• Sonuç bulunamadı

Sertralin, Fluoksetin, Sitalopram Ve Essitalopramın Kapiler Elektroforez Yöntemi İle Eş Zamanlı Tayini İçin Metot Optimizasyonu

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2021

Share "Sertralin, Fluoksetin, Sitalopram Ve Essitalopramın Kapiler Elektroforez Yöntemi İle Eş Zamanlı Tayini İçin Metot Optimizasyonu"

Copied!
72
0
0

Yükleniyor.... (view fulltext now)

Tam metin

(1)

T.C.

UŞAK ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

KİMYA ANABİLİM DALI

SERTRALİN, FLUOKSETİN, SİTALOPRAM VE ESSİTALOPRAMIN KAPİLER ELEKTROFOREZ YÖNTEMİ İLE EŞ ZAMANLI TAYİNİ İÇİN METOT

OPTİMİZASYONU

YÜKSEK LİSANS TEZİ

ELVAN ÖZSOY

OCAK 2017

(2)

T.C.

UŞAK ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

KİMYA ANABİLİM DALI

SERTRALİN, FLUOKSETİN, SİTALOPRAM VE ESSİTALOPRAMIN KAPİLER ELEKTROFOREZ YÖNTEMİ İLE EŞ ZAMANLI TAYİNİ İÇİN METOT

OPTİMİZASYONU

YÜKSEK LİSANS TEZİ

ELVAN ÖZSOY

OCAK 2017

(3)

Elvan ÖZSOY tarafından hazırlanan Sertralin, Fluoksetin, Sitalopram ve Essitalopramın Kapiler Elektroforez Yöntemleri ile Eşzamanlı Tayini için Metot Optimizasyonu adlı bu tezin Yüksek Lisans tezi olarak uygun olduğunu onaylarım.

(Yrd. Doç. Dr., Senem ŞANLI) ……….

Tez Danışmanı, Uşak Üniversitesi Kimya Anabilim Dalı

Bu çalışma, jürimiz tarafından oy birliği ile Kimya Anabilim Dalında Yüksek Lisans tezi olarak kabul edilmiştir.

Doç. Dr. Berkant KAYAN ……….

(Kimya Anabilim Dalı, Aksaray Üniversitesi)

Yrd. Doç. Dr. Senem ŞANLI ……….

(Tez Danışmanı, Uşak Üniversitesi Kimya Anabilim Dalı)

Yrd. Doç. Dr. Onur GÜNEŞER ……….

(Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı, Uşak Üniversitesi)

Yrd. Doç. Dr. İbrahim BULDUK ……….

(Kimya Anabilim Dalı, Uşak Üniversitesi)

Yrd. Doç. Dr. Özgür TARHAN ……….

(Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı, Uşak Üniversitesi)

Tarih: 06/01/2017

Bu tez ile Uşak Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Yönetim Kurulu Yüksek Lisans derecesini onamıştır.

Prof.Dr.Lütfullah TÜRKMEN ………. Fen Bilimleri Enstitüsü Müdürü

(4)

i

TEZ BİLDİRİMİ

Tez içindeki bütün bilgilerin etik davranış ve akademik kurallar çerçevesinde elde edilerek sunulduğunu, ayrıca tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu çalışmada bana ait olmayan her türlü ifade ve bilginin kaynağına eksiksiz atıf yapıldığını bildiririm.

(5)

ii SERTRALİN, FLUOKSETİN, SİTALOPRAM VE ESSİTALOPRAMIN KAPİLER

ELEKTROFOREZ YÖNTEMİ İLE EŞ ZAMANLI TAYİNİ İÇİN METOT OPTİMİZASYONU

(Yüksek Lisans Tezi)

ELVAN ÖZSOY UŞAK ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Ocak 2017

ÖZET

Kapiler Elektroforez son yıllarda ilaç analizlerinde yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Diğer analitik metotlara göre üstünlükleri bulunmaktadır. Yüksek ayırma gücü, kolay miktar hesabı, kısa analiz süreleri, çok az hacimde örneğin kullanılması, basit yöntem geliştirme imkanı ve otomatik cihaz gelişimi, yöntemin en önemli avantajlarıdır. Farklı ilaç etken maddelerinin eşzamanlı tayini, miktar analizleri kapiler elektroforez yöntemi ile yapılabilmektedir.

İlgili tez çalışmamızda amaç; son 20 yılda kullanımı hızla artan antidepresan ilaç etken maddelerinden sertralin, fluoksetin, sitalopram ve essitalopramın kapiler elektroforez yöntemi tayinleri için metot geliştirmektir. Çalışmanın ikinci aşamasında ise geliştirilen yöntem, sertralinin ilaç preperatlarından tayininde kullanılacaktır. Ayrıca yöntem geçerliliğinin tespiti için doğruluk, kesinlik, duyarlılık ve doğrusallık gibi validasyon parametreleri incelenecektir.

Anahtar Kelimeler: Antidepresan, Ayırma, İlaç Etken Madde, Kapiler Elektroforez, Sertralin, Fluoksetin, Sitalopram, Essitalopram

Sayfa Adedi: 57

(6)

iii SIMULTANEOUS DETERMINATION OF SERTRALIN, FLUOXETIN, CITALOPRAM AND ESCITALOPRAM BY CAPILLARY ELECTROPHORESIS

(MASTERS THESIS) ELVAN ÖZSOY UŞAK UNIVERSITY SCIENCE INSTITUTE January 2017

ABSTRACT

Capillary electrophoresis is a widely used method for drug analysis in recent years. They have important superiories over other analytical methods. High separation power, easy quantification calculation, short analysis time, use of sample in quite low facility volume, possibility of simple method development and automatic device development are the most important advantages of this method. Simultaneous determination of different drug substances and quantitative analysis can be achieved by capillary electrophoresis method. The purpose of our study was to develop a method has been developed for the determination of sertralin, fluoxetine, citalopram and escitalopram using capillary electrophoresis from antidepressant drugs which have been increasingly used in the last 20 years. In the second step of our study, the developed method was used to determine sertraline in drug preparations. In addition some parameters such as accuracy, precision, sensitivity and linearity were examined for the validation of the method used.

Key Words: Antidepressant, Seperate, Capillary electrophoresis, Pharmaceutical Active Ingredients, Sertralin, Fluoxetin, Citalopram, Escitalopram

Number of pages: 57

(7)

iv

TEŞEKKÜR

Yüksek lisans eğitimim boyunca ilminden yararlandığım, öğrencisi olmaktan onur duyduğum, her türlü yardım ve fedakârlığı sağlayan, bilgi, tecrübe ve güler yüzü ile çalışmama ışık tutan, ayrıca tecrübelerinden yararlanırken göstermiş olduğu sabır ve hoşgörülerinden dolayı danışman hocam Sayın Yrd. Doç. Dr. Senem Şanlı'ya en derin şükranlarımı sunarım.

Tez çalışmasının gerçekleştirildiği Uşak Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Gıda Mühendisliğine teşekkür ederim

Yine eğitimim ve laboratuvar çalışmalarım boyunca değerli tecrübelerini esirgemeyen diğer hocalarıma teşekkürü bir borç bilirim.

Tez çalışması 2015/TP006 numaralı BAP projesi ile desteklenmiştir. Uşak Üniversitesi Bilimsel Araştırma Proje birimine teşekkürü borç bilirim.

Maddi ve manevi destekleri ile beni bu günlere getiren değerli aileme ve her konuda sabrıyla manevi desteğini hayat boyu hissettiğim sevgili eşim Fatih Özsoy'a teşekkürlerimi sunarım.

(8)

v

İÇİNDEKİLER

Sayfa TEZ BİLDİRİMİ ... i ÖZET ... ii ABSTRACT ... iii TEŞEKKÜR ... iv İÇİNDEKİLER ... v

ÇİZELGELERİN LİSTESİ ... vii

ŞEKİLLERİN LİSTESİ ... viii

TABLOLARIN LİSTESİ ... x

SİMGELER VE KISALTMALAR ... xi

1. GİRİŞ ... 1

1.1. Antidepresan İlaçların Tarihçesi ... 2

1.2. Depresif Bozukluk ... 3

1.2.1. Depresyon tedavisi ... 4

1.2.2. Antidepresan İlaçların Sınıflandırılması ... 4

1.2.3. Selektif Serotonin Reuptake İnhibitörleri (SSRI) ... 5

1.2.4. Antidepresan İlaç Etken Maddelerinin Ortak Yönleri ... 6

1.2.5. SSRI’ların Farmakolojik Ve Moleküler Etki Mekanizmaları ... 6

1.3. Çalışılan Antidepresanların Kimyasal Yapı Ve Formülleri ... 12

2. KURAMSAL TEMELLER ... 13

2.1. Kapiler Elektroforez ... 13

2.1.1. Kapiler Elektroforezin Temel İlkeleri ... 19

2.2.2. Elektroosmotik Akış (EOF) ... 21

2.2.3. Elektroosmotik Akışı Etkileyen Faktörler ... 23

2.2.4. Band Genişlemesi ... 24

2.2.5. Joule Isınması ... 25

2.2.6. Kapiler Elektroforez Türleri... 25

2.2. Metot Validasyonu ... 31

2.2.1. Validasyon Parametrelerinin Tayini ... 32

Doğruluk ... 32

Kesinlik ... 32

Seçicilik ... 32

Teşhis Sınırı (LOD) ... 33

Tayin Alt Sınırı (LOQ) ... 33

(9)

vi

3. KAYNAK ARAŞTIRMASI ... 34

4. MATERYAL ve METOD ... 37

4.1. Genel Bilgi ... 37

4.1.1. Kullanılan Cihaz ve Ekipmanlar ... 37

4.1.2. Kullanılan Kimyasallar ... 38

4.1.3. Kullanılan Çözeltiler ... 39

4.1.4. Miktar Tayininde Kullanılan İlaç Preparatı ... 39

4.2. Kapiler Elektroforez Yöntemi İle Sertralin, Fluoksetin, Citalopram ve Escitalopram'ın Tayinleri İçin Optimum Koşulların Belirlenmesi İçin Yapılan Çalışmalar ... 39

