• Sonuç bulunamadı

Fındık yaprağından taksanların ekstraksiyon şartlarının belirlenmesi

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2021

Share "Fındık yaprağından taksanların ekstraksiyon şartlarının belirlenmesi"

Copied!
84
0
0

Yükleniyor.... (view fulltext now)

Tam metin

(1)

T.C.

DÜZCE ÜNİVERSİTESİ

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

FINDIK YAPRAĞINDAN TAKSANLARIN EKTRAKSİYON

ŞARTLARININ BELİRLENMESİ

MERVE CAN

YÜKSEK LİSANS TEZİ

KİMYA ANABİLİM DALI

DANIŞMAN

PROF. DR. HALİL İBRAHİM UĞRAŞ

(2)

T.C.

DÜZCE ÜNİVERSİTESİ

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

FINDIK YAPRAĞINDAN TAKSANLARIN EKTRAKSİYON

ŞARTLARININ BELİRLENMESİ

Merve CAN tarafından hazırlanan tez çalışması aşağıdaki jüri tarafından Düzce Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü KİMYA Anabilim Dalı’nda YÜKSEK LİSANS TEZİ olarak kabul edilmiştir.

Tez Danışmanı

Prof. Dr.Halil İbrahim UĞRAŞ Düzce Üniversitesi

Jüri Üyeleri

Prof. Dr. Halil İbrahim UĞRAŞ

Düzce Üniversitesi _____________________

Prof. Dr. Ümit ÇAKIR

Balıkesir Üniversitesi _____________________

Yrd. Doç. Dr.Ersin ORHAN

Düzce Üniversitesi _____________________

(3)

BEYAN

Bu tez çalışmasının kendi çalışmam olduğunu, tezin planlanmasından yazımına kadar bütün aşamalarda etik dışı davranışımın olmadığını, bu tezdeki bütün bilgileri akademik ve etik kurallar içinde elde ettiğimi, bu tez çalışmasıyla elde edilmeyen bütün bilgi ve yorumlara kaynak gösterdiğimi ve bu kaynakları da kaynaklar listesine aldığımı, yine bu tezin çalışılması ve yazımı sırasında patent ve telif haklarını ihlal edici bir davranışımın olmadığını beyan ederim.

3 ŞUBAT 2017

(4)

TEŞEKKÜR

Yüksek lisans öğrenimimde ve bu tezin hazırlanmasında gösterdiği her türlü destek ve yardımdan dolayı çok değerli hocam Prof. Dr. Halil İbrahim UĞRAŞ’e en içten dileklerimle teşekkür ederim.

Tez çalışmam boyunca değerli katkılarını esirgemeyen Fen Edebiyat Fakültesindeki kimya bölümündeki hocalarıma şükranlarımı sunarım.

Bu çalışma boyunca yardımlarını ve desteklerini esirgemeyen sevgili aileme ve çalışma arkadaşlarıma sonsuz teşekkürlerimi sunarım.

Bu tez çalışması, Düzce Üniversitesi BAP-2015.05.03.310 numaralı Bilimsel Araştırma Projesiyle desteklenmiştir.

(5)

İÇİNDEKİLER

ŞEKİL LİSTESİ ... VIII

ÇİZELGE LİSTESİ ... IX

KISALTMALAR ... X

SİMGELER ... XI

ABSTRACT ... XIII

1.

GİRİŞ ... 1

1.1 KURAMSAL BİLGİLER VE KAYNAK ARAŞTIRMASI ... 1

1.1.1 Kanser ... 1

1.1.1.1 Doğal Ürünlerde Kemoterapi Etken Maddeler ... 2

1.1.2 Terpenler ... 5

1.1.2.1 Taksanlar ... 5

1.1.2.2 Paklitaksel’in Buluşu ... 8

1.1.3 Fındığın Dünyada Ve Türkiyedeki Dağılışı ... 11

1.1.4 Fındık Yaprağındaki Taksanlar ... 14

1.1.5 İzolasyon Ve Saflaştırma Yöntemleri ... 16

1.1.5.1 Ekstraksiyon ... 16

1.1.5.2 Farklı Ekstraksiyon Metotlarının Kullanılması ... 18

1.1.5.2.1 Organik Çözücü Ekstraksiyonu ... 18

1.1.5.2.2 Soxhlet Metodu ... 18

1.1.5.2.3 Süperkritik Akışkan Ekstraksiyonu ... 18

1.1.5.2.4 Basınçlı Sıvı Ekstraksiyonu (Hızlandırılmış Çözücü Ekstraksiyon)20 1.1.5.2.5 Mikrodalga Ekstraksiyonu ... 21

1.1.6 Taksanlarin Analizinde Kullanilan Kromatografik Yöntemler ... 24

1.1.6.1 HPLC (Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi) ... 24

1.1.7 Taksanların Elde Edilmesiyle İlgili Önceki Çalışmalar ... 25

2.

MATERYAL VE YÖNTEM ... 29

2.1 EKSTRAKSİYON ÇALIŞMASI İÇİN NUMUNE HAZIRLAMA ... 29

2.2 EKSTRAKSİYON İŞLEMLERİ ... 30

2.3 HPLC ANALİZİ ... 31

(6)

2.3.2 Saf Eluant Piki. ... 31

2.3.3 Kütle Tayini ... 31

3.

BULGULAR ... 32

3.1 HPLC YÖNTEM ÇALIŞMASI SONUÇLARI ... 32

3.1.1 İç Standart Metodu ... 32

3.1.2 Saf Eluant Piki ... 33

3.1.2.1 Kütle tayini ... 34

3.2 EKSTRAKSİYON ÇALIŞMASI SONUÇLARI ... 34

3.2.1 Sekiz (8) Saatlik Çalışma Sonuçları ... 35

3.2.1.1 Sekiz (8) Saatlik Çalışma Sonuçları ... 35

3.2.1.2 Sekiz (8) Saatlik Sefalomannin Sonuçları ... 37

3.2.1.3 Sekiz (8) Saatlik Bakkatin III Sonuçları ... 39

3.2.1.4 Sekiz (8) Saatlik 10-Deasetil Bakkatin III Sonuçları ... 41

3.2.2 Onaltı (16) Saatlik Çalışma Sonuçları ... 43

3.2.2.1 Onaltı (16) Saatlik Paklitaksel Sonuçları ... 43

3.2.2.2 Onaltı (16) Saatlik Sefalomannin Sonuçları ... 45

3.2.2.3 Onaltı (16) Saatlik Bakkatin III Sonuçları ... 47

3.2.2.4 Onaltı (16) Saatlik 10-Deasetil Bakkatin III Sonuçları ... 49

3.2.3 Yirmi Dört (24) Saatlik Çalışma Sonuçları ... 51

3.2.3.1 Yirmi Dört (24) Saatlik Paklitaksel Sonuçları ... 51

3.2.3.2 Yirmi Dört (24) Saatlik Sefalomannin Sonuçları ... 51

3.2.3.3 Yirmi Dört (24) Saatlik Bakkatin III Sonuçları ... 51

3.2.3.4 Yirmi Dört (24) Saatlik 10-Deasetil Bakkatin III Sonuçları ... 52

3.2.4 Kırk Sekiz (48) Saatlik Çalışma Sonuçları ... 52

3.2.4.1 Kırk Sekiz (48) Saatlik Paklitaksel Sonuçları ... 52

3.2.4.2 Kırk Sekiz (48) Saatlik Sefalomannin Sonuçları ... 52

3.2.4.3 Kırk Sekiz (48) Saatlik Bakkatin III Sonuçları ... 53

3.2.4.4 Kırk Sekiz (48) Saatlik 10-Deasetil Bakkatin III Sonuçları ... 53

3.2.5 Yetmiş İki (72) Saatlik Çalışma Sonuçları ... 53

3.2.5.1 Yetmiş İki (72) Saatlik Paklitaksel Sonuçları ... 53

3.2.5.2 Yetmiş İki (72) Saatlik Sefalomannin Sonuçları ... 54

3.2.5.3 Yetmiş İki (72) Saatlik Bakkatin III Sonuçları ... 54

(7)

4.

SONUÇ VE TARTIŞMA ... 55

5.

