%) M680I (%) V726A (%) E148Q (%) İncelenen örnek sayısı Kaynaklar 97 - 1 - * 83 Kuzey Afrika Yahudisi Shahot ve ark., 1988 49 - 24 11 * 37 Ermeni 61 2 11 12 * 56 Türk 41 17 16 14 * 167 Yalçınkaya ve ark., 2000 43,5 2,8 12 11,1 * 230 Akar ve ark., 1999 42,05 1,47 7,94 12,05 4,1 170 Gershoni ve ark., 1999 44,8 * 18,7 24,2 * 90 Cazeneuve ve ark., 1999 20 7 9,5 14 * 42 Medlej-Hashim ve ark., 2000 * * * * 7,8 25 Ben-Chetrit ve ark., 2001 44,5 6 14,5 20,5 5,5 27 Amiloidozlu grup Yalçınkaya ve ark., 2000 60 7,5 12,5 10 5 20 Amiloidozsuz grup * 22,6 32,1 27,4 * 220 Gershoni-Baruch ve ark., 2002 51,55 0,44 9,22 2,88 3,55 450 Yılmaz ve ark., 2001 42,3 1,8 0,07 6,65 5 446 Ben-Chetrit ve ark., 2002 38 * 8 4 4 25 Amiloidozlu grup Balci ve ark., 2002 38 14 10 26 13 407 Majeed ve ark., 2005 *Bakılmayan mutasyon
3.MATERYAL VE YÖNTEM
3.1. Çalışma Grubu
Gaziosmanpaşa Üniversitesi Tıp Fakültesi Fizik Tedavi ve Rehabilitasyon Anabilim Dalı’nda enaz 100 kişilik Ankilozon spondilit ve enaz 100 kişilik Romatoid Artrit tanısı alan hasta grupları ile enaz 100 kişilik sağlıklı kontrol grupları oluşturularak toplam 300 bireyle çalışma gerçekleştirilmiştir. Bu gruplardan EDTA’lı tüplere 5’er ml kan örnekleri alındı. Kontrol grubu yaş ve cinsiyet özelliklerinin, hasta ve kontrol grubunda eşit oranlarda olması sağlandı. Bu çalışma için Gaziosmanpaşa Üniversitesi Tıp Fakültesi Bilimsel Araştırmaları Değerlendirme Komisyonundan 08.04.2008 tarihinde 08-GEKTIP-009 sayılı onay alındı. Çalışmanın tamamı Gaziosmanpaşa Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji ve Genetik Laboratuvarında yapıldı.
Tablo 3.1. AS, RA ve Kontrol Grubunun Özellikleri
3.2. Yöntem
3.2.1. Genomik DNA İzolasyonu
Çalışmada, AS (103 kişi) ve RA (101 kişi) tanısı konulmuş hastalardan ve sağlıklı bireylerden (120 kişi) 5 ml’lik EDTA’lı tüplere alınan kanlardan DNA izolasyon kiti kullanılarak her bir bireye ait 200 l hacimde DNA’lar elde edildi.
Kit İçeriği (QIAamp DNA Mini Kit):
- Lizis tamponu A (25ml) (Lysis buffer A)
- Bağlama tamponu A (15 ml) (Binding buffer A) Çalışma Grubunun Özellikleri AS Grubu N:103 RA Grubu N:100 Kontrol Grubu 120 Yaş (Ortalama) 38.7±9.2 51.4±13.9 42.6±11.2 Cinsiyet
- Ayırma tamponu D (15 ml) (Elution buffer D) - EL tamponu (50ml) (Buffer EL)
- Proteinaz K (1 ml) (Proteinase K)
- Yıkama tamponu I (30 ml) (Wash Buffer I) - Yıkama tamponu II (18 ml) (Wash Buffer II) - 2 ml.’lik alıcı tüpler 50 adet) (Receiver –Tubes) - 1.5 ml.’lik alıcı tüpler (50 adet) (Receiver –Tubes) - Spin filtreler (50 adet) (Spin Fitler)
Çalışma Solüsyonlarının Hazırlanması ve Saklanma Koşulları:
- Kit açıldıktan sonra 1 ml distile su proteinaz K şişesine eklenir ve liyofilize halde bulunan enzim çözülür. Çözülen proteinaz K +4 C’de 3 ay süreyle saklanabilir. Daha uzun sürede tüketilecekse çözülmüş olan enzim küçük miktarlara bölünerek -20 C’de saklanabilir.