4.3. Sertralinin İlaç Preparatlarındaki Miktar Tayini İçin Yapılan Çalışmalar ... 40

4.3.1. İç Standart Metodu ... 40

4.3.2. Sertralinin Lustral 50 mg ilacından miktar analizi... 40

5. BULGULAR ... 41

5.1. Sertralin Fluoksetin Citalopram ve Escitalopramın Kapiler Elektroforezde Tayini için Metot Optimizasyonuna ait bulgular ... 41

5.2. Sertralinin İlaç Preparatlarındaki Miktar Tayinine Ait Bulgular ... 43

5.3. Sertralinin Kapiler Elektroforez yöntemi ile tayini için metot validasyonu ... 47

5.3.1. Kalibrasyon Çalışması ... 47

5.3.2. Duyarlılık ve Doğrusallık ... 48

5.3.3. Kesinlik ve Doğruluk ... 49

5.3.4. Tabletlerde Sertralin Miktar Tayini Sonuçları ... 50

6. TARTIŞMA VE SONUÇ ... 51

KAYNAKLAR ... 52

(10)

vii ÇİZELGELERİN LİSTESİ

Sayfa

Çizelge 1.1. SSRI'ların Farmakokinetik Özellikleri . ... 7

Çizelge 2.1. Kapiler Elektroforezde Kullanılan Dedektör Çeşitleri ... 29

Çizelge 4.1. Çalışmada kullanılan ilaç etken maddeler ve özellikleri... 38

Çizelge 4.2. Çalışmada kullanılan kimyasal maddeler ... 38

Çizelge 5.1. Doğrusallık ve Duyarlılık Parametreleri ... 48

Çizelge 5.2. Sertralinin Kapiler Elektroforez yöntemi ile analizine ait gün içi bulgular .... 49

Çizelge 5.3. Sertralinin Kapiler Elektroforez yöntemi ile analizine ait günler arası bulgular ... 49

Çizelge 5.4. Ticari Tabletde (Lustral) sertralin miktar tayin sonuçları ... 50

(11)

viii ŞEKİLLERİN LİSTESİ

Şekil 1.1. Antidepresan ilaçların sınıflandırılması ... 5

Şekil 2.1. Kapiler elektroforez cihazının gösterimi ... 14

Şekil 2.3. Eritilmiş silika kapilerin boyuna kesiti. ... 16

Şekil 2.4. Elektroforetik ve elektrozmotik hızların göç zamanı üzerine etkisi ... 20

Şekil 2.5. Kapiler yüzeyinde oluşan çift tabaka ve elektroosmotik akış ... 21

Şekil 2.6. Kapiler kolonda EOF ve parabolik akış ... 23

Şekil 2.7. Kapiler Zone Elektroforez ... 26

Şekil 2.8. Kapiler Elektroforez cihazının bölümleri... 27

Şekil 5.1. Sertralinin (5 ppm) 205 nm’de elektroferogramı ... 41

Şekil 5.2. Citalopramın (5ppm) 205 nm’de elektroferogramı ... 42

Şekil 5.3. Escitalopramın (5 ppm) 205 nm’de elektroferogramı ... 42

Şekil 5.4. Fluoksetinin (5 ppm) 205 nm’de elektroferogramı ... 42

Şekil 5.5. Sertralin(1), Fluoksetin(2), Citalopram(3)'ın 5 ppm'lik karışım çözeltisinin elektroferogramı ... 43

Şekil 5.6. Sertralin(1), Fluoksetin(2), Escitalopram(3)'ın 5 ppm'lik karışım çözeltisinin elektroferogramı ... 43

Şekil 5.7. 8 ppm’lik Sertralinin ilaç preparatından hazırlanan çözeltisine 4 ppm’lik Citalopram çözeltisi ilavesi ile elde edilen elektroferogram ... 44

Şekil 5.8. 8 ppm’lik Sertralin çözeltisine ilave edilen 2 ppm’lik Citalopram katkı çözeltisinin (geri kazanım) elektroferogramı ... 44

Şekil 5.9. 2 ppm’lik Sertralin(1)'e 4 ppm’lik Citalopram(2) ilavesi ile elde edilen kalibrasyon çözeltisinin elektroferogramı ... 44

Şekil 5.10. 4 ppm’lik Sertralin(1)'e 4 ppm’lik Citalopram(2) ilavesi ile elde edilen kalibrasyon çözeltisinin elektroferogramı ... 45

Şekil 5.11. 8 ppm’lik Sertralin(1)'e 4 ppm’lik Citalopram(2) ilavesi ile elde edilen kalibrasyon çözeltisinin elektroferogramı ... 45

Şekil 5.12. 12 ppm’lik Sertralin(1)'e 4 ppm’lik Citalopram(2) ilavesi ile elde edilen kalibrasyon çözeltisinin elektroferogramı ... 45

Şekil 5.13. 2 ppm’lik Sertralin(1)'e 4 ppm’lik Citalopram(2) ilavesi ile elde edilen gün içi çalışmasının elektroferogramı ... 46

(12)

ix

Şekil 5.14. 8 ppm’lik Sertralin(1)'e 4 ppm’lik Citalopram(2) ilavesi ile elde edilen ... 46

gün içi çalışmasının elektroferogramı ... 46

Şekil 5.15. 2 ppm’lik Sertralin(1)'e 4 ppm’lik Citalopram(2) ilavesi ile elde edilen ... 46

gün arası çalışmasının elektroferogramı ... 46

Şekil 5.16. 8 ppm’lik Sertralin(1)'e 4 ppm’lik Citalopram(2) ilavesi ile elde edilen ... 47

gün arası çalışmasının elektroferogramı ... 47

(13)

x TABLO LİSTESİ

Tablo Sayfa

(14)

xi

SİMGELER VE KISALTMALAR

Bu çalışmada kullanılmış bazı simgeler ve kısaltmalar, açıklamaları ile birlikte aşağıda sunulmuştur.

Simge/Kısaltma Açıklama

BSS Bağıl standart sapma

C Santigrat derece

CE Kapiler elektroforez

CECK Kapiler elektroforez kromatografi

CGE Kapiler jel elektroforez

CYP Mikrozomal sitokrom P450 enzimleri

CZE Kapiler zone elektroforez

DAD Diyot array dedektör

DNA Deoksiribonükleik asit

ε Dielektrik sabiti

ECA Epidemiyolojik havza alanı

EKG Elektrokardiografi

EOF Elektroozmotik akış

EPS Ekstrapiramidal sendrom

GABA-B γ-Aminobutirik asit

HPLC Yüksek performanslı sıvı kromatografisi

ITP İzotakoforez

K Dağılma katsayısı

kV Kilovolt

LOD Teşhis sınırı

LOQ Tayin alt sınırı

LPME Sıvı faz mikro ekstraksiyonu

M Molar

MAO Monoamin oksidaz enzimi

MECK Misel elektrokinetik kromatografisi

mL Mililitre

(15)

xii

mM Milimolar

A Mikroamper

g Mikrogram

e Elektroforetik hareketlilik

μEOF Elektroosmotik hareketlilik

m Mikrometre

L Mikrolitre

MS Kütle spektrometresi

η Çözelti viskozitesi

N Normal

NaOH Sodyum hidroksit

NA Noradrenalin

ng Nanogram

nL Nanolitre

nm Nanometre

NSRI Noradrenalin geri alım inhibitörleri

ppb Milyarda bir kısım

ppm Milyonda bir kısım

RNA Ribonükleik asit

S Standart sapma

SiO- Silanoat

SiOH Silanol

SSRI Selektif serotonin geri alım inhibitörleri

SSS Santral sinir sistemi

TSA Trisiklik antidepresan

UV-VIS Morötesi-görünür bölge

W Watt

WHO Dünya sağlık örgütü

vEOF Elektroosmotik akış hızı

ζ Zeta potansiyel

(16)

1

1. GİRİŞ

Elektroforez, potansiyel fark oluşturulan bir alanın tesiriyle artı ve eksi yüklü taneciklerin bu alanın içinde tampon çözelti eşliğinde herbir taneciğin kendine özgü mobilite hızı esasına göre yapılan ayırma sonucu gerçekleşen bir analiz tekniğidir. Bu teknik, ilaç etken maddeleri, inorganik anyon ve katyonlar, vitaminler, aminoasitler, karbonhidratlar, peptitler, proteinler, nükleik asitler gibi çok sayıda bileşiğin miktar analizinde ve eşzamanlı ayrılmasında kullanılmaktadır. Organik ve biyokimyasal yüklü büyük çaplı taneciklerin ayrıştırılması ve analizlerinde yine bu yöntem başarılı bir şekilde uygulanmaktadır. Bu analiz tekniği, iyi bir ayırma tekniği olmasına rağmen, yapılan araştırmalar ve çalışmalar göstermiştir ki uzun analiz süreleri, elde edilen verimin düşüklüğü, veri aktarımı ve miktar analizi sıkıntıları yaşanmıştır. Yaşanan olumsuzluklar nedeniyle daha iyi bir teknik için jel tabaka sistemi yerine dar tüp yada kapiler sistemleri geliştirilmiş ve kullanılmaya başlanmıştır. Küçük çaplı kapiler kolonun anti-konvektif yapıda olması numune hacminin azaltılmasına olanak vermekte, kapilerle sıvı hareketli alan arasında meydana gelebilecek sıcaklık geçişine izin vermemektedir. Bu durum yüklenen numune çözelti viskozitesinin ve elektriksel alan uygulanan çözelti ortamının hareketinin kontrol altına alınması bakımından önem teşkil eder, jel tabaka sistemi ise bu ihtiyacı karşılayamamaktadır. Kapiler elektroforez; jel elektroforez, gaz kromatografisi, yüksek performanslı sıvı kromatografisi tekniklerinin avantajlı özelliklerinin birleşmesinden geliştirilmiş çağdaş bir metottur. Kapiler elektroforez tekniğinin; yüksek ayırım gücü (birçok bileşiği eş zamanlı analiz edebilme kabiliyeti), analizin daha çabuk yapılması, incelenecek numune miktarının diğer yöntemlere göre az olması, çalışmanın düşük maliyeti bulunması, kararlılığın yüksek olması, yavaş akışkan mobil sistem ve veri aktarımında iyi bir olanak sağlaması gibi üstünlükleri vardır. Kapiler elekroforez son yıllarda geliştirilmiş ve bugün araştırma ve analiz alanında uygulanan bir tekniktir. Eş zamanlı olarak birçok maddenin analizine imkan sağlaması, az hacimli numune çözeltisi ile analizin yapılması ve mikromoleküler maddelerin analizine imkan vermesi bu yöntemin farmakolojik çalışma alanlarında da uygulanmasını sağlamıştır.

