Turkish Journal of Agriculture - Food Science and Technology
Available online, ISSN: 2148-127X | www.agrifoodscience.com | Turkish Science and TechnologyThermal Resistance of Acid Adapted and Non-Adapted Stationary Phase
Escherichia coli O157:H7, Salmonella enterica Typhimurium and Listeria
monocytogenes in Pomegranate Juice
Zeynal Topalcengiz1,a,*, Sefa Işık2,b, Yusuf Alan3,c
1Department of Food Engineering, Faculty of Engineering and Architecture, Muş Alparslan University, 49250 Muş, Turkey 2Department of Food Processing, Vocational School of Technical Sciences, Muş Alparslan University, 49250 Muş, Turkey 3
Department of Primary Education, Faculty of Education, Muş Alparslan University, 49250 Muş, Turkey * Corresponding author A R T I C L E I N F O A B S T R A C T Research Article Received : 14/02/2019 Accepted : 04/07/2019
The purpose of this study was to investigate the thermal resistance of acid adapted and non-adapted stationary phase Escherichia coli O157:H7, Salmonella enterica Typhimurium and Listeria
monocytogenes in pomegranate juice. In addition, the performance of generic E. coli was evaluated as an
indicator. Non-adapted stationary phase cells were grown by incubating inoculated tryptic soy broth without glucose (TSB-NG) at 36±1°C for 18±2 hours. Tryptic soy broth with 1% glucose (10 g/l; TSBG) was used for acid adaptation. All media used for L. monocytogenes was supplemented with 0.6% yeast extract. After washing the cells with peptone, 5 ml of pasteurized pomegranate juice was added onto the pellet to obtain inoculated juice with a initial concentration of 107
-1010
log CFU/ml. Inoculated pomegranate juice was sealed into the microcapillary tubes. Microtubes were heat treated in waterbaths at 50, 52 and 54±1°C by immersing at pre-determined time intervals. Survived populations were counted on tryptic soy agar (TSA). S. Typhimurium had the lowest thermal resistance in pomegranate juice. At 50°C,
E. coli O157:H7 was the most resistant, whereas L. monocytogenes was more thermally tolerant at 52 and
54°C. Acid adaptation decreased the thermal resistance of E. coli O157:H7, but increased the heat resistance of L. monocytogenes at all tested temperatures significantly. Thermal tolerance of S. Typhimurium increased only at 50°C. The most resistant microorganism was non-adapted generic E. coli at 50 and 52°C; acid-adapted L. monocytogenes had the most thermal tolerance at 54°C. Thermal inactivation of microorganisms in pomegranate juice could be tested at lower temperatures compare to other fruit juices. This may be due to the natural antimicrobial effect and more acidic content of pomegranate juice. Keywords: Acid Adaptation Thermal resistance Escherichia coli Salmonella Listeria Pomegranate Juice
Türk Tarım – Gıda Bilim ve Teknoloji Dergisi 7(7): 1000-1007, 2019
Aside Adapte ve Adapte Olmayan Durağan Faz Escherichia coli O157:H7, Salmonella
enterica Typhimurium ve Listeria monocytogenes’in Nar Suyundaki Termal Direnci
M A K A L E B İ L G İ S İ Ö Z
Araştırma Makalesi
Geliş : 14/02/2019 Kabul : 04/07/2019
Bu çalışmada, aside adapte olan ve adapte olmayan durağan faz Escherichia coli O157:H7, Salmonella
enterica Typhimurium ve Listeria monocytogenes’in nar suyundaki termal dirençleri incelenmiştir.
Ayrıca, jenerik E. coli’nin gösterge mikroorganizma olarak performansı değerlendirilmiştir. Aside adapte olmayan durağan faz hücreler şeker içermeyen tryptic soy broth’da (TSB-NG) 36±1°C’de 18±2 saat inkübe edilerek elde edilmiştir. Asit adaptasyonu için %1 glukoz içeren tryptic soy broth (10 g/l; TSBG) kullanılmıştır. L. monocytogenes için kullanılan besiyerleri %0,6 yeast ekstraktla desteklenlmiştir. Hücreler peptonlu su ile yıkandıktan sonra, 5 ml pastörize nar suyu pellet üzerine eklenerek 107-109 log
CFU/ml konsantrasyonunda inoküle nar suyu elde edilmiştir. İnoküle edilmiş nar suyu, mikrokapilar tüp içine mühürlenmiştir. Mikrotüpler 50, 52 ve 54±1°C’deki önceden belirlenmiş zaman aralıklarında su banyolarına batırılarak ısıl işlem uygulanmıştır. Canlı kalan bakteri popülasyonları tryptic soy agar (TSA) üzerinde sayılmıştır. S. Typhimurium nar suyunda en düşük termal direnci göstermiştir. Düşük sıcaklıklarda E. coli O157:H7 ısıl işleme karşı daha dirençliyken, yüksek sıcaklıklarda L. monocytogenes daha fazla termal tolerans göstermiştir. Asit adaptasyonu, E. coli O157:H7’nin direncini azaltırken, S. Typhimurium’un 50°C’de, L. monocytogenes’in ise bütün sıcaklıklarda termal inaktivasyon süresini artırmıştır. Aside adapte olmayan jenerik E. coli 50 ve 52°C’de, aside adapte L. monocytogenes 54°C’de uygulanan ısıl işleme en dayanıklı olan mikroorganizma olmuştur. Nar suyu için elde edilen termal inaktivasyon süreleri diğer meyve sularına göre daha düşük sıcaklıklarda test edilebilmiştir. Bunun sebebi olarak nar suyunun doğal antimikrobiyal etkisi ve diğer meyve sularına oranla daha asidik olmasından kaynaklandığı düşünülmektedir. Anahtar Kelimeler: Asit Adaptasyonu Termal direnç Escherichia coli Salmonella Listeria Nar suyu
a [email protected] http://orcid.org/0000-0002-2113-7319 b [email protected] https://orcid.org/0000-0002-1480-7230 c
[email protected] https://orcid.org/0000-0003-0007-0212
1001 Giriş
Nar (Punica granatum L.) taze olarak tüketilebildiği gibi meyve suyu, meyve suyu konsantresi, jöle ve reçel gibi çeşitli ürünlere işlenerek de tüketilebilmektedir (Cemeroğlu ve Artık, 1990; Saxena ve ark., 1987). Nar suyunun zengin fenolik içeriğe sahip olması ve dolayısıyla sağlık üzerindeki pozitif etkileri bilinçlenen tüketicinin bu ürüne olan ilgisini artırmaktadır. Özellikle, nar suyunda bulunan fenolik bileşikler ve antosiyaninlerin antioksidan özelliklerinden dolayı sağlık üzerindeki olumlu etkileri bilimsel çalışmalarla kanıtlanmıştır (Aviram ve ark., 2000; Aviram ve Dornfeld, 2001; Aviram ve ark., 2004; Gil ve ark., 2000; Seeram ve ark., 2008; Zarfeshany ve ark., 2014). Son yıllarda, pastörize %100 nar suları Türkiye ve birçok ülkede çeşitli markalar ile raflardaki yerlerini almaktadır.
