1 T.C.
TRAKYA ÜNĠVERSĠTESĠ FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ
STREPTOZOTOSĠN ĠLE OLUġTURULMUġ DĠYABETĠK SIÇANLARDA BETA GLUKANIN ANTĠOKSĠDAN VE ĠMMUNOPROTEKTĠF ETKĠSĠ
SERPĠL BAYIR
DOKTORA TEZĠ
BĠYOLOJĠ ANABĠLĠM DALI
Tez DanıĢmanı: PROF. DR. TÜLĠN AKTAÇ
EDĠRNE-2014
II Doktora Tezi
Streptozotosin İle Oluşturulmuş Diyabetik Sıçanlarda Beta Glukanın Antioksidan ve İmmunoprotektif Etkisi
T.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı
ÖZET
Bu çalışmada, streptozotosin ile diyabet oluşturulmuş sıçanlarda Saccharomyces cerevisiae kaynaklı ticari beta glukanın antioksidan ve immunoprotektif etkileri çeşitli parametreler kullanılarak araştırılmıştır. Oksidatif stres ve doku hasarının belirlenmesi için, karaciğer ve böbrek dokularında malondialdehid (MDA) ve miyeloperoksidaz (MPO) aktiviteleri, antioksidan etki için süperoksid dismutaz (SOD), katalaz (CAT), glutatyon peroksidaz (GPx) ve glutatyon redüktaz (GR) enzimlerinin aktiviteleri, immunoprotektif etkiler için inflamatuvar (TNF-α ve IL-6) ve antiinflamatuvar (IL-10) sitokinlerin serum düzeyleri incelendi.
Çalışmada 40 adet Spraque Dawley erkek sıçan, 4 gruba ayrıldı. Grup 1 kontrol (n=10), grup 2 diyabet (n=7), grup 3 beta glukan (n=10) ve grup 4 (n=7) diyabet+beta glukan olarak belirlendi. Deneysel diyabet, grup 2 ve 4’teki sıçanlara intraperitoneal olarak 60 mg/kg STZ enjeksiyonu ile oluşturuldu. Enjeksiyondan 24 saat sonra grup 2 ve grup 4’teki sıçanlara beta glukan (50 mg/kg) 10 gün süreyle nazogastrik sonda ile oral olarak verildi.
Deney başlangıcı ve sonunda vücut ağırlıkları ölçülmüş, diyabet ve diyabet+beta glukan gruplarındaki hayvanların deney sonu vücut ağırlıklarında anlamlı bir azalma görüldü (p< 0.001). Diyabet ve diyabet+beta glukan gruplarının glukoz düzeyleri deney başındaki glukoz düzeyi ile karşılaştırıldığında anlamlı bir artış tespit edilmiştir (p< 0.001). Beta glukan grubunda ise anlamlı bir değişiklik görülmemiştir. Açlık kan şekeri ise, diyabet grubunda yükselmiş, diyabet+beta glukan grubunda ise diyabet grubu ile kıyaslandığında anlamlı bir azalma tespit edilmiştir (p<0.001).
III
Kolesterol düzeyleri incelendiğinde, 3 deney grubunda da, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında anlamlı olarak arttığı tespit edilmiştir (p<0.05, p< 0.01). Deney süresinin sonunda, diyabet ve diyabet+beta glukan gruplarının trigliserid düzeylerinin kontrol grubu ile karşılaştırıldığında anlamlı olarak artış gösterdiği tespit edilmiştir (p<0.001). LDL kolesterolün diyabet (p<0,05) ve diyabet+beta glukan (p<0.001) gruplarında kontrol grubuna göre yüksek olduğu görülmüştür. Ayrıca beta glukan grubunun LDL düzeyinin de, kontrol grubuna göre anlamlı olarak artmış olduğu görülmektedir (p<0.05).
ALT düzeyinde, diyabet grubu kontrol grubu ile karşılaştırıldığında istatiksel bir artış tespit edilmiştir ( p<0.05). Ancak Diyabet+beta glukan grubunda diyabet grubuna göre anlamlı derecede azalma tespit edilmiştir (p< 0.05). LDH düzeyi açısından diyabet+beta glukan grubunda kontrol ve diyabet grubu ile karşılaştırdığımızda anlamlı bir azalış görülmüştür (p<0.05).
Oksidatif stres ve doku hasarı için MDA ve MPO değerleri incelendiğinde, her ikisinin de diyabet grubunda arttığı (p<0.001), MDA’nın diyabet+beta glukan grubunda azaldığı tespit edilmiştir (p<0.001). Antioksidan etki için SOD, CAT, GPx ve GR aktiviteleri incelendiğinde, diabetik grupta oksidatif hasara bağlı olarak karaciğer ve böbrek dokusunda antioksidan enzim kapasitesi azalırken (p<0.001), diyabet+beta glukan grubunda SOD, CAT, GPx (p<0.001) ve GR (p<0.05) düzeyi artmıştır.
İnflamatuvar sitokinlerin serum düzeyleri diyabetik grupta kontrol grubuna göre artmış (p<0.01), antiinflamatuvar sitokin IL-10 ise azalmıştır (p<0.01). Diabet+beta glukan grubunda ise antiinflamatuvar sitokinlerin olan IL-10 düzeyi artmış (p<0.05) diğerleri (TNF-α ve IL-6) azalmıştır (p<0.05).
Anahtar Kelimeler: Diabetes mellitus, Beta glukan, Oksidatif stres, Antioksidan savunma, Sitokinler.
Yıl : 2014
Sayfa Sayısı : 73
Anahtar Kelimeler : Diabetes mellitus, Beta glukan, Oksidatif stres, Antioksidan savunma, Sitokinler.
IV Doctorate Thesis
Antioxidant and immunoprotective effets of beta glucan on rats with diabetes induced by Streptozotocin.
Trakya University Institute of Natural Sciences Biology Department
ABSTRACT
In this study, antioxidant and immunoprotective effects of beta glucan on rats with diabetes which induced by streptozotocin were researched. To determine the oxidative stress and the damage in tissues; the activities of MDA and MPO in liver and kidney tissues, for the antioxidant effect the activities of SOD, CAT, GPx and GR enzymes, for the immunoprotective effects, serum levels of inflammatory (TNF-α ve IL-6) and anti-inflamatory (IL-10) cytokines were examined.
40 male Spraque Dawley rats were divided into 4 groups. Group 1 was determined as control (n=10), Group 2as diabetes (n=7), Group 3 as beta glucan (n=10), Group 4 as diabetes+beta glucan (n= 7). Experimental diabetes was induced by intraperitoneal injection of 60 mg/kg STZ in group 2 and 4. 24 hours after the injection, the rats in groups 2 and 4 were given beta glucan (50 mg/kg) for 10 days by nazogastric foley.
At the end of the experiment, there was a significant decrease in body weights of the rats in diabetes and diabetes+beta glucan groups (p< 0.001). A significant increase was observed for the glucose levels of diabetes and diabetes+beta glucan groups when compared to the levels in the beginning of the experiment (p<0.001). Any significant change was observed in the beta glucan group. Fasten blood sugar was decreased significantly in diabetes+beta glucan (p<0.001) group when compared to diabetes group.
Cholesterol level was increased in all experimental group when compared to control group (p<0.05, p< 0.01). Triglyceride level in diabetes and diabetes+beta glucan
V
groups was increased significantly when compared to control group (p<0.001). LDL was increased in diabetes (p<0.05), diabetes+beta glucan (p<0.001) and beta glucan (p<0.05) groups when compared to control group.
ALT level was increased significantly in diabetes group (p<0.05) when compared to control group but decreased in diabetes+beta glucan group (p<0.05). LDH level was decreased significantly (p<0.05) in diabetes+beta glucan group when compared to control and diabetes groups.
When MDA and MPO values were examined for oxidative stress and tissue damage, it was seen that both values were increased in diabetes group (p<0.001) but MDA was decreased only in diabetes+beta glucan group (p<0.001).
When the activities of SOD, CAT, GPx and GR were examined for the antioxidant effect, in the diabetes group due to oxidative damage, the capacity of antioxidant enzyme in liver and kidney tissues were decreased (p<0.001). The activities of SOD, CAT, GPx (p<0.001) and GR in diabetes+beta glucan group were increased (p<0.05).
The serum levels of inflamatory cytokins in the diabetic group were increased when compared to the control group (p<0.01), and antiinflamatory cytokin IL-10 was decreased (p<0.01). The levels of anti-inflamatory cytokin IL-10 in diabete+beta glucan group was increased (p<0.05), but TNF-α and IL-6 were decreased (p<0.05).
Year : 2014
Number of Pages :73
Keywords : Diabetes mellitus, Beta glucan, Oxidative stress, Antioxidant defense, Cytokins.
VI TEġEKKÜR
Tezimin planlanması ve gerçekleştirilmesinde, önerileri, yardımları ve sabrı için değerli tez hocam Prof. Dr. Tülin AKTAÇ’a, bana eğitim hayatım boyunca bilimsel güveni ile destek olan değerli hocam Prof. Dr. Nihat AKTAÇ’ a
Deneysel çalışmalarım sırasında gerekli imkanların hazırlanmasında ve kullanılmasında gösterilen anlayış ve bilimsel destekten dolayı Biyoloji Bölüm Başkanlığı’na, çalışmalarımda yardımlarını esirgemeyen sayın hocalarım Prof. Dr. Figen Ertan, Doç.Dr. Ayşegül Çerkezkayabekir’e, Yrd. Doç. Dr. Filiz Sanal’a, katkılarından dolayı T.Ü. Deney Hayvanları Biriminde görev yapan Vet. Hek. Ziya Çukur’a, İng. Öğretmeni Arda Tunçel’e Edirne Devlet Hastanesi Selimiye Ünitesi Biyokimya biriminde çalışan sevgili mesai arkadaşlarıma , bana gösterdikleri destek ve sabırdan dolayı en içten duygularımla canım annem Müesser Bayır ve babam Halil Bayır’a, sevgili ablalarım Tülay Metin, Sevilay Berber ve kardeşim Sabriye Bayır’a, yeğenim İlke Metin’e Utku Metin, Canberk Berber, Berkay Berber ve ailemin diğer bireylerine teşekkür ederim.