Gerçekleştirdiğimiz laboratuvar analizinde, son 20 yılda kullanımı hızla artan antidepresan ilaçlardan sertralin, fluoksetin, sitalopram ve essitalopramın kapiler elektroforez yöntemi

(17)

2 tayinleri için metot geliştirmektir. Çalışmanın ikinci aşamasında ise geliştirilen yöntem, sertralinin ilaç preperatlarından tayininde kullanılacaktır. Ayrıca yöntem geçerliliğinin tespiti için doğruluk, kesinlik, duyarlılık ve doğrusallık gibi validasyon parametreleri incelenecektir.

1.1. Antidepresan İlaçların Tarihçesi

Ruhsal bozukluklarda insan davranışlarını düzenlemek için birtakım maddeler çok eski zamanlardan beri kullanılmıştır. Eski çağlarda bitki ve çeşitli maddelerden oluşturulan karışımlar ruhsal hastalıklara karşı tütün, afyon, esrar, kokain gibi maddeler ilaç olarak kullanılmıştır. Günümüzde ise psikoaktif ilaç olarak tanınan maddeler insan psikolojisini etkilemek, ağrıyı azaltmak veya keyif vermek amacıyla sürekli kullanılmaktadır.

Modern psikofarmakoloji 20. yüzyılın ikinci yarısında başlamış ve büyük bir hızla gelişmiştir. 19. yüzyılın sonlarından bu döneme kadar ruhsal bozuklukların tedavisinde afyon türevleri, bromürler, paraldehit, barbitüratlar kullanılmıştır. 20. yüzyılın başında, hastaları toplumdan uzaklaştıran ve yabancılaştıran akıl hastanesi örnekleri, Avrupa ülkeri ve ABD 'de yaygınlaşmış ve bu örnek diğer ülkelere de yayılmıştır. Her biri binlerce hastayı yıllarca toplumdan uzak tutan, en iyi koşullarda bile yeterli bakım ve tedaviyi sağlayamayan bu hastaneler, birçok hastanın hastalığının sürekli hal aldığı ve ömür boyu kaldıkları kurumlar olmuşlardır. Yüzyılın ikinci yarısında bu hastanelere karşı tepkiler artmaya başlamış ve psikofarmakoloji klinik psikiyatride geniş uygulama alanı bulurken, bir yandan da temel bilimlerde beyin biyokimyası, fizyolojisi alanında büyük gelişmelere yol açmıştır. Çalışmalarda psikofarmakoloji, nörokimya ve nörofizyoloji tıp biliminin en önemli uygulama ve araştırma konuları arasına girmiştir [1].

Ruhsal bozukluklar sınıflandırmasında bulunan depresif bozukluk (depresyon), Dünya Sağlık Örgütü (WHO) kayıtları göstermiştir ki ülkelerin ekonomilerine en çok zarar veren hastalıklar arasındadır [2]. Bu hesaplama, bireylerin sosyoekonomik durumları, işlevsellik verimlilik azalması ve yardım gereksinimleri esas alınarak sonuçlandırılmış çalışmalardır. Depresyon, ülkemizde de Ulusal Hastalık Yükü ve Maliyet Etkililik çalışmalarının neticesinde dördüncü hastalık olarak tespit edilmiştir [3]. Çoğu batı ülkesinde de durum

(18)

3 böyledir ve antidepresanların reçete edilmesi yaygınlaşmıştır. Genellikle Selektif Serotonin Geri Alım İnhibitörleri (SSRI) ve son kuşak antidepresan ilaçlar tedavide çok fazla kullanılmaya başlanmıştır [4]. SSRI grubu antidepresanlar genellikle Trisiklik Antidepresan (TSA)'lara oranla daha çok tercih edilirler ve etki düzeylerinin de benzer olması tercihi artırmaktadır [5,6].

Amerika Birleşik Devletlerin'de Epidemiologic Catchment Area (ECA) çalışmalarına göre majör depresyon sıklığı % 3-5,8, bir yıllık prevalans % 2,6-6,2'dir. Hayat boyu risk erkekler için % 3-12, kadınlar için % 10-26 olarak verilmektedir. Genel toplumda yaşam boyu prevalans % 15 kadardır [7,8].

1.2. Depresif Bozukluk

Depresyon, çok semptomlu bir ruhsal bozukluktur. Depresyonun başlıca belirtileri, keyifsizlik, beklentinin azalması, negatif düşüncenin artması, hayatındaki günlük işleri yerine getirememe, yaşamdan zevk almama gibi hayat konforunu azaltan durumlardır. Depresyondan bahsedebilmek için bu belirtilerin aralıksız iki üç hafta, hergün ve günün tüm saatlerinde yaşanıp yaşanmadığına karar verilmelidir. Bu belirtilerin yanında iştahta değişmeler görülür. Özellikle iştah azalması, vakaların bazılarında ise tatlıya karşı aşırı istek olur. Görülen diğer bir belirtisi de uyku problemleridir. Uykuya geçişte zorlanma, uykudan aniden uyanma, sabahları vaktinden önce sıkıntılı bir şekilde uyanma yaşanır. Depresyon yaşayan insanların bazılarında ise sürekli uyuma hali mevcuttur. Hastalarda psikomotor aktivitelerde değişiklikler gözlenir. Psikomotor ajitasyon (kıpır kıpır olma) veya psikomotor reterdasyon (yavaş yavaş hareket etme, yavaş konuşma, işe gitmeme gibi) görülür. Hastalar enerji kaybı, halsizlik, yorgunluk, bitkinlikten yakınır. Pişmanlık ve suçluluk duyguları ile içlenirler. Kendilerini işe yaramaz hissederler. Değersizlik ve suçluluk duyguları gerçeği değerlendirme yetisini bozabilir. Bilinçsel bozukluk olarak hastalar unutkanlıktan yakınırlar. Konsantrasyon güçlüğü ve dikkat kaybı nedeniyle günlük işlerini yapamaz hale gelirler. Hastaların intiharı düşündükleri gözlemlenmiştir.

Majör depresyon tanısı koyulabilmesi için hastada yukarıdaki belirtilerden beş tanesinin bulunması gerekmektedir. Hastada görülen belirtiler iki hafta boyunca hergün ve gün

(19)

4 boyunca sürüyorsa depresyondan söz edilir. Depresyonda, Santral Sinir Sistemi (SSS)'de norepinefrin, seratonin ve dopaminin azaldığı gözlenmiştir. Kolinerjik sistemde göreceli artış saptanır [9].

1.2.1. Depresyon tedavisi

Depresyon etiyolojisinde, amin nörotransmitterlerin (serotonin, noradrenalin) santral sinir sisteminde azalmasına bağlı sinaptik iletinin baskılanması ana rol oynar. Depresyon tedavisinde kullanılan ilaçlar temelde serotonin ve noradrenalinin nörona alımını inhibe eden ilaçlar (SSRI, NSRI, TAD) ile santral sinir sisteminde yıkımını sağlayan monoamin oksidaz (MAO) enziminin inhibitörleridir (maklobemid vb). Otoreseptör blokajı yaparak sinaptik aralığa serotonin ve noradrenalin salınımını artıran ilaçlarda (mirtazapin vb) mevcuttur [10].

Bu ilaçları sınıflandıracak olursak;

1. Serotonin (5-HT) ve noradrenalinin (NA) SSS'de nörona alımını bloke eden ilaçlar (SSRI, NSRI, TAD)

2. 5-HT ve NA'nin metabolizmasını inhibe eden ilaçlar (MAO inhibitörleri) 3. 5-HT ve NA reseptör blokajı yapan ilaçlar (Mirtazapin vb.)

1.2.2. Antidepresan İlaçların Sınıflandırılması

Antidepresan ilaçların sınıflandırılmasında detaylı olarak sadece tez çalışmamızda kullanılan Seçici Serotonin Geri Alım İnhibitörleri (SSRI)'leri anlatılacaktır.

(20)

5

Şekil 1.1. Antidepresan ilaçların sınıflandırılması

1.2.3. Selektif Serotonin Geri Alım İnhibitörleri (SSRI)

Özgül serotoninin geri alımını engelleyen antidepresanlardır. SSRI grubu ilaçlar depresyon hastalığında, kaygı denetim hastalıklarında, obsesyon bozukluklarında, fazla yada az yiyecek tüketimi gibi durumlarda, duygu durum bozukluğu hastalıklarında tedavi amacıyla reçete edilen ilaçlar arasındadır [11]. SSRI'lar depresyon tedavisinde etkin olmaları bakımından farklılık yaratmazken metabolizma, yarı-ömür, plazma seviyesinin doğrusal olması, yaşa bağlı metabolizma farklılıkları ve CYP enzimleri açısından farmakokinetik değişiklikler göstermektedir. Bu gruptaki ilaçlar genel olarak klinik vakalarda sorun teşkil etmemekte ve yaşlılarda güvenilir bir şekilde tedavide uygulanmaktadırlar. SSRI ilaçları, kardiyovasküler sistem üzerinde etkilerinin olmaması, antikolinerjik etkilerinin azlığı nedeniyle ve görülen ilaç yan etkilerinin azlığı sebebiyle kullanım açısından diğer grup ilaçlara göre daha sık kullanılmaktadır [12,13]. Depresyon tedavisinde kullanılacak ilaç seçimi yapılırken dikkat edilecek hususlar ilacın etkin oluşu, yan etkilerinin az olması ve ilacın güvenilirliğidir. Serotonin geri alım inhibitörleri ve çift etkili (serotonin-noradrenalin) depresyon ilaçları, TSA ve MAOI'lerine kıyasla az yan etkileri bulunması nedeniyle çoğu vakada etkinlik bakımından diğer ilaçlarla karşılaştırılabilir seviyededir. SSRI grubu ilaçların bu gibi üstünlükleri bulunduğundan trisiklik antidepresanlar tercih edilmemeli, dirençli vakalarda ilave ilaç olarak ya da tek başlarına kullanılmalıdırlar.