KAYNAKLAR ... 61

ÖZGEÇMİŞ ... 71

(8)

ŞEKİL LİSTESİ

Sayfa No Şekil 1.1 Prodofiliotoksin ... 3 Şekil 1.2 Teniposide ... 3 Şekil 1.3 Kampotoksin ... 4 Şekil 1.4 Topotekan ... 4 Şekil 1.5 Vinkristin ... 4 Şekil 1.6 Paklitaksel ... 4 Şekil 1.7 Taksin A ... …………...……….……….6 Şekil 1.8 Taksin B ... 6

Şekil 1.9 Taksisin (5-sinnamoltriasetiltaksisin) ... 7

Şekil 1.10 Bakkatin I ... 7

Şekil 1.11.Bakkatin IV ... 7

Şekil 1.12 Sefalomanin (Taxol B) ... 8

Şekil 1.13 (+)-discodermolide ... 9

Şekil 1.14 Epothilone A ... 9

Şekil 1.15 Epothilone B ... 9

Şekil 1.16 Pakliteksel’in düzlemsel gösterimi ... 10

Şekil 1.17 Paklitaksel’in 3 boyutlu yapısı ... 11

Şekil 1.18 Fındık Yan Ürünlerden Elde Edilen Yaprak Ekstraklarda Taksanların molekül yapıları………...16

Şekil 3.1 Dört standartın (paklitaksel, sefalomannin, bakkatin III ve 10-deasetil bakkatin III) HPLC kromatoğramı ... 32

Şekil 3.2 Numune ile birlikte dört standartın (paklitaksel, sefalomannin, bakkatin III ve 10-deasetil bakkatin III) HPLC kromatoğramı ... 32

Şekil 3.3 Numune + dört standart ve numueneye iç standart eklenmiş (paklitaksel, sefalomannin, bakkatin III ve 10-deasetil bakkatin III) HPLC kromatoğramında sadece paklitaksel kısmının gösterimi [Siyah: std, Kırmızı: numune, Mavi: numuneye iç std eklenmiş hali] ... 33

Şekil 3.4 Saf elantımız ve paklitaksel standartının HPLC kromatoğramı (Siyah: saf paklitaksel, kırmızı: saf eluant) ... 33

(9)

ÇİZELGE LİSTESİ

Sayfa No

Çizelge 1.1 Türkiye’de yetişen fındık çeşitleri ... 12

Çizelge 1.2 Fındık Yetiştirilen İl ve ilçeler . ... 12

Çizelge 1.3 Fındık üretiminde 2012 yılına ait illerin sıralanması ... 13

Çizelge 1.4 Başlıca üretici ülkelerin yıllara göre kabuklu fındık üretim miktarı . ... 13

Çizelge 1.5 Fındık Yan Ürünlerden Elde Edilen Yaprak Ekstraklarda Taksanlar ... .15

Çizelge 1.6 Süperkritik akışkanların fiziksel özelikleri ... 20

Çizelge 1.7 Gelişmiş ekstraksiyon tekniklerinin karşılaştırılması ... 223

Çizelge 2.1 Numunelerin bölgeleri ... 29

Çizelge 2.2 Çalışılan çözücü sistemleri ... 30

Çizelge 3.1 Sekiz (8) saatlik Paklitaksel sonuçları ... 35

Çizelge 3.2 Sekiz (8) saatlik Sefalomannin sonuçları ... 37

Çizelge 3.3. Sekiz (8) saatlik Bakkatin III sonuçları ... 39

Çizelge 3.4 Sekiz (8) saatlik 10-Deasetil Bakkatin III sonuçları ... 41

Çizelge 3.5 Onaltı (16) saatlik Paklitaksel sonuçları ... 43

Çizelge 3.6 Onaltı (16) saatlik Sefalomannin sonuçları ... 45

Çizelge 3.7 Onaltı (16) saatlik Bakkatin III sonuçları ... 47

Çizelge 3.8 Onaltı (16) saatlik 10-Deasetil Bakkatin III sonuçları ... 49

Çizelge 3.9 Yirmi dört (24) saatlik Paklitaksel sonuçları ... 51

Çizelge 3.10 Yirmi dört (24) saatlik Sefalomannin sonuçları ... 51

Çizelge 3.11 Yirmi dört (24) saatlik Bakkatin III sonuçları ... 51

Çizelge 3.12 Yirmi dört (24) saatlik 10-Deasetil Bakkatin III sonuçları ... 52

Çizelge 3.13 Kırk sekiz (48) saatlik Paklitaksel sonuçları ... 52

Çizelge 3.14 Kırk sekiz (48) saatlik Sefalomannin sonuçları ... 52

Çizelge 3.15 Kırk sekiz (48) saatlik Bakkatin III sonuçları ... 53

Çizelge 3.16 Kırk sekiz (48) saatlik 10-Deasetil Bakkatin III sonuçları ... 53

Çizelge 3.17 Yetmiş iki (72) saatlik Paklitaksel sonuçları ... 53

Çizelge 3.18 Yetmiş iki (72) saatlik Sefalomannin sonuçları ... 54

Çizelge 3.19 Yetmiş iki (72) saatlik Bakkatin III sonuçları ... 54

(10)

KISALTMALAR

ABD Amerika

A Aseton

ACN Asetonitril

BSE Basınçlı Sıvı Ekstraksiyonu B III Baccatin III

Ceph Sephalomannine

C18-SPE Ters Faz-Katı Faz Ekstraksiyonu

DNA Deoksiribo Nükleik Asit

DCM Diklorometan

E Etanol

FDA Amerikan İlaç ve Gıda Kurumu (Food and Drug Administration) HPLC Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (High Pressure Liquid

Chromatography)

IR Infrared

KİT Kemik İliği Transplasyonu

LC-MS Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi (Liquid Chromatography)

M Metanol

MDE Mikrodalga Ekstraksiyon

MRM Multiple Reaction Monitoring

MS Kütle spekturumlerı

NCI Ulusal Kanser Enstitüsü (National Cancer Institute)

ND Bulunmadı

NMR Nükleer Magnetik Rezonons

ORT STD SP Ortalama Standart Sapma ODS 3 Oktadesil

RNA Ribo Nükleik Asit

RP Ters Faz (Reverse Phase)

PAH Poliaromatik Hidrokarbonlar

PCH Brifeniller

USE Ultrasonik Ekstraksiyon

USDA Devletler Tarım Bölümü

UV Ultraviyole

10d T 7 epi 10 deacetyltaxol 10-DAB III 10-Deasetil Bakkatin III

(11)

SİMGELER

Atm Atmosfer Basınç

GHz Gigahertz G Gram K Kelvin Kg Kilogram KHz Kilohertz Kv Kilovolt M Metre

Mesh Meç (ölçü birimi)

µg Mikrogram

Mg Miligram

mL Mililitre

MPa Megapaskal

Nm Nanometre

Rpm Devir/Dakika (revulation per minute)

Pc Kritik basınç

(12)

ÖZET

FINDIK YAPRAĞINDAN TAKSANLARIN EKSTRAKSİYON ŞARTLARININ BELİRLENMESİ

Merve Can Düzce Üniversitesi

Fen Bilimleri Enstitüsü, Kimya Anabilim Dalı Yüksek Lisans Tezi

Danışman: Prof. Dr. Halil İbrahim UĞRAŞ Şubat 2017, 84 sayfa

Kanser, bir takım etkilerle farklılaşmış hücrelerin, lokal ve lokal olmayan noktalarda kontrolsüz olarak çoğalıp gelişmesinin sonucu oluşan kötücül hastalıklar grubudur. Doğal bileşikler bu yüzden git gide artan bir önem kazandığı bilinmektedir. Kanser hastalığının tedavisinde kullanılan en etkili kanser ilaçlarından birisi paklitakseldir. Paklitaksel ve türevleri taksanlar sınıfına ait bileşiklerdir. Taksanlar taksus familyasından olan karmaşık yapılı, diterpen sınıfına giren alkaloidlerdir. Bitkiler, geleneksel, destekleyici ve alternatif tıp kapsamında doğrudan ilaç yapımında hammadde kaynağı olarak kullanılmaktadır. Yapılan çalışmalarda porsuk ağacından sonra doğal ürün olarak fındık yaprağında paklitaksel bulunmaktadır. Paklitaksel, sentezlenmesinin yanında fındık türünün yapraklarından izole edilebilinir. Fındık yaprağının yapısında bulunan taksanlar paklitaksel, 10-deasetilbakkatin, sefalomanin, bacattin III çeşitli çözücülerle saflaştırılması amaçlanmıştır. Bu çalışmada farklı zamanlarda gerçekleştirilen ekstraksiyonların verimleri karşılaştırıldı. Projenin ilk adımında Türkiye’den farklı yerlerinden alınan farklı türdeki fındık yaprakları toplandı. Fındık yaprağından paklitaksel elde etmek için uygun ekstraksiyon yöntemleri uygulandı. Yapılan saflaştırma işlemlerinden sonra taksan miktarlarını belirlemek için analizler yapıldı. Burada miktar tayininde HPLC sistemi kullanıldı.