Gıda üretiminin tüm aşamalarında gıda kaynaklı patojenler, pH, sıcaklık ve ozmotik stres gibi çeşitli stres faktörleriyle karşılaşmaktadırlar. Patojenler bu stresli koşullara dayanmak ve hayatta kalmak için koruyucu mekanizmalar geliştirmektedirler (Mazzotta, 2001). Bazı gıda kaynaklı patojen türleri asit adaptasyonu sayesinde asidik koşullardan korunabilmektedir. Escherichia coli O157:H7, Salmonella türleri ve Listeria monocytogenes gibi gıda kaynaklı patojenlerin asit adaptasyon sistemleri geliştirip çapraz korumayla yüksek sıcaklık gibi çevresel etkenlere karşı daha dayanıklı hale gelebildikleri belirlenmiştir (Ryu ve Beuchat, 1998; Haberbeck ve ark., 2017; Ryu ve ark., 1999). Asit adaptasyonunun, E. coli O157:H7, E. coli O111, Salmonella türleri ve L.
monocytogenes’in termal dirençlerinin başka bir ifadeyle
desimal azalma sürelerinin (D-değerlerinin), elma, portakal, beyaz üzüm, karışık meyve suları, kavun ve karpuz sularında artırdığı tespit edilmiştir (Mazzotta, 2001; Ryu ve Beuchat, 1998; Sharma ve ark., 2005; Topalcengiz ve Danyluk, 2017; Usaga ve ark., 2014). Sonuç olarak asit adaptasyonu gıda kaynaklı patojenlerin inaktivasyonunu zorlaştıran bir sebep olmaktadır.
Meyve sularının kanıtlanmış birçok toplu gıda zehirlenmelerine neden olduğu rapor edilmiştir (CDC, 2014; Danyluk ve ark., 2012; Vojdani ve ark., 2008). Zehirlenmelere başlıca Salmonella türleri, E. coli O157:H7, E. coli O111, ve Crytosporidium’un sebep olduğu bildirilmektedir. Meyve sularında, L.
monocytogenes kaynaklı toplu zehirlenme olayı
görülmemiştir (CDC, 2015; Vojdani ve ark., 2008). Ancak,
L. monocytogenes’in doğal olarak yaygın bir şekilde
doğada bulunması, meyve sularında risk faktörü olarak görülmesine neden olmaktadır. Patojenlerin inaktivasyonu genellikle ısıl işlem ile yapılmaktadır. Amerikan İlaç ve Gıda Bakanlığı meyve suyu işletmelerinde, bir mililitre meyve suyundaki ilgili patojen sayısının 5-Log (100,000 kat) azaltılması için gerekli ısıl işlemin uygulanmasını şart koşan Hazard Analysis Critical Control Points (HACCP) uygulamasını 2001 yılında yayınlamıştır (FDA, 2001). İlgili patojen popülasyonunun 5-Log azalmayı sağlamak için gerekli minimum pastörizasyon parametresi 71,1°C’de 3 saniye olarak belirlenmiştir (Mazzotta, 2001). Gıda, Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı (GTHB, 2011) tarafından yayınlanan Türk Gıda Kodeksi Mikrobiyolojik Kriterler Yönetmeliğinde, pastörize meyve suyunun 25 ml’sinde ilgili patojenlerin bulunmaması şartı koşulmuştur.
Son on yıllık süreçte patojenlerin çeşitlli meyve sularında ki termal direnci üzerine önemli çalışmalar yapılmıştır (Enache ve ark., 2011; Gabriel ve ark., 2015; Gabriel ve Nakano, 2011; Topalcengiz ve Danyluk, 2017; Topalcengiz, 2019; Usaga ve ark., 2014) Patojenlerin termal toleransı, ortamın formülasyonuna, toplam kuru madde oranına, asitliğine ve su aktivitesi de dahil olmak üzere gıdaların fizikokimyasal özelliklerine bağlı olarak değişmektedir (Doyle ve Mazotta, 2000). E. coli O157:H7’nin ısı direnci, elma suyunda çözünür katı maddenin 11,8 ile 16,5 °Brix arasında artırılmasından etkilenmemiştir. Ancak, 52°C’de malik, sorbik ve benzoik asit ilavesi sonucunda pH’nın 4,4’ten 3,6’ya düşmesi E.
coli’nin ısıl direncini etkilemiştir (Splittstoesser ve ark.,
1996). Nar suyu ve diğer meyve parçalarından elde edilen madde ve ekstraktların antibiyotik etkilere sahip olduğu bildirilmektedir (Jayaprakasha ve ark., 2006). Meyve suyunun içeriği termal inaktivasyon parametrelerini doğrudan etkilemektedir.
Meyve suları gibi asidik gıdaların zehirlenmelere yol açtığının ispatlanması ile bu gıdaların güvenliği sorgulanmaya başlanmıştır. Nar suyu birçok meyve suyu gibi asidik gıdalar kategorisindedir. Asit adaptasyonu patojenlerin termal toleranslarını artırmaktadır. Gıda kaynaklı patojenlerin asidik gıda kategorisinde olan nar suyundaki termal inaktivasyonu ile ilgili güncel çalışma bulunmamaktadır. Meyve suyu pastörizasyonunda, prosesin başarısı, yeterli ısıl işlem zamanına ve pastörizasyon sıcaklığına bağlıdır. Bu çalışmanın amacı aside adapte ve adapte olmayan şiga toksin üreten E. coli O157:H7’nin, Salmonella enterica Typhimurium ve L.
monocytogenes’in nar suyundaki termal inaktivasyon
değerlerinin belirlenerek karşılaştırılmasıdır. Materyal ve Yöntem
Nar Suyu
Aynı parti numarası ve markaya sahip yüzde yüz nar suları piyasadan pastörize şekilde alınıp aseptik olarak steril santrifüj tüplerine doldurularak -20°C’de saklanmıştır. Deney gününde santrifüj tüpündeki nar suyu dondurucudan alınarak analizlerde kullanılması için oda sıcaklığında çözündürülmüştür. Nar suyunun pH ve suda çözünür kuru madde (°Brix) özellikleri pH metre (HACH, HQ30d Portable Multi Meter, CO, USA) ve otomatik bir refraktometre (Index Instrument, PTR 2a, USA) ile ölçülmüştür.
