Rat tibiasında oluşturulan defektlerde mezenkimal kök hücrelerinin, demineralize kemik tozunun ve trombositten zengin plazmanın osteogenezis üzerine etkilerinin histolojik ve immunohistokimyasal olarak araştırılması

TC

DİCLE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

RAT TİBİASINDA OLUŞTURULAN DEFEKTLERDE

MEZENKİMAL KÖK HÜCRELERİNİN, DEMİNERALİZE KEMİK

TOZUNUN VE TROMBOSİTTEN ZENGİN PLAZMANIN

OSTEOGENEZİS ÜZERİNE ETKİLERİNİN HİSTOLOJİK VE

İMMUNOHİSTOKİMYASAL OLARAK ARAŞTIRILMASI

Doktora Tezi Dt. Zozan ERDOĞMUŞ DANIŞMAN Prof. Dr. Belgin GÜLSÜN

AĞIZ-DİŞ-ÇENE HASTALIKLARI VE CERRAHİSİ ANABİLİM DALI DİYARBAKIR

2013

TC. DİCLE ÜNİVERSİTESİ

SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

RAT TİBİASINDA OLUŞTURULAN DEFEKTLERDE

MEZENKİMAL KÖK HÜCRELERİNİN, DEMİNERALİZE KEMİK

TOZUNUN VE TROMBOSİTTEN ZENGİN PLAZMANIN

OSTEOGENEZİS ÜZERİNE ETKİLERİNİN HİSTOLOJİK VE

İMMUNOHİSTOKİMYASAL OLARAK ARAŞTIRILMASI

Doktora Tezi

Dt. Zozan ERDOĞMUŞ

DANIŞMAN

Prof. Dr. Belgin GÜLSÜN

AĞIZ-DİŞ-ÇENE HASTALIKLARI VE CERRAHİSİ ANABİLİM DALI DİYARBAKIR

2013

Bu doktora tezi Dicle Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinatörlüğünce desteklenmiştir.

Proje No: 10-DH-102

TEŞEKKÜRLER

Doktora eğitimim süresince her türlü desteği ile sürekli yanımda olan, tezimin aşamalarındaki bilimsel katkı ve yönlendirmelerinden dolayı yardımını ve desteğini hiçbir zaman esirgemeyen ve tezimin hazırlanmasında çok emekler sarf eden değerli hocam Sayın Prof. Dr. Belgin GÜLSÜN ‘e,

Çalışmamın mezenkimal kök hücre elde etme aşamalarında büyük desteğini gördüğüm Prof. Dr. Erdal KARAÖZ’e,

Yoğun çalışmaları arasında, tezimin histolojik ve immünohistokimyasal değerlendirilmesi için bana vakit ayıran, tezimin sonuçlanmasında çok değerli katkıları olan Sayın Doç.Dr. Selver ÖZEKİNCİ’ye,

Eğitim hayatım boyunca en iyi şekilde yetişmem için çaba harcayan, önüme çıkan her türlü problemi çözmemde yardımlarını ve desteğini esirgemeyen tüm aileme sonsuz teşekkürler.

ZOZAN ERDOĞMUŞ

İÇİNDEKİLER

ÖN SAYFALAR Kapak Onay Sayfası………...I İç Kapak………II Teşekkürler Sayfası………..III İçindekiler Dizini……….. IV Tablolar Dizini ……….. V Şekiller Dizini ………...VI Resimler Dizini ……….VII Simgeler Ve Kısaltmalar Dizini……….X Özet Sayfaları

Türkçe Özet……….. XII Summary……….. XV Tez Metni Giriş Ve Amaç………1 Genel Bilgiler……….3 Gereç Ve Yöntem………51 Bulgular………66 Tartışma………82 Sonuçlar………..99 Kaynaklar………102 Özgeçmiş……….123 IV

TABLOLAR DİZİNİ

Sayfa Numarası

Tablo-1: Kemiğin temel yapıları 9 Tablo 2: İnsan kök hücre tiplerinin şeması 21 Tablo 3: Trombosit granüllerinin içerikleri 36