- Yıkama tamponu I (Wash Buffer I) solüsyonu içerisine 30 ml %99’luk ethanol eklenir.
- Yıkama tamponu II (Wash Buffer II) solüsyonu içerisine 42 ml %99’luk ethanol eklenir.
Çalışma Protokolü:
1. Örnek sayısı kadar 1,5 ml’lik mikrosantrifüj tüpü çıkartılır ve örnek isimleri işaretlenir.
2. 200 μl hasta serumu veya plazma tüplere eklenir, 200 ul lizis tamponu A ve 20 μl Proteinaz K eklenir ve vortekslenir.
3. Tüpler 56 derecede su banyosunda 10-15 dakika bekletilir.
4. Tüpler su banyosundan çıkartıldıktan sonra üzerlerine 200 μl bağlama tamponu A eklenir ve tekrar vortekslenir.
5. Tüplerin tüm içeriği Spin filter tüplerine aktarılır ve 1 dakika inkübasyona bırakılır. Ardından 12.000 rpm’de 2 dakika santrüfüj edilir.
6. Santrifüjden alınan kolonlar yeni toplama tüplerine yerleştirilir ve üzerlerine 500 μl yıkama tamponu I solüsyonu konup 12.000 rpm’de 1 dakika santrifüj edilir.
7. Santrifüj sonrası kolonlar tekrar yeni toplama tüplerine aktarılır ve üzerlerine bu kez 800 μl yıkama tamponu II solüsyonu ilave edilir.12.00 rpm’de 2 dakika santrifüj yapılır.
8. Kolonlar son olarak toplama tüplerine konur ve 12.000 rpm’de 2 dakika santrifüj edilir.
9. Santrifüjün ardından kolonlar steril 1,5 ml’lik mikrosantrifüj tüplerine yerleştirilir ve üzerine oda ısısında bekletilmiş ayırma tamponu D solüsyonundan 100-200 μl eklenir. Oda ısısında 3 dakika inkübe edildikten sonra 10.000 rpm’de 1 dakika santrifüj edilir.
10. Son olarak kolonlar mikrosantrifüj tüplerinden uzaklaştırılır ve alttaki bölüme geçen DNA örnekleri -20C’de veya -80 C’de saklanır.
11. Derin dondurucularda saklanan DNA örnekleri çalışma yapılmadan önce çözülür ve PCR için hazırlanır.
3.2.2. DNA’nın Kalitatif Tayini
0.5 g. agaroz, 50ml 0.5XTEB içerisinde kaynatılarak çözündürüldü, 60ºC’ye kadar soğutulduktan sonra 2.5µl EtBr (10mg/ml) eklendi. Sıvı haldeki jel, agaroz jel elektroforez kabına dökülerek donmaya bırakıldı. 1-2µl DNA, toplam hacim 4µl olacak şekilde 6xyükleme tamponu ile karıştırılarak jele yüklendi. Örnekler 0.5XTEB tamponu (Tablo 3.2) içerisinde, 120 V’da 30 dakika yürütüldükten sonra jel UV altında incelendi ve genomik DNA’nın kalitesi analiz edildi.
3.2.3. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR)
MEFV geni E148Q, P369S, M694V, M680I, V726A değişimleri Polimeraz zincir reaksiyonu artı restriksiyon fragmenti uzunluk polimorfizmi (PCR+ RLFP) tekniği ile allel tipleri belirlendi.
3.2.3.1. Primerler
Çalışmamızda kullanılan primer baz dizileri ve RFLP kesim enzimleri Tablo 3’ de verilmiştir.
Tablo 3.
Primer İsimleri, Baz Dizileri ve RFLP enzimleri.