Bakteri Suşları ve İnokülümün Hazırlanması
Bu çalışmada birer adet jenerik E. coli (ATCC 35218), E.
coli O157:H7 (ZT10; gıda izolatı), Salmonella enterica
serotip Typhimurium (ATCC 14028; 1999 yılında Amerika Birleşik Devletleri’nde portakal suyundan zehirlenmeye sebep olan izolat) ve Listeria monocytogenes serotip 4b suşu (ATCC 19115; insan izolatı) kullanılmıştır. Bakteri suşları aside adapte ve aside adapte olmayan suşlar olmak üzere iki grup olarak incelenmiştir. Donmuş kültürler (-20°C), tryptic soy agar (TSA; Biolife; Milan, Italy) üzerine ekilmiş 36±2°C’de 24 saat inkübasyona bırakılarak aktive edilmiştir. Aktif kültürlerden birer koloni glukoz içermeyen ve %1 (10 g/l) glukoz içeren 10 ml tryptic soy broth’a (TSB-NG ve TSBG; Neogen; Lanchashire, UK) inoküle edilmiştir. Asit
adaptasyonu Buchanan ve Edelson (1996)’ın tarif ettiği şekilde %1 saf glukozun (10 g/l) TSB’ye eklenerek glukozun fermantasyonu sonucu asitliğin düşürülmesi prensibine dayalı olarak yapılmıştır (Ryu ve Beuchat, 1998). İnoküle edilen mikroorganizmalar 36±2°C’de 18±2 saat inkübasyona bırakılmıştır. Ertesi gün, gelişen kültürlerin 100 µl’si 15 ml’lik santrifüj tüplerine (LABSOLUTE®, Germany) doldurulmuş 10 ml TSB-NG ve TSBG transfer edilerek tekrardan 36±2°C’de 18±2 saat inkübe edilmiştir. L. monocytogenes için kullanılan besiyerleri %0,6 yeast ekstraktla (Biolife; Milan, Italy) zenginleştirilmiştir. İnkübasyondan sonra hücreler 5.300 RPM’de 10 dakika santrifüj edilerek (Thermo Scientific, Labofuge 200 Benchtop Centrifuge, Germany) peptonlu su ile iki defa yıkanmıştır. Son yıkamadan sonra, supernatant uzaklaştırılıp pellet üzerine 5 ml nar suyu eklenerek vortekslenmiştir. Sonuç olarak 107-1010 CFU/ml
patojen yoğunluğuna sahip nar suları termal işlemde kullanılmak üzere elde edilmiştir.
İnoküle Edilmiş Nar Suyuna Termal İşlem Uygulanması
Patojenik E. coli, jenerik E. coli, S. Typhimurium ve L.
monocytogenes ile inoküle edilmiş 50 µl nar suyu, steril
mikrokapilari tüplere (1,5-1,8 (ID) 90 mm; Kimble-Kontes, Vineland, NJ, USA) aseptik olarak doldurulmuştur. Aseptik dolum işlemi steril 20 gauge 4 inç deflected-point needle (Popper and Sons, Inc., Hyde Park, NJ, USA) ve 1 mL’lik şırınga ile gerçekleştirilmiştir. Daha sonra mikrokapilari tüplerin açık uçları bunzen alevi ile mühürlenmiştir. Ardından 2 adet mikrokapilari tüp (100 µl inoküle edilmiş nar suyu), ön denemelerle belirlenen üç farklı sıcaklıkta (50, 52, 54±1°C) ve çeşitli sürelerde önceden ısıtılmış çalkalamalı su banyolarında (NÜVE, ST30, Ankara, Turkey) termal işleme tabi tutulmuştur. Termal uygulamadan sonra, mikrokapilari tüpler hızlıca buzla dolu kaba alınarak soğutulmuştur. Soğutulma işleminden sonra, mikrokapiler tüplerin dış yüzeyleri %70’lik alkole daldırılarak steril edilmiştir. Mikrokapilari tüp yüzeyindeki alkol steril deiyonize su ile yıkanarak, 10 ml peptonlu su içinde steril cam çubukla kırma yoluyla homojenize edilmiştir. İlk konsantrasyon 1:100’dür. E. coli O157:H7, jenerik E. coli, S. Typhimurium popülasyonları çeşitli dilüsyonlarda TSA üzerine ve L. monocytogenes ise %0,6 yeast ektrakt ile desteklenmiş TSA üzerine ekilerek sayılmıştır. Hassasiyeti artırmak ve az sayıdaki mikroorganizmaların sayısını belirlemek için 1 ml’lik ilk dilüsyon (10-2) 0,25 ml olarak dört petriye ekilmiştir. Her bir
ısı ve mikroorganizma için toplam altı tekrar (n=6) çift petri üzerine ekim yapılmıştır.
İstatistiksel Analiz
D-değerleri, ısıl işlem sonrasında canlı kalan
mikroorganizma konsantrasyonunun ve ısıl işlem süresinin grafiğe aktarılmasının ardından regresyon analizi ile
hesaplanmıştır. D- değerleri, Analysis of Covariance (ANCOVA) ile JMP software (Version 9.0.2 SAS® Institute Inc., Cary, NC, USA 2010) yardımıyla istatistiksel olarak karşılaştırılmıştır.