ŞEKİLLER DİZİNİ

Şekil 1: Kemik zarlarının histolojik görüntüsü Şekil 2: Kemik yapısı

Şekil 3: Kansellöz kemiğin morfolojik yapısı Şekil 4: Kortikal kemiğin morfolojik yapısı Şekil 5: Osteositler

Şekil 6: Kemik hücrelerinin ve farklılaşma yollarının şematik gösterimi Şekil 7: Kansellöz ve kortikal kemiğin kollajen yapıları

Şekil 8: İntramembranöz kemikleşme

Şekil 9: Kortikal kemiklerde kemik iyileşme süreci Şekil 10: Trombositlerin temel yapısı ve içerikleri

RESİMLER DİZİNİ

Resim 1: Mezenkimal kök hücre elde etmek için eksize edilmiş rat femur ve tibiasının görünümü

Resim 2: DMEM solüsyonu içindeki kemik iliği parçalarının görünümü. Resim 3: 10 ml komplet medium içeren 25 ml’lik flaskın görünümü.

Resim 4: Flaska yapışan mezenkimal kök hücrelerin inverted mikroskopta görünümü

Resim 5A,B: Hücre süspansiyonunun 800 G’de 10 dakika süreyle santrifüj sonrası görünümü

Resim 6: Tüplerdeki rat kanları Resim 7: Santrifüj işlemi

Resim 8: Santrifüj cihazı

Resim 9: Kemik greftinin görünümü

Resim 10: Cerrahi prensiplere uygun olarak hazırlanmış operasyon

Resim 11: Künt diseksiyon ile tibianın operasyon için hazır hale getirilmesi Resim 12: Defekt alanının görüntüsü ve primer olarak kapatılması

Resim 13: Demineralize kemik grefti ile doldurulmuş kemik defektinin görünümü.

Resim 14: TZP’nın insülin enjektörü yardımı ile defekt alanındaki greft materyalinin üzerine verilmesi

Resim 15: Mezenkimal kök hücrelerin insülin enjektörü ile defekt alanındaki greft materyalinin üzerine verilmesi

Resim 16: Mezenkimal kök hücrelerin insülin enjektörü ile defekt alanındaki greft materyalinin üzerine verilmesi

Resim 17: Sakrifiye edilen ratlardan çıkarılan tibianın görünümü Resim 18: Kontrol grubu 2. hafta histolojik görünümü

Resim 19:Demineralize kemik tozu uygulanan grubun 2. hafta histolojik görünümü

Resim 20:Demineralize kemik tozu uygulanan grubun 2. hafta immünohistokimyasal görünümü

Resim 21: Demineralize kemik tozu ve TZP uygulanan grubun 2. hafta histolojik görünümü

Resim 22: Demineralize Kemik Tozu ve Mezenkimal kök hücre uygulanan grubun 2. hafta histolojik görünümü

Resim 23: Demineralize kemik tozu ve TZP uygulanan grubun 2. hafta immünohistokimyasal görünümü

Resim 24: Demineralize Kemik Tozu, TZP ve Mezenkimal kök hücre uygulanan grubun 2. hafta histolojik görünümü

Resim 25: Demineralize Kemik Tozu, TZP ve Mezenkimal kök hücre uygulanan grubun 2. hafta immünohistokimyasal görünümü

Resim 26: Kontrol grubunun 8. hafta histolojik görünümü.