E148Q İleri (forward) primer: 5’-AGG TGG GGAGAA CCC TGT A-3′
Ters reverse) primer: 5’-TGA ATG CAA GAT ACA AGG CCA-3′,
BstNI
P369S İleri (forward) primer: 5’-
TCTTGGGCCCTAAACGTGG - 3’
Ters reverse) primer: 5’- TCC TTC AGG TCC GCA GAT GC - 3’
Hinf I
M680I /V726A İleri (forward) primer: 5’-TGT ATC ATT GTT CTG GGC TCT-3’
Ters (reverse) primer: 5’-AGG GCT GAA GAT AGG TTG AA-3’
HinfI
M694V İleri (forward) primer: 5’-GAA TGG CTA CTG GGT GGA GAT-3’
Ters (reverse) primer : 5’-TGT CAC ATT GTA AAA GGA G-3’
HphI
3.2.4.3. DNA Polimeraz Enzimi ve Tamponu
Bu çalışmada, kullanılan Taq DNA polimeraz enzim konsantrasyonu 5U/l’dir. (Fermentas Life Sciences). PZR tamponu olarak ise MgCI2 içermeyen 500mM KCI,
100mM Tris-HCI (pH 8.8) ve %0.8 Nonidet P40 içeren 10X tampon kullanıldı.
Çalışmadaki PCR karışımları, literatür bilgilerinin değerlendirilerek bazı değişikliklerin yapılması sonucu gerçekleştirildi. Uygulanan PCR karışımı Tablo 3.4’de verilmektedir.
Tablo 3.4.
R202Q Polimorfizminin Belirlenmesinde Kullanılan PCR
Karışımı.
PCR BİLEŞENLERİ l/TÜP SON KONSANTRASYON
Steril bidistile su 18.5 -
10Xtampon 2 1X
MgCI2 (25mM) 2 0.5mM
dNTP karışımı (25mM) 0.3 0.3mM
Primer 1 (10pmol/l) 0.5 0.5pmol Primer 2 (10pmol/l) 0.5 0.5pmol Taq polimeraz (5U/l) 0.2 1 U DNA (150ng/l) 1 150ng
Toplam hacim 25
3.2.4.5. PZR Programları
Çalışmada kullanılan PZR programı tablo 3.5’deki gibidir. Denatürasyon, bağlanma ve uzama için ardışık döngü sayısı 35’dir.
Tablo 3. PZR Programı.
Program Türü Derece (
o
C)
Zaman (saniye) Döngü Sayısı
Denatürasyon Bağlanma Uzatma 94 58 72 45 45 60 35 Son Uzatma 72 300 1
3.2.5. Agaroz Jel Elektroforezi
Elektroforez yürütme tamponu olarak hazırlanan 5XTBE ana stok, dH2O ile 1/10 oranında sulandırıldı. Hazırlanan %2’lik agaroz jele, 5-6µl PZR ürünü, 1-2µl yükleme tamponu ile karıştırılarak yüklendi ve 120V’da 30 dakika yürütüldükten sonra jel, UV altında incelenerek MEFV gen mutasyon noktalarını içeren DNA birimlerinin çoğaltılıp çoğaltılmadığı incelendi.
3.2.6. İstatitiksel Analizler
Verilerin istatistiksel analizi, Epi İnfo Software 3.2.2 versiyonu (CDC, Atlanta, GA) programı kullanılarak yapıldı. AS/RA hasta ve kontrol gruplarında MEFV değişimlerinin dağılımı χ2 veya Fisher testi ile karşılaştırıldı. p değerinin ≤ 0,05
olması, istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Genotip dağılımı ve Hardy-Weinberg denkliği Arlequin Software 2000 (University of Geneva, Switzerland) programı ile test edildi.
4. BULGULAR
4.1. Genomik DNA İzolasyonu
4.1.1. DNA’nın Kalitatif Tayini
İzole edilen tüm genomik DNA’lar %1 (w/v)’lik agaroz jel elektroforezinde analiz edildi. Genomik DNA’lara ait bantlar ultraviyole (UV) ışık altında parlak net ve keskin tekli bantlar halinde gözlendi (Şekil 4.1).