Bulgular ve Tartışma
Meyve sularına ısıl işlem uygulanması, patojenleri ve enzimleri inaktive etmek ve bozulmaya neden olan mikroorganizmalarının popülasyonunlarını azaltmak için etkili ve geniş çapta tercih edilen bir yöntemdir. Patojenlerin termal inaktivasyonu, meyve sularında yirmi yılı aşkın süredir incelenmektedir. Elma cideri, elma ve portakal suyu, pH değerleri 4,0’ın altında olan ve en çok çalışılan meyve sularıdır (Enache ve ark., 2011; Gabriel ve ark., 2015; Gabriel ve Nakano, 2011; Ingham ve Uljas, 1998; Mazzotta, 2001; Ryu ve Beuchat, 1998; Splittstoesser ve ark., 1995; Usaga ve ark., 2014; Topalcengiz ve Danyluk, 2017). Kullanılan nar suyunun pH’sı 3,23±0,02 ve Brix° değeri de 16,1±0,1 olarak belirlenmiştir. Daha önceki çalışmalarda test sıcaklıkları elma, portakal, diğer meyve suları için genel olarak 55 ile 62°C arası seçilmektedir. Bu çalışmada nar suyu daha önceki çalışmalarda seçilen sıcaklıklara göre daha düşük sıcaklıklarda (50, 52, 54°C) test edilebilmiştir. Bunun sebebi nar suyunun ortalama meyve suyu pH’sı olan 3,5’in altında olması ve ihtiva ettiği antimikrobiyal maddeler olarak düşünülmektedir (Jayaprakasha ve ark., 2006; Karabıyıklı ve ark., 2014). Mikroorganizmaların TSB-NG, TSBG, TSBY-NG ve TSBYG’ye inoküle edildikten 18±2 saat inkübasyon sonrasındaki besiyerlerinin mevcut pH değerleri Çizelge 1’de gösterilmiştir. Aside adapte edilmiş mikroorganizmalar arasında en düşük ve en yüksek besiyeri pH değişim değeri 4,39±0,02 ile L.
monocytogenes’e ve 4,96±0,03 ile S. Typhimurium’e aittir.
Benzer şekilde, aside adapte olmayan mikroorganizmalar tarafından gelişim sırasında oluşan en yüksek pH ise 6,65±0,02 ve 7,19±0,02 ile aynı mikroorganizmalara aittir. Bu değerler, Buchanan ve Edelson (1996)’un belirttiği asit adaptasyon koşullarının sağlandığını göstermektedir. Yapılan hesaplama sonucunda D-değerlerinin
hesaplanmasında kullanılan lineer regresyon doğrularından elde edilen R2 değerleri yalnızca %12,5’inde
0,8’den düşük çıkmıştır (Çizelge 2). En düşük R2 değeri
aside adapte olmayan L. monocytogenes’te 0,743 olarak hesaplanmıştır. Bu da hesaplanan D-değerlerinin geçerliliğinin genel olarak yüksek olduğu anlamına gelmektedir. z-değerlerinin hesaplanmasında kullanılan lineer regresyon doğrularının R2 değerleri 0,95’in
üzerindedir (Şekil 3).
Çizelge 1 Suşların yıkanmadan önce geliştirildiği besiyerlerinin 36 ± 1°C’de 18 ± 2 saat inkübasyon sonrası pH değerleri (n=6).
Table 1 pH values of media after incubation at 36 ± 1°C for 18 ± 2 h where strains (n=6).
Suş Medya pH
E. coli O157:H7 (ZT10) TSB-NG 7,00±0,02
TSBG 4,83±0,01
Jenerik E. coli (ATCC 35218) TSB-NG 7,15±0,02
TSBG 4,81±0,01
S. Typhimurium (ATCC 14028) TSB-NG 7,19±0,02
TSBG 4,92±0,03
L. monocytogenes (ATCC 19115) TSBY-NG 6,65±0,02
TSBYG 4,39±0,01
TSB-NG: Şeker içermeyen tryptic soy broth, TSBG: %1 glukozla desteklenmiş tryptic soy broth, TSBY-NG: Şeker içermeyen %0,6 yeast ekstrakt eklenmiş tryptic soy broth, TSBYG: %1 glukoz ve %0,6 yeast ekstraktla desteklenmiş tryptic soy broth
1003 Çizelge 2 50, 52, 54°C’de D-değeri hesaplamasında kullanılan E. coli O157:H7, jenerik E. coli, S. Typhimurium ve L.
monocytogenes suşları için lineer regresyon eşitliklerinden elde edilen R2 değerleri.
Table 2 R2 of linear regression lines obtained from E. coli O157:H7, generic E. coli, S. Typhimurium, and L.
monocytogenes strains used in D-value calculations at 50, 52, 54°C.
Suş Lineer regresyon eşitliklerinden elde edilen R2 değerleri
Adaptasyon 50°C 52°C 54°C
E. coli O157:H7 (ZT10) Hayır 0,893 0,8833 0,9065
Evet 0,9823 0,9397 0,9183
Jenerik E. coli (ATCC 35218) Hayır 0,8599 0,7892 0,8983
Evet 0,9827 0,9914 0,9862
S. Typhimurium (ATCC 14028) Hayır 0,9895 0,9219 0,9735
Evet 0,974 0,9728 0,949
L. monocytogenes (ATCC 19115) Hayır 0,805 0,7437 0,743
Evet 0,9825 0,8807 0,9418
Çizelge 3 Aside adapte olan ve olmayan E. coli O157:H7, jenerik E. coli, S. Typhimurium ve L. monocytogenes’in lineer regresyon eşitlikleriyle hesaplanmış D ve z-değerleri
Table 3 D and z- values of non-adapted and acid adapted E. coli O157:H7, generic E. coli, S. Typhimurium and L. monocytogenes calculated from linear regression equations
Suş D50°C± SD (dk)* D52°C± SD (dk)* D54°C± SD (dk)* z-değeri (°C)
Hayır Evet Hayır Evet Hayır Evet Hayır Evet
ZT10 4,22±0,19aA 1,41±0,18aB 2,03±0,30aA 0,73±0,14aB 1,18±0,07aA 0,41±0,09aB 7,2 7,5
ATCC 35218 7,08±0,43bA 2,86±0,20abB 4,77±0,17bA 1,83±0,26bcB 2,67±0,13bA 1,14±0,11bB 9,4 10
ATCC 14028 1,33±0,16cA 2,44±0,21bcB 0,85±0,11cA 0,81±015cB 0,50±0,07cA 0,43±0,10cB 9,4 5,3
ATCC 19115 4,09±0,28aA 4,64±0,36cB 2,56±0,13dA 4,20±0,15dB 1,56±0,11dA 3,39±0,11dA 9,6 29,3
*Satır üzerindeki farklı büyük harfler aside adapte olan ve adapte olmayan hücreler için D-değerleri arasındaki anlamlı farklılığı gösterir. Kolon üzerindeki farklı küçük harfler test edilen sıcaklıkta suşlar arasındaki anlamlı farklılığı gösterir (P<0,05)
Escherichia coli O157:H7
Meyve sularında patojenlerin termal inaktivasyon çalışmaları şiga toksin üreten E. coli suşları üzerine elma cideri ve suyunda yoğunlaşmıştır (Enache ve ark., 2011; Gabriel ve Nakano, 2011; Ingham ve Uljas, 1998; Mazzotta, 2001; Splittstoesser ve ark., 1995; Usaga ve ark., 2014). Bunun sebebi ise meydana gelmiş ve ispatlanmış elma cideri ve elma suyu kaynaklı zehirlenme vakalarıdır (CDC, 2014; Danyluk ve ark., 2012; Vojdani ve ark., 2008). Asit adaptasyonu E. coli O157:H7’nin nar suyunda test edilen tüm sıcaklıklardaki termal dayanıklılığını azalmıştır (P<0,05). Asit adaptasyonunun, şiga toksin üreten E. coli’nin elma ve portakal suları dahil diğer meyve sularına termal toleransını artırdığı veya bu çalışmaya benzer şekilde azalttığı rapor edilmiştir (Mazzotta, 2001; Ryu ve Beuchat, 1998; Topalcengiz ve Danyluk, 2017). E.