(13)

ABSTRACT

IDENTIFICATIN OF EXTRACTION CONDITION OF TAXANS FROM HAZELNUT PLANT LEAVES

Merve Can Duzce University

Graduate School of Natural and Applied Sciences, Department of Chemistry Master of Science Thesis

Supervisor: Prof. Dr. Halil İbrahim UĞRAŞ February 2017, 84 pages

Cancer is a group of malicious diseases which develop unrestrained via a number of altered cells at local or non-local sections. Because of that natural compounds gain interest increasingly. One of the most effective medicines that used to treat canser is paclitaxel. Paclitaxel and derivatives are taxan class compounds. Taxans are alkoloids with complex stracture which belongs to taxus familia in diterpene class. Plants are used to make raw materials for medicine in traditional, supportive or alternative medicine. Paclitaxel and its side chains are naturally found in hazelnut plant leaves as well as in yew tree, in the studies. Taxol, synthesis aside, can be isolated from different type of hazelnut plant leaves. Our purpose is purification of paclitaxel, 10-deacetilbaccatin, sefalomanin and baccatin III from hazelnut plant leaves. In this study, extractions with different timing are compared. As the first step different types of hazelnut plant leaves collected from different locations of Turkey. Suitable extraction methods are applied to obtain paclitaxel from hazelnut plant leaves. After purification process, some analyses are going to be made to detememine paclitaxel quantity. HPLC method is going to be used in quantification process.

(14)

1. GİRİŞ

Ülkemizde yabani olarak yetişen bitki türleri sayısı oldukça fazladır. Ülkemiz hem floramız hem de endemik bitkilerimiz açısından zengin çeşitliliğe sahiptir. Türkiye 12 bin civarında bitki taksonu olduğu bilinmektedir. Türkiye florasını oluşturan taksonlardan yaklaşık %31’i endemiktir [1]. Ülkemiz bitkisel zenginliği sebepleri, Türkiye’nin coğrafi konumu nedeniyle, Güney Avrupa ile Güney batı Asya floraları arasında bir bölgede olması pek çok bitki türünün farklılaşmasının merkezi olduğu düşünülmektedir. Günümüzde bitkiler çeşitli hastalıkların tedavisinde kullanılan ilaçların önemi bir bölümünün kaynağını oluşturmaktadır. Halk arasında değişik amaçlarla kullanılan bitkilerden tıbbı olanlarının tespiti ve bunların bugünkü bilgilerin ışığında insan sağlığı açısından değerlendirilmesi araştırmaların temelini oluşturur. Kanser, yapısal düzenlerinde meydana gelen özel değişiklikler sonucu hücrelerin organizmaların denetim mekanizmalarına doğal olmadan çoğalarak, hastanın varlığını tehdit eder hale gelmesi olarak tanımlanabilir. Bu ölümcül illete karşı dünyada en çok kullanılan beş etken maddeden biri de paklitakseldir. Paklitaksel total sentezinin çok zor olması hesabıyla porsuk ağacının kabuklarından ve yarı sentetik metodla hücre kültür yoluyla elde edilmektedir. Paklitaksel porsuk ağacında fındık yaprağında da bulunmaktadır. Fındık yaprağında bulunan etken maddenin varlığının ve miktarının tespiti amacıyla bu çalışma planlanmıştır. Analizler doğal olarak yetişen fındık yaprakları örnekleri üzerinden bitki örnekleri HPLC ile karşılaştırılmalı analiz edilmiştir.

1.1 KURAMSAL BİLGİLER VE KAYNAK ARAŞTIRMASI

1.1.1 Kanser

Kanser, bazı etkilerle değişime uğramış hücrelerin, gerek yerel ve gerek uzak noktalarda kontrolsüz olarak çoğalıp büyümelerinin sonucu oluşan hastalıklar grubudur. Bir hücrenin doğal hayat sürecinde proto-onkogenler normal hücresel faaliyetleri idare eden genlerdir. Bu genler herhangi bir etkenle mutasyona uğradıklarında “işlev kazanımı” geçirerek onkogene dönüşmekte ve hücrelerin kontrolsüz çoğalmasına neden olarak

(15)

ilerler ve hücrelerin kanserleşmesine neden olmaktadır. Normalde hücreler belli bir kontrol altında, ihtiyaca göre bölünerek çoğalırlar. Hücreler bir taraftan programlı ölüm ya da "apoptoz" denen olay ile yokolurken, diğer taraftan da büyüme faktörlerinin etkisiyle çoğalır. Büyüme faktörleri normalde DNA'daki çeşitli genlerin etkisiyle oluşan proteinlerdir. Bu genler mutasyona (değişime) uğrayarak hücrelerin aşırı büyümesine sebep olurlarsa, o zaman kanser oluşur. Yurdumuzda en sık görülen kanserler erkeklerde akciğer, prostat, kalın barsak, rektum, mide ve pankreas; kadınlarda meme, akciğer, kalın barsak, mide ve pankreas kanserleri olarak sıralanabilir. Kanser, hastalığı olarak çok fazla çeşidi bulunan başlangıç büyüme oranına tanıya ve tedavi edilme durumuna göre farklılık gösteren bir sağlık sorunudur [2]. Kanserin tedavi yöntemleri kemoterapi, kemik iliği transplantasyonu (KİT), kök hücre nakli, cerrahi tedavi ve radyoterapi olup, kanser tanısı konan hastaların bireysel özellik ve hastalık durumuna göre bu yöntemlerden bir veya birkaçı tedavide kullanılmaktadır. Bu tedavi yöntemleri ile hastaların yaşam süresinin uzaması ve tedaviye bağlı olarak ortaya çıkan semptomların kontrol edilmesi ve daha nitelikli yaşaması amaçlanmaktadır [3, 4]. Bütün hastalar için kür ve kaliteli yaşam tedavinin ana amaçlarıdır. Bu amaçlar birden fazla faktöre bağlıdır. Bunlar içerisinde; hastalığın tipi, evresi, yaygınlığı, tedavi seçenekleri, gelişen teknoloji, bilimsel veriler, onkolojide ekip yaklaşımı, bilinen yanıtlar ve hastanın bilgilendirilmesi yer almaktadır [5]. Kemoterapi, antikanser ilaçlarının kullanılarak tümörlerin büyümesinin önlenmesi ya da kontrol altına alınmasıdır. Kemoterapi, özellikle çoğalan hücrelere karşı seçici öldürücü etkileri olan, doğal veya sentetik kimyasal, biyolojik ajanlar ve hormonlarla yapılan tedavi şeklidir [6]. Son yıllarda en önemli kemoterapötiklerden biri paklitakseldir.

1.1.1.1 Doğal Ürünlerde Kemoterapi Etken Maddeler

Doğal ürünler hastalıkların tedavisinde kullanılmaktadır. Bu doğal ürünlerin yapısında etken madde bulunması, başta kanser olmak üzere birçok tedavide baskın bir rol oynamıştır [7]. En etkili antikanser ajanların bulunduğu oldukça yararlı doğal bileşikler olduğu ve bunların çok önem önem kazandığı belirtilmektedir. Yaklaşık yüze yakın antikanser ilaç olduğu ve bunların % 62’si doğal bileşiklerden üretilmişlerdir [8]. Doğal bir üründen elde edilen podofilotoksin (Şekil 1.1) bileşiği yetişkinlerde Hodgkin hastalığı ve diğer kötü huylu lenfoma, pediatrik refrakter nöroblastom ve beyin tümörlerine karşı aktivite gösteren Teniposid (Vumon® ) (Şekil 1.2) ilacının yarı sentez mekanizmasında yer alır [9]. İlk olarak Camptotheca acuminata alkaloit ağacından izole

(16)

edilen kamptotesinin (Şekil 1.3) laboratuvar deneylerinde çeşitli kanserlere karşı iyi bir aktiviteye sahip ama klinik kullanım için uygun değildir. Bundan dolayı kamptotesinin suda çözünür hali olan topotekan (Şekil 1.4) geliştirilmiş ve klinikte kullanılabilinmiştir [10,11]. Bu doğal ürünlerinden olan Cezayir menekşesi (Catharanthus roseus) türünden vinkristin (Şekil 1.5) izole edilir ve ticari adı (Oncovin®)’dır. Bir antimitotik madde olan vinkristin, lösemi, mesane kanseri, testis kanseri ve Hodgkin hastalığı gibi limfomlar dahil olmak üzere, çeşitli kanser tedavisi için kullanılmaktadır [12, 13]. 1971 yılında paklitaksel ilk defa pasifik porsuk ağacının (Taxusbrevifolia) kabuklarından saf olarak edilmiştir. 2000 yılında Stopher ve ark. ABD’de yaptığı bir çalışmada fındık kabuğunda anti kanser ilaçlarından biri olan paklitaksel (taxol) (Şekil 1.6) maddesini keşfetmiştirler. Bu çalışmada ise fındık kabuğunda gözlenen paklitakselin varlığı fındık yaprağında araştırılmıştır. O O O OH O OCH3 H3CO H3CO Şekil 1.1 Prodofiliotoksin. O O O HO OH O O O O O OH OCH3 OCH3 S H Şekil 1.2 Teniposide.