ġekil 4.1. Genomik DNA’larin % 1’lik Agaroz Jeldeki Görüntüsü
4.1.2. DNA’nın Kantitatif Tayini
İzole edilen genomik DNA’nın kantitatif tayini, spektrofotometrik ölçümler ile yapıldı. Spektrofotometre analizleri sonucunda, OD260 değerine göre saptanan DNA
konsantrasyonları birbirinden farklılık göstermekle birlikte, bütün örnekler steril distile su ile sulandırılarak, konsantrasyonları 150ng/l olacak şekilde ayarlandı. DNA’ların saflığı OD260 ve OD280 değerlerinin birbirlerine olan oranı alınarak hesaplandığında,
4.2. İstatistiksel Bulgular
Çalışma kapsamında yer alan 103 AS hastasında ve 120 kontrolde bakılan MEFV gen değişiminin genotip dağılımı ve bazı demografik bilgiler Tablo 4.1. ve Tablo 4.2.’de verilmiştir. Gruplar arasında yaş ortalaması ve cinsiyet açısından anlamlı bir fark gözlenmedi.
Total mutasyon ve allel sıklığı kontrol gruplarına oranla AS hastalarında daha yüksek olduğu ve anlamlı bir ilişki olduğu bulundu. (Pc: <0.004, OR: 2.5, 95% CI: 1.32– 4.76)
Tablo 4.1. : AS ve kontrol grubuna ait genotip veriler. AS hastası (n=103) (%) Kontrol (n=120) (%) P OR (95% CI) No. heterozigot M694V/WT 11 (10.7) 5 (4.2) 0.060 2.8 (0.92-8.20) M680I/WT 6 (5.8) 5 (4.2) 0.569 1.4 (0.42-4.81) V726A/WT 5 (4.9) 3 (2.5) 0.560 2.0 (0.38-13.09) E148Q/WT 9 (8.7) 5 (4.2) 0.161 2.2 (0.71-6.80) P369S/WT 1 (1.0) 1 (0.8) - -
No. Homozigot yada compound heterozigot M680I/M680I 1 (1.0) - - - Total mutasyon (n) 33 (32.0) 19 (15.8) 0.004 2.5 (1.32-4.76) Total allelle sıklığı (n) 34/206 19/240 0.005 2.3 (1.27-4.2) M694V allel 11/206 5/240 0.065 2.7 (0.91-7.76) M680I allel 8/206 5/240 0.261 1.9 (0.61-5.90) MEFV: Mediterranean Fever; AS = Ankyloson spondlitis; WT: yabanıl tip
Tablo 4.2. : AS çalıĢma grubuna ait demografik ve klinik bilgiler. Total (n=103) Carrier (n=33) Non-carrier (n=70) P value
Cinsiyet (% erkek/ % kadın) 54/49 (52.4/47.6) 13/20 (39.4/60.6) 41/29 (58.6/41.4) 0.069 Yaş ortalaması ± SD 38.7±9.2 38.3±10.4 38.9±8.6 0.766 Hastalık başlangıç yaşı ± SD 32.6±9.7 32.5±10.5 32.7±9.3 0.911 Hastalık süresi ± SD 6.3±5.2 6.3±5.2 6.2±5.2 0.914 BASDAI± SD 3.2±1.3 3.4 ±1.4 3.1±1.3 0.246 Sober test ± SD 4.0±1.5 4.2±1.5 3.9±1.5 0.343 Göğüs expansion, ± SD 2.7±1.1 2.7±1.2 2.7±1.0 0.942 ESR ± SD mm/h 18.3±13.6 20.6±16.2 17.2±12.1 0.234 HLA–B27 (%) 76 (73.8) 27 (81.8) 49 (70.0) 0.203 Aile hikayesi n (%) 18 (17.5) 5 (15.2) 13 (18.6) 0.670 Syndesmophtes n (%) 26 (25.2) 8 (24.2) 18 (25.7) 0.873 Ocular tutulum n (%) 15 (14.6) 7 (21.2) 8 (11.4) 0.189 Hip involvement n (%) 39 (37.6) 16 (48.5) 23 (32.9) 0.127 Cardiac involvement n (%) 4 (3.9) 3 (9.1) 1 (1.4) 0.060 Articuler ağrı n (%) 73 (70.9) 24 (72.7) 49 (70.0) 0.776 Cervical ağrı n (%) 15 (14.6) 4 (12.1) 11 (15.7) 0.630 Sakroiliitis (%) 81 (78.6) 27 (81.8) 54 (77.1) 0.589 Oral aphthous ulcer n (%) 22 (21.4) 7 (21.2) 15 (21.4) 0.980 Bambu görünümü 24 (23.3) 8 (24.2) 16 (22.9) 0.877 Dorsal-kifoz 21 (20.4) 7 (21.2) 14 (20.0) 0.887 Ağrı varlığı 84 (81.6) 27 (81.8) 57 (81.4) 0.962 Egzersiz n (%) 25 (24.3) 7 (21.2) 18 (25.7) 0.619 Sigara kullanımı n (%) 15 (14.6) 3 (9.1) 12 (17.1) 0.280 BASDAI = Bath Ankylosing Spondylitis Disease Activity Index; ESR = Erythrocyte sedimentation oranı.