coli O157:H7 için hesaplanan D-değerleri Çizelge 3’te
gösterilmiştir. Bu çalışmada, nar suyunda 50, 52 ve 54°C’de aside adapte olmayan E. coli O157:H7’nin nar suyu için D-değerleri sırası ile 4,22±0,19, 2,03±0,30 ve 1,18±0,07 dk olarak hesaplanmıştır. Aside adapte olan E.
coli O157:H7’nin nar suyundaki hesaplanan D-değerleri
ise 1,41±0,18; 0,73±0,14 ve 0,41±0,09 dk olarak belirlenmiştir. Nar suyunda hesaplanan bu D-değerleri, daha önceki elma ve portakal suyunda yapılan çalışmalardan en az üç kat daha düşüktür (Mazzotta, 2001; Ryu ve Beuchat, 1998; Splittstoesser ve ark., 1995; Topalcengiz ve Danyluk, 2017; Usaga ve ark., 2014). E.
coli O157:H7’nin zamana karşı popülasyonunun azalması
grafiksel olarak Şekil 1’de gösterilmiştir. E. coli’nin serogrup değişkenliği termal direncini etkileyebilir. Enache ve ark. (2011) ve Topalcengiz ve Danyluk (2017) tarafından yapılan farklı iki çalışmada, E. coli serogrup
O26, O45, O103, O111, O121, O145 ve O157:H7’nin elma ve portakal sularında farklı termal tolerans değerleri gösterdikleri rapor edilmiştir.
Salmonella enterica Typhimurium
Meyve sularında Salmonella’nın termal inaktivasyonunu inceleyen çalışmaların sayısı sınırlıdır. S. Typhimurium için hesaplanan D-değerleri Çizelge 3’de gösterilmiştir. Bu çalışmada, nar suyunda 50, 52 ve 54°C’de aside adapte olmayan S. Typhimurium’un nar suyu için D-değerleri sırası ile 1,33±0,16; 0,85±0.11 ve 0,50±0.07 dk olarak hesaplanmıştır. Aside adapte olan S. Typhimurium’un nar suyundaki D-değerleri ise 2,44±0,21; 0,81±015 ve 0,43±0,10 dk olarak belirlenmiştir. 54°C’de nar suyu için bulunan termal inaktivasyon değerlerinin, 55°C’de aynı metodoloji ile portakal suyunda hesaplanan D-değerinin yarısı kadar olduğu belirlenmiştir (Topalcengiz ve Danyluk, 2017). Nar suyundaki inaktivasyon hızının meyve suyu içeriğindeki antimikrobiyal maddelerden kaynaklandığı düşünülmektedir. S. Typhimurium’un nar suyunda 50, 52 ve 54°C’deki termal inaktivasyon işlemi sonunda, aside adapte ve adapte olmayan mikroorganizmaların D-değerlerinde meydana gelen değişim istatiksel olarak anlamlı bulunmuştur (P<0,05). Bu çalışmada, sadece 50°C’de
Salmonella’nın asit adaptasyonu sonucu termal inaktivasyon
süresinin artığı belirlenmiştir. Asit adaptasyonun,
Salmonella’nın elma, portakal, beyaz üzüm, kavun ve
karpuz suyundaki 55-60°C arası farklı sıcaklıklarda termal direncini artırdığı rapor edilmiştir (Mazotta, 2001; Sharma ve ark., 2005; Topalcengiz ve Danyluk, 2017). S. Typhimurium’un zamana karşı popülasyonun azalması grafiksel olarak Şekil 1’de gösterilmiştir.
Şekil 1 A) E. coli O157: H7, B) S. Typhimurium C) L. monocytogenes suşlarının 50, 52 ve 54°C’de ki D-değerleri tahmin etmek için kullanılan lineer regresyon doğruları. (■) Aside adapte olan, (♦) Aside adapte olmayan (n = 6).
Figure 1. Linear regression lines of A) E. coli O157:H7, B) S. Typhimurium C) L. monocytogenes strains to estimate D-values at 50, 52 and 54°C. (■) Acid adapted, (♦) Non-adapted (n=6)
Şekil 2 Jenerik E. coli suşunun A) 50°C B) 52°C C) 54°C'de D-değerleri tahmin etmek için kullanılan lineer regresyon doğruları. (■) Aside adapte olan, (♦) Aside adapte olmayan (n = 6).