Bu çalışma Trakya Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri (TÜBAP) biriminin mali desteği ile gerçekleştirilmiştir (TÜBAP-2013/11).
VII
ĠÇĠNDEKĠLER Sayfa No. ÖZET ... III ABSTRACT ... V TEġEKKÜR ... VII ĠÇĠNDEKĠLER ... VIII KISALTMALAR ... X TABLO LĠSTESĠ ... XII ġEKĠL LĠSTESĠ ... XIII
1.GĠRĠġ ... 1
2.GENEL BĠLGĠLER ... 5
2.1. Oksidatif stres ... 5
2.1.1 Canlılarda Serbest Oksijen Radikallerinin Kaynakları ... 5
2.1.2 Serbest Radikallerin Hücre ve Biyomoleküller Üzerine Etkileri ... 6
2.1.3 Serbest Radikallerin Biyomembranlar Üzerine Etkisi ... 7
2.2. Oksidatif Strese Karşı Organizmanın Savunma Sistemler ... 8
2.3. Oksidatif Streste Oluşan Doku Hasarı ve Miyeloperoksidaz ... 11
2.4. Diabetes Mellitus (Şeker Hastalığı) ... 12
2.4.1. Tip 2 Diyabet... 14
2.4.2. Diabetes Mellitus’ un Tanısal Kriterleri ... 14
2.4.3. Streptozotosin (STZ) aracılığıyla oluşturulan deneysel diyabet modeli ... 15
2.4.4. Diyabet ve Oksidatif Stres İle İlişkisi ... 16
2.4.5. Diyabette antioksidan mekanizmalar ... 17
2.4.6. Diyabette Serbest Radikal Üretimi... 18
2.5. Sitokinler ... 19 2.5.1. Interlökin -1 (IL-1) ... 20 2.5.2. Interlökin -6 (IL-6) ... 20 2.5.3. Interlökin -10 (IL-10) ... 21 2.5.4. Tümör Nekroz Faktör –α (TNF-α) ... 21 2.6. Beta glukan... 22 3. MATERYAL VE METOD ... 25 3.1. Materyal ... 25
VIII
3.2. Yöntem ... 26
3.2.1. Kan örneklerinin biyokimyasal analizi ... 26
3.2.1.1. Kan örneklerinin TNF-α analizi ... 27
3.2.1.2. Kan örneklerinin IL-6 analizi ... 29
3.2.1.3. Kan örneklerinin IL-10 analizi ... 30
3.2.1.4. Miyeloperoksidaz aktivitesinin ölçülmesi ... 32
3.2.2. Karaciğer ve böbrek dokularında oksidatif stres ve antioksidan savunma ... 33
3.2.2.1. Doku örneklerinin hazırlanması ... 34
3.2.2.2. MDA ölçümü ... 34 3.2.2.3. MPO ölçümü ... 36 3.2.2.4. SOD ölçümü ... 36 3.2.2.5. GPx ölçümü ... 38 3.2.2.6. GR ölçümü ... 40 3.2.2.7. CATölçümü ... 41
3.2.2.8. Total protein tayini ... 43
3.3. İstatiksel Analizler ... 44
4. BULGULAR ... 45
4.1. Vücut ağırlıkları sonuçları ... 45
4.2. Kan örneklerinin deney başlangıç ve bitiş glukoz değerlerinin analizi ... 46
4.3. Kan örneklerinin AKŞ, KOL, TRİ, HDL, LDL ve HCT analizleri ... 47
4.4. Kan örneklerinin karaciğer enzim analizleri ... 49
4.5. Kan örneklerinin immünolojik analizleri ... 50
4.6. Kan örneklerinin (Eritrosit) GPx ve GR analizleri ... 51
4.7. Karaciğer ve Böbrek dokularının MDA ve MPO analizleri ... 52
4.8. Karaciğer dokusunun antioksidan enzim analizi... 53
4.9. Böbrek dokusunun antioksidan enzim analizleri ... 54
4.10. Karaciğer ve Böbrek dokusunun total protein analizleri... 56
5. TARTIġMA ... 57
6. KAYNAKLAR ... 64
IX
KISALTMALAR
ADA : Amerika Diabet Araştırmaları AKġ : Açlık Kan Şekeri
ALT : Alanin Transferaz
AST : Aspartat Transferaz
AGE : İleri glikasyon ürünleri β-Glu : Beta glukan
CAT : Katalaz
DM : Diabetes Mellitus
DNA : Deoksiribo Nükleik Asid
GP-x : Glutatyon Peroksidaz
GSH : Glutatyon
GSSG : Okside Glutatyon
GR : Glutatyon redüktaz
HDL : Yüksek Yoğunluklu Lipoprotein
HLA : İnsan Lökosit antijenleri
HOCl : Hipoklorus Radikali HCT : Hematokrit
H2O2 : Hidrojen Peroksit
HRP : Yaban Turbu Peroksidaz
X IL-6 : İnterlökin 6
IL-1 : İnterlökin 1
IL-10 : İnterlökin 10
INT : 2-(4-iyodofenil)-3-(4-nitrofenol-5-feniltetrazolium klorür) ĠP : İntraperitoneal LDH : Laktik Dehidrogenaz LDL : Düşük Yoğunluklu Lipoprotein MDA : Malondialdehid MPO : Myeloperoksidaz NO : Nitrik Oksit
NOS : Nitrik Oksit Sentetaz
NADP : Nikotinamid Adenin Dinükletid Fosfat
NF-κB : Nüklear Faktör kapa B
PMNL : Polimorfonükleer Lökosit
ROO. : Peroksil radikali
ROS : Reaktif Oksijen Türevleri
SDS : Sodyum Dodesil Sülfat
SOR : Serbest oksijen radikalleri
O2•- : Süperoksit radikali 1
O2 : Singlet oksijen
SOD : Süperoksit Dismutaz
XI TNF-α : Tümör Nekroz Faktör alfa
TNFR I : Tümör Nekroz Faktör Reseptör tip 1
TNFR II : Tümör Nekroz Faktör Reseptör tip 2
TMB : Tetrametilbenzidin
TBA : Tiyobarbitürik Asit
TCA : Triklorasetik Asid
TBARS : Tiyobarbitürik asit reaktif maddeleri TRĠ : Trigliserid
XII
TABLO LĠSTESĠ
Tablo No Tablo BaĢlığı Sayfa No.
Tablo 4.1.Vücut ağırlıkları ... 45
Tablo 4.2. Kan örneklerinin deney başlangıç ve bitiş glukoz değerlerinin analizi . 46 Tablo 4.3. Kan Örneklerinin AKŞ, KOL ,TRİ, HDL,LDL, HCT değerlerinin analizleri ... 48
Tablo 4.4 . Kan örneklerinin karaciğer enzim analizleri ... 49
Tablo 4.5. Kan örneklerinin immunulojik analizleri ... 50
Tablo 4.6. Kan örneklerinin (eritrosit) GPx ve GR analizleri ... 51
Tablo 4.7. Karaciğer ve Böbrek dokularının MDA ve MPO analizi ... 52
Tablo 4.8. Karaciğer dokusunun antioksidan enzim analizi... 54
Tablo 4.9. Böbrek dokusunun antioksidan enzim analizi ... 55
XIII ġEKĠL LĠSTESĠ
ġekil No. ġekil BaĢlığı Sayfa No.
Sekil 2.1. Glutatyon peroksidaz ve glutatyon redüktaz aktiviteleri ... 11
ġekil 2.2. Streptozotosin’in kimyasal formülü ... 16
ġekil 2.3. Beta-glukanın genel kimyasal yapısı ... 23
ġekil 2.4. Makrofajlar, beta glukanları tanıyan ve onlara bağlanan reseptörleri ... 24
ġekil 2.5 .Makrofajlar beta-glukanların etkileri ... 24
ġekil 4.1. Deney başlangıç ve deney sonu vücut ağırlıkları ... 45
ġekil 4.2. Kan örneklerinin deney başlangıç ve bitiş glukoz değerlerinin analizi ... 46
ġekil 4.3. Kan Örneklerinin AKŞ, KOL, TRİ, HDL,LDL, HCT değerlerinin analizleri ... 48
ġekil 4.4 . Kan örneklerinin karaciğer enzim analizleri... 49
ġekil 4.5. Kan örneklerinin immunulojik analizleri... 50
ġekil 4.6. Kan örneklerinin (eritrosit) GPx ve GR analizleri ... 51
ġekil 4.7. Karaciğer ve Böbrek dokularının MDA ve MPO analizi ... 53
ġekil 4.8. Karaciğer dokusunun antioksidan enzim analizi ... 54
1
BÖLÜM 1.
GİRİŞ
Diyabet günümüzde rastlanan en yaygın metabolik hastlalıklardan birisidir. İnsülinin tamamen veya kısmi eksikliğine bağlı olarak gelişen yüksek kan şekeri ile karakterize bir hastalıktır. İnsülin eksikliğinin yanı sıra, insüline karşı gelişen direnç, diyabet gelişiminde önemli rol oynamakta; karbonhidrat, lipid ve protein metabolizmalarını etkilemektedir [1] .
Kontrol altına alınmamış ve yüksek seyreden kan şekeri uzun vadede çeşitli komplikasyonların ortaya çıkmasına yol açmaktadır. Şişmanlık, tip 2 diyabet ile birlikte kalp damar hastalıkları, böbrek yetmezliği ile sonuçlanan nefropati, sinir sistemi hastalığı nöropati, körlüğe neden olan retinopati ve ayak ülserlerine neden olmakta; felç, kangren ve koroner hastalıkların meydana gelme riskini arttırmaktadır [2] .