100 RA hastası ve 100 kontrolde bakılan MEFV gen değişiminin genotip dağılımı Tablo 4.3.’de verilmiştir.
Tablo 4.3. RA ve kontrol grubuna ait genotip veriler.
RA (n=101) (%) Kontrol (n=100) (%) M694V/WT 10 (9.9) 7 (7.0) M680I/WT 5 (5.0) 4 (4.0) V726A/WT 4 (4.0) 4 (4.0) E148Q/WT 7 (7.0) 7 (7.0) P369S/WT 2 (2.0) - M694V/P369S 1 (1.0) - V726A/E148Q 2 (2.0) - Total mutations (n) 31 (30.7) 22 (22) Allelle frequency (n) 34/202 22/200
MEFV: Mediterranean Fever; RA: rheumatoid arthritis; WT: yabanıl tip.
Tablo 4.2. : RA çalışma grubuna ait demografik ve klinik bilgiler. Toplam (n=101) Taşıyıcı (n=31) Taşıyıcı olmayan (n=70) P değeri No. kadın/erkek (%) 74/25 (73.3/26.7) 23/8 (74.2/25.8) 51/19 (72.9/27.1) 0.917 Yaş ortalaması 51.4±13.9 49.4±12.9 52.3±14.3 0.540 Hastalık başlangıç yaşı 45±13.4 43.8±13.0 45.6±13.7 0.769 Hastalık süresi 6.3±5.8 5.4±5.6 6.7±5.9 0.769 RF positif hastalar (%) 91 (90.1) 26 (83.9) 65 (92.9) 0.301 Serum RF düzeyi, IU/ml 134.7±197.7 201.3±254.8 105.2±160.2 0.001* Swollen/tender joint 8.2±10.5 7.4±8.8 8.5±10.6 0.261 Deforme eklem sayısı 3.8±6.8 4.3±8.1 3.5±6.1 0.054 RA: rheumatoid arthritis; RF: rheumatoid faktör. ±S.D. *istatistiksel anlamlı grup.
5. SONUÇ VE TARTIŞMA
Ailevi Akdeniz ateşi (AAA) (Familial Mediterranean fever, FMF, MIM249100), ateş ve periton, sinovya veya plevra gibi sörazal zarların inflamasyonu ile karakterize, otozomal resesif kalıtımlı bir hastalıktır (Sohar, 1967). İlk olarak 1945’de Siegal tarafından klinik olarak tanımlanmıştır. AAA’ya sebep olan genin (MEFV) 1997 de Fransız FMF Konsorsiyumu ve Uluslar arası FMF Konsorsiyumu tarafından yerinin belirlenmesi ve AAA’ya neden olan mutasyonların bildirilmeye başlanmasıyla yaygın olarak görüldüğü 4 etnik grupta (Türkler, Ermeniler, Araplar ve Yahudiler) mutasyon sıklıkları ve saptanan mutasyonların fenotiple ilişkisi araştırılmaya başlanmıştır. Türkiyede AAA hastalığı yaklaşık 1/1000 gibi yüksek sıklıkta (Türk FMF Çalışma Grubu, 2005) gözlenen ve taşıyıcı sıklığı 1/5’e kadar çıkan yaygın bir hastalıktır (Ozen ve ark., 1998; Dinc ve ark., 2000; Yılmaz ve ark, 2001; Tunca ve ark., 2002). Romatoid artrit (RA) birçok eklemi aynı anda tutabilen, kronik seyirli, etiyolojisi bilinmeyen, sistemik, inflamatuvar, otoimmün bir hastalıktır. Karakteristik özelliği el ve ayağın küçük eklemlerini simetrik olarak tutmasıdır. Eklemler dışında cilt, göz, akciğer, kalp, nörolojik ve vasküler tutulum görülebilir. Genel prevelansı 1:100’dür. En çok 30-50 yaşlarında başlamakta ve kadınlarda 3 kat daha fazla görülmektedir. Genetik yatkınlık bildirilmiştir. HLA DR4, RA’e yatkınlık oluşturan genlerin başında gelmektedir. Birinci derece akrabalarında RA bulunan bir kişide hastalığa yakalanma riski 16 kat artmaktadır (Lightfoot ve ark., 1993).