(21)

6 Yapılan araştırmalarda iki nörotransmitter üzerinden etki eden depresyon ilaçlarının etki mekanizmasında daha başarılı sonuçlara ulaşıldığı gibi bu durum henüz kesinleşmemiştir. Major depresyon hastalığının atipik veya melankolik alt tiplerine kıyasla antidepresan ilaç tercihi farklılaşabilmektedir. Tipik olmayan depresyon vakaları hakkında yapılan çalışmalar oldukça azdır, MAOI’lerin üstünlüklerine ait sonuçlar bulunmaktadır. TSA'lar ve çift etkili ilaçlardan venlafaksinin iyi olduğunu gösteren çalışmalar bulunmakla beraber paroksetin, sertralin ve moklobemidin de tesirli olduğunu gösteren çalışmalar bulunmaktadır [14]. İlaç seçiminde vurgulanması gerekli görülen diğer bir durumda çoklu ilaç kullanımında mühim olan sitokrom izoenzimleri sebebiyle olan ilaç etkileşmeleridir. Depresyonda kullanılan ilaçların klinik vakalarda diğer ilaçlarla etkileşmelere sebep olabilecek durumları göz önünde bulundurulmalıdır [15,16].

1.2.4. Antidepresan İlaç Etken Maddelerinin Ortak Yönleri

SSRI'ların meydana getirdikleri ilaç sınıfının beş ünlü üyesi vardır ve bu ilaçlar ABD ve birçok ülkede antidepresan içeren reçetelerin çoğunluğunu oluşturur. Bunlar fluoksetin, sertralin, paroksetin, fluvoksamin ve citalopramdır. Bu beş SSRI'dan her biri, farklı bir kimyasal aileye ait olsa da, hepsinin çok önemli ortak farmakolojik özelliği, serotoninin gerialımını selektif ve güçlü bir şekilde inhibe etmeleridir. Bu etkileri, noradrenalin gerialımı veya alfa 1, histamin 1 veya muskarinik kolinerjik reseptörler üzerindeki etkilerinden çok daha güçlüdür.

Bu nedenle SSRI'lar klinik uygulamalarda büyük ölçüde yerlerini aldıkları trisiklik antidepresanlara göre önemli ayırıcı özellikleri paylaşırlar. Şöyle ki, SSRI'lar, trisiklik antidepresanlardan daha seçici ve daha güçlü serotonin gerialım inhibisyonu özellikleri taşırlar. SSRI'lar trisiklik antidepresanların istenmeyen farmakolojik özelliklerine sahip olmadıklarından, bu özelliklerle ilişkili yan etkilerden de kurtulmuşlardır [17].

1.2.5. SSRI’ların Farmakolojik Ve Moleküler Etki Mekanizmaları

Her ne kadar klasik olarak SSRI'ların presinaptik akson terminalindeki etkileri sürekli vurgulanmışsa da, son zamanlardaki araştırmalar, serotonin nöronlarının somatodendritik

(22)

7 ucunda gerçekleşen olayların, terapötik etkilerinin açıklanmasında daha önemli olabileceklerini göstermiştir. Postsinaptik serotonin nöronlarında gelişen olayların, akut yan etkilere ve bu yan etkilere karşı zamanla gelişen toleransa aracılık etmeleri mümkündür [17].

Çizelge 1.1. SSRI'ların farmakokinetik özellikleri [18].

Sitalopram Fluoksetin Fluvoksamin Paroksetin Sertralin

Otoinhibisyon

Yok Var Var (hafif) Var Yok

Ana bileşik yarı ömrü 26saat (tek doz sonrası)

33 saat 1,9 gün 15 saat 10 saat 26 saat

Ana bileşik yarı ömrü (çoklu doz sonrası)

33 saat 5,7 gün 22 saat 21 saat 26 saat

Aktif metabolit

yarı ömrü 3 saat 7 - 9 gün - - 62 – 104 saat

Plazma protein bağlanması % 80 % 95 % 80 % 95 % 95 Kararlı düzeye ulaşması için gereken zaman (gün) 6-7 30-60 3-5 4-5 4-5 En yüksek plazma konsantrasyonuna ulaşması için gereken zaman (saat) 4 6 - 8 5 (1 - 8) 5 (0,5 - 11) 2 - 4

SSRI'lar yapıları bakımından heterojen olan gruplardır. Fluoksetin bir fenilpropilamin türevi, paroksetin bir fenilpiperidin türevi, sertralin ise bir naftilamin bileşimidir. Sitalopram ise dimetilaminopropil yan zinciri olan trisiklik bir yapıdadır. SSRI'ların bilinen sedasyon belirtileri bulunmamaktadır. Ancak kaygı bozukluklarında TCA/HCA’lara göre üstünlükleri olduğu düşünülmektedir. SSRI'ların klinik vakalarda depresyon tedavisine

(23)

8 etkileri açısından diğer ilaçlara göre üstünlükleri bulunmamasına rağmen, yan etki insidansı ve çeşitliliği bakımından farklılıklar gösterirler. Yine CYP enzim sistemindeki farklı etkileri nedeniyle de ilaç etkileşimleri birbirlerinden değişiktir. Farklı farmakokinetik özellikleri, kullanım şekillerinde de farklılıklar yaratır. Örneğin, fluvoksamin, diğerlerine göre daha kısa yarılanma ömrüne sahip olduğundan, bir günde iki kez aynı miktarda kullanılması uygun olmasına rağmen, fluoksetin gibi türlerde ve diğer SSRI’larda yarılanma süreleri 24 saat gibi uzun bir süre olduğundan günde bir defa kullanılmaları gerekmektedir. SSRI'ların, suisidal düşünce ve davranışları tedavisinde ve alkol madde bağımlılığında diğer depresyon ilaç gruplarına kıyasla daha başarılı oldukları görülmektedir. SSRI'ların etkileri diğerlerine göre daha çabuk meydana gelse de, TCA’lara oranla daha etkili sonuçlar vermediği bazı araştırmacılar tarafından belirtilmektedir. Şiddetli olmayan vakalarda ve nörolojik kaynaklı hastalıklarda kullanılması önerilir. Lakin, bu çalışmalardaki sonuçlar netlik kazanmamış olup tartışılmaktadır. Bu ilaçların sürekli kullanımı betaadrenoreseptör ve 5-HT 2 reseptör sayı ve duyarlılığında eksilmeye neden olur. Ancak bu durumlarda değişiklikler gösterebilir [18].

Fluoksetin

Depresyon tedavisinde kullanılabildiği gibi obsesif kompulsif bozuklukta ve blumia nervozada da başarılı tedaviler gösteren çalışmalar vardır. Unipolar depresyonlarda sinirlilik durumlarını en aza indirdiği düşünülmektedir. Fluoksetin, grubundaki başka ilaçlar gibi beta adrenoreseptör sayı ve duyarlılığında eksilmeye neden olmaz. Ancak GABA-B ve beta 1 reseptör sayı ve duyarlılığını yükseltir. Serotonin geri emilimine kuvvetli oranda engel olur. Etkli doz miktarı günde 20-80 mg’dır. Bu dozun yaşlı hastalarda daha az ayarlanması önerilir. Tesiri çabuk görülür. Fluoksetin ilacının ve etkin bozunma ürünün güçlü olması ve yarılanma ömrünün uzun olması sebebiyle ilacın alınmasındaki aksaklıklar problem değildir. Bu sebeplerden dolayı çekilme belirtileri oluşma durumu söz konusu değildir. Fakat bu özelliği diğer serotonin üzerinden etki eden antidepresanlarla kombinasyonunu olanaksız kıldığı üzere, farklı ilaca geçişte belirli bir zaman beklemek gerekir. Eğer bu süre beklenilmezse, "Santral Serotonin Sendromu" adı verilen istenmeyen bir duruma yol açar. Diğer ilaçlara oranla uyarıcı bir etkisi mevcuttur. Uyarıcı etki yapılan hayvan deneyi çalışmalarında amfetamin ve kokain ihtiyacını azalttığı

(24)

9 gösterilmiştir. Aynı zamanda bazı duyarlı kişilerde, akatizi ve diğer ekstrapiramidal sendrom (EPS) semptomlarına benzer reaksiyonlar ortaya çıkarabilir. Diğer SSRI'lara bağlı serotonerjik etki artışı, nigrostriatal ve tuberoinfundibular nöronlarda inhibisyona dolayısıyla EPS bulgularına sebep oluşturur. Fluoksetinin oluşturduğu EPS yan tesirinin, beta adrenoreseptör iletimindeki artışa bağlı olduğu düşünülmektedir. İştahsızlık ve kilo vermeye sebep olmaktadır. Fluoksetin, genellikle CYP 2D6 enzimini çalışmasını engellediğinden, CYP 2D6 enzimi ile yıkılan ilaç gruplarıyla etkileşime girer. Türkiye’de Fluoksetin, 20 mg’lık kapsül formu ile (Prozac, Depreks, Fulsac, Florak, Zedprex vb) tüketiciye sunulmuştur.

Fluvoksamin

Fluvoksamin, SSRI grubun ilaçları arasında daha çok obsesif kompulsif bozuklukta kullanımı başarılı bulunmuş bir antidepresandır. Günde kullanılması gereken doz 50-300 mg'dır. Tedavi dozu ilk başta 50 mg/gün olarak belirlenmelidir. Ancak bazı yan etkilere bakılarak doz artımına gidilebilir. Depresyonda genellikle günde 100-150 mg civarında bir doz kullanılır. Obsesif kompulsif bozukluklarda ise, bu dozun iki katı kadar bir doz kullanılması gerekir. İlaç seviyesi tedavi dozuna beş on gün gibi bir sürede ulaştığı düşünüldüğü için klinik etkinin bir haftada başladığı görüşü hakimdir. Ancak bu durumun kesinliği kanıtlanmamıştır. Fluvoksaminin yarılanma ömrü 24 saatten az olması nedeniyle bir günde eşit miktarlarda iki doz şeklinde kullanılması önerilmektedir. Fluvoksaminin, uyarıcı ve EPS yapıcı etkileri mevcuttur. Türkiye’de fluvoksaminin ticari adı Faverin olup 50 ve 100 mg’lık tablet formu ile satışa sunulmaktadır.