Serbest radikal olarak adlandırılan ürünler, fizyolojik veya patolojik reaksiyonlar sırasında oluşabilen eşlenmemiş elektronu bulunan atom ve moleküllerdir. Kendilerini nötralize etmek için diğer maddelerden elektron alırlar. Oksijen ve nitrojen kaynaklı olabilirler. Hücresel metabolizmanın hızlandığı durumlarda (infeksiyonlar, kronik inflamatuvar hastalıklar, allerjik hastalıklar, zorlu egzersiz gibi), inflamatuvar hücrelerin varlığında, yüksek oksijen basıncı, hava kirliliği, sigara dumanı, pestisid, radyasyon ilaç ve toksik maddelere maruz kalma durumlarında, iskemi-reperfüzyonda ve yaşlanma sürecinde reaktif oksijen türleri artar [3].
Serbest oksijen radikalleri (SOR) hidroksil radikali (OH.), süperoksit radikali (O2
), singlet oksijen (1O2) , peroksil radikali (ROO.) ve nitrik oksitten (NO.)
oluşmaktadır. Reaktif oksijen türlerinin hücre çoğalması, farklılaşma, apoptoz, immün cevaplar ve sinyal ileti yolakları gibi çeşitli olaylarda etkileri vardır. Serbest radikaller küçük boyutları ve yüksek enerjileriyle hücresel makro molekülleri okside edebilirler.
2
Çok sayıda hücresel bileşenin kontrolsüz oksidasyonu söz konusu olursa bu durum “oksidatif stres” olarak adlandırılır. Oksidatif stres hücrelerde lipid peroksidasyonuna, protein oksidasyonuna, DNA mutasyon ve kırıklarına, sitotoksik etkilere ve sinyal iletilerinde bozulmaya neden olabilir.
Serbest radikallerin neden olduğu hücre hasarının, yaşlanma süreci ve yaşlanmaya bağlı dejeneratif hastalıkların (Ateroskleroz, katarakt, diyabet, nörodejeneratif hastalıklar, immun sistem bozuklukları, kanser oluşumu) gelişiminde önemli rol oynadığına inanılmaktadır [1,3].
Organizmalar, oksidatif saldırılardan korunmak için çeşitli mekanizmalar geliştirmişlerdir. Hücrelerde, serbest radikallerin istenmeyen etkilerini ortadan kaldıran onların oluşumunu engelleyen savunma mekanizmaları bulunmaktadır. Hücrelerde, oksidan maddeleri inaktif hale getirerek, oksidatif hasarı önleyen, yok eden veya kısmen azaltan maddelere “antioksidanlar” adı verilmektedir. Normal fizyolojik şartlar altında antioksidan savunma sistemleri reaktif oksijen türlerini organizmaya zarar vermeyecek seviyede tutar. Ancak, serbest radikallere uzun süre maruz kalınması hücresel hasarı önlemede yetersizlikle sonuçlanır [4, 5].
Antioksidanlar endojen ve ekzojen antioksidanlar olarak sınıflandırılabilir. Katalaz (CAT), glutatyon peroksidaz (GPx), glutatyon reduktaz (GR), süperoksit dismutaz (SOD) gibi hücreiçi antioksidan enzimler ve melatonin endojen antioksidanlar; selenyum, vitamin E, asetilsalisilik asit, vitamin C gibi pek çok bitkisel kaynaklı molekül ekzojen antioksidanlar grubuna girer.
Günümüzde, ekzojen antioksidan olarak önemli bir yer tutan beta glukanlar maya, bakteri ve mantarlar ile yulaf, arpa, çavdar gibi tane yemlerin hücre duvarlarından elde edilen glukoz polimerleridir. Glukanın kendine has yapısal özelliği, glukoz moleküllerinin birbirine bağlanış şekillerinin farklılığı nedeni ile olmaktadır. Beta glukanın biyolojik aktivitesini etkileyebilen faktörler, molekül ağırlığı, dallanma derecesi, uyumluluk ve moleküller arası birleşim şekilleri bakımından olan farklılıklardır [6]. Maya ve mantarların hücre duvarındaki beta glukanlar dallanmış (1 3)(1 6)-β-D-glukoz polimeridir. Tahıllarda ise dallanmamış (1 3)(1 4)-β-D-glukanlar bulunmaktadır.
3
Mantar hücre duvarında yer alan beta glukan polisakkaridi, doğal katil hücreleri ile makrofajların fonksiyonlarını arttırarak konakçının bağışıklık sistemini kuvvetlendirir. Aynı zamanda lipid peroksidasyonunu engelleyici özellik gösterir [7]. Deneysel veriler glukanların etkin bir serbest radikal süpürücüsü olarak görev yapabileceğini ortaya koymuştur [8].
Yulaf beta glukan alımının tip 2 diabette yararlı etkileri görülmektedir. Düşük glisemik indekse sahip olan beta glukan, gastrointestinal boşalma süresini arttırarak yemek sonrası kan glukoz düzeyini ve insülin cevabını azaltır [9, 10, 11]. Günümüzde sıkça karşılaşmaya başladığımız probiyotik tanımının temelini beta glukanlar üzerine yapılan çalışmalar oluşturmaktadır [12].
Beta glukan, immün sistem üzerine etkileri olan, toksik veya yan etkisi olmayan güçlü immünostimülatör olarak tanımlanmaktadır. Bunun dışında tümör gelişiminin inhibisyonu, antibakteriyel, antifungal ve antiparazitik etki, sitokin üretiminin tetiklenmesi, makrofaj aktivasyonu, lipid düşürücü özellik, radyasyona karşı korucu etki yara iyileşmesini hızlandırıcı ve hemopoietik etkileri yapılan çalışmalar ile bildirilmiştir [12].
Oksidatif stres, diyabet ve diyabetin daha sonraki komplikasyonlarının patogenezinde önemli görev alır. Enzimatik olmayan protein glikozilasyonu, glikozillenen proteinlerin oksidasyonu, sorbitol yolu aktivitesi, antioksidan savunma sistemindeki çeşitli değişiklikler, hipoksi gibi nedenler diyabette oksidatif stresi arttıran mekanizmalardır. Diyabette serbest radikal oluşumunda artma ve radikal bağlayıcı sistemlerde azalma olduğu ileri sürülerek, diyabetiklerin antioksidanlara daha fazla ihtiyaç gösterebileceği savunulmaktadır [2].
Saccharomyces cerevisiae beta glukanının özellikle diyabetik koşullarda, inflamasyon mekanizması üzerindeki etkilerinin incelendiği çalışmalara, literatürde rastlanılmamıştır. Beta glukanların diyabetik koşullarda oluşan oksidatif hasarlara karşı antioksidan özelliklerinin ve muhtemel immün sistem destekleyici etkilerinin belirlenmesinin, günümüzde önemli sağlık sorunlarına yol açan diyabetle mücadeleye katkı sağlayacağı kuşkusuzdur. Bu nedenle, diyabetik sıçanlarda oluşan oksidatif stres ve immün sistem hasarı üzerine, beta-glukanın antioksidan ve immün sistem
4
destekleyici, özellikle inflamasyon engelleyici etkilerini araştırmak için, bu çalışma planlanmıştır.
5
BÖLÜM 2.
GENEL BİLGİLER
2.1 Oksidatif stres
Serbest radikaller dış yörüngelerinde bir ya da daha fazla ortaklanmamış elektron bulunduran ve organizmadaki diğer biyolojik moleküllerle reaksiyona girme potansiyeli gösteren kimyasal moleküllerdir [13]. Oksidatif stres, serbest oksijen radikallerinin oluşumu ve bunların yok edilmesi için antioksidan savunma arasındaki dengenin serbest oksijen radikalleri lehine bozulmasıdır.
Serbest oksijen radikalleri peroksil radikali (ROO.), hidroksil radikali (OH.), süperoksit radikali (O2•-), singlet oksijen (1O2) ve nitrik oksitten (NO.) oluşmaktadır
[13]. Oksidatif stres organizmanın temel yapıtaşı olan protein, karbonhidrat, lipid ve DNA gibi önemli moleküllere hasar verici etki göstermektedir. Özellikle, lipidler radikallerin saldırısına en hassas biyomoleküllerdir.
Serbest oksijen radikallerinin en reaktif olanı hidroksil radikalidir. DNA bazları ve deoksiriboz şekeri ile hızla reaksiyona girer [14]. Hidroksil radikali ayrıca DNA molekülü dışında diğer biyomolekülleri de hasarlama eğilimindedir. Yarılanma ömrü son derece kısa olan hidroksil radikali oksidatif strese neden olduğu gibi farklı radikallerin oluşmasına da neden olmaktadır [15].
2.1.1. Canlılarda Serbest Oksijen Radikallerinin Kaynakları
Reaktif oksijen türevleri (SOR), ekzojen kaynaklı olduğu gibi mitokondri, peroksizom, lizozom, nukleus, endoplazmik retikulum, plazma membranı gibi hücre organelleri tarafından da endojen olarak üretilir [16, 17]. Hücredeki farklı organellerin herbiri farklı miktarlarda radikal oluşumuna neden olurlar. Bunlardan başka stres, radyasyon, ksenobiyotikler ve aktif hale gelmiş fagositler de, serbest radikal üretimini arttırırlar.
6
Moleküler otooksidasyon yapan hidrokinon, katekolamin, tiol, flavonoidler, antibiyotikler, elektron transport zinciri, prostaglandin sentaz, lipooksijenaz, triptofan dioksijenaz, ksantin oksidaz, sitokrom p450, sitokrom b5, lipid peroksidasyonu ve iskemi başlıca serbest radikal üretim kaynaklarını oluşturmaktadır [15].