Ankilozan spondilit (AS) primer olarak sakroiliyak eklemleri ve aksiyel iskeleti tutan sebebi bilinmeyen sistemik inflamatuvar bir hastalıktır. Hastalık genellikle sinsi başlangıçlı, istirahatte artan, aktiviteyle azalan bel ağrısı ve sabah tutukluğu ile ortaya çıkmaktadır. Genellikle alt ekstremite büyük eklemlerinin asimetrik tutulumu ile karakterize periferik eklem tutulumu da görülebilmektedir. Eklemler dışında bağırsak, deri, göz, akciğer tutulumu ve aortit olabilmektedir. Hastalığın prevalansı %0.2-1.4 olarak verilmektedir. Başlangıç yaşı ergenlikten genç erişkin yaşa kadar değişebilir. Erkekler 3 kat daha fazla etkilenir. Artmış sıklıkta ailesel birikim
bildirilmektedir. Hastaların %95’inde HLA B27 geni pozitiftir (Gümüşdiş ve ark., 2003).
Toplumda sıklıkla gözlenmesi ve her üç hastalığın oluşumunda inflamatuar olayların etkili olması ortak özellikleridir. Rabinovich ve arkadaşlarının RA hastalarında yaptığı bir çalışmada MEFV major mutasyonlarının sıklığı açısından kontrol grubu ile anlamlı bir fark bulunamamış ancak hastalığın şiddetini arttırdığı gözlenmiştir (Olgun ve ark., 2005).
Migita ve ark. nın Japonya’da RA hastalarında yaptığı bir çalışmada MEFV geni (M694I, R408Q, P369S, E148Q, L110P) mutasyonlarına bakılmış, ancak bir genetik risk factörü olarak anlamlı bulunmamıştır (Migita ve ark., 2008). Koca ve ark.nın yaptığı başka bir çalışmada ise RA hastaları ile kontrol grubu arasında bakılan MEFV geni mutasyonları açısından (E148Q, M694V, M694I, V726A ve P369S) anlamlı fark gözlenmemiştir (Koca ve ark. 2010). Ancak Kalyoncu ve ark.nın 2006 yılında yaptığı çalışmada gruplar arasında anlamlı fark bulunmuştur (Kalyoncu ve ark.,2006).
Durmuş ve ark.nın 2009 yılında yaptıkları çalışmada AS ve kontrol grubunda MEFV mutasyonları sıklığı açısından anlamlı fark bulmuştur (durmuş ve ark., 2009). Akkoç ve ark. 2010 yılında yaptıkları çalışmada AS’li hastalarda M694V mutasyonunu anlamlı derecede yüksek bulmuştur (Akkoç ve ark., 2010).
Bizim çalışmamızın sonuçlarına göre hem RA hemde AS hastalarında bakılan MEFV mutasyonlarının toplam sıklığı, kontrole göre anlamlı derecede yüksektir. Ancak AS’de özellikle M694V mutasyonu kontrol grubuna göre fazla çıksa da istatistiki açıdan anlamlı fark bulunamamıştır. Elde ettiğimiz bulgular doğrultusunda çalışılan MEFV geni (M694V, M680I, V726A, P369S, E148Q) mutasyonlarının varlığı ile AS ve RA arasındaki ilişkisi bu mutasyonların saptanmasının erken tanı ve tedavide yol gösterici olup olamayacağı tartışmasını daha anlamlı ölçüde gündeme getirmiştir.