(17)

Şekil 1.3 Kampotoksin. Şekil 1.4 Topotekan. N N OH CH3 CO2CH3 N N CO2CH3 H3CO2C OH H CHO Şekil 1.5 Vinkristin. O OH OH H OAcH OCOC6H5 O OAc O OH NH O O Şekil 1.6 Paklitaksel.

(18)

1.1.2 Terpenler

Bitki bileşenlerinden su buharı destilasyonuyla ayrılırlar. Organik kimyada uçucu yağlar ve özellikle terpentin kimyacıların ilgisini çekmiştir. Organik kimyada yapılan araştırmalarda terpentinde karbon-hidrojen oranı 5:8’dir. Bu sınıftaki bileşikler terpenler olarak adlandırılmıştır. Daha sonra terpenlerin izopren iskelet birimlerinin baş-kuyruk kısımlarının bağlanmasıyla oluştuğunu öğrenmişlerdir. Terpenlere, izoprenle olan durumlarını belirlemek amacıyla izoprenoidler denilmektedir. C ve H ‘den başka elementlerin içeren bileşiklere terpoidler denir. Terpenler 5 gruba ayrılır.

1.Monoterpenler: İkiizopren birimi(10 karbon) 2.Seskiterpenler: Üçizopren birimi(15 karbon) 3.Diterpenler: Dörtizopren birimi (20 karbon) 4.Triterpenler: Altıizopren birimi(30 karbon) 5.Tetra terpenler: Sekiz izopren birimi(40 karbon)

1.1.2.1 Taksanlar

1856 yılında Lucas tarafından Avrupa ‘da yetişen Taxus baccata çalı bitkisinde bulunan ve bitkinin toksik özelliğinden sorumlu bileşik olarak ’Taksin’ adı verilen psödoalkolit bileşik bulunmuştur [14]. Taksanlar Taxus cinsi bitkilerde bulunan doğal diterpenlerdir. Zehirli bitkiler arasında yer alan Taxus türleri üzerinde yapılan kimyasal çalışmalar daha çok Taxus türlerinde bulunan zehirli bileşikleri ortaya çıkarmak için çalışılmıştır. Taxus türevlerinin 350 civarında bileşikler olduğu bilinmektedir. Büyük çoğunluğu taksan çekirdeğine bulunur. Paklitaksel kimyasal olarak taksanların diterpenler sınıfında bulunur [15]. Diterpenler geranilgeranil pirofosfattan türetilmiş bir C-20 karbon iskeletine sahip doğal ürünlerdir. Paklitaksel taksanların diterpenler ailesinin en ünlü ve en çok öneme sahip üyesidir. Bu ailede Paklitaksel’in 200 yakın türevi vardır. Bu türevlerin iskelet yapısında hemen hemen hepsi temel [9.3.1.0] onbeşgen halka sistemine sahiptir [16]. 1921 yılında Wıntersteın tarafından % 0.7-1.4 oranında olduğu tespit edilen birleşiğin formülü C37H51NO10 olarak belirlenmiştir. Kan basıncını düşüren

bu maddenin kalp zehri olacağı ön görülmüştür [17]. Hücre bölünmesi sırasında hücrenin bükülmesini sağlayan mikrotubul proteinler üzerine etki eden paklitaksel önemli bir antitümor bileşiktir [18]. Taksanların bir kısmı antitümöral etki göstermekte veya antitümöral etki gösteren başka bileşiklerin sentezlenmesinde başlangıç maddesi olarak kullanılmaktadır. Genel olarak bu bileşikler yumurtalık, meme, prostat, kolon,

(19)

mide, böbrek kanseri ve lösemi tedavisinde kullanılmaktadır. Taksan türevi diterpenlerin sentezi üzerinde birçok çalışma yapılmıştır. Bileşiğin sentezinin güç olmasının nedeni üçlü halkanın meydana getirilmesinden kaynaklanmaktadır [19]. Lucas tarafından yapılan taksanların karekterizasyon çalışmaları yapının çok karmaşık olması ve modern spektroskopik tekniklerin olmamasından dolayı çok uzun bir süreçte gerçekleştirilmiş ve yapı analizinden sonra bunlara taksin (Taxine) adını vermiştir. İlk zamanlarda belirlenen taksinlerin fiziksel özelliklerinde bir takım tutarsızlıklar olmasına rağmen daha sonra Graf en az 7 bileşenli karışımlarının, saf yapılarını izolasyonu yapmış ve onları Taksin A, B olarak adlandırmıştır. Taksin A ve B’ nin yapıları Şekil 1.7 ve Şekil 1.8’de gösterilmiştir [20].

Şekil 1.7 Taksin A. OH H OH OAc HO O NMe2 O O Şekil 1.8 Taksin B.

Şekil 1.7’de ve şekil 1.8’de gösterilen taksin A, taksin B, molekülü 1963 yılında, birbirinden bağımsız olarak Lytgoe, Nakanishi ve Uyeo’nun grupları tarafından taksan molekülün çekirdek yapısı trisiklik polialkollerin asitlerle esterleştirilmesi sonucu elde elde edilmiş ve 3 yıl sonra yapının stereokimyası aydınlatılmıştır [8], [21], [22].

(20)

Şekil 1.9 Taksisin (5-sinnamoltriasetiltaksisin).

1960 yıllarının sonunda yapılan sistematik çalışmalarda Şekil 1.9’da olduğu gibi çeşitli taksan familyaları ve alkaloid yapı bulunmayan pek çok sayıda taksan türü bulunmuştur. Örneğin Halsall ve ark. Bugün hala kullanılan ve Şekil 1.10 ve Şekil 1.11’ da belirtilen Bakkatin III’ü ve izomerlerini izole edip taksanın temel yapısı için sınıflandırma yapmışlardır [8], [23]. Şekil 1.10 Bakkatin I. OH OAc O O AcO H OH HO OBc

Şekil 1.11 Bakkatin IV.

Sefalomanin (Taxol B), paklitaksele göre daha düşük etkide antikanser etkiye sahip olmasına rağmen, taksan ilaçlarının yarı-sentetik olarak sentezlenmesinde başlangıç maddesi olarak kullanılabilmektedir. Sefalomanin ve paklitakselin molekül yapıları birbirine benzerlik gösterir. Bu yapılardaki fark paklitaksel yan zincirindeki N-benzoil grubu ile sefalomaninden ayrılmasıdır. Sefalomaninin molekül yapısı Şekil 1.12’de gösterilmiştir.

(21)

AcO O O OH H AcO O HO O OH Ph O Ph O NH O

Şekil 1.12 Sefalomanin (Taxol B).

Bugüne kadar 100’den fazla taksan izole edilmiş ve yapısı aydınlatılıp yayımlanmıştır. Taksanlar pek çok yapısal alt sınıflara ayrılabilmektedirler. Paklitaksel’in karekterizasyonu ve izolasyonu ile ilgili pek çok çalışma gerçekleştirilmiş. Taksan ve türevlerini sentezi zor olmasından dolayı alternatif olarak doğal ürünlerde bulunduğu keşfedilmiştir. Ancak kimyasal yollardan sentezi bu bileşiğin çok zor ve uzun reaksiyon basamakları olması nedeni ile ilgi görmemiştir.

1.1.2.2 Paklitaksel’in Buluşu

1967 yılında Kuzey Carolina'da Research Triangle Enstitüsü, Amerika Birleşik Devletleri’nde 1960 yılında, kanser kemoterapi ajanlarının izlenmesi ve keşfedilmesi amacıyla Amerikan Ulusal Kanser Enstitüsü (NCI) kuruldu. Binlerce bitki Birleşik Devletler Tarım Bölümü (USDA) tarafından toplandı, ekstrakte edildi ve kanser aktivitelerinin değerlendirilmesi için Amerikan Ulusal Kanser Enstitüsüne sunuldu. 1962 yılında Washington eyaletinde botanikçi Arthur S. Barclay ve ekibi Kalifornia, Washington ve Oregon’da içinde Taxus brevifolia’nın yaprak, dal ve kabuklarını da olduğu 650 bitki örnekleri topladılar [8]. Paklitaksel ilk kez Taxus brevifolia porsuk ağaçında keşfedildi. Kimyasal yapısı ilk olarak Mayıs 1971'de yayımlandı [24]. Paklitaksel sabit mikrotübüller içine tubulin montajını desteklediğinden bir antimitotik ilaçın temeli olduğu açıklandı. Vinka alkaloidleri ve epipodofilotoksinler dahil olmak üzere diğer anti-kanser ajanları, antimitotik maddeler ve tübülin bağlayıcı olarak kullanıldığı bilinmesine rağmen, bu maddeler mikrotübüllere tubulin polimerizasyonunu desteklememiştir. Paklitaksel discodermolide (Şekil 1.13) ve epothilones A (Şekil 1.14)

(22)

ve B (Şekil 1.15) gibi doğal olarak meydana gelen bir ilaçtır [25].