Figure 2 Linear regression lines of generic E. coli strain to estimate D-values at A) 50°C B) 52°C C)54°C. (■) Acid adapted, (♦) Non-adapted (n=3)
Listeria monocytogenes
Meyve suları ile ilgili L. monocytogenes’in sebep olduğu doğrulanmış bir salgın olmamasına rağmen, doğal olarak her yerde bulunması nedeni ile pastörize meyve suyu transfer edildiğinde veya harmanlandığında meyve suyuna potansiyel kontaminasyonu riski nedeniyle hedef mikroorganizma olarak kabul edilir (FDA, 2004). L.
monocytogenes için hesaplanan D-değerleri Çizelge 3’te
gösterilmiştir. 50, 52 ve 54°C’de aside adapte olmayan L.
monocytogenes’in nar suyu için hesaplanan D-değerleri
sırasıyla 4,09±0,28; 2,56±0,13 ve 1,56±0,11 dk olarak belirlenmiştir. Aside adapte olan L. monocytogenes’in nar suyundaki D-değerleri ise 50, 52 ve 54±1°C’de sırasıyla 4,64±0,36; 4,20±0,15 ve 3,39±0,11 dk olarak belirlenmiştir. İki derecelik sıcaklık artışının, özellikle aside adapte hücreler üzerinde termal inaktivasyon süresi açısından çok belirgin bir fark yaratmadığı görülmüştür. Bu çalışmada nar suyu için hesaplanan D-değerlerinin
farklı ve aynı metodoloji ile çeşitli meyve sularında hesaplanan D-değerlerine paralellik gösterdiği
belirlenmiştir (Mazotta, 2001; Topalcengiz ve Danyluk, 2017). L. monocytogenes’in nar suyunda 50, 52 ve 54°C’deki termal inaktivasyon işlemi sonunda, aside adapte ve adapte olmayan mikroorganizmaların D- değerlerinde meydana gelen artış istatiksel olarak anlamlı bulunmuştur (P<0,05). Bu çalışmadaki sonuçlara benzer şekilde, asit adaptasyonunun, L. monocytogenes’in elma, portakal ve beyaz üzüm suyundaki 56, 60 ve 62°C’deki termal direncini artırdığı rapor edilmiştir (Mazotta, 2001). Tam tersi bir şekilde, asit adaptasyonunun bazı L.
monocytogenes suşlarının portakal, kavun ve karpuz
suyunda ısıl direnci düşürdüğü de tespit edilmiştir (Sharma ve ark., 2005; Topalcengiz ve Danyluk, 2017). L.
monocytogenes’in zamana karşı popülasyonun azalması
grafiksel olarak Şekil 1’de gösterilmiştir. 0 2 4 6 8 10 0 10 20 30 L og C F U/m l A-50°C 0 2 4 6 8 10 0 5 10 15 20 A-52°C 0 2 4 6 8 10 0 5 10 15 A-54°C 0 2 4 6 8 10 0 10 20 30 L og C F U/m l B-50°C 0 2 4 6 8 10 0 5 10 15 20 B-52°C 0 2 4 6 8 10 0 5 10 15 B-54°C 0 2 4 6 8 10 0 10 20 30 L og C F U/m l Zaman (Dakika) C-50°C 0 2 4 6 8 10 0 5 10 15 20 Zaman (Dakika) C-52°C 0 2 4 6 8 10 0 5 10 15 Zaman (Dakika) C-54°C 0 2 4 6 8 10 0 5 10 15 20 L og C F U/m l Zaman (Dakika) A 0 2 4 6 8 10 0 5 10 15 L og C F U/m l Zaman (Dakika) B 0 2 4 6 8 10 0 5 10 L og C F U/m l Zaman (Dakika) C
1005 Şekil 3 A) E. coli O157:H7, B) jenerik E. coli, C) S. Typhimurium ve D) L. monocytogenes suşlarının z-değerleri tahmin etmek için kullanılan lineer regresyon doğruları. (■) Aside adapte olan, (♦) Aside adapte olmayan (n = 6).
Figure 3 Linear regression lines of A) E. coli O157:H7, B) generic E. coli, C) S. Typhimurium, and D) L. monocytogenes strains to estimate z-value. (■) Acid adapted, (♦) Non-adapted.
Jenerik Escherichia coli ve Bütün Mikroorganizmaların Karşılaştırılması
50, 52, 54°C’de aside adapte olmayan jenerik E.
coli’nin D-değerleri sırası ile 7,08±0,43; 4,77±0,17 ve
2,67±0,13 dk olarak hesaplanmıştır. Aside adapte olan jenerik E. coli’nin 50, 52, 54°C’de nar suyu için hesaplanan D-değerleri ise sırası ile 2,86±0,20; 1,83±0,26 ve 1,14±0,11 dk olarak belirlenmiştir (Çizelge 3). Aynı şekilde jenerik E. coli’nin nar suyunda 50, 52 ve 54°C’deki termal inaktivasyon işlemi sonunda, aside adapte ve adapte olmayan mikroorganizmaların D-değerlerinde meydana gelen değişim istatiksel olarak anlamlı bulunmuştur (P<0,05). 50°C’de uygulanan ısıl işlemde aside adapte olmayan E. coli O157:H7 ve jenerik E. coli D-değerlerinde meydana gelen değişim istatiksel olarak anlamlı bulunmuştur (P<0,05). Aside adapte E. coli O157:H7 ve jenerik E. coli’nin D-değerlerinde meydana gelen değişim ise istatiksel olarak anlamlı değildir (P>0,05). 52 ve 54°C’de uygulanan ısıl işlemde hem aside adapte hem de aside adapte olmayan E. coli O157:H7 ve jenerik E.
coli’nin D-değerleri arasındaki farklılık istatiksel olarak
anlamlı bulunmuştur (P<0,05). Jenerik E. coli’nin zamana karşı popülasyonunun azalması grafiksel olarak Şekil 2’de gösterilmiştir.
En yüksek z-değeri 29,3 ile aside adapte L.
monocytogenes’te, en düşük z- değeri ise S.
Typhimurium’da 5,3 olarak ölçülmüştür. Hesaplanan z-değerleri Çizelge 3’te gösterilmektedir. L. monoocytogenes test edilen diğer mikroorganizmalara göre nar suyu içinde termal uygulamaya daha fazla dayanıklılık göstermiştir. Bu sonuçlar daha önce tespit edilen verilerle uyumludur (Enache ve ark., 2006; Mazzotta, 2001; Topalcengiz ve Danyluk, 2017). 50°C’de uygulanan ısıl işlem sonucunda aside adapte olmayan E. coli O157:H7 ve L.
monocytogenes’in jenerik E. coli ve S. Typhimurium’un D-
değerleri arasındaki farklılık istatiksel olarak anlamlı bulunmuştur (P<0,05). 50°C’de, aside adapte olan E. coli
O157:H7’in D-değeri, S. Typhimurium ve L. monocytogenes’ten istatiksel olarak farklıdır (P<0,05).