Resim 27: Demineralize kemik tozu uygulanan grubun 8. hafta histolojik görünümü

Resim 28: Demineralize Kemik Tozu ve TZP uygulanan grubun 8. hafta histolojik görünümü

Resim 29: Demineralize Kemik Tozu ve Mezenkimal kök hücre uygulanan grubun 8. hafta histolojik görünümü

Resim 30: Demineralize Kemik Tozu ve Mezenkimal kök hücre uygulanan grubun 8. hafta immünohistokimyasal görünümü

Resim 31: Demineralize Kemik Tozu, TZP ve Mezenkimal kök hücre uygulanan grubun 8. hafta histolojik görünümü

Resim 32: Kontrol grubunun 12. hafta histolojik görünümü

Resim 33: Demineralize Kemik Tozu uygulanan grubun 12. hafta histolojik görünümü

Resim 34:Demineralize Kemik Tozu uygulanan grubun 12. hafta immünohistokimyasal görünümü

Resim 35: Demineralize Kemik Tozu ve TZP uygulanan grubun 12. hafta histolojik görünümü

Resim 36: Demineralize Kemik Tozu ve Mezenkimal kök hücre uygulanan grubun 12. hafta histolojik görünümü

Resim 37: Demineralize Kemik Tozu ve Mezenkimal kök hücre uygulanan grubun 12. hafta immünohistokimyasal görünümü

Resim 38: Demineralize Kemik Tozu, TZP ve Mezenkimal kök hücre uygulanan grubun 12. hafta histolojik görünümü

SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ

BCP Bifazik Kalsiyum Fosfat Seramikleri

BF Büyüme Faktörü

bFGF basic-Fibroblast Growth Factor

BMP Bone Morphogenetic Protein (Kemik morfogenetik proteini) β- TCP Beta-trikalsiyum fosfat

β - TCP/HA Beta-trikalsiyum fosfat ve Hidroksilapatit karışımı BPKA Bovin poröz kemik allogrefti

DBM Demineralized Bone Matriks (Demineralize kemik matriksi)

DMEM Dulbeccosminimum essential medium DKKA Dondurulmuş-kurutulmuş kemik allogreftleri DKMK Dondurulmuş-kurutulmuş mineralize kemik DKDK Dondurulmuş-kurutulmuş demineralize kemik EKH Embriyonik kök hücreler

EGF Epithelial Growth Factor FGF Fibroblast Growth Factor FBS Fetal bovine serum HA Hidroksilapatit

HE Hemotoksilen Eozin

HKH Hematopoetik kök hücreler

IGF Insulin-like Growth Factor (İnsülin benzeri büyüme faktörü)

IL-1 İnterlökin 1

KGF Keratinosit Growth Factor

KİMKH Kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücreler MKH Mezenkimal kök hücreler

MYPH Multipotent yetişkin progenitör hücre ONC Osteonectin

OPN Osteopontin

PDGF Platelet Derived Growth Factor( Trombosit kaynaklı büyüme faktörü)

PDAF Platelet-derived angiogenesis factor(trombosit kaynaklı anjiogenezis faktör)

PCBM Partiküler kansellöz kemik ve kemik iliği Rpm Round Per Minute

TBT Topikal bovin trombin

TCP Trikalsiyum fosfat

TKBF Trombosit kaynaklı büyüme faktörü TZP Trombositten Zengin Plazma

TFP Trombositten fakir plazma TGF Transforming Growth Factor

TGF- α, β Transforming Growth Factor Alfa, Beta VEGF Vascular Endothelial Growth Factor YKH Yetişkin/somatik kök hücreler μm Mikrometre

ÖZET

Rat Tibiasında Oluşturulan Defektlerde Mezenkimal Kök Hücrelerinin, Demineralize Kemik Tozunun ve Trombositten Zengin

Plazmanın Osteogenezis Üzerine Etkilerinin Histolojik ve İmmunohistokimyasal Olarak Araştırılması

