Gökova Bölgesinde Eküvyon Tekni¤i ile Yüksek Oranda
Çevresel Cryptococcus neoformans ‹zolasyonu
High Environmental Isolation Rate of Cryptococcus neoformans
by Swabbing Technique in Gökova Region
Ça¤r› Ergin
Pamukkale Üniversitesi T›p Fakültesi T›bbi Mikrobiyoloji Anabilim Dal› Denizli ÖZET
Amaç: Cryptococcus neoformans, özellikle ba¤›fl›kl›¤› bask›lanm›fl konakta hayat› tehdit eden enfeksiyonlar oluflturan bazidiomiçet s›n›f›ndan kapsüllü bir maya mantar›d›r. Birçok ülkeden bildirilen raporlar›n aksine, Anadolu’da, Ege ve Akdeniz bölgesinde 1999-2010 y›llar› aras›nda yap›lan tekrarlayan taramalarda, kolonizasyon oda¤› olarak bildirilen Eucalyptus camaldulensis a¤açlar›ndan sadece bir C. neoformans kökeni izole edilmifltir. Bu çal›flma Gökova-Akçap›nar bölgesinde farkl› yöntemle tarama yapmak amac›yla yap›lm›flt›r.
Gereç ve Yöntem: Bu araflt›rmada çevresel tarama, 2003 y›l›nda sadece bir kökenin izole edilebildi¤i Gökova-Akçap›nar bölgesinde yap›lm›fl ve tarama için eküvyon tekni¤i kullan›lm›flt›r. Araflt›rma alan› içinde yaklafl›k 1400 E. camaldulensis a¤ac› bulundu¤u ve sadece 17 a¤aç üzerinde büyük kovuk oldu¤u saptanm›flt›r. Bu kavuklardan eküvyonla al›nan örnekler kloramfenikol ve bifenil içeren Staib agar besiyerine ekilmifl ve C. neoformans varl›¤›na bak›lm›flt›r.
Bulgular: C. neoformans kolonizasyonu 2008 y›l›nda 11 a¤açta (11/17; %64.7), 2009 y›l›nda 7 a¤açta (7/11; %63.6) bulunmufl ve ortalama koloni say›s›n›n 35±9.7 koloni/eküvyon oldu¤u saptanm›flt›r.
Sonuç: Anadolu’da Gökova bölgesi bir "s›cak nokta"d›r. Geleneksel yöntemler ile negatif sonuçlar›n al›nd›¤› bölgelerdeki çevresel taramalar için eküvyon yönteminin seçilmesi önerilebilir.
Anahtar Kelimeler: Cryptococcus neoformans, Eucalyptus camaldulensis, eküvyon tekni¤i SUMMARY
Objective: Cryptococcus neoformans which belongs to the class Basidiomycetes is an encapsulated yeast that is among the most prevalent agents of life-threatening fungal infections especially in immunsupressed individuals. Contrary to the reports from many countries, only one C. neoformans has been isolated from Eucalyptus camaldulensis as a niche for the yeast, in Mediterranean and Aegean region of Anatolia by consecutive studies reported between 1999-2010.
Materials and Methods: In this study, swabbing technique was used for environmental screening of C.neoformans in Gökova-Akçap›nar region where only one strain of C. neoformans has been isolated in the area in 2003. The present research was carried out with approximately 1400 living E. camaldulensis trees. Only 17 large tree trunk hollows were found. Their swabbing samples have been cultured by Staib agar with antibiotic and biphenyl supplement.
Results: C. neoformans colonization was found as 11/17 (64.7%) and 7/11 (63.6%) in tree trunk hollows in 2008 and 2009, respectively. Mean colony counts were 35.0±9.7 per swab.
Conclusion: Gökova region is a "hot spot" for C. neoformans in Anatolia. It was postulated that swabbing methods should be chosen for environmental sampling of tree trunk hollows even in the areas with repeated negative results by conventional sedimentation technique.