Sertralin

Sertralinin serotonin gerialımına etkisi, fluoksetinle karşılaştırıldığında 5 kat daha etkili olduğu düşünülmektedir. Trombosit hücrelerinde de sertralin serotonin gerialımını engel olmaktadır. Obsesif kompulsif bozukluklarda da kullanılmaktadır. Panik atak vakalarında ise günlük doz 25- 50 mg gibi düşük dozlarda kullanılır. Fluoksetin ve fluvoksaminde görülen EPS etkisi, sertralinde seyrek oranda görülmektedir. Kullanılan etkili doz miktarı, günde 50- 200 mg olup (yaşlı hastalarda günde 50-100 mg), tedaviye mutlaka 50 mg /gün

(25)

10 dozuyla başlanmalıdır. Majör depresyon dışında bu doz genellikle etkili olur. Ancak, majör depresyonlarda ve obsesyonda yüksek dozlarda (günlük doz 200 mg) kullanılması gerekmektedir. Sertralin, günde iki kez bir doz şeklinde aç veya tok olarak kullanılabilir. Tedavide başarı genellikle 15-30 gün arasında görülse de, depresyon belirtilerinde ilk bir haftadan sonra az düzeyde iyileşme olmaktadır. Böbrek ve karaciğer yetmezliği olan hastalarda kullanımında dikkat edilmesi gerekmektedir. Tedavi dozlarında sinir sistemi çalışmasını ve kardiyovasküler işlevselliği bozmaz ayrıca EKG'de herhangi bir değişikliğe yol açmaz. Karaciğerde CYP-450 enzim inhibisyonuna neden olmadığından dolayı, farklı ilaçlarla birlikte güvenli şekilde kullanılabilir. Ancak serotonerjik iletimi arttıran diğer ilaçlarla toksik serotonin sendromuna sebep olabilmektedir. İlaç değişikliği yapılması gerekiyorsa, sertralin bırakılmalıdır daha sonra yeni ilaca başlamak için 15 gün beklenmelidir. Sertralin, Türkiye'de 50 - 100 mg’lık tablet ve kapsül formlarında (Lustral, Serdep, Seralin, Selectra) satışa sunulmuştur.

Paroksetin

Paroksetin fluoksetin, fluvoksamin ve sertraline oranla seçicilik özelliği daha yüksek olan bir bileşiktir. Klinik vakalarda etkisini beta adrenoreseptör duyarlılığını eksilterek yapmaz ancak serotonin otoreseptör duyarlılığını eksilterek yaptığı iddia edilmektedir. Paroksetinin günlük tedavi dozu 20-60 mg'dır. Yaşlı hastalarda günlük doz 40 mg'dan fazla olmaması gerekmektedir. Renal, hepatik ve kardiyovasküler sistem hastalıkları olan vakalarda günlük dozun 20-30 mg'ı geçmemesine dikkat edilmelidir. Sedatif etkisi olmadığı gibi, uyku bozukluklarına sebep olabileceğinden yatmadan önce kullanımı fazla önerilmemektedir. Alınan yiyeceklerle etkileşime girmediği için ve bulantı ihtimaline karşı sabah kahvaltısıyla beraber alınması önerilmektedir. Yapılan klinik çalışmalarda, paroksetinin diğer SSRI'lara göre, majör depresyon vakalarında daha başarılı olduğu düşünülmektedir.

Sitalopram

SSRI grubu antidepresanların içinde seçiciliği en belirgin etken madde sitalopramdır. Panik atakta ve psikojenik ağrı durumlarında daha tesirli olduğundan, analjezik tedavi gücü depresyon tedavi gücünden daha hızlıdır ve daha az dozlarda başlamaktadır. Alkol

(26)

11 bağımlılığı durumlarında uzun bir tedavi sonrası alkol alma isteğinde ve alkol kullanımında belirli seviyede azalmalar gösterdiği iddia edilmektedir. Tedaviye başlama dozu genellikle günlük 20 mg'dır. Günlük doz 20 ile 40 mg olmasına rağmen bazı vakalarda en çok 60 mg da kullanılabilir. Renal ve hepatik yetmezliği olan hastalar ile yaşlılarda günlük doz 40 mg olarak ayarlanmalıdır. Sitalopramın tablet formu Cipram 20 mg olarak satışa sunulmaktadır.

SSRI grubu antidepresanların etkileri TCA’lara kıyasla daha çabuk görülse de tedavi etlinlikleri 2 haftaya varan sürelerde ortaya çıkar. Ancak, en yüksek etki için ya da tedavi başarısını izlemek için 2 ay gibi uzun bir süre beklemeye gerek yoktur. Hastaların SSRI grubu antidepresanlara farklı cevap verdikleri de görülmektedir. SSRI grubu ilaçlardan birine tedavi başarı gösterirken diğer bir çeşidine tedavi başarısı göstermeyebilir. Sıklıkla bütün SSRI grubu antidepresanların yan etkileri arasında uyku bozukluğu, iştahsızlık, kilo verilmesi, kendini huzursuz hissetme gibi olumsuz durumlar bazı vakalarda belirgin şekilde görülürken, bazı vakalarda bu durumlarla karşılaşılmayabilir. Seyrekte olsa hastaların bir kısmında yeterli sürelerde ve tedavi etkin dozlarda kullanılmalarına karşın, yan etkilere engel olunamamış yani yan etkiler azalmamış ise ilacı bırakıp yeni ilaca geçmek yerine, alınan doz bir ay gibi bir süre içinde yan etkilerin azaltılması için en az miktara indirilmelidir. Görülen yan etkiler nedeniyle ilaçların kullanıma düşük dozlarda başlanıp, eğer gerekiyorsa zaman içinde yüksek dozlara çıkılması gerektiği araştırmacılar tarafından vurgulanmaktadır [19-26].

(27)

12 1.3. Çalışılan Antidepresanların Kimyasal Yapı Ve Formülleri

Aşağıda çalışılan 4 farklı antidepresan ilaç etken maddesinin (sertralin, fluoksetin, citalopram ve escitalopramın) kimyasal yapıları ve formülleri verilmiştir.

Tablo 1.1. Çalışılan etken maddelerinin kimyasal yapıları, formül ve IUPAC adlandırılmaları [59,60,61,62]

Formül ve Adlandırma Kimyasal Yapı Sertralin (1s,4s)-4-(3,4-dichlorophenyl) 1,2,3,4- tetrahydro-n-methyl-1-napthalenamine hydrochloride C17H18Cl3N Fluoksetin (RS)-N-methyl-3-phenyl-3-[4-(trifluoromethyl) phenoxy]propan-1-amine C17H18F3NO Citalopram (RS)-1-[3- (Dimethylamino)propyl]- 1-(4-fluorophenyl)-1,3- dihydroisobenzofuran-5-carbonitrile C20H21FN2O Escitalopram (S)-1-[3- (Dimethylamino)propyl]- 1-(4-fluorophenyl)-1,3- dihydroisobenzofuran-5-carbonitrile C20H21FN2O

(28)

13

2. KURAMSAL TEMELLER

Kapiler elektroforez 1990'lı yıllarda gelişen, günümüzde de çeşitli bilim alanlarındaki analizlerde uygulanan bir yöntemdir [27]. CE tekniği gıda analizleri, farmakolojik uygulamalar, biyobilim, çevresel uygulamalar ve adli tıp uygulamaları gibi geniş uygulama alanlarına sahiptir. CE’in geniş uygulama alanlarının yanında inorganik iyonların ayırımında da iyon kromatografiye alternatif olarak yaygın kullanıldığı görülmektedir [28,29]. Kapiler elektroforez birkaç kromatografik tekniğin ve jel elektroforezin üstün niteliklerinin biraraya gelmesiyle üretilmiş modern bir metottur. CE, kromatografik yöntemlerin iyi yönlerine sahip olduğu gibi, eş zamanlı ayırma analizlerine olanak sağlaması, analizin az bir zaman diliminde gerçekleştirilebilmesi, analiz için gerekli örnek miktarının az olması, joule ısısını etkin bir şekilde dağıtabilme yeteneği, analiz maliyetinin düşüklüğü, yüksek kararlılık, yavaş akışkan faz tüketimi ve verilerin kolay alınabilmesi gibi birçok avantajları bulunan kolay ve karmaşık olmayan bir sistemdir [30]. CE tekniğinde iyon analizi, tampon çözelti geçirilen kapiler kolona elektrik alan uygulanmasıyla birlikte iyonların göç hızları farklılığına dayanmaktadır. İyonların göç hızlarındaki farklılık, yükleri ve kütleleri ile belirlenen kendi elektroforetik mobilitelerine bağlıdır. Kapilerin bir ucundan verilen iyonlar güçlü elektroosmotik akış (EOF) ile kapilerin diğer ucuna sürüklenerek dedektörden sırayla geçerler. CE, kısa analiz süresi ve 0,1 ile 10 nL gibi az miktarda numune gereksinimi ile maddelerin tayinine imkan vermektedir. Ayırma ortamı küçük iç çapa sahip kapiler kolonda gerçekleştiğinden, dedeksiyon hacmini sınırlandırmaktadır [31].

2.1. Kapiler Elektroforez

Kapiler elektroforez (CE) cihazı; yüksek voltaj güç kaynağı, giriş ve çıkış vialleri, kapiler, dedektör ve bilgisayardan oluşmaktadır. Farklı cihaz sistemlerinde kapilerdeki ısınmayı önlemek ve kapiler sıcaklığını kontrol altında tutmak için termostat bulunmaktadır. Bir kapiler elektroforez analizinde izlenen adımlar; kapilerin ön yıkaması, kapiler ile giriş ve çıkış viallerinin çalışma tamponu ile doldurulması, kapilerin tampon ile şartlandırılması, numunenin kapilere enjeksiyonu ve elektriksel alan uygulanmasını içermektedir. Numunenin içinden alınan maddeler kapiler kolon içinde hareket etmektedirler. Dedektörden geçerken gözlemlenmekte, veriler bilgisayara gönderilmektedir. Veriler,

(29)

14 dedektör cevabının zamana karşı grafiği olan elektroferogramlar şeklinde elde edilmektedir.