52°C’de uygulanan termal işlem sonucunda aside adapte olan ve olmayan E.coli O157:H7, jenerik E. coli, S. Typhimurium ve L. monocytogenes arasındaki D-değerleri farklılığı istatiksel olarak anlamlı bulunmuştur (P<0,05). 54°C’de uygulanan termal işlem sonucunda ise aside adapte ve aside adapte olmayan E. coli O157:H7, jenerik
E. coli, S. Typhimurium ve L. monocytogenes’in
D-değerleri arasındaki farklılık istatiksel olarak anlamlı bulunmuştur (P<0,05). Mak ve ark. (2001) tarafından da belirtildiği gibi, jenerik E. coli (ATCC 35218) proses çalışmalarında E. coli O157:H7 ve Salmonella için indikatör mikroorganizma olarak kullanılabileceğini göstermiştir.
Sonuç
Glukoz eklenmiş besiyerlerinin pH’sı başarılı bir şekilde bütün test edilen mikroorganizmalar için asit adaptasyonunun gerçekleşebileceği orta derece asitlik derecesine ulaşmıştır. Önceki çalışmaların aksine, tüm asit adapte edilmiş E. coli O157:H7, jenerik E. coli, Salmonella suşlarının, nar suyundaki aside adapte olmayan hücrelerle karşılaştırıldığında daha düşük ısı direncine sahip olduğu belirlenmiştir. Yalnızca L. monocytogenes asit adaptasyonu sonucu bütün sıcaklıklarda nar suyu içindeki ısıya karşı olan direncini artırmıştır. Ancak, daha fazla suşla teyit edilmesi gerekmektedir. Genel olarak nar suyu daha etkili antimikrobiyal özelliklere sahip olduğundan dolayı düşük sıcaklıklarda ölümcül etki göstermiştir. Bu antimikrobiyal etkinin daha ziyade gram negatif türler olan E. coli ve
Salmonella enterica üzerine etkili olduğu gözlemlenmiştir.
Diğer meyve sularına kıyasla daha düşük sıcaklıklarda yakalanan termal inaktivasyon değerleri, nar suyunun pastörizayonu sırasında kullanılan ısı ve enerji kullanımının azaltılabileceğine işaret etmektedir. Bu sayede endüstriyel -0,5 0 0,5 1 49 50 51 52 53 54 55 L og D -v al u e Temperature (°C) A -0,6 -0,1 0,4 0,9 1,4 49 50 51 52 53 54 55 L og D -v al u e Temperature (°C) B -0,5 0 0,5 1 49 50 51 52 53 54 55 L og D -v al u e Temperature (°C) C -0,6 -0,1 0,4 0,9 49 50 51 52 53 54 55 L og D -v al u e Temperature (°C) D
olarak nar suyu üretiminde daha düşük sıcaklıklarda pastörizasyon yapılırken besin değerleri daha çok korunarak gıda güvenliği güvenceye alınabilir, enerji giderleri azaltılabilir ve kârlılık arttırılabilir. Fakat bu sonucun daha fazla suşun termal dirençliliğinin nar ve diğer meyve sularında belirlenerek kuvvetlendirilmesi gerekmektedir. Teşekkür
Bu proje Muş Alparslan Üniversitesi Bilimsel Araştırma Proje Komisyonu tarafından MŞÜ-MMF-G02 proje numarası ile desteklenmiştir. Yazarlar ayrıca Kadir Halkman, İlknur Dağ, Gökhan Durmaz ve Michelle D. Danyluk’a katkı ve desteklerinden dolayı teşekkür etmektedir
Kaynaklar
Aviram M, Dornfeld L, Rosenblat M, Volkona N, Kaplan M, Coleman R, Hayek T, Presser D, Fuhrman B. 2000. Pomegranate juice consumption reduces oxidative stress, atherogenic modifications to LLD, and platelet aggregation: studies in humans and in atherosclerotic apolipoprotein E-deficientmice. Am. J. Clin. Nutr. 71(5): 1062–1076. DOI: 10.1093/ajcn/71.5.1062
Aviram M, Dornfeld L. 2001. Pomegranate juice consumption inhibits serum angiotens in converting enzyme activity and reduces systolic blood pressure. Atherosclerosis. 158(1): 195–198. DOI: 10.1016/S0021-9150(01)00412-9
Aviram M, Rosenblat M, Gaitini D, Nitecki S, Hoffman A, Dornfeld L, Volkova N, Presser D, Attias J, Liker H, Hayek T. 2004. Pomegranate juice consumption for 3 years by patients with carotid artery stenosis reduces common carotid intima-media thickness, blood pressure and LDL oxidation. Clin. Nutr. 23(3): 423–433. DOI: 10.1016/j.clnu.2003.10.002 Buchanan RL, Edelson SG. 1996. Culturing enterohemorrhagic
Escherichia coli O157:H7 in the presence and absence of
glucose as a simple means of evaluating the acid tolerance of stationary-phase cells. Appl. Environ. Microbiol. 62(11): 4009–4013. PMID: 8899990
Cemeroğlu B, Artık N. 1990. Isıl işlem ve depolama koşullarının nar antosiyaninleri üzerine etkisi. Gıda 15(1): 13–19. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). 2014. Foodborne
Outbreak Online Database (FOOD). Available from: http://wwwn.cdc.gov/foodborneoutbreaks/Default.aspx. [Accessed 28 October 2014].
Centers for Disease Control and Prevention (CDC). 2015. Analysis and evaluation of preventive control measures for the control and reduction/elimination of microbial hazards on fresh and fresh-cut produce: Chapter IV. Outbreaks tables. Available from: http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/SafePracticesf orFoodProcesses/ucm091270.htm. [Accessed 25 March 2016]. Doyle ME, Mazotta AS, Wang T, Wiseman DW, Scott VN. 2001.
Heat resistance of Listeria monocytogenes. J. Food Prot. 64(3): 410–429. DOI: 10.4315/0362-028X-64.3.410 Enache E, Mathusa EC, Elliot PH, Black DG, Chen Y, Scott VN,
Schaffner DW. 2011. Thermal resistance parameters for Shiga Toxin–Producing Escherichia coli in apple juice. J. Food Prot. 74(8): 1231–1237. DOI: 10.4315/0362-028X.JFP-10-488
Danyluk MD, Goodrich-Schneider RM, Schneider KR, Harris LJ, Worobo RW. 2012. Outbreaks of foodborne disease associated with fruit and vegetables juice, 1922-2010. EDIS Document FSHN 12-04. Available from: http://ucfoodsafety.ucdavis.edu/files/223883.pdf. [Accessed 28 July 2018].