G‹R‹fi
Cryptococcus neoformans; do¤ada kolonize olan, insana hava yolu ile bulaflan, özellikle ba-¤›fl›kl›k sistemi bask›lanm›fl konakta enfeksiyon etkeni olan bazidiomiçet s›n›f›ndan kapsüllü bir maya mantar›d›r. Mikroklimatik ortam›n olufltu-¤u büyük a¤açlar›n üzerindeki genifl kovuklarda da kolonize olabildi¤i, 1990 y›l›ndan itibaren çok say›da rapor ile bildirilmifltir. Eucalyptus camaldulensis Dehn mayan›n kolonizasyonu-nun ilk tan›mland›¤› ve en yayg›n taramalar›n yap›ld›¤› a¤aç türüdür. Bu ortamlarda yüksek say›da bulunan sporlar, solunum havas›na kar›fl-makta, hayvan ve insanlarda kriptokokkoza ne-den olmaktad›r (1,2). C. neoformans, ayn› cins içinde bulunan C. gattii ile ekolojik benzer ya-y›l›ma sahiptir. Bu iki tür maya mantar› Dünya co¤rafyas› üzerinde genellikle birlikte yay›l›m gösterir. E. camaldulensis’de dahil olmak üzere birçok odunsu yap›dan, her iki tür kriptokok da izole edilebilmifltir (3-6).
Türkiye’de, özellikle Ege ve Akdeniz bölgeleri okaliptüs a¤açlar›n›n bulundu¤u bölgelerdir ve mayan›n kolonizasyonu ile ilgili çevresel tara-malar bu bölgelerde yap›lm›flt›r (7-11). Türki-ye’nin de içinde bulundu¤u Do¤u Akdeniz hav-zas›, Dünya’n›n di¤er bölgelerinden bildirilen s›k kolonizasyonun aksine çevresel C. neofor-mans’›n izolasyonunun s›kl›kla yap›lamad›¤› bir bölgedir (8,12). Yap›lan yo¤un taramalara ra¤men sadece bir köken C. neoformans, Göko-va körfezinde, Marmaris-Fethiye-Mu¤la yol kavfla¤›nda bulunan E. camaldulensis a¤açlar›n-dan 2004 y›l›nda izole edilmifltir (7). ‹zolasyon, çok say›da yay›nla desteklenen canl› a¤açlar›n kovuklar›ndan yap›lamazken çiçek, operkulum ve kapsül yap›lar›n› içeren döküntü örneklerin-den olmufltur. Mayan›n yüksek izolasyon oran›-na sahip oldu¤u bölgelerde dahi a¤ac›n alt›nda-ki döküntülerden yap›lan taramalarda
izolasyo-nun az olabilece¤i bildirilmektedir (13). 2008 y›l›nda, daha önceki yöntemden farkl› olarak eküvyon yöntemi ile örnekleme Çukurova böl-gesinde kullan›lm›fl, ancak C. neoformans izole edilememifltir (8). Eküvyon tekni¤inin literatür-de daha yüksek izolasyon oran›na sahip oldu¤u öne sürülmektedir (3,14). Sunulan araflt›rmada, eküvyon tekni¤i Gökova-Akçap›nar bölgesi E. camaldulensis a¤açlar›nda yap›lan çevresel C. neoformans ve C. gattii taramas›nda kulla-n›lm›flt›r.