2.1.2. Serbest Radikallerin Hücre ve Biyomoleküller Üzerine Etkileri
Organizmada normal fizyolojik şartlar altında reaktif oksijen radikalleri ile antioksidan savunma arasında bir denge vardır [18]. Aşırı serbest oksijen radikali üretimi veya antioksidan savunmanın azalması biyomoleküllerde yapısal ve fonksiyonel değişikliklere yol açar. Bu da oksidatif strese neden olur. Örneğin yaşlılık, radikallerin hücrelerde aşırı birikimi ve bu hasarın kalıcı olması sebebiyle meydana gelmektedir.
Yaşlanma üzerine oksidatif stresin etkisini araştıran çalışmalarda bu alandaki ilk teoride, biyomoleküllerdeki oksidatif hasarın birikimi ve tüm fonksiyonların yaşa bağlı azalması şeklinde olduğu iddia edilmiştir [19]. Farklı araştırmacılar tarafından yapılan çalışmalarda serbest radikalllerin lipid, DNA ve proteinlerde hasara neden olduğu bildirilmiştir. Ayrıca in vivo DNA hasarının lipid ve protein hasarından daha tehlikeli olduğu öne sürülmektedir. Proteinlerde meydana gelen oksidatif hasar proteinlerin görev aldığı hücresel fonksiyonları da beraberinde etkilemektedir. Proteinlerdeki oksidatif hasar etkileri reseptör, transport sistemleri, sinyal ileti yolları ve enzimlerin rol aldığı hücresel olaylar üzerinde olmaktadır [20].
Serbest radikallerin, karbonhidratların bozulmasında da etkileri vardır. Oksidatif stresin etkisi ile oluşan monosakkaritlerin otooksidasyonu hidrojen peroksit, oksoaldehitler ve peroksitlerin oluşumuna neden olur. Oksoaldehitler de DNA, RNA ve proteinlerle çapraz bağlar oluşturur. Bu sayede kanser ve yaşlanma olayları tetiklenmiş olur. [21] .
SOR organizmada protein modifikasyonu, lipid peroksidasyonu, DNA zincir hasarı, baz modifikasyonu ve enzim inaktivasyonuna neden olarak oksidatif hasara yol açmaktadırlar. Bu hasarlar hücreyi bozar, yaşlandırır ve sonunda apoptozise götürür [5, 21].
7
2.1.3. Serbest Radikallerin Biyomembranlar Üzerine Etkisi
Memeli organizmalarda hücre membranları peroksidatif hasara karşı aşırı duyarlı olan çok sayıda doymamış yağ asidi (PUFA) içermektedir. Membrandaki yağ asitlerinin doymamış bağları serbest radikaller ile reaksiyona girer. Böylece peroksidasyon ürünleri oluşur. PUFA’nın yıkımı lipid peroksidasyonu olup hücrede meydana gelen en önemli hasar sebeplerindendir. Çünkü lipid peroksidasyonu bir seri zincir reaksiyonunu kendi kendine devam ettirir [21].
PUFA’dan bir hidrojen atomunun çıkması ile peroksidasyonun başlar, böylece çoklu doymamış yağ asidi bir lipid radikal özelliği kazanır. Bu lipid radikali dayanıksız bir molekül olup çift bağların yerini değiştirir ve daha sonra oksijenle reaksiyona girerek lipit peroksil radikaline dönüşür. Lipit peroksil radikalleri yine diğer doymamış yağ asitleri ile reaksiyona girer ve yeni radikaller oluşturur. Bir yandan da yapısına hidrojen atomları alır ve hidroperoksitleri oluşturur. Lipid alkoksi radikalleri de hidroperoksitlerin parçalanması ile oluşur. Bu reaksiyonlar ya antioksidan savunma ile sonlandırılır veya zincirleme şeklinde devam eder [3].
Lipit peroksitleri, aldehidler ve hidroperoksitler gibi lipid peroksidasyon ürünleri membran yapısına direk olarak etki eder, hücrenin diğer bileşenlerine ise lipid peroksidasyon ürünü olan aldehitler aracılığıyla indirekt etki eder. Bu olaylar doku hasarı ve pek çok hastalığında oluşmasına neden olur. SOR etkisi ile membran yapısındaki hasarın sonucunda malondialdehit (MDA) meydana gelir. Fe, Cu gibi redoks yapan metaller aracılığıyla lipid peroksidasyonu artar [15].
Membranlardaki PUFA’larda oluşan lipid peroksidasyonu sonucu hücre membran geçirgenliği ve kırılganlığı giderek artar. Bu hasara bağlı olarak hücre zar yapısı ile birlikte, etrafındaki diğer hücrelerin zar yapıları da bozulur ve hücre zarından iyon geçiş dengesi kaybolur. Örneğin hücre dışından hücre içine kalsiyum girişi artar. Sitoplazmadaki kalsiyum artışı fosfolipaz aktivitesini etkileyerek fosfolipid kaybına, membran geçirgenliğinde değişikliğe neden olarak zararlı maddelerin hücre içine girişine, buna bağlı olarak toksik etkinin artmasına; proteaz aktivasyonu ile proteolitik etkinin artmasına; katabolitik enzim aktivitesinin artması ile DNA kırılmalarına neden
8
olarak hücreleri yaşlanmaya götüren hasarlayıcı pek çok olayın başlamasına sebep olur. Hücrede oksidatif hasar sonucu hücre için gerekli olan potasyum iyonları da hücre dışına bırakılır [21] .
Serbest oksijen radikalleri aracılığıyla gelişen hücre zedelenmesinde üç reaksiyon önemlidir:
1- Deoksiribonükleik Asit (DNA) Lezyonları: SOR timinle reaksiyona girerek mitokondriyal ve nükleer DNA’da tek iplik kırılmasına neden olur. DNA’daki tek iplik kırılması ile meydana gelen DNA hasarı hücrede malign değişime ve hücre ölümüne neden olur.
2- Membranlarda Lipit Peroksidasyonu: Oksijen kaynaklı serbest radikaller membrandaki PUFA kolayca hasarlar. Serbest radikal membran etkileşmesi ile reaktif olan peroksitleri meydana getirir ve beraberinde otokatalitik zincir reaksiyonlarının oluşmasını sağlar.
3- Proteinlerin Çapraz Bağlanması: Proteinlerin parçalanmasının artması ve enzimatik aktivite kaybı, serbest oksijen radikalleri ile sülfidril çapraz bağlarının oluşması sonucu meydana gelmektedir. Ayrıca serbest radikaller polipeptid parçalanmasına da neden olur [22] .
2.2. Oksidatif Strese Karşı Organizmanın Savunma Sistemleri
Evrimsel gelişim sürecinde organizmalarda, serbest radikalleri yok etme zorunluluğu gelişmiştir. Bu nedenle, organizmalar oksidatif saldırıdan korunmak için çeşitli mekanizmalar geliştirmişlerdir [23]. Organizmalarda serbest radikallerin istenmeyen etkilerini ortadan kaldıran etkili savunma mekanizmaları bulunmaktadır. Serbest radikallerin meydana gelme hızı ve savunma mekanizmalarının aktiviteleri arasındaki denge sürdüğü müddetçe, organizma serbest radikalllerden etkilenmemektedir. Serbest radikallerin oluşum miktarı savunma sisteminin gücünü aşar veya savunma sistemi bu radikallere karşı etkisiz kalırsa, serbest radikallerin zararları ortaya çıkmaya başlar. Oksidatif hasar bu dengenin bozulması sonucunda ortaya çıkar [24].
9
Hücrelerde, oksidanları inaktif hale getirerek, oksidatif hasarı önleyen, yok eden veya kısmen azaltan maddelere antioksidanlar adı verilmektedir. Bütün antioksidanlar dört faklı şekilde etkilerini gösterirler:
1- Enzimler oksidanları tutarak bunları daha etkisiz zayıf bir moleküle dönüştürürler. 2- Bazı antioksidanlar, örn. Flavonoid ve vitaminler, zararlı oksidanlara bir hidrojen atomu katarak onları etkisizleştirirler.
3- Bazı antioksidanlar, oksidanların meydana getirdiği hasarları tamir ederler.
4- Bazı antioksidanlar (ağır metaller, hemoglobin, seruloplazmin, E vitamini) oksidanları bağlayarak onların fonksiyonlarını engellerler [3].
Organizmada normal fizyolojik şartlar altında antioksidan savunma sistemleri reaktif oksijen türlerini organizmaya zarar vermeyecek seviyede tutar. Fakat oksidatif saldırıya uzun süre maruz kalınması hücrelerde meydana gelen hasarı engellemede yetersiz kalmaktadır [4, 5].
Antioksidan savunma sistemleri endojen ve ekzojen antioksidanlar olarak sınıflandırılabilir.
Katalaz (CAT), glutatyon peroksidaz (GPx), glutatyon reduktaz (GR), süperoksit dismutaz (SOD) gibi antioksidan enzimler ve melatonin endojen antioksidanlar; selenyum, E vitamini, asetilsalisilik asit, C vitamini ekzojen antioksidanlardır.
Endojen antioksidanlardan (SOD) enzimi (EC 1.13.1.1), süperoksit radikalinin daha az reaktif olan hidrojen peroksit ve moleküler oksijene dönüşümünü sağlamaktadır [25]. SOD metabolizmada oksijeni kullanan tüm hücrelerde bulunmaktadır. Organizma tarafından üretilen en etkili antioksidan olup antioksidan savunma sisteminin temel belirteç faktörü olarak kullanılmaktadır [26].
SOD
10
Diğer bir enzim CAT (EC 1.11.1.6), hidrojen peroksidin su ve moleküler oksijene dönüşümünü sağlamaktadır [27]. Hücrede CAT enzimi en fazla peroksizomlarda, mitokondride daha az miktarda da sitoplazma ve endoplazmik retikulumda bulunmaktadır [13].
CAT
H2O2 + H2O2 2H2O + O2
GPx (EC 1.11.1.19), organizmada lipit hidroperoksitlerin ve hidrojen peroksidin detoksifikasyonunda rol alır. Bu sebepten ötürü glutatyon peroksidaz hücreyi lipid peroksidasyonuna karşı koruyan önemli enzimlerdendir [25]. GPx koenzim olarak glutatyonu (GSH) kullanmaktadır.