Food and Drug Administration (FDA). 2001. Federal Register Final Rule – 66 FR 6137, January 19, 2001: Hazard Analysis and Critical Control Point (HACCP); Procedures for the Safe and Sanitary Processing and Importing of Juice. Available from: https://www.federalregister.gov/documents/2001/01/19/01-
1291/hazard-analysis-and-critical-control-point-haacp-procedures-for-the-safe-and-sanitary-processing-and. [Accessed 28 July 2018].
Food and Drug Administration (FDA). 2004. Guidance for Industry: Juice HACCP Hazards and Controls Guidance First Edition; Final Guidance. Available from: https://www.fda.gov/Food/GuidanceRegulation/GuidanceDo cumentsRegulatoryInformation/Juice/ucm072557.htm. [Accessed 28 July 2018].
Gabriel AA, Albura MP, Faustino KC. 2015. Thermal death times of acid habituated Escherichia coli and Salmonella
enterica in selected fruit beverages. Food Control, 55, 236–
241. DOI: 10.1016/j.foodcont.2015.03.002.
Gabriel AA, Nakano H. 2011. Effects of culture conditions on the subsequent heat inactivation of E. coli O157:H7 in apple juice. Food Control 22(8): 1456–1460. DOI: 10.1016/ j.foodcont.2011.03.011
Gıda, Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı (GTHB). 2011. Türk Gıda Kodeksi Mikrobiyolojik Kriterler Yönetmeliğinde. Available from: http://www.resmigazete.gov.tr/eskiler/2011/12/ 20111229M3-6.htm. [Accessed 28 July 2018].
Gil MI, Tomas-Barberan FA, Hess-Pierce B, Holcroft DM, Kader AA. 2000. Antioxidant activity of pomegranate juice and ıts relationship with phenolic composition and processing. J. Agric. Food Chem. 48(10): 4581–4589. DOI: 10.1021/jf000404a
Haberbeck LU, Wang X, Michiels C, Devlieghere F, Uyttendaele M, Geeraerd AH. 2017. Cross-protection between controlled acid-adaptation and thermal inactivation for 48 Escherichia
coli strains. Int. J. Food Microbiol. 241, 206–214. DOI:
10.1016/j.ijfoodmicro.2016.10.006.
Ingham SC, Uljas HE. 1998. Prior storage conditions ınfluence the destruction of Escherichia coli O157:H7 during heating of apple cider and juice. J. Food Prot. 61(4): 390–394. DOI: 10.4315/0362-028X-61.4.390
Jayaprakasha GK, Negi PS, Jena BS. 2006. Antimicrobial activities of pomegranate. In, Pomegranates, Ancient roots to Modern Medicine. Seeram P. Schulman RN, Heber D. (Eds.). Taylor &Francis Group LLC, CRC press, Boca Raton FL, pp. 167–177. ISBN 9780849398124
Karabıyıklı Ş, Değirmenci H, Karapınar M. 2014. Inhibitory effect of sour orange (Citrus aurantium) juice on Salmonella Typhimurium and Listeria monocytogenes. LWT-Food Sci. Technol. 55 (2): 421–425. DOİ: 10.1016/j.lwt.2013.10.037. Mak PP, Ingham BH, Ingham SC. 2001. Validation of apple cider
pasteurization treatments against Escherichia coli O157:H7,
Salmonella, and Listeria monocytogenes. J. Food Prot.
64(11): 1679–1689. DOI: 10.4315/0362-028X-64.11.1679 Mazzotta AS. 2001. Thermal inactivation of stationary-phase and
acid-adapted Escherichia coli O157:H7, Salmonella, and
Listeria monocytogenes in fruit juices. J. Food Prot. 64(3):
315–320. DOI: 10.4315/0362-028X-64.3.315
Ryu JH, Beucha LR. 1998. Influence of acid tolerance responses on survival, growth, and thermal cross-protection of
Escherichia coli O157:H7 in acidified media and fruit juices.
Int. J. Food Microbiol. 45(3): 185–193. DOI: 10.1016/S0168-1605(98)00165-2
Ryu JH, Deng Y, Beuchat LR. 1999. Behavior of acid-adapted and unadapted Escherichia coli O157:H7 when exposed to reduced pH achieved with various organic acids. J. Food Prot. 62(5): 451–455. DOI: 10.4315/0362-028X-62.5.451
1007
Saxena AK, Manan JK, Berry SK. 1987. Pomegranates: Post-harvest technology, chemistry & processing. Indian Food Packer 4: 43–60.
Seeram NP, Aviram M, Zhang Y, Henning SM, Feng L, Dreher M, Heber D. 2008. Comparison of antioxidant potency of commonly consumed polyphenol-rich beverages in the United States. J. Agric. Food Chem. 56(4): 1415–1422. DOI: 10.1021/jf073035s
Sharma M, Adler BB, Harrison MD, Beuchat LR. 2005. Thermal tolerance of acid-adapted and unadapted Salmonella,
Escherichia coli O157H7, and Listeria monocytogenes in
cantaloupe juice and watermelon juice. Lett. Appl. Microbiol. 41(6): 448–453. DOI: 10.1111/j.1472-765X.2005.01797.x Splittstoesser DF, McLellan MR, Churey JJ. 1996. Heat
resistance of Escherichia coli O157:H7 in apple juice. J. Food Prot. 59(3), 226–229. DOI: 10.4315/0362-028X-59.3.226
Topalcengiz Z, Danyluk MD. 2017. Thermal inactivation responses of acid adapted and non-adapted stationary phase Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC), Salmonella spp. and Listeria monocytogenes in orange juice. Food Control 72: 73–82. DOI: 10.1016/j.foodcont.2016.07.014 Topalcengiz Z. 2019. Assessment of Recommended Thermal
Inactivation Parameters for Fruit Juices. LWT-Food Sci. Technol. (In Press).
Vojdani JD, Beuchat LR, Tauxe RV. 2008. Juice-associated outbreaks of human illness in the United States, 1995 through 2005. J. Food Prot. 71(2): 356–364. DOI: 10.4315/0362-028X-71.2.356
Usaga J, Worobo RW, Padilla-Zakour OI. 2014. Effect of acid adaptation and acid shock on thermal tolerance and survival of Escherichia coli O157:H7 and O111 in apple juice. J. Food Prot. 77(10): 1656–1663. DOI: 10.4315/0362-028X.JFP-14-126
Zarfeshany A, Asgary S, Javanmard SH. 2014. Potent health effects of pomegranate. Adv. Biomed. Res. 3:100. DOI: 10.4103/2277-9175.129371.