MATERYAL VE METOT
Bu araflt›rma, 2004 y›l›nda, E. camaldulensis a¤açlar›n›n operkulum ve kapsül örneklerinden bir tane C. neoformans izolasyonunun yap›ld›¤› Gökova-Akçap›nar bölgesinde yürütüldü. Gökova körfezinde Akyaka-Akçap›nar yolu üzerinde, [37" 03’ 14 Kuzey, 28" 21’ 33 Do¤u] ile [37" 01’ 37 Kuzey, 28" 21’ 32 Do¤u koordi-natlar› aras›nda] yaklafl›k 1400 E. camaldulensis bulunan bölge çal›flma alan› olarak seçildi. Örnek al›mlar› 13.07.2008 ve 23.08.2009 tarih-lerinde yap›ld›. 2008 y›l›nda bölgede üzerinde büyük kovuk (en az 5 litre hacimde) bulunan 17 a¤aç saptan›rken, 2009 y›l›nda baz› kovuklu a¤açlar›n köylüler taraf›ndan kesilerek kullan›lma-s› nedeni ile 11 kovuklu a¤aç saptand›. Her iki seferde de bu a¤açlardan Randhawa ve arkadafl-lar› (14) taraf›ndan önerilen eküvyon tekni¤i ile örnekler al›nd›. K›saca; 50-60 cm uzunlu¤unda bambu çubuklar› ile haz›rlanm›fl steril ekivyonlar serum fizyolojik ile ›slat›ld›. Tek eküvyon ile bir a¤açtaki kovu¤un çeflitli bölgelerinden sü-rüntü örne¤i al›nd›. Eküvyonun pamuklu k›sm› 2ml steril %0.9 NaCl içine bat›r›lm›fl olarak ayn› gün içinde oda ›s›s›nda laboratuvara ulaflt›r›ld›. Örnek ayn› eküvyon yard›m›yla içinde %0.1 g/L bifenil (Sigma B6890) ve 50 µg/ml kloramfenikol bulunan Staib agar besiyerine
ekildi. Oda ›s›s›nda iki hafta süre ile inkübe edildi. Ekim plaklar›, koloni mikroskobu ile de-¤erlendirildi. Koloni mikroskobu; Staib agar içinde bifenil ile inhibe edilemeyen özellikle zi-gomiçet s›n›f› gibi küflerin h›zl› bir flekilde ya-y›lmas›ndan daha önce ç›plak gözle görüleme-yen pigmentli kolonilerin saptanmas› amac› kullan›ld›. S tipi morfolojide, kahverengi pig-ment yapan koloniler Gram boyama yöntemi, 37°C’da üreyebilme, üreaz aktivitesi varl›¤›, m›s›r unlu agarda hif gelifltirememe ve kanava-nin-glisin-bromtimol (CGB) agar besiyeri reak-siyonlar› ile de¤erlendirildi. CGB agar besiyeri C. neoformans ve C. gattii ay›rmak için kulla-n›ld›. C. gattii, kanavanin direnci sonucunda, glisin varl›¤› ile üreyebilmesi ve besiyerini sar›-ya çevirmesi ile C. neoformans’dan ayr›ld› (14).
BULGULAR
Bu taramada; 13.7.2008 tarihinde 17 kovuklu E. camaldulensis a¤ac›ndan al›nan örneklerin 11 (%64.7)’inde; 23.08.2009 tarihinde 11 kovuklu E .camaldulensis a¤ac›ndan al›nan örneklerin 7 (%63.7)’sinde C. neoformans izolasyonu yap›ld›. 2008 ve 2009 y›l›nda ayn› yedi a¤açta kolonizas-yon saptanm›flt›r. Üreme olan örnekler için 2008 y›l›nda 22±4.3 koloni/eküvyon izolasyonu yap›l›rken; 2009 y›l›nda 55.4±22.8 koloni/eküvyon izolasyonu yap›ld›. Y›llara göre de¤iflen bu izolas-yon oranlar› istatistiksel olarak farkl› bulunmad› (Mann-Whitney U; p>0.05). Üreme saptanan tüm örnekler göz önüne al›nd›¤›nda C. neoformans yo¤unlu¤u 35.0±9.7 koloni/eküvyon’dur.
Yap›lan örneklemelerde C. gattii varl›¤›na rast-lanmam›flt›r.
TARTIfiMA
Dünya’da okaliptüs a¤açlar›ndan yap›lan tara-malarda bildirilen C. neoformans ve C. gattii
izolasyon oranlar› çok de¤iflkendir (3-6, 12,14). Ülkemizde E .camaldulensis a¤açlar›ndan yap›-lan taramalarda Gökova-Akçap›nar bölgesi d›-fl›nda C. neoformans izole edilememifltir (7-11). Sunulan araflt›rmada ise bir sene ara ile ayn› bölgede yap›lan iki örneklemede ayn› a¤açlarda kolonizasyon gösterilmifl, flimdiye kadar ülke-mizde yap›lan taramalardaki en yüksek izolas-yon oran› elde edilmifltir. Bu araflt›rmada da ül-kemizde do¤adan yap›lan di¤er taramalara ben-zer flekilde C. gattii izole edilememifltir.