6. KAYNAKLAR
Akar, N., Mısırlıoğlu, M., Yalçınkaya, F., Akar, E., Çakar, N., Tümer, N., Akçakuş, M., Taştan, H., Matzner, Y., 1999. MEFV mutations in Turkish patients suffering from familial Mediterranean fever. Hum Mutat, 288: 1-5.
Balci, B., Tinaztepe, K., Yilmaz, E., Gucer, S., Ozen, S., Topaloglu, R., Besbas, N., Ozguc, M., Bakkaloglu, A. (2002). MEFV gene mutations in familial Mediterranean fever phenotype II patients with renal amyloidosis in childhood: a retrospective clinicopathological and molecular study. Nephrol Dial Transplant. 17(11):1921-3.
Ben-Chetrit, E., Backenroth, R., 2001. Amyloidosis induced, end stage renal disease in patients with familial Mediterranean fever is highly associated with point mutations in the MEFV gene. Ann Rheum Dis. 60: 146-149
Akkoc, N., Sari, I., Akar, S., Binicier,O., Thomas, M. G., Weale, M. E., Birlik, M., Savran, Y., Onen, F., Bradman, N., Christopher A. Plaster, C. A., 2010. Increased
Prevalence of M694V in Patients With Ankylosing Spondylitis. Arthrıtıs &
Rheumatısm Vol. 62, No. 10, October 2010, pp 3059–3063 DOI 10.1002/art.27598.
Cazeneuve, C., Sarkisian, T., Pecheux, C., Dervichian, M., Nedelec, B., Reinert, P., Ayvazyan, A., Kouyoumdjian, J.D., Ajrapetyan, H., Delpech, M.,
Goossens, M., Dode, C., Grateau, G., Amselem, S. (1999). MEFV gene analysis in Armenian patiens with familial Mediterranean fever: diagnostic value and
unfavorable renal prognosis of the M694V homozygous genotype-genetic and therapeutic implications. Am J Hum Genet, 65: 88-97.
Cosan, F., Ustek, D., Oku, B., Duymaz-Tozkir, J., Cakiris, A., Abaci, N., Ocal, L.,
Aral, O., Gul, A., 2010. Association of Familial Mediterranean Fever–Related MEFV
Variations With Ankylosing Spondylitis. Arthrıtıs & Rheumatısm.
Durmus, D., Alayli, G.,, Cengiz , K., Yigit, S., Canturk, F., Bagci, H.,2009. Clinical significance of MEFV mutations in ankylosing spondylitis. Joint Bone Spine 76 (2009) 260e264.
Eisenberg, S., Aksentijevich, I., Deng, Z., Kastner, D.L., Matzner, Y., 1998. Diagnosis of familial Mediterranean fever by a molecular genetics method. Ann Intern Med, 129: 539-542.
Gersoni-Baruch, R., Kepten, I., Shinawi, M., Brik, R. (1999). Direct detection of Common mutations in the familial Mediterranean fever gene (MEFV) using naturally occuring and primer mediated restriction fragment analysis. Hum Mutat, 14(1): 91-94.
Gersoni-Baruch, R., Brik, R., Shinawi, M., Livneh, A. (2002). The differantial Contribution of MEFV mutant alleles to the clinical profile of familial Mediterranean fever: Eur J Hum Genet, 10(2): 145-149.
Gümüşdiş, G., Doğanavşargil, E., Gümüşdiş G (Eds),2003. Romatoid Artrit. Klinik Romatoloji. İzmir Güven Kitabevi, İzmir, S. 209-28.
Kalyoncu M, Acar BC, Cakar N, Bakkaloglu A, Ozturk S, Dereli E, Tunca M, Kasapcopur O, Yalcinkaya F, Ozen S. Are carriers for MEFV mutations "healthy"? Clin Exp Rheumatol 2006;24(5 Suppl 42):S120-2.