GPx
H2O2 + 2GSH 2H20 + GSSG
GPx endojen ve eksojen kaynaklı serbest radikalllerin zararlı etkilerine karşı hücreleri korumaktadır. Ayrıca aminoasitlerin hücre içine taşınması ve proteinlerdeki –SH gruplarının korunmasında önemli bir role sahiptir [3]. Hücre içinde GPx: stoplazma ve mitokondride daha yoğun olarak bulunur. Fare karaciğer peroksizomlarında da bulunmaktadır [13]. GPx enziminin aktivitesi indirgenmiş glutatyona bağlıdır. GR aktivitesi ile, glutatyonda oluşan disülfit bağı tekrar sülfidril yapısına indirgenir. [Şekil 2.1].
11
Sekil 2.1. Glutatyon peroksidaz ve glutatyon redüktaz aktiviteleri [3].
Antioksidan savunma sistemine ait bir diğer önemli enzim GR (E.C. 1.6.4.2)’ dır. Glutatyon reduktaz, hidroperoksitlerin redükte olması sırasında oluşan yükseltgenmiş glutatyonun (GSSG) indirgenmiş şekline (GSH) dönüşümünü katalizler [3] .
GR
GSSG + NADPH + H+ 2GSH + NADP+
2.3. Oksidatif Streste Oluşan Doku Hasarı ve Miyeloperoksidaz
Serbest oksijen radikalleri hem PMNL’lerin (Polimorfonükleer lökosit) hasarlı dokuda birikmesine hem de dokuya zarar vermesine neden olmaktadırlar. PMNL’nin % 90’ından fazlasını dolaşımda bulunan nötrofiller oluşturmaktadır. Monositler ve nötrofiller primer lizozomal granüllerinde MPO (E.C 1.11.1.7) ihtiva etmektedirler. Hidroksil radikalleri, ROS ve sitokinler gibi uyarılar nötrofil aktivasyonuna neden olur [3]. Dokulara giren aktif hale gelmiş PMNL’ler; elastaz, proteaz, kollejenaz, laktoferrin, katyonik proteinler ve MPO gibi enzimlerini açığa çıkarırlar. Bu enzimler hem aşırı radikal oluşmasına hem de doku hasarına neden olurlar. Nötrofillerin esas görevi
12
mikroorganizmaların sindirilmesi ve fagositoz olmasına karşın, toksik maddelerin sekresyonu ve sızıntısı yakınındaki hücrelere zarar verir.
MPO hücrede substratı olan H2O2 ile birleşir ve bunların oksidasyonu sonucu
çeşitli mekanizmalarla organizmayı etkileyebilen zararlı toksik ajanlar meydana getirir. Bu toksik ajanlar hücre ölümüne sebep olurlar. Fagositik kaynaklı oksidanlar ototoksik, immünosüpresif ve mutajenik etkiler gösterirler. Akciğerlerde iskemi-reperfüzyon sonucunda nötrofil birikimi meydana gelir. Nötrofillerden ortama salınan SOR akciğer hasarına sebep olur [3] .
Ayrıca kemotaktik faktörler, immün bir uyarı veya fagosite edilebilen partiküller yine nötrofilleri aktif hale getirir. Çeşitli faktörlerin etkisiyle gerçekleşen bu aktivasyonda nötrofil membranına bağlı NADPH oksidaz enzim sistemi uyarılmış olur ve bunun sonucunda süperoksit radikali meydana gelir. Bu olay respiratory burst (patlama) olarak adlandırılır.
Nötrofillerde yüksek konsantrasyonda bulunan MPO enzimi lizozomal kaynaklıdır ve NADPH oksidazın aracılığıyla oluşan H2O2’i kullanarak iyot, brom, klor
gibi halojenleri okside edebilir ve böylece hipohalöz asitler meydana gelir. Biyolojik moleküllerin çoğu ile reaksiyona giren hipohalöz asitler çok güçlü oksidanlardır. Nötrofillerde hipohalöz asit ve süperoksit radikalinin reaksiyonu sonucunda da hidroksil radikali açığa çıkar.
2.4. Diabetes Mellitus (Şeker Hastalığı) (DM)
Yaşam boyu devam eden, sürekli takip ve tedavi gerektiren, akut ve kronik komplikasyonları ile hastanın yaşam kalitesini azaltan, günümüzde en sık karşılaşılan metabolik hastalıklardan birisidir [3]. Glukozun organizmada yetersiz kullanımı, insülinin kısmi veya tamamen eksikliği ile ortaya çıkan hipergliseminin oluşturduğu bir grup hastalık DM sendromu olarak tanımlanmaktadır. Uzun dönemde nöropatik ve
13
vasküler komplikasyonların ortaya çıktığı glukoz ve enerji veren diğer moleküllerin bozulmuş metabolizması ile karakterize olan kronik bir hastalıktır.
Diyabet ortak başlatıcı faktörün kan glukoz düzeyinin artışı olan ve diğer patolojik mekanizmaların bir araya gelmesiyle oluşan bir hastalıktır. İnsülin eksikliği olarak isimlendirilen hormonal bozukluk ile ilişkilendirilmektedir.
Diabetes mellitus’un en son kabul edilen teşhis, tanı kriterleri ve sınıflandırması ADA [29] (Amerikan Diabet Araştırmaları)’nın 2000 yılında yayınlanmış olan raporlarına göre yapılmaktadır:
I. Tip 1 diyabet
A. İdiyopatik B. İmmun aracılı II. Tip 2 diyabet
III. Diğer spesifik tipler
A. β-hücre işlevinde genetik hata B. İnsülin etkisinde genetik hata C. Ekzokrin pankreas hastalıkları
a) Pankreatit b) Pankreatektomi D. Endokrin hastalıklar
a) Akromegali b) Cushing sendromu E. İnfeksiyonlar
F. İlaçlar ve kimyasallar
G. İmmun aracılıklı diyabetin nadir formları H. Diyabettle ilişkili diğer genetik hastalıklar
a) Turner Sendromu b) Klienfelter Sendromu c) Down Sendromu
14 2.4.1. Tip 2 Diyabet
Tip 2 diyabet pek çok faktörlerin etkisi ile oluşan bir hastalıktır. Beta hücre fonksiyon bozukluğu ve kas, karaciğer ve yağ dokuda insülin duyarlılığının azalması ile karakterizedir. Tip 2 DM her yaşta görülmekte ise de, yaygın olarak 30’ lu yaşlardan sonra ortaya çıkar.
İki önemli faktör Tip 2 DM gelişmesinde rol almaktadır. Bunlar:
1. İnsüline karşı azalmış reseptör cevabı ve reseptör duyarlılığının azalması ile ortaya çıkan postreseptör kusurlar.
2. Glukoz uyarısına karsı azalmıs akut insülin salınması ile karakterize yetersiz total insülin salınması [30].
Bunlardan başka, kalıtsal faktörlerin tip 2 diyabette etkinliğinin daha fazla olduğu belirtilmektedir. Oluşan hastalık her ne sebepten olursa olsun, insülinin kısmi veya tamamen eksikliği sonucunda hiperglisemi açığa çıkar ve bu tablonun ilerleyen döneminde yağ, karbonhidrat ve protein metabolizması da yaygın olarak etkilenerek hasarlanmaya yol açar [30, 31].
2.4.2. Diabetes Mellitus’ un Tanısal Kriterleri
1. Diyabet semptomları (idrar miktarında artış, susama, sebebi açıklanamayan kilo kaybı) ile beraber kanda plazma glukoz düzeyinin 200 mg/dl (11,1 mmol/l) ve üstünde olması,
2. Açlık plazma glukoz düzeyinin en az 8 saatlik gece açlığından sonrası 126 mg/dl (7,0 mmol /L) ve üzerinde olması.
3. Oral glukoz yükleme testi (standart 75 gramlık yükleme) sonrası 2.saat plazma glukoz düzeyinin 200 mg/dl veya üzerinde olması.
15
Bu üç ölçüt diabet uzmanlarının oluşturduğu uluslararası komisyonun kabul ettiği son tanısal ölçütlerdir. Yeni bir tanısal ölçüt olarak, bozulmuş kan glukoz düzey toleransına bozulmuş açlık glukozu (Imparied Fasting Glucoze =IFG) denilmektedir. Bozulmuş açlık glukozunda tanısal ölçüt, 8 saatlik gece açlığını takip eden süre sonunda plazma glukoz düzeyinin 100-126 mg/dl arasında olmasıdır. Bozulmus glukoz toleransı ise yemekten 2 saat sonra alınan kanda (Tokluk kan şekeri) plazma glukoz düzeyinin 140 mg/dl - 199 mg/dl arasında olmasıdır.
2.4.3. Streptozotosin (STZ) aracılığıyla oluşturulan deneysel diyabet modeli: STZ hayvanlarda diyabete neden olması ile deneysel diyabet çalışmalarında sıklıkla tercih edilen bir maddedir. STZ, Streptomyces griseus adlı mantarın küfünden elde edilen kimyasal bir toksindir. Kimyasal yapısı ise C8H15N3O7
şeklindedir. STZ, 2-deoksi-D-glukozun C-2 pozisyonuna bağlı bir metilnitrozoüre yan zincirinden oluşmaktadır (Şekil 2.2).
Şekil 2.2. Streptozotosin’in kimyasal formülü [16].
STZ nin sitotoksik etkisi intrasellüler serbest radikal oluşturulması ve NAD+
seviyelerinin azaltılması aracılığıyla gerçekleşir. STZ nin hücre içinde esas zarar verdiği yer nükleer DNA dır. STZ hücre içinde dekompozisyona uğrar, reaktif karbon iyonları açığa çıkar, bu iyonlar da DNA bazlarının alkilasyonuna neden olur, bu olayı hücrede DNA tamir mekanizmaları izler. Tüm bu olaylar sırasında nukleus enzimi
16
poli(ADPriboz) sentetaz aşırı miktarda üretilir. Bu enzimin üretimi sırasında hücrede enzim aktivitesi için NAD+
fazla tüketilir ve hücre NAD+ depoları boşalmış olur, sonucunda hücre ölümü gerçekleşir.