Araflt›rman›n yap›ld›¤› Gökova-Akçap›nar gesinde E. camaldulensis a¤açlar› batakl›k böl-gelerin d›fl›nda, çevre güzellefltirme amac› ile dikilmifllerdir. Bu bölge, Mersin-Adana’da, Berdan Çay› batakl›¤›n›n kurutulmas› amac›yla, 1885 y›l›nda Cezayir’den ithal edildi¤i düflünü-len E. camaldudüflünü-lensis tohum ve fidanlar›n›n, faz-lalar›n›n Gökova bölgesine gönderilmesi ile oluflturulmufltur (15). Ad› geçen bölgedeki Ber-dan çay› kurutulmas› ifllemi, bugün için Tarsus Do¤u Akdeniz Araflt›rma Enstitüsü Karabucak Orman ‹flletmesi okaliptoryumu olarak devam etmektedir. Karabucak bölgesinde son 10 y›l içinde iki farkl› yöntemle yap›lan, üç ayr› çal›fl-mada da, bölgeden C. neoformans izolasyonu yap›lamam›flt›r (7-9).
Ülkemizdeki taramalarda a¤aç kovuklar›ndan ve çevresel örneklerden az say›da izolasyonun nedeni aç›klanamam›flt›r. Çevresel antifungal maddelerin varl›¤›n›n olabilece¤i, çevresel pH ve topra¤›n di¤er kimyasal özellikleri, a¤ac›n genetik farkl›l›klar›ndan kaynaklanabilecek kimyasal yap› de¤iflimleri bu konuda belirgin bir sonuç oluflturamam›flt›r (8,16,17). Bu sonuç hem C. neoformans hem de C. gattii için de¤iflme-mifltir (17). Benzer flekilde, C. neoformans’›n çevresel kolonizasyonunda di¤er önemli bir çevresel odak olarak bilinen güvercin d›flk›la-r›ndan da izolasyon yap›labilmektedir, ancak
baz› bölgelerimizde bu izolasyon oranlar› bek-lenenden daha azd›r (8,18,19). Bu durum ile Do¤u Akdeniz ülkelerinden Ürdün’de de karfl›-lafl›l›rken, M›s›r’da a¤açlardan ve güvercin d›fl-k›s› ile kontamine ortamlardan C. neoformans üremesine s›k olarak rastlanm›flt›r (5,12). Bu sonuç, ülkemizde risk ortamlar›nda çevresel C. neoformans’›n kolonizasyonuna engel teflkil eden bir faktörün varl›¤›n› düflündürmektedir. Çevresel faktörlerin özellikle ba¤›l nem, s›cak-l›k, buharlaflma ve solar radyasyonun çevresel kolonizasyonda belirleyici etmenler oldu¤u belirtilmifltir (4,20). Do¤ada varl›¤›n› sürdüren C. neoformans’›n a¤açlarda kolonize olmas›n›n, efleyli üreme yaflam siklusunda önemli bir basa-mak oldu¤u ileri sürülmektedir (21). Hindis-tan’da farkl› co¤rafi bölgelerden ve farkl› a¤aç-lardan izole edilen C. neoformans kökenlerinin araflt›r›ld›¤› bir çal›flmada; düflük nitrojen kay-na¤›, düflük nem ve uygun s›cakl›klarda, karfl›t efllenik tiplerin varl›¤›n›n basidiosporlanma için yeterli oldu¤u bildirilmifltir. Ancak hangi fak-törlerin bu olay› tetikledi¤i aç›klanamam›fl, do-¤ada C. neoformans’›n efleyli ço¤almas›n›n yüksek oldu¤u "s›cak bölgeler" bulundu¤u hi-potetik olarak ileri sürülmüfltür (22). Ülkemizde farkl› a¤aç kovuklar›ndan yap›lan taramalarda, sadece iki farkl› türden [Do¤u ç›nar› (Platanus orientalis) ve bir nar (Punica granatum) a¤ac›n-dan] az say›da koloni izole edilebilmifltir (23). Ayn› bölge ve