Sitokinler, peptid ya da glikoprotein yapısında çözünebilen biyolojik mediyatörlerdir. Hücreler arası mesaj iletirler; immün ve inflamatuvar olaylara katılan hücrelerin etkinliğini arttırırlar. Aktive olmuş pek çok hücre (monosit, makrofaj, lenfosit ve diğer bazı hücreler) tarafından üretilip salınmaktadır. Oluşmaları ve hedef hücreleri etkilemeleri için antijenik bir uyarıya ihtiyaç duyarlar.
Sitokinler genellikle salındıkları bölgede etkilidirler. Bununla birlikte, endokrin etkileri de mevcuttur. Parakrin ve otokrin etkileri çeşitli inhibitör ve antagonist faktörlerle düzenlenebilir. Sitokinler hücre yüzeyindeki spesifik reseptörlere yüksek afinite ile bağlanırlar ve hücre içine fonksiyonel sinyal gönderirler [40].
Sitokinler, genel olarak birbiri ile ilişkili, baslıca 5 doğrultuda etkinlik gösterebilirler: 1- Kemik iliğinde hemopoietik regülasyona katılmak,
2- Bazı hipofiz hormonlarının ve diğer biyolojik maddelerin sentez ve salınmalarına neden olmak,
3- Lenfoid hücrelerin çoğalma ve farklılaşmasını sağlamak,
20
5- Enflamasyon olaylarına katılan hücreleri aktive etmek, reaksiyon yerine toplayarak orada tutmak, çeşitli biyolojik etkinlikler göstermek.
Sitokinler inflamatuvar cevabın regülasyonu ve organ fonksiyonlarının homeostazisinde görev yapmak için kompleks bir ağ oluştururlar. Lenfokinler en önemli sitokinlerdendir.
2.5.1. Interlökin -1 (IL-1) :
IL-1 esas olarak makrofajlarda üretilir. İn vitro kosullarda, IL-1; diğer lenfokinlerin (IL-2, IL-3, IL-4 ve IL-6) miktarını arttırır, pıhtı oluşumuna yol açan endotelyal faktör miktarını arttırarak vasküler konjesyon oluşumuna neden olur. IL-1 histamin salınımına neden olur. IL-1 prostaglandin E2 sentezinde artışa neden olan
araşidonik asit metabolitlerini arttırır.
IL-1 alfa ve IL-1 beta olmak üzere iki formu vardır. İnsan pankreas adacık hücrelerinin uzun süreyle yüksek glukoza maruz kalması sonucunda, pankreas hücrelerinde IL-1 beta yapımının uyarıldığı, bununda NF-kB (nuclear factor-kB) aktivasyonu ve Fas sinyalinin up-regülasyonuna yol açtığı ve tüm bunların da otokrin apoptozisi tetiklediği iddia edilmektedir [41].
2.5.2. Interlökin -6 (IL-6) :
İnterlökin-6 (IL-6) yaklaşık 26 kD luk bir sitokin olup, mononükleer fagositler, endotel, fibroblastlar, yağ hücreleri, bazı aktif T hücreleri gibi pek çok hücre tarafından sentez edilir. IL-6’nın en iyi tanımlanan etkileri hepatositler ve B lenfositleri üzerine olup, akut faz yanıtına katkıda bulunan birçok plazma proteininin hepatositler tarafından sentezine neden olur . IL-6 düzeylerinin TNF-α ve obeziteye bağlı insülin direnciyle daha sıkı ilişkili olduğu düşünülmüştür [42] .
Yağ dokusundan salgılanan ve insülin direncinde rol alan IL-6 pek çok dokudan da salgılanabilir ve yemeklerden sonra da yükselmektedir. Yağ stromal hücreleri ve adipozitleri içeren birçok hücreden salgılandığı gösterilmiştir.
21
Günümüzde, TNF-α ve IL-6’nın insülin direnci ile ilişkili olan temel dolaşım komponentleri olduğu ileri sürülmektedir [42] .
2.5.3. Interlökin -10 (IL-10) :
18 KD ağırlığında bir sitokindir. Aktive olmuş makrofajlar, bazı T lemfositler ve non-lenfositik hücreler (keratinositler) tarafından üretilmektedir.
Makrofajlar tarafından salınan TNF alfa, IL-1, IL-12 sentezini inhibe eder ve T hücre aktivasyonunda makrofajların yardımcı rollerini baskılar. IL-6 ve TNF-alfa gibi inflamatuvar sitokinlerin üretimini inhibe ederek, makrofaj ve lenfositler aracılığı ile oluşan güçlü inflamatuvar yanıtı işlemez duruma getirir. IL-10 inflamatuar cevapta rol alan temel düzenleyici sitokindir. T helper-1 ve T helper-2 hücrelerinin sitokinlere cevabını ve proliferasyonunu inhibe eder.