Şekil 1.13 (+)-discodermolide.

Şekil 1.14 Epothilone A.

Şekil 1.15 Epothilone B.

Pasifik porsuk ağacı kabuğunda paklitaksel yanında paklitaksel türevi bazı bileşiklerde bulunmakta ve saflaştırma esnasında o bileşiklerde izole edilmektedir. Bu bileşikler, 10-deasetil bakkatin III, bakkatin III, docetaxel ve sefalomannin gibi bazı taksan türevi bileşiklerdir. Taxus(porsuk agacı)familyasına ait olan birçok bitki kompleks yapısında diterpenoid, paklitaksel ve anti-kanser bileşikleri içermektedir. Paklitaksel bileşiği dışındaki diğer bileşikler ise bu bileşiklerden paklitaksel sentezinin gerçekleştirilebilmesi (semi sentez) sebebiyle önemli olmaktadır. Paklitaksel’in gelişim süreci pek çok kimya uygulamasını da beraberinde getirmiştir. En önemli ve dikkat çekici çalışmalardan birisi paklitakselin yan zincirinden sentezlenebilmesidir, paklitakselin bakkatin III ve 10-deasetilbakkatin III’den yarı sentezine imkan

(23)

vermektedir. 10-deasetilbakkatin III, paklitaksel sentezi için Avrupa porsuğu olarak bilinen Taxus baccata L.’nin yenilenebilir yapraklarında fazlaca bulunmaktadır [26], [27].

Şekil 1.16 Pakliteksel’in düzlemsel gösterimi.

1994 yılında Holton ve Nicolaou’nun paklitaksel’in sentezini gerçekleştirmiştir. Fakat iki sentez yöntemide oldukça uzun olup ticari olarak elverişsiz olmaktadır [28], [29]. Taxus diterpenoitlerinin yapılarının aydınlatılmasında Ultraviyole (UV), Infrared (IR), Nükleer Magnetik Rezonons (NMR) ve Kütle spekturumlerı’nden (MS) faydanılır ve şekil 1.16 da paklitakselin düzlemsel yapısı gösterilmiştir. [30]-[40]. Taksanların yapı analizlerinde X-Ray kristalografisinden de yararlanılmıştır [17], [41]-[43]. Aurıola ve arkadaşları ise Taxus türlerinde bulunan paklitakselin tayin etmek için bir ‘High Performans liquid chromatography-Thermo spray Mass Spectrometry’(HPLC –TSP-MS) metodu geliştirmişlerdir [44]. Ayrıca taksanların yapılarının bulunmasında spesifik çevirme açılar da önemli olmaktadır [35]-[40], [45]. Paklitaksel kanser tedavisinde özellikle rahim, meme kanserlerinde kullanılan diğer kanser ilaç etken maddelerinden daha önemli bir ilaç etken maddesidir. Paklitaksel, göğüs, rahim, akciğer ve yumurtalık kanserlerinin yanı sıra son on yılda baş ve boyun bölgesindeki kanserler ve akciğer kanseri için etkili olduğu ispatlanmıştır.

(24)

Şekil 1.17 Paklitaksel’in 3 boyutlu yapısı. Paklitaksel bileşiğinin kronolojik tarihi aşağıda verilmiştir.

1962- 1967- Toplanan pasifik porsuk ağacı kabuğunda anti tümör etki tespit edildi. 1967- Aktif bileşik olarak paklitaksel izole edildi.

1971- Paklitaksel’in yapısı tespit edildi.

1978- Paklitaksel’in etki mekanizması belirlendi.

1983- Paklitaksel’in faz I klinik çalışması gerçekleştirildi. 1985- Paklitaksel’in faz II klinik çalışması gerçekleştirildi.

1989- Amerikan kanser enstitüsü paklitaksel’in ilaç olarak satışına onay verdi. 2000- Fındık kabuğunda paklitaksel ve türevi maddeler tesbit edildi.

1.1.3 Fındığın Dünyada Ve Türkiyedeki Dağılışı

Yeryüzünde, 36-41 kuzey enlemlerinde ve kendine özgü iklim koşullarında kendine yer bulan fındık Türkiye, İtalya, İspanya ve Amerika’da başta olmak üzere, Gürcistan, Azerbaycan, Yunanistan gibi ülkelerde yetiştirilmektedir. Türkiye, yıllık dünya fındık üretiminin yaklaşık %70-80 kadarını karşılar. Ülkemizin en önemli tarımsal ürün ihracatı olan fındık, Türkiye'de özellikle Karadeniz Bölgesinde tek tarım tipi (mono kültür) olarak yapılır. Türkiye, Dünya fındık üretiminde ilk sırada yer alır. Türkiye

(25)

dünyanın en büyük fındık üreticisi olup, bunu sırasıyla İtalya, ABD ve İspanya izlemektedir. Karadeniz Bölgesinde yaklaşık olarak 550,000-600,000 hektar alanda fındık üretimi yapılmaktadır. Bu üretimde Karadeniz Bölgesi %72.5’ ini oluşturmaktadır. Yaklaşık 534,000 ton yıllık ortalama üretim ve 136,000 milyon ton ihracatı ile ülkemiz 2,5 milyar Amerikan doları civarında gelire sahiptir. Fındığın kalitesini oluşturan parametreler: fındığın üretiminden tüketimine kadar olan sürede hasat, kurutma, depolama ve nakliye gibi birçok işlemden ve çeşitli faktörlerden etkilenmektedir. Fındık, kış aylarında çiçeklenen ve tozlanan tek bitkidir. Fındığın çeşitli türleri vardır. 5-6 metre boylanabilen ülkemizdeki kültür fındıkları ’corylus

avellana’ ile ‘corylus Maxima’ türlerinin melezleridir. Türk fındığı, kaliteli olarak

Giresun ve Levant olmak üzere ayrılır. Yaklaşık 5 bin yıldır tanınıp bilinen fındık, üç ana gruba ayrılmaktadır.

Çizelge 1.1 Türkiye’de yetişen fındık çeşitleri.

Tombul fındıklar: Tombul, Palaz, Mincane, Gök, Kalınkara, Kan, Cavcava, Delisava

Sivri fındıklar: Sivri, İncekara, Kuş

Diğer fındıklar: Badem, Foşa, Kargalak, Ordu İkizi

Ülkemizde fındık ticari olarak;

Çizelge 1.2 Fındık Yetiştirilen İl ve ilçeler [46].

Düzce Merkez, Kaynaşlı, Gümüşova, Cumaova, Yığılca, Gölyaka, Çilimli, Akçakoca ilçelerinde

Koceeli Kandıra ilçelerinde

Sakarya Merkez, Karasu, Kocaeli, Kaynarca, Karapürçek, Akyazı, Ferizli, Hendek ilçelerinde

Bartın Merkez, Ukus, Amasra, Kurucaşile ilçelerinde Zonguldak Merkez, Alaplı, Ereğli ilçelerinde

(26)

Çizelge 1.2 (devam) Fındık Yetiştirilen İl ve ilçeler. Ordu, Giresun

ve Trabzon

Merkez ve tüm ilçelerinde

Rize Ardeşen, Fındıklı, Çamlıhemşin ilçelerinde Artvin Borçka, Arhavi, hopa ilçelerinde

Kastamonu Cide, İnebolu, bozkurt, Çatalzeytin ilçelerinde

Sinop Merkez Ayancık, Türkeli, Erfelek ve gerze ilçelerinde

Çizelge 1.3 Fındık üretiminde 2012 yılına ait illerin sıralanması [47].

İL 2010 2011 2012 2013 2014 Ordu 206.605 122.050 150.414 178.357 84.874 Sakarya 94.520 50.200 114.172 64.540 84.865 Giresun 51.657 51.600 102.456 81.342 25.327 Samsun 82.055 76.650 93.502 69.392 65.011 Düzce 67.427 50.450 76.838 48.295 56.306 Trabzon 42.861 32.820 59.046 44.537 31.065 Zonguldak 23.852 21.700 24.144 19.105 30.148 Kocaeli 11.438 8.402 13.699 8.531 7.323 Artvin 7.281 8.480 8.111 14.420 9.346 Bartın 3.195 2.250 6.760 5.684 6.688 Kastamonu 4.751 2.150 5.892 5.102 4.231 Rize 2.158 2.060 3.357 1.377 1.122 Sinop 1.656 572 1.046 1.112 1.078 Diğer 543 616 562 7.206 4.616 Toplam 600.000 430.000 660.000 549.000 412.000

Çizelge 1.4 Başlıca üretici ülkelerin yıllara göre kabuklu fındık üretim miktarını gösteren tablo (ton) [48], [49].