çevresindeki E. camaldulensis a¤açlar›ndan ise izolasyon yap›lamam›flt›r an-cak ayn› bölge de güvercinliklerde C. neofor-mans varl›¤› gösterilmifltir (11,19). Daha yafll› ve büyük kovuklar›n bulundu¤u, Anadolu’da farkl› co¤rafyalarda, farkl› yükseklik ve iklim koflullar›nda bulunan an›t a¤açlardan taramalar-da ise C. neoformans izole edilememifltir (24). Sonuç olarak; sunulan araflt›rmada elde edilen yüksek izolasyon oran›, Gökova-Akçap›nar
böl-gesinin ülkemiz için, Nawange ve arkadafllar› (22) taraf›ndan tan›mland›¤› flekilde "s›cak nok-ta" oldu¤unu hipotetik olarak desteklemektedir. Ülkemizde yap›lacak olan çevresel C. neofor-mans kolonizasyon taramalar›nda, eküvyon ile örnek alma tekni¤inin tercih edilmesi, izolasyon oran›n› yükseltecek, insan sa¤l›¤› için tehdit oluflturacak bölgelerin saptanmas›n› kolaylaflt›-racakt›r. Efl zamanl› olarak C.gattii varl›¤›n›n da taranmas›, bu mayan›n ekolojisinin araflt›r›lmas› ve henüz bilinmeyen do¤ada yay›l›m›n›n belir-lenmesi aç›s›ndan önemlidir.
‹letiflim / Correspondence Ça¤r› Ergin
Pamukkale Üniversitesi T›p Fakültesi T›bbi Mikrobiyoloji Anabilim Dal› Denizli
Tel: 0258 2962536 e-mail: cagri@pau.edu.tr
Kaynaklar
1. Lin X, Heitman J. The biology of the Cryptococcus neoformans species complex. Ann Rev Microbiol 2006; 60:69-105.
2. Ribeiro AM, Silva LK, Schrank IS, Schrank A, Meyer W, Vainstein MH. Isolation of Cryptococcus neoformans var. neoformans serotype D from Eucalypts in South Brazil. Med Mycol 2006; 44:707-13.
3. Refojo N, Perrotta D, Brudny M, Abrantes R, Hevia AI, Davel G. Isolation of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii from trunk hollows of living trees in Buenos Aires City, Argentina. Medical Mycology 2009; 47:177-84.
4. Randhawa HS, Kowshik T, Chowdhary A, et al. The expanding host tree species spectrum of Cryptococcus gattii and Cryptococcus neoformans and their isolations from surrounding soil in India. Med Mycol 2008; 46:823-33.
5. Mahmoud YA. First environmental isolation of Cryptococcus neoformans var. neoformans and var. gatti from the Gharbia Governorate, Egypt. Mycopathologia 1999; 148:83-6.
6. Mseddi F, Sellami A, Jarboui MA, Sellami H, Makni F, Ayadi A. First environmental isolations of Crypto-coccus neoformans and CryptoCrypto-coccus gattii in Tunisia and review of published studies on environmental isolations in Africa. Mycopathologia 2011; 171:355-60.
7. Ergin Ç, ‹lkit M, Hilmio¤lu S, et al. The first isolation of Cryptococcus neoformans from Eucalyptus trees in South Aegean and Mediterranean regions of Anatolia despite Taurus Mountains alkalinity. Mycopathologia 2004; 158:43-7.
8. ‹lkit M, Atefl A, Biçer AT, Yula E. Environmental study of Cryptococcus neoformans in and around Adana, Turkey. Ann Microbiol 2006; 56:97-9.