Farklı iddialar arasında STZ’nin uygun olmayan NO cevaplarına ve sonuçta diyabete neden olduğu belirtilmektedir [32]. STZ intravenöz, subdermal, intramüsküler ve intraperitoneal olarak uygulanabilir.
2.4.4. Diyabet ve Oksidatif Stres İle İlişkisi
Diyabet oluşumunda oksidatif stres önemli bir rol oynamaktadır. Organizmadaki hücreleri ve dokuları pekçok hastalığa karşı koruyan en temel mekanizma, serbest radikaller ile antioksidan savunma arasındaki dengedir.
Serbest radikallerin protein, lipid, DNA ve hücre organelleri üzerine hasarı son yıllarda pek çok araştırmacı tarafından incelenmektedir. SOD , CAT , GPx gibi antioksidan enzim ifadeleri ve antioksidan kapasite, pankreas adacık hücrelerinde diğer pek çok dokudan daha düşüktür [33]. Bu nedenle, pankreas β-hücreleri oksidatif strese karşı en duyarlı yapılardan biri olarak bilinir.
Beta hücrelerinde gözlenen hasarın, hipergliseminin toksik etkilerinden kaynaklandığı düşünülmektedir. Oksidatif stres ile hiperglisemi arasında var olduğu düşünülen ilişki görüşü in vivo çalışmalar ile de desteklenmiştir. Hidrojen peroksid aracılığıyla açığa çıkan son derece zararlı hidroksil radikalinin, insülin tarafından reseptör aracılığı ile düzenlenen reseptör sinyal yolunu etkilediği ileri sürülmektedir. Glikasyon aracılı serbest radikal üretiminin insülinin gen ifadesini azalttığını ve β-hücre apoptozuna yol açtığını gösteren çalışmaların bulguları bu görüşü desteklemektedir [33].
17 2.4.5. Diyabette antioksidan mekanizmalar
Normal kişilerde serbest radikaller ve antioksidan savunma denge halindedir. Diyabette ise bu denge serbest radikaller lehine bozulmuştur [34]. Bu da diabetin komplikasyonlarına neden olmaktadır.
Antioksidanlar 4 mekanizma ile oksidanları etkisizleştirir [35] .
1. Tarayıcı (Scavening) etkisi: Oksidanları zayıf moleküle çevirme şeklinde olan bu etki enzimler tarafından yapılır.
2. Baskılama (Quencher) etkisi: Oksidanlara bir hidrojen katarak etkisiz hale getirme şeklinde olan bu etki vitaminler ve flavonoidler tarafından yapılır.
3. Onarma etkisi
4. Zincir koparma etkisi: Oksidanları bağlayarak fonksiyonlarını engelleme şeklinde olan bu etki ağır metaller, hemoglobin, seruloplazmin ve E vitamini tarafından yapılır.
2.4.6. Diyabette Serbest Radikal Üretimi
Hipergliseminin etkisi ile SOR üretimi çeşitli yollarla gerçekleşmektedir. 1. Glukozun oto-oksidasyonu ve süperoksit üretimi.
2. Proteinlerin glikasyonu ve ilerlemiş glikasyon son ürünleri (AGE) oluşumu. 3. Poliol yolu [34].
Proteinlerin glikasyonu ve AGE oluşumunun yol açtığı oksidatif stres, glukooksidasyonla AGE oluşumunu hızlandırmaktadır. Oksidatif stresi arttıran ve AGE oluşumunu hızlandıran poliol yolu aktivasyonu damar duvarında doku protein kinaz C aktivasyonuna neden olmakta ve retina, lens, glomerul ile sinir dokusunda miyoinozitol düzeyinde ve protein kinaz C aktivitesinde azalmaya yol açmaktadır [34, 36, 37].
Poliol yolu hipotezine göre, glukoz girişi için insüline ihtiyaç duymayan ve aldoz reduktaz enzimi içeren lens, periferik sinirler, böbrek glomerulleri gibi dokularda
18
hiperglisemi sonucu hücre içi glukoz ve dolayısıyla sorbitol konsantrasyonu artar. Aşırı su tutucu özellikte olan sorbitolün bu dokularda birikmesi hücre ödemi ve doku hasarına neden olur [37]. Hiperglisemide poliol yolunun aktivasyonuyla NADH/NAD+ oranı artmakta ve bu da enzimatik olmayan glikasyon ve diaçilgliserolün sentezini arttırmaktadır. Diaçilgliserolun artışı da protein kinaz c aktivasyonuna yol açarak diabetteki damar patolojilerine neden olmaktadır [36, 37 ].
Oksidatif stres hipotezinde reaktif oksijen türleri ve serbest radikallerin oluşum hızı ile antioksidan savunma kapasitesi arasındaki dengesizlik diyabetin kronik komplikasyonlarına neden olmaktadır. Yani hiperglisemi oksidatif strese neden olmaktadır.
Lipid hidroperoksidler, konjuge dienler, tiyobarbitürik asit reaktif maddeler (TBARS) ve isoprosantanlar gibi oksidatif stres göstergelerinin düzeylerinin arttığı diyabetli hastalarda E, C vitaminleri, glutatyon, SOD, CAT, GPx gibi antioksidan parametrelerin azalmasının, komplikasyonların patogenezinde önemli rolü olabileceğini göstermektedir [34].
Mitokondri ve endoplazmik retikulum membranları ve plazmada bulunan lipidler, peroksidasyonun ve ROS saldırısının ana hedefidir.
Diyabetin kronik komplikasyonlarının mekanizması ile ilgili diğer bir hipotez de AGE hipotezidir. Oligosakkarit zincirlerinin enzimatik olarak proteinlere glikozidik bağ ile bağlandığı glikozilasyon, glikoprotein sentezi sırasında oluşan posttranslasyonel modifikasyondur. Bazal membran proteinleri alfa 2 makroglobulin, HLA (İnsan lökosit antijenleri) antijenleri, immunoglobulinler ve bazı hormonlar bu şekilde sentezlenen önemli glikoproteinlerdir [37].
Hiperglisemi durumlarında hücre içine alınmasının insülinden bağımsız olduğu eritrosit, beyin, lens, periferik sinirler gibi dokularda intrasellüler konsantrasyonu artan glukoz, proteinlere non-enzimatik bir tepkime sonucu bağlanmaktadır. Proteinleri terminal aminoasidindeki α-aminoasidine veya lizinin -amino grubuna glukozun bağlanması ile labil schiff bazı oluşur. Yaşam süresi kısa olan proteinlerde daha dayanıklı ve geri dönüşümlü amadori ürünleri oluşmaktadır. Bu şekilde erken glikasyon ürünleri tedavi sonucunda glukozun normale dönmesiyle azalmaktadır. Yarı ömrü uzun
19
olan proteinlerde ise geri dönüşümsüz olarak imidazol veya pirol yapısında ileri glikasyon ürünleri (AGE) oluşmaktadır.
Proteinlerin yapı işlev ve metabolizmasını etkileyen protein glikasyonunu serbest radikallerin oluşumu ve glikooksidasyon izlemektedir. Aşırı biriken inaktif proteinler DNA hasarına neden olabilir veya hücre siklusunu bozabilir. Glukoz kaynaklı amadori ürünlerinden glikooksidasyonla uzun ömürlü proteinlerdeki amino gruplarını çapraz bağlayabilen AGE bileşikleri oluşmaktadır. Böylece non-enzimatik glikasyonun artışı sonucu ortaya çıkan AGE bileşikleri diyabetin kronik komplikasyonlarını ortaya çıkarır [38, 39].
2.5. Sitokinler
Sitokinler, peptid ya da glikoprotein yapısında çözünebilen biyolojik mediyatörlerdir. Hücreler arası mesaj iletirler; immün ve inflamatuvar olaylara katılan hücrelerin etkinliğini arttırırlar. Aktive olmuş pek çok hücre (monosit, makrofaj, lenfosit ve diğer bazı hücreler) tarafından üretilip salınmaktadır. Oluşmaları ve hedef hücreleri etkilemeleri için antijenik bir uyarıya ihtiyaç duyarlar.
Sitokinler genellikle salındıkları bölgede etkilidirler. Bununla birlikte, endokrin etkileri de mevcuttur. Parakrin ve otokrin etkileri çeşitli inhibitör ve antagonist faktörlerle düzenlenebilir. Sitokinler hücre yüzeyindeki spesifik reseptörlere yüksek afinite ile bağlanırlar ve hücre içine fonksiyonel sinyal gönderirler [40].
Sitokinler, genel olarak birbiri ile ilişkili, baslıca 5 doğrultuda etkinlik gösterebilirler: 1- Kemik iliğinde hemopoietik regülasyona katılmak,
2- Bazı hipofiz hormonlarının ve diğer biyolojik maddelerin sentez ve salınmalarına neden olmak,
3- Lenfoid hücrelerin çoğalma ve farklılaşmasını sağlamak,
20
5- Enflamasyon olaylarına katılan hücreleri aktive etmek, reaksiyon yerine toplayarak orada tutmak, çeşitli biyolojik etkinlikler göstermek.
Sitokinler inflamatuvar cevabın regülasyonu ve organ fonksiyonlarının homeostazisinde görev yapmak için kompleks bir ağ oluştururlar. Lenfokinler en önemli sitokinlerdendir.
2.5.1. Interlökin -1 (IL-1) :
IL-1 esas olarak makrofajlarda üretilir. İn vitro kosullarda, IL-1; diğer lenfokinlerin (IL-2, IL-3, IL-4 ve IL-6) miktarını arttırır, pıhtı oluşumuna yol açan endotelyal faktör miktarını arttırarak vasküler konjesyon oluşumuna neden olur. IL-1 histamin salınımına neden olur. IL-1 prostaglandin E2 sentezinde artışa neden olan
araşidonik asit metabolitlerini arttırır.