Ülke 2010 2011 2012 2013 Ortalama

(27)

Çizelge 1.4 (devam) Başlıca üretici ülkelerin yıllara göre kabuklu fındık üretim miktarını gösteren tablo (ton).

İtalya 87.200 140.000 85.000 120.000 102.525 Azerbaycan 25.000 55.000 45.000 35.000 34.848 Gürcistan 40.000 30.000 40.000 30.000 28.424 ABD 24.500 35.000 36.000 35.000 34.045 İspanya 20.000 22.000 16.000 19.500 21.000 Diğerleri 27.000 27.000 27.000 25.000 31.988 TOPLAM 823.700 739.000 909.000 813.500 841.804

Ayrıca Çin, İran, Şili, Avustralya ve Fransa fındık üretiminde önemli ülkelerdendir. Listedeki ülkelerin yanında küçük miktarlarda üretim yapan diğer ülkeler şunlardır: Polonya, Yunanistan, Belarus, Hırvatistan, Tacikistan, Özbekistan, Rusya, Kamerun, Portekiz, Moldova, Ukrayna, Tacikistan, Tunus, Slovakya, Slovenya, Suriye, Kıbrıs, Arjantin, Avusturya, Estonya, Yeni Zelanda ve Romanyadır [49].

1.1.4 Fındık Yaprağındaki Taksanlar

Bitkilerin sekonder metabolitleri faydalı bileşiklerin eldesinde kullanılmaya başlanmış ve biyoteknolojinin yeni bir alanını oluşturmuştur. Bitkilerde bazı sekonder metabolitlerin yapı ve fonksiyonları ilk kez 19. yüzyılda belirlenmiştir. Sekonder metabolitler, primer metabolitlerden biyosentetik yolla üretilir. Sekonder metabolitlerin, bitkinin primer metabolizmasındaki fonksiyonları tartışmalı olup, genelde böcek ve diğer predatörlere (avcılara) karşı kimyasal savunma, diğer bitkilerle yarışma gibi rollere sahip oldukları düşünülmektedir [50], [51]. Taksanlarlarin üyesi olan Diterpenoid sınıfına bağlı olan paklitaksel, özellikle taksol, yüksek katma değerli fitokimyasal maddelerdir. Bitki bünyesinde oldukça az miktarlarda biriktirilirler. Özelleşmiş hücre tiplerinde ve bitkinin farklı büyüme evrelerinde sentezlendiklerinden dolayı ekstraksiyonları ile saflaştırılmaları zordur [52]. Bitkiyi fungal patojen saldırılarına karşı korurlar [53], [54]. Sekonder metabolitler, nadir olarak amino asitler, bitki aminleri ve glikosidler, vb. bünyesinde biriktirerek çeşitli bilimsel, teknolojik ve ticari uygulamalara ham madde oluşturur [55], [56]. Fındık yaprağında az miktarda

(28)

bulunan sekonder metabolit olarak bilinen, 10-deasetil bakkatin III, bakkatin III, paklitaksel ve sefalomannin gibi bazı bileşiklerdir. Bitki metaryelinden ekstraksiyonu zor olan paklitaksel fiyatı oldukça yüksektir. Bildiğimiz kadarıyla taksol C. avellana ağaçlarında 1998 yılında Hoffman ve diğerleri tarafından bulunmuştur.[57], [58]. 1967'de Taxus brevifolia'da bulunan paklitaksel 500'den fazla doğal taksan, farklı Taxus türlerinde ve çok sayıda sentetik taksol analoglarında karakterize edilmiştir.[59], [60]. Doğal bitki ürünleri(fitokimyasallar) çok sayıda endüstride doğrudan ya da dolaylı olarak kullanılır, özellikle yağlar, taninler, doğal plastikler, yapışkanlar, balmumu, boyalar, ilaçların kaynağı halindedir [61], [62]. Şu anda ilaç endüstrisinde kullanılan önemli bitki bileşiklerinden biri paklitakseldir [63]. Fındık türündeki bulunan bakkatin III, 10-deasetilbakkatatin III, 10-deasetiltaksol ve sefalomannin miktarları, Taxus spp'den on kat daha düşük olduğu HPLC-MS / MS yöntemiyle belirlenmiştir [58]. 2004 yılında yapılan ‘Fındık ve Fındık Yan Ürünlerinde Fitokimyasal Maddeler ve Biyoaktif Bileşikler’ isimli bir çalışmada fındık yaprağında paklitaksel ve türevinin varlığı ayrıca teyit edilmiş [64]. Bu ilaç etken maddeler arasında dünyada en etkili ve en fazla kullanılan maddelerden birisi paklitakseldir (1). Paklitakselin yanısıra sefalomannin (2) bileşiğide bir taksan ailesi üyesi bileşik olup aynı şekilde ilaç olarak kullanılmaktadır. Bakkatin III (3) ve onun bir türevi olan 10-deasetilbakkatin III (4) kendilerinden paklitaksel sentezlenebildiği için önem kazanmış taksan bileşikleridir [65].

Çizelge 1.5 Fındık Yan Ürünlerden Elde Edilen Yaprak Ekstraklarda Taksan’lar (µg/g) [17].

Örnek 10d B III B III 10d T Ceph 7,10d T Paclitaxel

YAPRAK

0.38 ND ND 0.01 ND 0.04

(29)

Şekil 1.18 Fındık Yan Ürünlerden Elde Edilen Yaprak Ekstraklarda Taksanların molekül yapıları Paklitakseldir (1) , Sefalomannin (2) , Bakkatin III (3) , 10-deasetilbakkatin III (4).

1.1.5 İzolasyon Ve Saflaştırma Yöntemleri

1.1.5.1 Ekstraksiyon

Bitkiler belirli oranlarda bileşikler içermektedirler. Bitki ekstraktları gıda, ilaç, kağıt ve kozmetik endüstrisinde geniş alanda kullanılmaktadır. Bununla ilgili olarak elde edilen doğal bileşiklerin ticarileştirilmesiyle ekstraksiyon metotları geniş aralıkta araştırılmaktadır. İdeal kabul edilen bir ekstraksiyon süreci hızlı, basit ve ucuz olmalıdır. Ekstrakte edilen maddeler, madde kayıpları ve bozunma olmadan elde edilmeli, ve bir saflaştırma gerektirmemeli ve atık çözücü barındırmamalıdır. Genelde çözücü ekstraksiyonu bu koşulları sağlamakta yetersiz kalmaktadır. Çözücü ekstraksiyonu basit, ucuz ve kuramsal olarak yerleşmiş bir yöntemdir fakat birtakım dezavantajları bulunmaktadır. Bunların en başında yüksek ısı ve çözücü tüketimi gelmektedir. Genelde çevre, sağlık ve güvenlik açısından zararlı çözücüler kullanılır.

(30)

Ekstraksiyon sırasında kullanılan ısı çözücülerin verimini etkiler, dolayısıyla ısıyla bozunan hassas maddelerin ekstraksiyonu için çözücü ekstraksiyonu uygun bir yöntem değildir. İstenilen ürünün çözücüden ayrılıp derişiklendirilmesi için fazladan bir ayırma işlemine gerek duyulduğunda işlem süresi uzadığında maliyeti de yüksek olduğu için alternatif ekstraksiyon yöntemlerine gereksinim duyulmuştur [66], [67]. Ekstraksiyon, bir çözelti ya da süspansiyon içindeki organik maddeyi, çözen fakat çözelti ya da süspansiyondaki çözgen ile karışmayan bir başka organik çözgen yardımıyla ayırmaktır. Kimyada bilinenin aksine bir saflaştırma değil ayırma yöntemi olarak kullanılır. 1.Sıvı-sıvı Ekstraksiyon 2. Sıvı-katı Ekstraksiyon 3.Katı-katı Ekstraksiyon 4.Sıvı-gaz Ekstraksiyon 5.Katı-gaz Ekstraksiyon

Bir maddenin bir sıvı fazından kısmen veya tamamen başka bir sıvı fazına alınması işlemine sıvı-sıvı ekstraksiyonu denir. Bu durum için madde iki sıvıda da çözünmesi gerekir. Bunun için kullanılan sıvılar birbirine çözünmeyen sıvılardır. Sıvı-sıvı ekstraksiyon'da ayırma hunisi kullanılır. Bu yöntem iki sıvının yoğunluk farkından yararlanılarak uygulanır. Katı-sıvı ekstraksiyon başlıca doğal ve biyolojik örneklerle ilgili uygulamalarda kullanılır. Katı-sıvı ekstraksiyonunda katının içerdiği maddelerden biri veya bir kısmı uygun bir çözücü ile ekstrakte edilir. Katıların ekstraksiyonu genellikle uzun zaman aldığı için alternatif olarak sürekli ekstraksiyon yöntemleri tercih edilir. Maddenin katı içinden difüzlenmesi yavaş bir işlem olduğu için katı örnek öğütülüp ince toz haline geldikten sonra ekstrakte edilmelidir. Böylece ince toz halindeki maddenin çözücü ile daha fazla teması sağlanır. Ekstraksiyon işlemini geleneksel ve yeni metotlar olmak üzere iki gruba ayırabiliriz. Sokselet ekstraksiyonu ve maserasyon işlemi geleneksel yöntemler arasında olup işlem süresi uzundur ve büyük miktarlarda çözücüler kullanılmaktadır. Süperkritik sıvı ekstraksiyonu, mikrodalga ekstraksiyonu ise son yıllarda geliştirilen yeni ekstraksiyon yöntemidir ve hızlı, etkin, modern yöntemler arasındadır [68].