Şekil 2.1. Kapiler elektroforez cihazının şematik gösterimi

Numune enjeksiyon çözeltisinin kapiler kolon içine alınması hidrodinamik veya elektrokinetik olarak yapılmaktadır. Hidrodinamik enjeksiyon, daha çok kullanılan enjeksiyon yöntemidir ve üç şekilde yapılabilmektedir. Bu yöntemlerden ilki, kapilerin giriş kısmında bulunan numune vialine basınç uygulanmasıdır. Genelde basınç 50 mbar civarında olup 1 ile 5 saniye arası uygulanır. Daha sonra numune viali çıkarılıp çalışma tamponu viali takılır ve voltaj uygulanarak analize devam edilir. Hidrodinamik enjeksiyonun ikinci yolu, numune viali kapilerin giriş kısmındayken, çıkış kısmındaki tampon vialine vakum uygulanmasıdır. Uygulanan vakumla istenen miktardaki numune kapilere girince vakum kesilir, numune viali çıkarılıp çalışma tamponu viali takılır ve voltaj uygulanarak analize devam edilir. Üçüncü hidrodinamik enjeksiyon yönteminde, sifon etkisinden yararlanılır. Kapilerin giriş kısmına takılan numune viali, çıkıştaki tampon vialinden daha yükseğe yerleştirilir. Yerçekiminin etkisiyle, numune kapilerin içine girer. Ardından numune viali çıkarılıp çalışma tamponu viali takılır ve voltaj uygulanarak analize devam edilir.

(30)

15

Şekil 2.2. Kapiler elektroforezde enjeksiyon sistemleri: a, b, c) Hidrodinamik enjeksiyon, d)

Elektrokinetik enjeksiyon.

Elektrokinetik enjeksiyonda kapilerin giriş kısmına numune viali yerleştirildikten sonra, numune vialiyle çıkış kısmındaki çalışma tamponu viali arasına voltaj uygulanır. Oluşan elektrik alanın etkisiyle numunedeki iyonlar kapiler içine hareket etmeye başlar. Bu voltajın uygulanmasıyla birlikte numune viali çıkarılıp tampon viali takılır ve voltaj uygulanarak analize devam edilir.

Kapiler elektroforezde kullanılacak kapiler kolonun türü, boyu ve çapı, uygulanacak metot, analiz edilecek numune örneği, istenen ayırıcılık ve uygun analiz zamanına göre belirlenmektedir. Kapilerden istenen, kısa analiz zamanıyla, yeterli ve uygun ayırımı yapabilmesidir. Kapiler kolonun üretildiği materyalin elektrik iletkenliğini sağlamaması, kimyasal olarak inert olması ve dedektörle uyumlu olması (örneğin UV dedektör için kapilerin ışınları absorplamaması) gerekmektedir.

Eritilmiş silika son yıllarda en çok kullanılan kapiler materyalidir. Kolay deforme olduğu için dış yüzeyi poliimid ile kaplanmıştır ve sağlamlaştırılmıştır. UV dedektör kullanılacaksa, ışık yolunu kapatmaması için poliimid kaplama bu bölgeden kaldırılıp bir pencere açılması gerekmektedir.

(31)

16

Şekil 2.3. Eritilmiş silika kapilerin boyuna kesiti.

Pyreks kapiler, eritilmiş silika kapilere göre daha sağlam olması ve dedektör penceresi açmaya gerek göstermemesine rağmen 280 nm'nin altında çalışılamama gibi bir dezavantaja sahiptir. Teflon kapilerde homojen iç çap elde edilemez ve ısı iletkenliği düşük olduğundan yüksek voltaj uygulanamaz. Bu nedenlerden dolayı eritilmiş silika, pyreks ve teflondan daha sık kullanılan bir kapiler malzemesidir. Genellikle iç çapı 25- 100 µm olan eritilmiş silika kapiler kolon tercih edilmektedir. Geniş çaplı kapiler kolonlarda yüksek ısı oluşmakta ve kapilerin iç duvarıyla merkezi arasında ısı farkı çok fazla olmaktadır. Küçük çaplı kapiler kullanılması ile UV-VIS absorbans veya floresans gibi dedektörlerde ışık yolunun küçülmesi nedeniyle absorbans düşmekte ve pik yüksekliği azalmaktadır. Aynı zamanda çok küçük çaplı kapilerin partiküllerle tıkanma ihtimali bulunmaktadır.

Kapiler kolon ile yapılan analizlerden tekrarlanabilir sonuçlar almak için ilk çalışmadan önce ve her analizden önce şartlandırma çalışmasının yapılması gerekmektedir. Silika yüzeyinin yapısı, CE'de moleküllerin hızlarına etki eden kuvvetlerden biri olan elektroozmotik akış (EOF) üzerinde oldukça etkilidir. Kapilerin şartlandırılmasıyla kapilerin iç çeperindeki silanol gruplarının iyonlaşma oranı, dolayısıyla EOF, her analizde aynı kalacaktır. Kapiler yeni ise 1 N NaOH, ardından 0,1 N NaOH, saf su ve daha sonra da çalışma tamponu geçirilerek şartlandırma işlemi yapılır. Aynı zamanda her analizden önce 0,1 N NaOH, saf su ve çalışma tamponu geçirilerek kapilerin aynı şartlanması sağlanmış olur. Gün sonunda kapilerden saf su geçirilerek kapilerin yıkanması

(32)

17 sağlanmalıdır. Birkaç gün içinde cihaz açılmayacaksa kapiler içinde mikroorganizma üremelerine engel olmak için hava geçirilerek kurutulmuş şekilde bırakılması faydalı olur. Kapiler Elektroforez’de tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için kapiler sıcaklığının kontrol altında tutulması önemlidir. Sıcaklığın değişmesiyle doğruluk, göç zamanı, enjeksiyon hacmi ve dedektör cevabı değişir. Ayrıca numunenin içindeki bileşiklerin bozunmasına da sebep olabilir. Kapiler sıcaklığının kontrolü, kapilerinde içinde bulunduğu kaset bölümünde, istenen sıcaklığa termostatlı sistem ile ayarlanmış havanın fan ile üflenmesiyle sağlanmaktadır.

Elektroforez için gerekli olan voltaj, akım veya yüksek voltaj güç kaynağı ile sağlanmaktadır. Pek çok CE ayırımı sabit voltajda gerçekleştirilir, bu nedenle güç kaynağı sabit akım ve sabit güç uygulayabilme özelliğine sahip olmalıdır. Voltaj 30 kV'a kadar, akım 300 µA'e kadar ve güç 6 W'a kadar uygulanabilir. Ayrıca gerektiği zaman uygulanan elektrik alanın yönü (giriş viali katot, çıkış viali anot) değiştirilebilir.

CE'de en çok kullanılan dedektörler UV-VIS absorbans (direkt ve indirekt), floresans (direkt ve indirekt), lazerle indüklenmiş floresans, kütle spektrometrisi, iletkenlik, amperometri (direkt ve indirekt), radyometrik ve kırılma indisi dedektörleridir. UV-VIS absorbans dedektörleri CE'ye uygulanabilirlikleri sebebiyle yaygın olarak kullanılırlar. Gözlenebilme sınırı genellikle 10-5-10-7 M aralığındadır. Tek bir dalga boyunda veya dizi

diyot dedektör kullanılarak birçok dalga boyunda absorbans alınabilir. Absorbans dedektörlerinde kapilerin kendisi dedektör hücresi olarak görev yapar. Bunun için erimiş silika kapilerin dış kısmındaki poliimid koruyucu kaplamanın bir kısmı yakma, çözme ve kazıma ile uzaklaştırılır. Ancak, bu durumda ışın yolunun uzunluğu kapiler iç çapından (50 ile 100 µm) fazla olamaz ve bu da derişim cinsinden gözlenebilme sınırını kısıtlar. Işın yolunun arttırılması için “z” veya baloncuk şeklinde dedektör hücresine sahip kapilerler kullanılarak duyarlılık arttırılabilir [32].

Elektroforez, İsveçli kimyacı Arne Tiselius tarafından geliştirilen, yüklü moleküllerin akışkan sıvı ortamında elektrik alanı uygulanarak ayrılması yöntemidir. Yüklü moleküllerin elektroforetik hızlarının farklılığı, ayırımı sağlar [33]. Elektroforez birçok analitik ayırma çalışmalarına uygulanmaktadır. Elektroforezin en belirgin özelliği, biyoteknoloji endüstrisinde biyolojik ve biyokimyasal araştırma ve çalışmalarda yüklü moleküllerin ayrılmasını sağlamasıdır. Elektroforetik ayırma birbirinden farklı iki formatta

(33)

18 gerçekleştirilir; birincisi tabaka (slab) elektroforez ve ikincisi kapiler elektroforezdir. Tabaka yönteminde moleküllerin ayrılması, gözeneklerinde tampon çözelti bulunan yarı katı, gözenekli bir ince jel tabakası kullanılarak yapılmaktadır. Analiz edilen numuneler, bir damla veya bant şeklinde jel tabaka üzerine eklenir, doğru akım potansiyeli belli bir süre uygulanır. Ayırma işlemi gerçekleştirildikten sonra potansiyel kesilir [34].

Partiküllerin hareketliliği esasına dayanan ilk elektroforetik yöntem, protein araştırmaları için Tisellus tarafından 1937 yılında kullanılmıştır. Tisellus bu buluşuyla nobel ödülü almıştır. Daha sonra elektroforetik yöntem geliştirilmiş ve günümüzde çeşitli elektroforetik türler kullanılmaya başlanmıştır. Kapiler elektroforez de bu türlerden birisidir. 1981 yılında Jongerson ve Lukacs 75 μm iç çaplı kapilerde ayırma yaparak yöntemin teorisini ortaya koymuşlardır [35].

Kapiler elektroforez (CE), küçük hacimdeki örneklerde bulunan yüklü parçacıkların hızlı ve etkili şekilde ayrılmalarını sağlayan modern bir analitik yöntemdir. Ayırım, kapiler içindeki elektroforetik ortamda bulunan yüklü parçacıkların elektroforetik hızlarındaki farklılık esasına göre yapılmaktadır [36].