2.5.4. Tümör Nekroz Faktör-alfa (TNF-α) :
İmmün fonksiyonları düzenleyen TNF-α, ilk kez yağ doku makrofajlarından salgılandığı saptanmış, ancak, daha sonraları yağ hücrelerinden de salgılandığı tespit edilmiştir. Ayrıca lenfositler tarafından da salgılanır. TNF-α leptin üretimini arttrırır, yağ hücre sayı ve hacmini düzenler ve lipolizi uyarır. TNF-α tümör hücrelerinde apoptozise neden olur, hücrede insülin resptörlerinin sayısını azaltarak insülin direncine neden olur. Ayrıca insülin reseptörlerinin tirozin kinaz aktivitesini bozarak hücrelerin glukoz alımını azaltır [43, 44, 45]. Her ikisi de aktif, membrana bağlı ve serbest iki formu bulunmaktadır.
TNF- α’nın iki tip reseptörü vardır: tip 1 (TNFRI) ve
tip 2 (TNFRII).
TNFRII’ nin aynı zamanda insülin direnci sendromunun patogenezinde baskın bir rol oynadığı düşünülür. Son yıllarda yapılan çalışmalarda tip 2 DM patogenezinde TNFRII geninde mutasyonun önemli olduğu görülmektedir. Tip 2 DM ve
22
mikrovasküler komplikasyonlarında; TNF-α’nın büyümeyi uyarma, sitotoksisite ve anjiyogenez gibi önemli fonksiyonları vardır.
Diyabette oksidatif stres ile açığa çıkan radikallerin non-enzimatik glikozilasyona neden olması sonucu oluşan son ürünlerin makrofajlara bağlanarak TNF-α ve IL-6 gibi sitokinlerin salınımının uyarılması, diyabete insülin direnci üzerinden sitokinlerin neden olduğunu açıklayan bir mekanizmadır [46, 47]. Dolayısıyla diyabetin mi inflamasyonu devreye soktuğu yoksa inflamasyonun mu diabete neden olduğu henüz tam açıklığa kavuşmamıştır.
2.6. Beta glukan (β-Glu)
Beta glukanlar maya, bakteri ve mantarlar ile yulaf, arpa, çavdar gibi tane yemlerin hücre duvarlarından elde edilen glukoz polimerleridir. Glukanın kendine has yapısal özelliği, glukoz moleküllerinin birbirine bağlanış şekillerinin farklılığı nedeni ile olmaktadır. Beta glukanın biyolojik aktivitesini etkileyebilen faktörler, molekül ağırlığı, dallanma derecesi, uyumluluk ve moleküller arası birleşim şekilleri bakımından olan farklılıklardır [6,12]. Maya ve mantarların hücre duvarındaki beta glukanlar dallanmış (1 3)(1 6)-β-D-glukoz polimeridir. Tahıllarda ise dallanmamış (1 3)(1 4)-β-D- glukanlar bulunmaktadır. Ticari olarak kullanılan beta-glukan ekstresi genellikle ekmek mayasından yani Saccharomyces cerevisiae’den elde edilir [48]. Ayrıca Phellinus linteus veya Sparassis crispa gibi mantarlardan elde edilen ve piyasada yaygın olarak satılan pek çok beta-glukan preperatı mevcuttur.
23
Şekil 2.3. Beta-glukanın genel kimyasal yapısı [6].
Çözülebilir beta glukan, oral olarak alındığında gastrointestinal sistemden emilerek sistemik dolaşıma katılmaktadır. Dolaşıma katılan beta glukan, monositler ve nötrofiller üzerindeki reseptörlere kompetitif olarak bağlanmaktadır. Ayrıca beta glukanlar makrofajların fagositik kapasitesini ve sitotoksisitesini arttırmaktadır [49].
Organizmada Beta glukanlar güçlü immün stimülatörler olarak kabul edilmektedirler. Hem doğal hem de kazanılmış immüniteyi etkilemektedir [50]. Antitümör, antiviral, antibakteriyel, antifungal aktivitelerinin olduğunu, yara iyileşmesine yararlı etkileri olduğunu ve skar dokusunu azalttığını gösteren yayınlara ilave olarak beta glukanın antioksidan etkileri literatürde bulunmaktadır [7,51] .
Beta glukan alımının, kan kolestrolünü düşürdüğü ve vücut hücreleri tarafından glukoz kullanımını arttırdığı insanlar üzerinde yapılan çalışmalarda gösterilmiştir [52]. Yine, insanlarda diyete %10 beta glukan ilave edildiğinde, glukoz toleransının arttığı gösterilmiştir [53].
Beta glukanın en önemli biyolojik aktivitesi immün sistemi desteklemesidir. Çünkü bu aktivitesine bağlı olarak diğer etkileri gerçekleşir. İmmün sistem kontrolünde veya makrofaj fagositozunu ayarlamada rol alan sitokinlerin makrofajlardan salınımını uyarma veya engelleme yeteneği de, beta glukanın immünoregülatör aktiviteleri ile ilişkilidir [53] . Beta glukanın sitokinlerin salınımı için makrofajlara bağlanarak onları aktive ettiği hayvanlarla yapılan bazı çalışmalarda, gösterilmiştir [53, 54] .