(31)

1.1.5.2 Farklı Ekstraksiyon Metotlarının Kullanılması

1.1.5.2.1 Organik Çözücü Ekstraksiyonu

Bitki numunesi, uçucu yağı kolaylıkla çözebilen benzen, hekzan, petrol eteri, kloroform gibi kaynama noktası düşük organik çözücülerle çözülür. Organik çözücünün alçak basınçta uçurulması ile bir miktar (sabit yağ, boya maddeleri, mum vs.) yabancı madde içeren uçucu yağ elde edilir ve bu karışıma da konkret adı verilir. Konkret, önce alkolle muamele edilir ve sonra vakum distilasyonu ile alkol uçurulur. Geriye kalan yağımsı madde absolü (absolute) adı verilir, pahalı ve kullanılması kolay bir yağ elde edilmiş olur [69].

1.1.5.2.2 Soxhlet Metodu

1879 yılında F. Soxhlet tarafından geliştirilen ve 1980’lerin ortalarına kadar tercih edilen Soxhlet ekstraksiyonu günümüzde laboratuvarların çoğunda kullanılmaktadır. Son yıllarda gelişmiş ekstraksiyon tekniklerine artan bir talep olmasının nedeni otomasyona uygun olması, ekstraksiyon zamanının kısalması, organik çözücü tüketiminin azalması, analitik laboratuvarlarında kirliliğin önlenmesi ve örnek hazırlama maliyetindeki azalmadır [70], [71]. Bir katının sıcak çözücü ile ekstraksiyonunda kullanılır. Soxhlet ekstraksiyonu, iyi uygulanan bir metotdur. Endüstriyel proseslerde yüksek verimli ve tekrarlanabilir, ekstrakta daha az harekete sahip olması diğer metotlara göre üstün özellik gösterir [72]. Geleneksel Soxhlet cihazı, sürecin hızlanmasına yardımcı olan çalkalama işlemi yapılmaz. Büyük miktarlarda çözücü kullanıldığından, ekstraksiyon sonrası çözücü uzaklaştırılması zorunludur. Soxhlet tekniği çözücü seçiciliği ile sınırlıdır [73], [74].

1.1.5.2.3 Süperkritik Akışkan Ekstraksiyonu

Ekstraksiyon metodları kimyasal atığına çok fazla olduğundan çevresel kirlenme neden olmaktadır bu durumda yeşil kimya diye bir kavramın oluşmasını sağlamiştir. Kimyacılar artık kimyasal ve çözücü kullanımında çok daha dikkatli davranmaya ve çevre dostu çözümler geliştirmeye çalışmışlardır. Doğal ürünlerin ekstraksiyonu ve saflaştırılmasında yüksek miktarlarda atık organik çözücü oluşmaktadır. süperkritik akışkan ekstraksiyonu (SFE), doğal ürünlerin ekstraksiyonunda bir alternatif olarak karşımıza çıkmaktadır [75]. Süperkritik bir akışkanla ekstraksiyon; seçilen akışkanın, kritik basınç ve sıcaklık değerinin üstünde bir çözücü kullanılması gereklidir. Süperkritik hal olarak adlandırılan bu bölgede, akışkanın fizikokimyasal özellikleri

(32)

değişerek, sıvı ve gaz arası farklı özellikler gösterir. Bu yüzden süperkritik koşullardaki madde, sıvı veya gazdan ziyade “akışkan” olarak adlandırılır [76]. 1822 yılında Cagniard de la Tour’ un, değişik çözücüleri kapalı bir ortamda ısıtarak sıvı fazın kaybolduğu gözlemesiyle süperkritik alanında yapılan ilk çalışma kabul edilmektedir. SFE ilk olarak 1930' lu yıllarda petrokimya alanında kullanılmaya başlandığı ve çeşitli patentler alındığı bilinmektedir. Gıda üzerindeki çalışmalar ise 1970' li yıllarda başlamış ve özellikle şerbetçi otu, kahve, çay, tütün ve baharatlar gibi pek çok ürünün SFE’ yi içeren birçok patent alınmıştır. Süperkritik akışkanlar, endüstriyel ölçekte olduğu kadar, analitik ölçekteki örnek ekstraksiyonlarında git gide tercih edilmeye başlanmiştir. Hava ve su gibi çevresel matrislerden poliaromatik hidrokarbonlar (PAH) ve poliklorlanmış bifeniller (PCB) gibi maddelerin ayırımından gıda ürünlerine kadar değişen pek çok örnekte, genellikle 30 dakikadan daha kısa sürede ve kantitatif tayinlerde geri kazanımla ekstraksiyon yapılmaktadır [77]. Her maddenin bir kritik sıcaklığı (Tc) ve kritik basıncı (Pc) vardır. Maddenin kritik sıcaklığı ve basıncı, gaz ve sıvı fazlarının bir arada bulunabildiği en yüksek sıcaklık ve basınçtır. Maddenin 3 hali vardır. Katı, sıvı ve gaz olarak üç gruba ayrılırlar. Ancak maddeye, kritik sıcaklığının ve kritik basıncının üzerindeki koşullar uygulandığında “Süperkritik Akışkan” olarak adlandırılan dördüncü gruba girer [78]. İlk kez 1879’ da Hannay ve Hogart tarafından, bir katının yüksek basınçtaki gazda çözündüğü, basınç düşürülünce katının çöktüğü açıklanmıştır. Daha sonra Eduard Buchner, bileşik olarak naftalinin süperkritik karbon dioksit içindeki çözünürlüğünü ölçmüştür. Sub-kritik su ekstraksiyonu; pek çok organik molekül için iyi bir çözücü özelliğine sahip olması nedeniyle, bitki ekstraksiyonu için klasik ve süperkritik CO2 ekstraksiyonu yöntemlerine karşı alternatif bir yöntemdir. Birçok

uygulamalarda en çok kullanılan çözücülerin kritik sıcaklık, basınç ve yoğunluk değerleri verilmiştir. Amonyak, n-pentan, metanol ve toluenin kritik sıcaklıklarının yüksek olmasından dolayı, sıcaklığa duyarlı olan doğal maddelerin ekstraksiyonu için uygun çözücü olmadıkları görülmektedir.

(33)

Çizelge 1.6 Süperkritik akışkanların fiziksel özelikleri. Çözücü Tc (0C) Pc (atm) ρ (g/Cm3) Karbondioksit 31,3 72,9 0,47 Etanol 243.4 63 0.28 Su 374.4 226.8 0.33 Etan 32.4 48.3 0.20 n-pentan 196 33.2 0.237 Metanol 240 79.8 0.272 Toluen 319 40.6 0.292

1.1.5.2.4 Basınçlı Sıvı Ekstraksiyonu (Hızlandırılmış Çözücü Ekstraksiyonu-ASE) Basınçlı sıvı ekstraksiyonu (BSE), sıcaklığın artması ile çözünürlüğün artması ve sıvıların çeşitli matrislere yüksek basınçta olduklarında daha iyi nufuz etmesi avantajına sahiptir. Yükseltilmiş basınç, solventin daha yüksek sıcaklıklarda sıvı halde bulunmasını sağlar. Yüksek sıcaklıkların kullanımı, van der Waals kuvvetleri, hidrojen bağı ve dipol çekim gibi analit-örnek matriksi etkileşimlerinin bozulmasına yardımcı olarak ekstraksiyon verimini artırır [79]. Katılar ve yarı katı hammaddeler için geliştirilmiş bir ekstraksiyon tekniğidir. Basınç artışı çözücülerin atmosferik basınçtaki kaynama noktalarının üstündeki sıcaklıkların kullanımını sağlar. Artan sıcaklık sıvı solventin viskozitesini azaltır ve matriks partiküllerinin içine girmesini kolaylaştırır. Sıcaklık, güçlü analit ve matriks etkileşimlerinin bozulmasına yardım eder ve denge zamanını kısaltan difüzyon hızlarını artırır. Bu durum özellikle difüzyon kontrollü örneklerde daha hızlı ekstraksiyonlara izin verir. PLE’nin temel özelliği, gerekli solvent miktarını önemli ölçüde azaltırken, ekstraksiyon sürecinin hızını artıran yüksek difüzyon sıvıları kullanmasıdır [80]. Bu teknik katıdan istenilen bileşiklerin, süperkritik koşullarda, yüksek sıcaklık (50 ve 200°C) ve basınçta (10–15MPa) organik çözücü sistemi ile ekstrakte edilmesini sağlar [81]. BSE, bilinen ekstraksiyon tekniklerinden olan Soxhlet, göre ekstraksiyon süresi, çözücü tüketimi, ekstraksiyon verimi ve tekrarlanabilirlik açısından daha avantajlı bir yöntemdir. Yüksek sıcaklık ve basınç ile sağlanan bu koşullar ekstrakt edilecek bileşiklerin çözünürlük ve katı matristen desorpsiyon kinetiğini artırmaktadır. Bu özellik, süperkritik koşulların altında çevre dostu çözücülerin (su, etanol gibi) daha çok kullanılmasına olanak sağlar [82]. Sıvı çözücünün yüksek sıcaklık ve basınçta kullanılarak, oda koşullarındaki veya atmosferik