9. Atefl A, Biçer AT, ‹lkit M. Sedimentasyon ve eküvyon yöntemleri ile okaliptüs a¤açlar›nda Cryptococcus spp. varl›¤›n›n araflt›r›lmas›. Mikrobiyol Bul 2008; 42:655-60. 10. Derici YK, Tümbay E. ‹zmir ilinde do¤al ve klinik Cryptococcus neoformans kökenlerinin varyete ve serotipleri. ‹nfeksiyon Dergisi 2008; 22:53-8.
11. Erdem F, Ak›dan M, Duman B, Ergin Ç. Denizli-Karahay›t bölgesindeki Eucalyptus camaldulensis a¤açlar›ndan Cryptococcus neoformans varl›¤›n›n araflt›r›lmas›. Pam T›p Derg 2009; 2:134-6.
12. Hamasha AM, Y›ld›ran fiT, Gönlüm A, Saraçl› MA, Do¤anc› L. Cryptococcus neoformans varieties from material under the canopies of eucalyptus trees and pigeon dropping samples from four major cities in Jordan. Mycopathologia 2004; 158:195-9.
13. Gugnani HC, Mitchell TG, Litvintseva AP, et al. Isolation of Cryptococcus gattii and Cryptococcus ne-oformans var. grubii from the flowers and bark of Eucalyptus trees in India. Med Mycol 2005; 43:565-9. 14. Randhawa HS, Kowshik T, Khan ZU. Efficacy of
swabbing versus a conventional technique for isolation of Cryptococcus neoformans from decayed wood in tree trunk hollows. Med Mycol 2005; 43:67-71. 15. Adal› F. Sa¤l›k a¤ac› okaliptus. ‹stanbul, Ziraat Vekâleti
Neflriyat Müdürlü¤ü, 1944.
16. Ergin Ç, fiengül M, Kaleli ‹, Gürbüz M. Eucalyptus debris küf mantar› floras›nda antikriptokokkal aktivitenin araflt›r›lmas›. Turk Mikrobiyol Cem Derg 2005; 35:256-9.
17. Ergin Ç, fiengül M, Kaleli ‹, Mete E. Güney-Bat› Anadolu kökenli ökaliptüs s›v› besiyerlerinde Cryptococcus neoformans ve Cryptococcus gattii serotiplerinin üreme dinamikleri. Turk Mikrobiyol Cem Derg 2007; 37:94-7. 18. Y›ld›ran fiT, Saraçl› MA, Gönlüm A, Gün H. Isolation
of Cryptococcus neoformans var. neoformans from pigeon droppings collected throughout Turkey. Med Mycol 1998; 36:391-4.
19. Pelek fi, Alt›nkaya S, Korkmaz UB, Ergin Ç. Denizli flehir merkezi’nde güvercin (Columba livia) ç›kart›lar›nda Cryptococcus neoformans varl›¤›n›n araflt›r›lmas›. Pam T›p Derg 2011; 4:21-4.
20. Granados DP, Castañeda E. Influence of climatic conditions on the isolation of members of the Cryptococcus neoformans species complex from trees in Colombia from 1992-2004. FEMS Yeast Res 2006; 6:636-44.
21. Xue C, Tada Y, Dong X, Heitman J. The human fungal pathogen Cryptococcus can complete its sexual cycle during a pathogenic association with plants. Cell, Host & Microbe 2007; 1:263-73.
22. Nawange SR, Shakya K, Naidu J, Singh SM, Jharia N, Garg S. Decayed wood inside hollow trunks of living trees of Tamarindus indica, Syzygium cumini and Mangifera indica as natural habitat of Cryptococcus neoformans and their serotypes in Jabalpur City of Central India. J Med Mycol 2006; 16:63-71.
23. Ergin Ç, Kaleli ‹. Denizli flehir merkezinde kovuklu a¤aç gövdelerinden Cryptococcus neoformans izolasyonu. Mikrobiyol Bul 2010; 44:79-85.
24. Atefl A, Ergin Ç, ‹lkit M. Anadolu an›t a¤açlar›nda Cryptococcus neoformans’›n araflt›r›lmas›. ‹nfeks Derg 2006; 20:57-60.