Yüz ve çene defektlerinin etyolojisinde enfeksiyöz, inflamatuar, kistik ve neoplastik nedenlerle ortaya çıkan patolojik durumlar, travma ve konjenital deformiteler sayılabilir. Oral ve maksillofasiyal cerrahide, tedavi amacıyla yapılan müdahalelerin sonunda da fiziksel yaralanmalar meydana gelibilir. Defektler sert ve/veya yumuşak dokuları kapsayabilir. Çeşitli etyolojilerle meydana gelen defektlerin hızla ve anatomik forma en uygun şekilde onarımı gereklidir. Yıllardan beri çeşitli araştırmacılar, oluşan kemik defektinin onarımında yeni kemik yapımını stimüle edebilecek nitelikte olan greftler ve biyomateryaller üzerinde çalışmaktadırlar. İstenmeyen etkilerin oluşmasını engellemek, daha sorunsuz ve hızlı bir iyileşme sağlayabilmek amacı ile greft materyalleri kullanılarak deneysel ve klinik çalışmalar yapılmış ve halen de yapılmaktadır. İyileşmeyi olumlu etkileyebileceği düşünülen materyaller yalın ve kombine halde kullanılarak çok sayıda kıyaslamalı çalışmalar yapılmıştır.

Kemik defeklerinin tamiri için kullanılacak üstün özellikler içeren greft materyalleri üzerindeki arayışlar sürerken, demineralizasyon sırasında antijenik özelliklerinin elimine edildiği ve ideal biyomateryalde olması gereken özelliklerin çoğunu taşıdıkları düşüncesi ile demineralize kemik greftleri çalışmaya konu olmuştur.

Bunu yanısıra kemik iliğinden elde edilen mezenkimal kök hücreler multipotansiyel hücreler olup, rekonstrüktif cerrahide kullanılması yönünde çeşitli araştırmalar mevcuttur. Son yıllarda kendini yenileme, sınırsız bölünme, birçok hücre tipi veya dokuya farklılaşabilme kapasitesine sahip hücre topluluğu olan kök hücreler üzerinde önemli çalışmalar başlatılmıştır.

Bu alanda özellikle kök hücreleri ile kombine edilen doğal veya sentetik biyomateryaller kullanılarak elde edilen karışımın, kemik defektlerinde yeni kemik oluşumuna etkileri üzerine literatürde giderek artan araştırmaların başladığı dikkati çekmektedir.

Trombositten Zengin Plazma; donörden alınan venöz kanın santrifüj işlemlerine tabi tutulması sonucunda trombositlerin kan elemanlarından ayrıştırılması ile elde edilen, yumuşak ve sert doku iyileşmesinde avantaj sağladığı düşünülen ve büyüme faktörleri içeren bir ajandır.

Araştırmamızdan kök hücre teknolojisi ile elde edilen mezenkimal kök hücreleri, demineralize kemik tozu ve trombositten zengin plazma kullanılarak bu materyallerin ve hücrelerin kemik defektindeki etkilerinin histolojik ve immunohistokimyasal olarak araştırılması hedeflendi

Bu araştırmada 55 adet Wistar-Albino türü dişi rat kullanılması planlandı. 4 adet rat trombositten zengin plazma elde etmek için kullanıldı. Geriye kalan ratlar beş gruba ayrıldı. Ratların her iki tibiasında 10 mm uzunluğunda 3 mm derinliğinde ve 2 mm genişliğindeki kemik defekleri oluşturuldu.

Grup I (n=3) operatif kontrol grubu iken, Grup II’de (n=12) demineralize kemik grefti, Grup III’de (n=12) demineralize kemik grefti ve trombositten zengin plazma, Grup IV’de (n=21) mezenkimal kök hücre ve demineralize kemik grefti kombinasyonu ve Grup V’de (n=21) mezenkimal kök hücre, trombositten zengin plazma ve demineralize kemik grefti kombinasyonu defektlere uygulandı. Deneklerin tamamı 2., 8. ve 12. hafta sonunda sakrifiye edildi. Histolojik ve immunohistokimyasal değerlendirmede, gruplar arasında osteoblastik aktivite, osteogenezis ve maturasyon kriterleri dikkate alınmıştır.