CE yöntemi, klasik elektroforezin ayırma tekniği ile kromatografik yöntemlerin cihaz tasarımlarının birleşmesinden oluşmaktadır. CE büyük bir hızla gelişim gösteren güvenilir bir ayırma yöntemidir. Bu yöntem ile inorganik katyon ve anyonlar gibi en küçük iyonlardan, DNA gibi büyük molekül ağırlığına sahip moleküllere kadar çeşitli moleküllerin kantitatif ve kalitatif olarak analizi mümkündür. Ayrıca başta inorganik anyon ve katyonlar olmak üzere aminoasitler, ilaçlar, vitaminler, karbonhidratlar, peptitler, proteinler ve başka pekçok türlerin analizi yapılabilmektedir. Bu teknik, karmaşık olmayan kolay düzenek yapısı, yüksek ayırma gücü, analiz hızı, küçük hacimde numune gereksinimi, düşük maliyeti ve kullanım kolaylığı gibi daha birçok avantaja sahiptir [37]. Geliştirilen kapiler elektroforez yöntemi, son yıllarda ilaç, ziraat, adli tıp, genetik, biyolojik, tarım gibi çok geniş uygulama alanlarında kullanılabilme olanağına sahip bir yöntemdir. Bu gibi avantajlı yönlerinden dolayı, CE tekniğinin gelecek yıllarda birçok yöntemin yerini alacağı düşünülmektedir.

(34)

19 2.1.1. Kapiler Elektroforezin Temel İlkeleri

Elektroforetik ayırma, elektrik alan uygulanan kapiler kolon içerisindeki iyonların göç hızlarındaki farklılıklara bağlıdır. Kapiler kolon içerisindeki bir iyonun hızı şu eşitlik yardımıyla bulunabilir. (Eş.2.1)

ν= μe . E (2.1)

E=V/L (Volt/cm) (2.2)

Bu denklemde v iyon hızı, μe elektroforetik hareketlilik ve E uygulanan elektrik alan (V/cm) olarak tanımlanır [38]. Elektrik alan; Eş.2.2'de görüldüğü üzere kullanılan kapiler boyu (L) ve uygulanan voltaja (V) göre değişir. Elektroforetik hareketlilik (μe), iyonun özelliğine ve bulunduğu ortam koşullarına bağlıdır. Bir başka değişle μe her iyon için karakteristiktir. Elektroforetik hareketlilik, uygulanan elektrik kuvvet ile doğru (FE) ve ortamın sürtünme kuvveti (FF) ile ters orantılıdır. Bu iki kuvvetin μe’ye etkisi Eş.2.3 gösterildiği gibidir.

(2.3)

Uygulanan elektrik kuvvetine ve iyonun sürtünme kuvvetine ait eşitlik Eş.2.4 ve Eş.2.5’de verilmiştir.

FE = q.E (2.4)

FF = -6.π.η.r.v (2.5)

Eşitliklerdeki q iyon yükü, η çözelti viskozitesi, r iyon yarıçapı ve v iyon hızı olarak tanımlanır. Sabit elektrik alan uygulandığında elektroforez süresince FE ve FF kuvvetleri dengeye gelerek sabit bir durum oluşturur. Bu noktada bu iki kuvvet birbirine eşit fakat zıt yönlüdür, bu duruma ait eşitlik Eş.2.6.’de verilmiştir.

(35)

20 Elde edilen Eş.2.6 ifadesi Eş.2.1'da yerine konduğunda elektroforetik hareketliliği veren son Eş.2.7 elde edilmektedir.

(2.7)

Viskozite sabit olduğunda, ayırmada q ve r oranı (q/r) etkili olacaktır. Çözelti içindeki moleküller bu orana bağlı olarak elektrik alanda değişik hızlara sahip olurlar. Küçük ve çok yüklü türler yüksek mobiliteye sahipken, büyük ve az yüklü türler düşük mobiliteye sahiptir [39]. Çözünmüş olan yüklü moleküller, farklı elektroforetik mobilitelere sahip oldukları için birbirlerinden ayrılırlar. Nötral çözünen moleküller, birbirlerinden değil, yüklü çözünen moleküllerden ayrılırlar. Yüksek mobiliteye sahip, daha fazla yüklü ve boyut olarak daha küçük katyonlar kapiler kolondan ilk olarak geçerler. Kapiler kolondan en son, fazla yüklü küçük anyonlar birbirlerinden farklı tip kapiler elektroforez yöntemi ile geçerler [40]. Şekil 2.4'de bir elektroferogram görülmektedir. Nötral çözünen maddeler birbirlerinden farklı tip kapiler elektroforez yöntemleri ile kolay bir şekilde ayrılırlar.

Şekil 2.4. Elektroforetik ve elektrozmotik hızların göç zamanı üzerine etkisi: (EOF:

(36)

21 2.2.2. Elektroosmotik Akış (EOF)

CE uygulamasının temel unsurlarından biri de elektroosmotik veya elektroendoosmotik akış (EOF)' dır [39]. Kapiler elektroforezde genellikle eritilmiş silika kapiler kullanılır. Eritilmiş silika kapilerin iç yüzeyi silanol grupları (SiOH) ile kaplıdır. Kapiler iç yüzeyindeki silanol gruplarının NaOH ve KOH ile muamele edilmesi neticesinde SiOH, SiO-’a iyonize olur. Konvansiyonel CZE çalışmalarında iyonların göç hareketinde EOF’un baskın olması için silanol gruplarının iyonize olduğu pH ≥ 3 tamponlarla çalışılması tavsiye edilir. Kapiler kolondan çalışma tamponu geçirildiğinde eksi yüklü kapiler duvarı, çalışma tamponundaki katyonları çeker. Böylece kapiler duvarının yakınında elektriksel bir çift tabaka ve bu tabaka sonucunda bir potansiyel farkı (zeta potansiyeli) oluşur.

Şekil 2.5’de gösterildiği üzere kolon çeperine yakın bölgedeki artı yüklü iyonlar hareket etmezken çeperden uzaklaşıldıkça çeperle artı yüklü tanecikler arasındaki elektrostatik çekim kuvveti zayıflar. Kapilere uygulanan elektriksel alanın iyonlar üzerindeki kuvveti daha güçlü hale gelir ve artı yüklü iyonlar beraberce katota doğru hareket ederler. Bu toplu göç kapiler içindeki tamponun katoda doğru yönelmesine neden olur. Bu akışa elektroosmotik akış (EOF) denir [41,42].

Özet olarak tampon çözelti içeren bir kapiler tüpe yüksek bir potansiyel uygulandığında, genellikle bir elektroosmotik akış oluşur. Bu akış sebebiyle çözücü katot veya anoda doğru hareket eder. Şekil 2.5’de görüldüğü gibi elektroosmotik akışın nedeni silika ile çözelti ara yüzeyinde oluşan elektriksel çift tabakadır [43].

(37)

22 Elektroosmotik akışın hızı, vEOF, Eş. 2.8 ile hesaplanır.

vEOF = E.μEOF (2.8)

vEOF : Elektroosmotik akış hızı (cm/sn) E : Elektriksel alan (V/cm)

μEOF : Elektroosmotik hareketlilik (cm2/ V.sn)

Ayrıca elektroosmotik akışın hızı, vEOF, Eş.2.9 ile de hesaplanabilir.

vEOF =ε.ζ .E / 4.π.η (2.9)

Eşitliğin sağ tarafındaki değişkenler elektroosmotik akışta da değişikliklere sebep olurlar. Burada ε tamponun dielektrik sabiti, ζ zeta potansiyeli, E (volt/cm) elektrik alanı ve η tamponun viskozitesidir.

Elektroosmotik hareketlilik,

μEOF = ε.ζ / 4.π.η (2.10)

Elektroosmotik hareketlilik; dielektrik sabiti, Eş.2.10'da görüldüğü üzere viskozite, pH ve konsantrasyon (zeta potansiyelinden etkilenir) gibi tamponların karakteristik özelliklerine bağlıdır ve uygulanan elektrik alanından bağımsızdır.

Kapiler elektroforezde EOF; kullanılan tampon çözeltinin özelliklerine, ayrımın yapıldığı sıcaklığa ve uygulanan potansiyele göre farklılık göstermektedir [44]. Elektroosmotik akış, kapiler içinde parabolik olmayan düz kesitli bir dizi çözelti akışına sebep olur. Sıvı kromatografi tekniklerinde ise akış basıncın etkisi altında parabolik kesitlidir (Şekil 2.6). Bu gibi sebeplerle elektroosmotik akış, sıvı kromatografisinden farklı olarak bant genişlemesine önemli bir derecede etki etmemektedir ve kapiler elektroforez de bu nedenle dar bantlı ve dik pikler elde edilmektedir [39].

(38)

23

Şekil.2.6. Kapiler kolonda EOF ve parabolik akış

2.2.3 Elektroosmotik Akışı Etkileyen Faktörler

Elektroosmotik akış hızı kapiler elektroforez tekniğinde, elektroforezin gerçekleşmesini direk etkilediği için kontrol altında tutulmalıdır. EOF hızının yüksek olduğu durumlarda pikler çakışır ve ayırım gerçekleşmez. EOF hızı düşük olduğu durumlarda piklerin ayırım gücü azalmaktadır. CE tekniğinde elektroosmotik akış, çalışmada kullanılan tampon çözeltilerin özelliklerine (dielektrik sabiti, viskozitesi ve dolayısıyla zeta potansiyeli büyüklüğü) çalışılan sıcaklığa göre değişim sergilemektedir. Kapiler kolonda kullanılan tampon çözeltiler, kimyasal yapı farklılıkları nedeniyle değişik birer mobiliteye sahiptirler. Bu gibi sebeplerle kolon içerisinde en uygun akışı sağlamak için tampon çözelti karışımları da kullanılabilmektedir [39].