IL-1 alfa ve IL-1 beta olmak üzere iki formu vardır. İnsan pankreas adacık hücrelerinin uzun süreyle yüksek glukoza maruz kalması sonucunda, pankreas hücrelerinde IL-1 beta yapımının uyarıldığı, bununda NF-kB (nuclear factor-kB) aktivasyonu ve Fas sinyalinin up-regülasyonuna yol açtığı ve tüm bunların da otokrin apoptozisi tetiklediği iddia edilmektedir [41].
2.5.2. Interlökin -6 (IL-6) :
İnterlökin-6 (IL-6) yaklaşık 26 kD luk bir sitokin olup, mononükleer fagositler, endotel, fibroblastlar, yağ hücreleri, bazı aktif T hücreleri gibi pek çok hücre tarafından sentez edilir. IL-6’nın en iyi tanımlanan etkileri hepatositler ve B lenfositleri üzerine olup, akut faz yanıtına katkıda bulunan birçok plazma proteininin hepatositler tarafından sentezine neden olur . IL-6 düzeylerinin TNF-α ve obeziteye bağlı insülin direnciyle daha sıkı ilişkili olduğu düşünülmüştür [42] .
Yağ dokusundan salgılanan ve insülin direncinde rol alan IL-6 pek çok dokudan da salgılanabilir ve yemeklerden sonra da yükselmektedir. Yağ stromal hücreleri ve adipozitleri içeren birçok hücreden salgılandığı gösterilmiştir.
21
Günümüzde, TNF-α ve IL-6’nın insülin direnci ile ilişkili olan temel dolaşım komponentleri olduğu ileri sürülmektedir [42] .
2.5.3. Interlökin -10 (IL-10) :
18 KD ağırlığında bir sitokindir. Aktive olmuş makrofajlar, bazı T lemfositler ve non-lenfositik hücreler (keratinositler) tarafından üretilmektedir.
Makrofajlar tarafından salınan TNF alfa, IL-1, IL-12 sentezini inhibe eder ve T hücre aktivasyonunda makrofajların yardımcı rollerini baskılar. IL-6 ve TNF-alfa gibi inflamatuvar sitokinlerin üretimini inhibe ederek, makrofaj ve lenfositler aracılığı ile oluşan güçlü inflamatuvar yanıtı işlemez duruma getirir. IL-10 inflamatuar cevapta rol alan temel düzenleyici sitokindir. T helper-1 ve T helper-2 hücrelerinin sitokinlere cevabını ve proliferasyonunu inhibe eder.
2.5.4. Tümör Nekroz Faktör-alfa (TNF-α) :
İmmün fonksiyonları düzenleyen TNF-α, ilk kez yağ doku makrofajlarından salgılandığı saptanmış, ancak, daha sonraları yağ hücrelerinden de salgılandığı tespit edilmiştir. Ayrıca lenfositler tarafından da salgılanır. TNF-α leptin üretimini arttrırır, yağ hücre sayı ve hacmini düzenler ve lipolizi uyarır. TNF-α tümör hücrelerinde apoptozise neden olur, hücrede insülin resptörlerinin sayısını azaltarak insülin direncine neden olur. Ayrıca insülin reseptörlerinin tirozin kinaz aktivitesini bozarak hücrelerin glukoz alımını azaltır [43, 44, 45]. Her ikisi de aktif, membrana bağlı ve serbest iki formu bulunmaktadır.
TNF- α’nın iki tip reseptörü vardır: tip 1 (TNFRI) ve
tip 2 (TNFRII).
TNFRII’ nin aynı zamanda insülin direnci sendromunun patogenezinde baskın bir rol oynadığı düşünülür. Son yıllarda yapılan çalışmalarda tip 2 DM patogenezinde TNFRII geninde mutasyonun önemli olduğu görülmektedir. Tip 2 DM ve
22
mikrovasküler komplikasyonlarında; TNF-α’nın büyümeyi uyarma, sitotoksisite ve anjiyogenez gibi önemli fonksiyonları vardır.
Diyabette oksidatif stres ile açığa çıkan radikallerin non-enzimatik glikozilasyona neden olması sonucu oluşan son ürünlerin makrofajlara bağlanarak TNF-α ve IL-6 gibi sitokinlerin salınımının uyarılması, diyabete insülin direnci üzerinden sitokinlerin neden olduğunu açıklayan bir mekanizmadır [46, 47]. Dolayısıyla diyabetin mi inflamasyonu devreye soktuğu yoksa inflamasyonun mu diabete neden olduğu henüz tam açıklığa kavuşmamıştır.
2.6. Beta glukan (β-Glu)
Beta glukanlar maya, bakteri ve mantarlar ile yulaf, arpa, çavdar gibi tane yemlerin hücre duvarlarından elde edilen glukoz polimerleridir. Glukanın kendine has yapısal özelliği, glukoz moleküllerinin birbirine bağlanış şekillerinin farklılığı nedeni ile olmaktadır. Beta glukanın biyolojik aktivitesini etkileyebilen faktörler, molekül ağırlığı, dallanma derecesi, uyumluluk ve moleküller arası birleşim şekilleri bakımından olan farklılıklardır [6,12]. Maya ve mantarların hücre duvarındaki beta glukanlar dallanmış (1 3)(1 6)-β-D-glukoz polimeridir. Tahıllarda ise dallanmamış (1 3)(1 4)-β-D-glukanlar bulunmaktadır. Ticari olarak kullanılan beta-glukan ekstresi genellikle ekmek mayasından yani Saccharomyces cerevisiae’den elde edilir [48]. Ayrıca Phellinus linteus veya Sparassis crispa gibi mantarlardan elde edilen ve piyasada yaygın olarak satılan pek çok beta-glukan preperatı mevcuttur.
23
Şekil 2.3. Beta-glukanın genel kimyasal yapısı [6].
Çözülebilir beta glukan, oral olarak alındığında gastrointestinal sistemden emilerek sistemik dolaşıma katılmaktadır. Dolaşıma katılan beta glukan, monositler ve nötrofiller üzerindeki reseptörlere kompetitif olarak bağlanmaktadır. Ayrıca beta glukanlar makrofajların fagositik kapasitesini ve sitotoksisitesini arttırmaktadır [49].
Organizmada Beta glukanlar güçlü immün stimülatörler olarak kabul edilmektedirler. Hem doğal hem de kazanılmış immüniteyi etkilemektedir [50]. Antitümör, antiviral, antibakteriyel, antifungal aktivitelerinin olduğunu, yara iyileşmesine yararlı etkileri olduğunu ve skar dokusunu azalttığını gösteren yayınlara ilave olarak beta glukanın antioksidan etkileri literatürde bulunmaktadır [7,51] .
Beta glukan alımının, kan kolestrolünü düşürdüğü ve vücut hücreleri tarafından glukoz kullanımını arttırdığı insanlar üzerinde yapılan çalışmalarda gösterilmiştir [52]. Yine, insanlarda diyete %10 beta glukan ilave edildiğinde, glukoz toleransının arttığı gösterilmiştir [53].
Beta glukanın en önemli biyolojik aktivitesi immün sistemi desteklemesidir. Çünkü bu aktivitesine bağlı olarak diğer etkileri gerçekleşir. İmmün sistem kontrolünde veya makrofaj fagositozunu ayarlamada rol alan sitokinlerin makrofajlardan salınımını uyarma veya engelleme yeteneği de, beta glukanın immünoregülatör aktiviteleri ile ilişkilidir [53] . Beta glukanın sitokinlerin salınımı için makrofajlara bağlanarak onları aktive ettiği hayvanlarla yapılan bazı çalışmalarda, gösterilmiştir [53, 54] .
24
Sekil 2.4. Makrofajlar, beta glukanları tanıyan ve onlara bağlanan reseptörlere sahiptirler.
(http://immupet.com/Scientifically-Proven.cfm).
Sekil 2.5. Makrofajlar beta-glukanların etkilerine aracılık ederler. (http://immupet.com/Scientifically-Proven.cfm)
Deneysel veriler glukanların etkin bir serbest radikal süpürücüsü olarak görev yapabileceğini ortaya koymuştur [8].
Yulaf beta glukan alımının tip 2 diabette yararlı etkileri görülmektedir. Düşük glisemik indekse sahip olan beta glukan, gastointestinal boşalma süresini arttırarak yemek sonrası kan glukoz düzeyini ve insülin cevabını azaltır [9, 10, 11] .
Glukanların farklı zincir yapıları ve çözünebilirliği insülin ve glukoz cevabını değiştirmektedir [55].
25
BÖLÜM 3.
MATERYAL ve METOD
Çalışmanın deneysel aşaması için Trakya Üniversitesi Deney Hayvanları Yerel Etik Kurulu’ndan 08.11.2012 tarih ve 2012.08.01 sayılı karar ile onay alınmıştır. Çalışma, TÜBAP tarafından 2013/11 nolu proje ile desteklenmiştir.
3.1. Materyal
Çalışmada T.Ü. Deney Hayvanları Araştırma Merkezinde yetiştirilen 8–12 haftalık (yaklaşık 300-400 gr) Spraque Dawley erkek sıçanlar (40 adet) kullanıldı. Hayvanların bakımı ve deney aşaması bu merkezde yürütüldü. Standart pellet yem ve su ile beslenen hayvanlar, 22 ± 2 o
C oda ısısı, % 60 nem oranı ve 12 saat aydınlık/12 saat karanlık periyodunda tutuldular.