24
Sekil 2.4. Makrofajlar, beta glukanları tanıyan ve onlara bağlanan reseptörlere sahiptirler.
(http://immupet.com/Scientifically-Proven.cfm).
Sekil 2.5. Makrofajlar beta-glukanların etkilerine aracılık ederler. (http://immupet.com/Scientifically-Proven.cfm)
Deneysel veriler glukanların etkin bir serbest radikal süpürücüsü olarak görev yapabileceğini ortaya koymuştur [8].
Yulaf beta glukan alımının tip 2 diabette yararlı etkileri görülmektedir. Düşük glisemik indekse sahip olan beta glukan, gastointestinal boşalma süresini arttırarak yemek sonrası kan glukoz düzeyini ve insülin cevabını azaltır [9, 10, 11] .
Glukanların farklı zincir yapıları ve çözünebilirliği insülin ve glukoz cevabını değiştirmektedir [55].
25
BÖLÜM 3.
MATERYAL ve METOD
Çalışmanın deneysel aşaması için Trakya Üniversitesi Deney Hayvanları Yerel Etik Kurulu’ndan 08.11.2012 tarih ve 2012.08.01 sayılı karar ile onay alınmıştır. Çalışma, TÜBAP tarafından 2013/11 nolu proje ile desteklenmiştir.
3.1. Materyal
Çalışmada T.Ü. Deney Hayvanları Araştırma Merkezinde yetiştirilen 8–12 haftalık (yaklaşık 300-400 gr) Spraque Dawley erkek sıçanlar (40 adet) kullanıldı. Hayvanların bakımı ve deney aşaması bu merkezde yürütüldü. Standart pellet yem ve su ile beslenen hayvanlar, 22 ± 2 o
C oda ısısı, % 60 nem oranı ve 12 saat aydınlık/12 saat karanlık periyodunda tutuldular.
Hayvanlar, vücut ağırlıkları ölçülerek 4 gruba ayrıldı:
Kontrol grubu (n=10) : Hiçbir işlem yapılmadan pellet yem ve su ile beslendiler. Diyabet grubu (n=10) : İntraperitoneal enjeksiyon yoluyla STZ (Streptozotosin: Sigma) uygulanarak diyabet oluşturuldu. Sitrat tampon ile (pH 4.5) hazırlanan STZ 60 mg/kg’ lık dozda IP (İntraperitoneal) enjeksiyon ile verildi [56]. STZ uygulandıktan 24 saat sonra, kuyruk venlerinden alınan kan örneklerinde glukoz oksidaz yöntemi ile kan glukoz değerleri ölçüldü ve 200 mg/dl nin üzerindeki değerlere sahip hayvanlar diyabetik olarak kabul edildi. Bu grupta 3 hayvan deney sürecinde kaybedildi.
Beta-glukan grubu (n=10) : Bu gruptaki hayvanlara, beta glukan 50 mg/kg/gün olacak şekilde gavaj yoluyla (nazogastrik sonda ile) 10 gün süreyle günde bir defa olarak uygulandı [48]. Beta glukan, Saccharomyces cerevisiae’den elde edilen mikropartiküler formda hazırlanmış ilaç (Immunex, Mustafa Nevzat ilaç san.) olarak kullanıldı. Immunex kapsüller % 0.9 serum fizyolojik içinde çözülerek hayvanlara verildi.
Diyabet + Beta glukan grubu (n=10) : STZ ile diyabetik yapılmış sıçanlara beta glukan 50 mg/kg/gün olacak şekilde gavaj yoluyla (nazogastrik sonda ile) 10 gün süreyle günde bir defa olarak uygulandı. Immunex kapsüller % 0.9 serum fizyolojik içinde çözülerek hayvanlara verildi. Bu grupta 3 hayvan deney sürecinde kaybedildi.
26
10 günlük deney süresi sonunda, vücut ağırlıkları ölçülen hayvanlara rampun (10 mg/kg) ve ketalar (50 mg/kg) anestezisi İP olarak uygulandı. Anestezi altında açılan hayvanlardan intrakardiyak kan (yaklaşık 8 cc) örnekleri ile karaciğer ve böbrek doku örnekleri alındı. Kan örnekleri 3500 rpm’de 10 dak. santifüj edilerek serumları ayrıldı [57]. Doku örnekleri % 0.9 serum fizyolojik ile yıkandı. Serum ve doku örnekleri analiz gününe kadar -80 C’de saklandılar. Kan örneklerinde biyokimyasal, immünolojik analizler ile oksidatif stres ve antioksidan parametreler; doku örneklerinde ise oksidatif stres ve antioksidan parametreler incelendi.