EOF, uygulanan elektrik alanın değiştirilmesine bağlı olarak orantılı bir şekilde değişiklik gösterir. Elektriksel alanın azaltılmasıyla verim ve ayırıcılık azalabilir. Elektriksel alanın artırılmasıyla joule ısınması meydana gelebilir. Elektroosmotik akışı etkileyen önemli etkilerden biri de tampon çözeltinin pH’ıdır. Tampon çözelti pH’ının artması ile kapiler iç duvarında bulunan SiOH yapılarının SiO- 'a iyonizasyonu yüksek oranda olacaktır. Kapiler

yüzey yükünde oluşan artış, zeta potansiyelinin ve bunun sonucunda da EOF’ın artmasına sebep olur. Tampon çözeltinin iyonik gücünün veya derişiminin artması zeta potansiyelini düşürür ve EOF’ı azaltır. Tampon çözeltinin derişiminin düşük olması ise, analiz süresinin azalmasına neden olur fakat tampon derişimi numune derişiminden fazla değilse elektriksel iletkenlikte problem oluşturur. Sıcaklık artışı, tampon viskozitesinin azalmasına, dolayısıyla da EOF’nin artmasına neden olur. Sıcaklık sürekli kontrol altında tutulmalıdır, çünkü sıcaklıktaki artış numunenin bozulmasına, pik genişlemesine, tampon kaynamasına

(39)

24 ve tekrarlanamayan göç zamanlarına neden olur [41,42]. Bir diğer etken organik değiştiricidir. Zeta potansiyeli ve viskoziteyi değiştirir. (genelde EOF’ ı azaltır)

2.2.4 Band Genişlemesi

Ayırma etkinliği HPLC de olduğu gibi CE’de de teorik plaka sayısıyla gösterilir. Eş. 2.11'de görüldüğü üzere band genişliğinin artması ayırma etkinliğini düşürür.

N= 5,54.(t / w1/2)2 (2.11)

Band genişlemesine neden olan etkenlerden en önemlisi difüzyondur. Kapilerin çapı küçük olduğu için, kapiler çapı boyunca difüzyon ihmal edilebilir, ancak kapiler boyunca difüzyon oluşabilir. Difüzyon ve N arasındaki eşitlik (2.12.) şöyledir:

σ2 = 2Dt= 2DlL / μe.V (2.12)

Eş.2.11 ve 2.12 yardımıyla teorik plaka sayısı ve difüzyon arasında bir eşitlik (2.13) verilebilir.

N= μe.V.l / 2DL = μe.E.L / 2D (2.13)

Bu eşitlikten de görüldüğü üzere teorik plaka sayısı, difüzyon katsayısı arttıkça azalır. Büyük molekül kütlesine sahip maddeler daha küçük difüzyon katsayılarına sahip olmaları nedeniyle daha yüksek plato sayıları ile ayrılabilirler. Ayrıca Eş.2.12’de görüldüğü üzere analiz süresi azaldıkça difüzyon sebebiyle pik genişlemesi azalacaktır. Kapiler elektroforezde yüksek voltaj etkisiyle ayırmalar genellikle çok kısa bir zaman diliminde tamamlandığından pikler dik ve simetriktir. Band genişlemesine sebep olan diğer etkiler; sıcaklık, tampon viskozitesinde yerel değişimler sebebiyle pik genişlemesi, enjeksiyon hacmi, büyük hacimlerde difüzyon nedeniyle pik genişlemesi, örneklerin çepere adsorpsiyonu, pik şekillerinde bozulmalar, elektrodispersiyon (örnek ve tampon çözelti arasındaki iletkenlik farklılıkları) ve pik şekillerinin üçgen halinde görülmesidir [45].

(40)

25 2.2.5. Joule Isınması

Kapiler elektroforezde uygulanan yüksek voltaj ve bundan dolayı uygulanan yüksek akım kapilerin ısınmasına sebep olur. Bu durum kapiler elektroforez çalışmalarında joule ısınması olarak adlandırılır ve sonuçları olumsuz etkileyen bir durumdur. Joule ısınması kapiler içindeki sıvının soğutulmasını engeller, sıcaklık kapiler içinde yükselir ve bu yükseliş pik genişlemesine, tekrarlanamayan ayırım zamanına, numunenin yapısının bozulmasına veya tamponun kaynaması sonucu elektriksel iletkenliğin bozulmasına sebep olur. Bu gibi olumsuzlukları önlemek için çalışmalarda en uygun potansiyel değeri seçilmelidir [42,46].

2.2.6 Kapiler Elektroforez Türleri

Kapiler elektroforezin en çok kullanılan tipi kapiler zone (kuşak) elektroforez (CZE)'dir. CZE’de ayırım, elektrolit çözeltisi ile doldurulmuş kapiler kolonda, uygulanan elektrik akım altında, maddelerin değişik göç sürelerine sahip olmasına dayanmaktadır. Kapilerin bir polimer veya jel çözeltisi ile doldurulduğu CE türü ise kapiler jel elektroforez (CGE)'dir. CGE’de ayırım büyük molekül yapısına sahip maddelerin moleküler büyüklüklerine göre oluşmaktadır. Nötr moleküllerin ayırımı için geliştirilen CE türleri genellikle kapiler elektrokinetik kromatografi (CEKC) adını almaktadır. En yaygın elektrokinetik kromatografi çeşidi ise misel elektrokinetik kromatografi (MEKC)'dir. MEKC’de molekül ayırımı ise, elektrolit çözeltisine ilave edilen yüzey aktif maddenin meydana getirdiği misel adı verilen oluşumlar ile çözücü arasında yüksüz maddelerin farklı paylaşım esasına dayanır. İzoelektrik odaklanma kapiler elektroforez metodu daha çok proteinlerin analiz çalışmasında kullanılır. Geliştirilen bu metotda ayırım, proteinlerin farklı pH’larda izolelektrik nokta farklılıklarından yararlanarak gerçekleştirilir. Kapiler elektrokromatografi tam bir kromatografidir. Kapiler duvarın iç yüzeyi ortalama 1 μm çaplı sabit fazla doldurulur. Analizi yapılan moleküller uygulanan elektrik voltaj altında sabit fazda tutunmaları esasına göre ayrılırlar. Diğer bir CE yöntemi izotakoforez (ITP)'dir. ITP’de numune değişik iyon hareketliliğine sahip iki elektrolit çözeltisi arasında ortama verilir.

(41)

26 Kapiler Zone Elektroforez

Geniş bir uygulama alanına sahip olan kapiler zone elektroforezin kolay bir çalışma tekniği vardır. Bu yöntemde tampon çözelti, kapiler kolonun her bölgesinde aynı özellikte olup eşit bir şekilde dağılır. Uygulanan voltaj etkisi ile kapiler kolondaki parçacıklar farklı mobilitelerine göre zonlara ayrılır. Bu zonlar arasında tam bir ayırım gerçekleştirilebildiği gibi zonların örtüşme ihtimalleri de vardır. Tam bir ayırım gerçekleştirilmiş zonlar arasında tampon mevcuttur [47]. Kapiler kolon içerisinde oluşan bu zonlar kolon içerisinde ileriye doğru hareket ederek dedektöre ulaşırlar zonların analizi gerçekleşmiş olur. Şekil 2.7.'de bu durum gösterilmiştir.

Şekil 2.7. Kapiler Zone Elektroforez

Kapiler Elektroforez Cihazının Bölümleri

Bir kapiler elektroforez cihazı; kapiler, dedektör, yüksek voltaj güç kaynağı, numune viali, giriş ve çıkış vialleri ve bilgisayardan oluşur. Genel olarak CE cihazının bölümleri şekil 2.8.'de gösterilmiştir [40].

(42)

27

Şekil 2.8. CE cihazının bölümleri

Kapilerin başlangıç kısmı numune vialinin içerisine konulur, çalışılan örnek kapilerden içeri verilir, sonra kapiler girişi kaynak vialine yerleştirilir. Kaynak ve hedef vialleri arasında elektrik alanı uygulanır. Numunenin içinde çözünmüş olan maddeler kapilerden göç ettikleri için, bunlar dedektör aracılığı ile belirlenirler ve ayırımı gerçekleştirilen bu maddelerin elektroferogramları bilgisayara gönderilir. Elde edilen elektroferogramlar, dedektör yanıtının zamana karşı belirtildiği ve pikler şeklinde gösterildiği sonuçlardır. Elde edilen elektroferogram, zamana karşı dedektör yanıtlarının grafiğidir. Numune içinde yer alan farklı çözünmüş maddeler, kapilerden farklı oranlarda göç ettikleri için, dedektörden farklı sürelerde geçerler. Ayrılan bileşenler pik olarak farklı göç zamanları ile elektroferogramda belirirler. Göç zamanları piklerin maksimum yaptığı yerde ölçülür. Bu süre elektroferogramda dakika olarak gösterilir.

Yüksek Voltaj Güç Kaynağı:

Kapiler üzerinde elektrik alan güç kaynağının varlığında oluşturmaktır. Güç kaynaklarının çoğu ya sabit potansiyel, ya sabit akım ya da sabit güç modunda çalışır ve polariteyi tersine çevirme özelliğine sahiptir. Gerilimler 30 kV'a kadar, akımlar 300 A'e kadar ve güçte 6 W'a kadar çıkabilir. Gerçekleştirirlen çalışmanın güvenilirliği ve doğruluğu, uygulanan voltajın kararlılığıyla doğrudan ilişkilidir. Eş.1.2’den de görüldüğü üzere potansiyel değişimiyle elektrik alan da değişir. Elektrik alanın değişimi, göç zamanından, alan tekrarlanırlığına birçok önemli parametrenin değişmesine sebep olmaktadır

Referanslar

Benzer Belgeler

Gözler gibi kapanır, gözler gibi her yara, Adalarda mercanım, denizde incim gibi, Uyu yavru çocuğum, uyu sevincim gibi... mecmuasında “ Saadet Şiirleri „

Saadettin Kaynak’ı anıyor Boğaziçi Üniversitesi Türk Müziği Kulübü bu­ gün 20.30'da Üniversitesinin Büyük Toplantı Solo- nu'nda bir konser verecek.. TRT

Cumhuriyet’te bazı bölümleri yayınlanmış­ tı Erenburg anılarının., kitap daha genişletilmiş, ve yazarın Ara­ gón, André Gide, Brecht, Nâzım Hikmet,

Ünlü Güllüoğlu Ailesi'nde baklavacılık yapan tek kadın Neşe Güllü, "İşi bırak' diyen akrabalarına savaş açtı... Sözlerime 'Dünya Kadınlar günü kutlu

Bu çok bilinen şairimizin önemli bir politik özelliği var: Yahya Kemal, ilk Cumhuriyet yönetimlerine hep muhalefet etmiştir.. Gerçi bu muhalefeti,

Tablo 3’de görüldüğü üzere, Maastricht Kriterleri ile Euro ortak para alanına katılan ülkeler için getirilen borçlanma tavanı zorunluluğu kuralı her ne

[r]

Vegetation Indices produced from multi-temporal Sentinel-2 satellite images were used for monitoring vegetative stages, namely, Normalized Differential Vegetation