Hayvanlar, vücut ağırlıkları ölçülerek 4 gruba ayrıldı:
Kontrol grubu (n=10) : Hiçbir işlem yapılmadan pellet yem ve su ile beslendiler. Diyabet grubu (n=10) : İntraperitoneal enjeksiyon yoluyla STZ (Streptozotosin: Sigma) uygulanarak diyabet oluşturuldu. Sitrat tampon ile (pH 4.5) hazırlanan STZ 60 mg/kg’ lık dozda IP (İntraperitoneal) enjeksiyon ile verildi [56]. STZ uygulandıktan 24 saat sonra, kuyruk venlerinden alınan kan örneklerinde glukoz oksidaz yöntemi ile kan glukoz değerleri ölçüldü ve 200 mg/dl nin üzerindeki değerlere sahip hayvanlar diyabetik olarak kabul edildi. Bu grupta 3 hayvan deney sürecinde kaybedildi.
Beta-glukan grubu (n=10) : Bu gruptaki hayvanlara, beta glukan 50 mg/kg/gün olacak şekilde gavaj yoluyla (nazogastrik sonda ile) 10 gün süreyle günde bir defa olarak uygulandı [48]. Beta glukan, Saccharomyces cerevisiae’den elde edilen mikropartiküler formda hazırlanmış ilaç (Immunex, Mustafa Nevzat ilaç san.) olarak kullanıldı. Immunex kapsüller % 0.9 serum fizyolojik içinde çözülerek hayvanlara verildi.
Diyabet + Beta glukan grubu (n=10) : STZ ile diyabetik yapılmış sıçanlara beta glukan 50 mg/kg/gün olacak şekilde gavaj yoluyla (nazogastrik sonda ile) 10 gün süreyle günde bir defa olarak uygulandı. Immunex kapsüller % 0.9 serum fizyolojik içinde çözülerek hayvanlara verildi. Bu grupta 3 hayvan deney sürecinde kaybedildi.
26
10 günlük deney süresi sonunda, vücut ağırlıkları ölçülen hayvanlara rampun (10 mg/kg) ve ketalar (50 mg/kg) anestezisi İP olarak uygulandı. Anestezi altında açılan hayvanlardan intrakardiyak kan (yaklaşık 8 cc) örnekleri ile karaciğer ve böbrek doku örnekleri alındı. Kan örnekleri 3500 rpm’de 10 dak. santifüj edilerek serumları ayrıldı [57]. Doku örnekleri % 0.9 serum fizyolojik ile yıkandı. Serum ve doku örnekleri analiz gününe kadar -80 C’de saklandılar. Kan örneklerinde biyokimyasal, immünolojik analizler ile oksidatif stres ve antioksidan parametreler; doku örneklerinde ise oksidatif stres ve antioksidan parametreler incelendi.
3.2. Yöntem
Çalışılacak tüm parametrelerin analizleri 2 grup (Kan örnekleri ve Doku örnekleri) halinde yapıldı. Kan örneklerinin biyokimyasal analizi için beslenmeden 12 saat sonra örnekler alındı.
3.2.1. Kan Örneklerinin Biyokimyasal Analizi:
Yağ metabolizma analizleri: Kolesterol, trigliserit, HDL ve LDL Karbonhidrat metabolizma analizi: Açlık Kan Şekeri
Karaciğer metabolizma analizleri: LDH, ALT, AST
İmmün sistem analizleri: TNF-α, Interlökin-6 ve Interlökin-10
Oksidatif stres ve antioksidan savunma analizi: Eritrositlerdeki GPx, GR enzimleri
Serumlardaki enzim aktiviteleri (AST, ALT, LDH), açlık kan şekeri (AKŞ), kolesterol (KOL), trigliserit (TRİ), HDL, LDL değerleri otoanalizör ile (ADVİA 1800 Siemens Germany); Hematokrit ölçümü (Electro-mag Germany) santrifüj ile yapıldı. Sitokin (TNF α -, IL-6 ve IL-10) düzeyleri “Rat Alpha ELISA Kit, Invitrogen” kullanılarak Bio-tek Elx-800 ELISA okuyucu ile ölçüldü.
Elisa Yöntemi
Yöntemin prensibi biyolojik bir çözeltide bulunan ve antijenik özellik gösteren bir hücresel yapının varlığını ve miktarını saptamak için o yapıyı tanıyan bir antikorla
27
muamele etmek ve bağlanma gerçekleşen madde miktarını renk veren bir substrat yardımıyla saptamaktır.
ELISA deneyinin en basit uygulaması olan direkt ELİSA’nın basamakları şöyledir: İncelenecek maddenin bulunduğu çözelti plastik, ışık geçirgen, düz zeminli kuyucukların bulunduğu plakaya etiketlenerek konur.
Ortamdaki protein bağlanma noktalarını bloklamak için bloklama tamponu kuyucuğa eklenir.
Aranan antijenik yapıdaki maddeye özgün antikor ortama eklenir.
Birinci antikoru tanıyan ikincil antikor-HRP (Horse-radish peroksidaz) konjugatı ortama eklenir.
Son olarak HRP ile reaksiyona girerek onu görünür hale getiren TMB (3,3’,5,5’-tetrametilbenzidin) eklenir.
Hızlıca spektrofotometrik ölçüm yapan ELİSA okuyucu ile kuyucuklar okunur.
3.2.1.1. Tümör Nekroz Faktör- α ölçülmesi
TNF-α standart seri Tüp Konsantrasyon 1 750 pg/ml 2 375 pg/ml 3 187.5 pg/ml 4 93.8 pg/ml 5 46.9 pg/ml 6 23.4 pg/ml 7 11.7 pg/ml 8 0 pg/ml
28 Kit içeriği
Sıçan TNF-α standart
Standart sulandırma tamponu İnkübasyon tamponu
Sıçan TNF- α yüksek ve düşük kontroller Antikor kaplı küvetler (12 8 plate) Sıçan TNF- α biotin konjugatı Streptavidin HRP konsantresi
Streptavidin HRP çözücüsü Yıkama tampon konsantresi TMB
Durdurma solüsyonu Plaka kapatan yapışkanlar
Yöntem
1. Mikroplaka antikor ile kaplıdır
2. Sulandırma standart / numune 100 l ... 120 dakika, 20-25 C 3. 4 defa yıkanır
4. Biotinlenmiş takip antikoru 100 l ... 60 dakika, 20-25 C 5. 4 defa yıkanır
6. Streptavidin –peroxidase konjugat 100 l ... 30 dakika, 20-25 C 7. 4 defa yıkama
8. TMB solüsyonu 100 l (karanlıkta) ... 30 dakika, 20-25 C 9. Durdurma solüsyonu 100 l
29 3.2.1.2. Interlökin-6 ölçülmesi
IL-6 Standart seri
Kit içeriği
Sıçan IL-6 standart
Standart sulandırma tamponu İnkübasyon tamponu
Sıçan IL-6 yüksek ve düşük kontroller Antikor kaplı küvetler (12 8 plate) Sıçan IL-6 biotin konjugatı
Streptavidin HRP konsantresi Streptavidin HRP çözücüsü Yıkama tampon konsantresi TMB
Durdurma solüsyonu Plaka kapatan yapışkanlar
Tüp Konsantrasyon 1 1500 pg/ml 2 750 pg/ml 3 375 pg/ml 4 187.5pg/ml 5 93.8 pg/ml 6 46.9 pg/ml 7 23.5 pg/ml 8 0 pg/ml
30 Yöntem
1. Mikroplate antikor ile kaplıdır
2. Sulandırma standart/numune 100 l (serum1:2 sulandırma) 120 dakika, 20-25oC 3. 4 defa yıkanır
4. Biotinlenmiş takip antikoru 100 l ……… 90 dakika, 20-25 oC 5. 4 defa yıkanır
6. Streptavidin –peroxidase konjugat 100 l……….. 30dakika, 20-25 oC 7. 4 defa yıkama
8. TMB solüsyonu 100 l (karanlıkta)………. 30 dakika, 20-25 oC 9. Durdurma solüsyonu 100 l
10. 450 nm’de absorbans ölçümü yapılır.
3.2.1.3. Interlökin-10 ölçülmesi
IL-10 Standart seri
Tüp Konsantrasyon 1 1000 pg/ml 2 500 pg/ml 3 250 pg/ml 4 125 pg/ml 5 62.5 pg/ml 6 31.2 pg/ml 7 15.6 pg/ml 8 0 pg/ml
31 Kit içeriği
Sıçan IL-10 standart
Standart sulandırma tamponu İnkübasyon tamponu
Sıçan IL-10 yüksek ve düşük kontroller Antikor kaplı küvetler (12 8 plate) Sıçan IL-10 biotin konjugatı Streptavidin HRP konsantresi Streptavidin HRP çözücüsü
Yıkama tampon konsantresi TMB
Durdurma solüsyonu Plaka kapatan yapışkanlar
Yöntem
1. Mikroplate antikor ile kaplıdır
2. Sulandırma standart /numune 100 l (1:2 standart dilüent ile dilüe) (120 dakika 20-25 C)
3. 4 defa yıkanır
4. Biotinlenmiş izleyici antikor 50 l……….. .. 120 dakika, 20-25 C 5. 4 defa yıkanır
6. Streptavidin –peroxidase konjugat 100 l ……… 30dakika, 20-25 C 7. 4 defa yıkama
8. TMB solüsyonu 100 l (karanlıkta)………... 30 dakika, 20-25 C 9. Durdurma solüsyonu 100 l
32 3.2.1.4. Miyeloperoksidaz aktivitesinin ölçülmesi
MPO standart seri
Tüp Konsantrasyon 1 125 ng/ml 2 63 ng/ml 3 31 ng/ml 4 15.6 ng/ml 5 7.8 ng/ml 6 3.9 ng/ml 7 0 ng/ml Kit içeriği
Sıçan MPO standart
Standart sulandırma tamponu İnkübasyon tamponu
Sıçan MPO yüksek ve düşük kontroller Antikor kaplı küvetler (12 8 plate) Sıçan MPO biotin konjugatı Streptavidin HRP konsantresi
Streptavidin HRP çözücüsü Yıkama tampon konsantresi TMB
Durdurma solüsyonu Plaka kapatan yapışkanlar