Yapılan çalışmanın sonucunda; araştırmanın 12. haftasında osteoblastik aktivite ve osteogenezisin daha ideal oluştuğu, osteogenezise bağlı olarak

osteopontin ve osteonektin ile boyanmaya pozitif yanıt verdiği saptanmıştır. En ideal osteogenezisi oluşturan grubun Greft+Trombositten zengin plazma+Mezenkimal kök hücre grubunun olduğu, bunu sırasıyla Greft+ Mezenkimal kök hücre uygulanan grubunun, Greft+ Trombositten zengin plazma grubunun ve son olarakta yalnızca Greft uygulanan grubun izlediği gözlenmiştir.

Anahtar Kelimeler: Kemik Defekti, Demineralize Kemik Tozu, Mezenkimal Kök Hücre,Trombositten Zengin Plazma

SUMMARY

HISTOLOGICAL AND IMMUNOHISTOCHEMICAL RESEARCH FOR MESENCHYMAL STEM CELL, DEMINERALIZE BONE GRAFT

AND PLATELET RICH PLASMA’S EFFECTS OF BONE OSTEOGENESIS IN RAT TIBIAL DEFECT

Pathological conditions (that caused by infectious, inflammatory, cystic and neoplastic lesion) , trauma and congenital deformities are common factors of facial and jaw defect's etiolgy In oral and maxillofacial surgery, physical injuries can occur during the surgical procedure. Defects can comprise hard or/and soft tissues. Defects that caused by different etiologies need to quickly repair in a suitable position to anatomic form.

For many years, various researchers have been worked on new bone grafts and biomaterials that stimulate bone healing in bone defect. To prevent adverse events and to provide faster rejeneration experimental and clinical studies have been still done by using graft materials. Numerous comparative studies were done by using simple or combined materials which may have a positive affect on bone healing.

While searching have been continued to find excellent graft materials to repair bone defects, demineralized bone graft were subjected to the studies with the tought of antigenity was elected by demineralization and also it has ideal features in terms of ideal bone graft.

Also mesenchymal stem cells that derived from bone marrow are multipotential cells and there are some investigation about using it in reconstructive surgery. Recently, important studies are started on stem cells which have the capacity of self renew, unlimited division, transforming in different types of tissue.

In this field, ıt is a rematrkable point that Investigation are started to search that effects of combination of mesenchymal stem cells and natural or synthetic biomaterials on bone defects.

Platelet rich plasma is derived from autogen blood plasma by centrifuging trombosit from other blood cells. It includes growing factors to provide quick healing on soft and hard tissues.

In this study, it’s aimed to research the effects of mesenchymal stem cells derived with stem cell technology, demineralized bone graft and platelet rich plasma in bone defects by histologically and immunohistochemically

This study was planned on fifty five Wistar Albino female rats. Four rats were used to obtain platelet rich plasma. The remainders were separated into five groups. In this study, 10 mm length, 3 mm dept, 2 mm width defects were performed in rat tibias.

Group I (n=3) was operative control group. In Group II (n=21) demineralized bone matriks were applied, in Group III (n=12) demineralized bone matrix and platelet rich plasma combination were used to fill defects, In Group IV (n=12) demineralized bone matrix and mesenchimal stem cell combination were applied to the defects. In Group V (n=12) demineralized bone matrix platelet rich plasma and mesenchimal stem cell combination were applied into the defects. At the end of the 2th, 8th and 12th week, all of the rats were sacrificed. In histologic and immunohistochemical evaluation osteoblastic activity and osteogenesis and maturation are considered among groups,.

At the conclusion of the study, osteoblastic activity and osteogenesis were ideally occured in the 12th week. Therefore preparate were painted positively with osteonectin and osteopontin. It was observed that Graft+Platelet rich plasma+Mesenchymal stem cell group was the most effective in inducing new bone formation (osteogenesis) among groups. This group is followed by Graft+ Platelet rich plasma and only Graft used group. Also regular bone formation and osteoinduction were detected, even in a rat tibial defects, in the Graft+Platelet rich plasma+Mesenchymal stem cell group.

Keywords:Bone Defect, Demineralized Bone Graft, Mesenchymal Stem Cell, Platelet Rich Plasma