Koca SS, Etem EO, Isik B, Yuce H, Ozgen M, Dag MS, Isik A. Prevalence And significance of MEFV gene mutations in a cohort of patients with
rheumatoid arthritis. Joint Bone Spine 77 (2010) 32–35.
Lightfoot, R.W., Mc Carty, D.J., Koopman, W.J., 1993. Intermittent and Periodic Arthritic Syndroms. Arthritis and Allied Conditions. 2: 1121-1137.
Majeed, H.A., Al-Khateeb, M., El-Shanti, H., Rabaiha, Z.A, Tayeh M, Najib D., 2005. The Spectrum of familial Mediterranean fever Gene Mutations in Arabs: Report of Large Series. Semin Arthritis Rheum. 34:813–818.
Medlej-Hashim, M., Rawashdeh, M., Chouery, E., Mansour, I., Delague, V., Lefrance, G., Naman, R., Loiselet, J., Megarbane, A. (2000). Genetic screening of fourteen mutations in Jordanian familial Mediterranean fever patients. Hum Mutat, 15(4): 384- 390.
Migita K, Nakamura T, Maeda Y, Miyashita T, Koga T, Tanaka M, Nakamura M, Komori A, Ishibashi H, Origuchi T, Ida H, Kawasaki E, Yasunami M, Eguchi K. MEFV mutations in Japanese rheumatoid arthritis patients. Clin Exp Rheumatol 2008;26(6):1091-4.
Olgun A, Akman S, Kurt I, Tuzun A, Kutluay T. MEFV mutations in familial Mediterranean fever: association of M694V homozygosity with arthritis. Rheumatol Int 2005;25(4):255-9.
Ozen, S., Karaaslan, Y., Ozdemir, O., Saatci, U., Bakkaloglu, A., Koroglu, E.,Tezcan, S. 1998. Prevalence of juvenile chronic arthritis and familial Mediterranean fever in Turkey: a field study. J Rheumatol.25: 2445–2449.
Pras, E., Aksentijevich, I., Gruberg, L., Balow, J.E., Prosen, L., Dean, M., Richards, R.I., Pras, M., Kastner, D.L., 1992. Mapping of a gene cousing familial Mediterranean fever to the short arm of chromosome 16. N Eng J Med, 326:1509-513.
Rabinovich, E., Livneh, A., Langevitz, P., Brezniak, N., Shinar, E., Pras, M., Shinar, Y., 2005. Severe disease in patients with rheumatoid arthritis carrying a mutation in the Mediterranean fever gene. Ann Rheum Dis 2005;64:1009–1014. doi: 10.1136/ard.2004.029447.
Shohat, M., Magal, N., Shohat, T., Chen, X., Dagan, T., Mimouni, A., Danon, Y., Lotan, R., Ogur, G., Sirin, A., Schlezinger, M., Halperg, G., Schwabe, A.,
Kastner, D., Rotter, J.I., Fischel Ghodsian N. (1999). Phenotype-genotype correlation in familial Mediterranean fever: evidence for an association between Met694Val and amyloidosis. Eur J Hum Genet, 7: 287-292
The French FMF Consortium; 1997. Candidate gene for familial Mediterranean fever. Natur Genet, 17: 25-31.
The International FMF Consortium., 1997. Ancient missense mutations in a new member of the RoRet gene family are likely the cause familial Mediterranean fever. Cell, 90: 797- 807.
Touitou I., 2003. Standardized Testing for Mutations in FMF. Clinical Chemistry 49:11
Yalçınkaya, F., Çakar, N., Mısırlıoğlu, M., Tümer, N., Akar, N., Tekin, M., Taştan, H., Koçak, H., Özkaya, N., Elhan, A.H. (2000). Genotype-phenotype correlation in a large group of Turkish patients with familial Mediterranean fever: evidence for
mutation independent amyloidosis. Rheumatology, 39: 67-72.
Yalçinkaya, E., Güran, Ş., Nas, B. G., Dursun, A., Imirzalioglu, N., 2006. Ailesel Akdeniz Ateşi Ön Tanısı Alan Olgularda MEFV Gen Mutasyon Analiz Sonuçlarının Önemi. Erciyes Tip Dergisi (Erciyes Medical Journal) 28 (1) 019-024.