(34)

koşullara yakın ekstraksiyonlara oranla daha iyi sonuç vermesinin iki sebebi vardır: • Çözünürlük ve kütle transferi etkileri

• Yüzey dengesinin dağılımı

Yüksek sıcaklık çözücülerin bileşikleri çözme kapasitesini arttırmaktadır. Organik çözücülerde suyun çözünürlüğü sıcaklığın artmasıyla artmaktadır [83]. İdeal çözeltilerde, sıcaklığın 50°C’den 150°C’ye çıkması, çözünürlüğü 13 kat arttırmaktadır. Sıcaklığın 25°C’den 150°C’ye çıkması, difüzyon katsayılarında 2–10 kat arasında artmaya neden olmaktadır [84]. Ekstraksiyonlar, çözücünün sıvı formda kalması için basınç ve kaynama noktasının hemen altında sıcaklıklarda gerçekleştirilmektedir. Sıcaklığı kaynama noktası altında kullanabilmek için ekstraksiyon sırasında yeterince basınç uygulanmalıdır. Yüksek basınç kullanılması (yüksek sıcaklık ve düşük çözücü yüzey gerilimi ile), çözücüyü, katı içindeki ekstre edilecek bileşiğe temas etmek için, boşluklara doğru itmektedir. Yüksek basınç, çözünme hızını arttırmaktadır. Bu basınç altında sıvının taşınabilmesi için sıvılaştrılmış azot kullanılmaktadır [85]. Bununla birlikte olası en yüksek sıcaklık ve basınç, mutlaka en yüksek verimle sonuçlanmaz. Bozucu etki de yapabilir. Ayrıca ekstraksiyon verimini etkileyen birkaç değişken daha vardır. Bunlar; ekstraksiyon zamanı, çözücü seçimi, çözücü hacmi ve yüklenen örnek miktarıdır. Orijinal örneğin bileşimine (organik bileşim, su içeriği, partikül boyutu ve heterojenite) ek olarak, örnek ön hazırlama teknikleri de (kurutma, öğütme gibi) sonucu etkileyebilir [86].

1.1.5.2.5 Mikrodalga Ekstraksiyonu

Mikrodalgalar yüksek frekanslı elektromanyetik dalgalardır (300-300000 MHz). Mikrodalga enerjisi kullanılarak, iyonların iletimi ve dipol dönme yoluyla molekül üzerine mikrodalganın ısısının direkt etkisi temeline dayanır. Birçok uygulamalarda bu iki mekanizma aynı anda meydana gelir. Mikrodalga ışımaları polar ve polarlanabilen bileşiklerin dipolleri ile etkileşerek etki gösterirler. Dipol dönme, uygulanan manyetik alanla dipollerin yeniden düzenlenmesi anlamına gelir [87], [88]. İyonik iletim, iyonların elektroforetik geçişidir ve bir manyetik alan uygulandığında oluşur. Çözeltinin bu iyon akışına karşı direnci sürtünme ile sonuçlanır ve böylece çözelti ısınır. Bu ısıl etkileşim materyalin yüzeyinde gerçekleşir, materyalin tamamının ısınması ise iletkenlikle olur. Burada sıcaklık artışını engellemek için soğutma işlemi yapılır. Bu etkileşimle polar moleküller yeniden düzenlenirler ve dolayısıyla ısınırlar. İşlem süresini kısaltmak, daha az çözücü kullanımıyla daha iyi sonuçlar almak için klasik

(35)

metotlarla mikrodalganın birlikte kullanıldığı bir ekstraksiyon türüdür. Bu teknikte çok az numune, üzerine eklenen çözücü ile beraber mikrodalga ışınlara maruz bırakılır. Mikrodalgalar 0.3-300 GHz aralığında değişen elektromanyetik ışımalardır. Bu durum mikrodalga ısıtmasının dezavantajıdır çünkü küçük moleküllerden oluşan agregatların ısınması homojen olmaz. Eğer ekstraksiyonda hekzan ve toluen gibi apolar çözücü gerekliyse, çözücü su metanol ve aseton gibi yüksek bir dipol momente sahip polar çözücü karıştırmak önerilir. Seçilen çözücü çok kuvvetli ısınmaya neden olursa, bileşiklerin degredasyonundan kaçınılamaz. Bu yüzden yaygın uygulama, yalnızca biri mikrodalga ışımayı absorplayan ikili karışımların kullanımıdır. Diğer önemli faktörlerden biri de, ekstraksiyon solventi ile ekstraktın analizinde kullanılan analitik metodun uyumluluğudur. Gaz kromatografik analizler için daha az polar solventler, sıvı kromatografik analiz için daha polar çözücü tercih edilir. MAE’nin seçiciliği üzerine çok az literatür rapor edilmiştir. Örneğin içindeki tüm maddeler ekstrakte edildiğinden seçici bir ekstraksiyon tekniği olduğu söylenemez ve hemen hemen her durumda ekstraksiyon sonrası temizleme basamağı gereklidir [89]. MAE genellikle çevresel analizlerde kullanılır. Tortu ve toprak gibi matrisklerden, poliaromatik hidrokarbonlar, polikloro bifeniller ve organoklorlu pestisitlerin ekstraksiyonları çalışılmıştır [90], [91]. Mikrodalga enerjisini ileten çözücüler kullanıldığında gönderilen enerjinin tümü numune tarafından tutulmakta, hücre içindeki su bu enerjiyi tuttuğunda hücre ısınmakta ve hücre duvarının bu ısıyla çatlaması sonucunda hücre materyali çözücüye karışmaktadır [92]. Mikrodalga ekstraksiyon yöntemiyle bitkilerde bulunan polifenoller ve lignanlar ayrıştırılabilmektedir [93]. Doğal ürünlerin ekstraksiyonu genellikle 2.5-75 GHz’de gerçekleştirilmektedir. Mikrodalga enerjisinin uygulanabilirliği büyük oranda çözücünün içeriğine, bitki materyaline ve uygulanan mikrodalga gücüne bağlı olmaktadır [94]. Fakat mikrodalga metodu uçucu bileşenleri kazanmak için pek fazla kullanılmaz. Bu metotta clevenger aparatına yerleştirilen bitki materyalleri bir mikrodalga fırın içinde kısa bir zaman aralığında uçucu yağları uzaklaştırmak için kullanılır. Böylece örnek kaynama noktasına çok hızlı bir şekilde ulaşır [95].

(36)

Çizelge 1.7 Gelişmiş ekstraksiyon tekniklerinin karşılaştırılması. Ekstraksiyon Teknikleri Avantajları Dezavantajları Soxhlet Ekstraksiyonu

 Fazla miktarda örnek kütlesi ekstrakte edilmesi

 Matrikse bağımlı olmaması

 Filtrasyon gerektirmemesi

 Büyük miktarda organik solvent kullanılması (100-500 mL)

 Uzun zaman gerektirmesi (6- 24 saat)  Ekstraksiyon sonrası buharlaştırma/deriştirme basamağı Süperkritik Sıvı Ekstraksiyonu  Hızlı olması (20-60 dakika)

 Düşük solvent tüketimi (10-20 mL) CO2 in toksik olmaması, alev almaması, çevre dostu olması, ucuz olması

 Yüksek maliyet

 Matrikse bağımlı olması

 CO2 nonpolar olduğundan, daha polar analitlerin ekstraksiyondaki zorluk Verimini artırmak için

Mikrodalga Destekli Sıvı Ekstraksiyonu

 Hızlı olması (10-30 dakika)

 Düşük solvent tüketimi (20-50 mL)

 Daha yüksek sıcaklıklar Ekstraksiyon parametrelerinin tamamen kontrolü (zaman, güç, sıcaklık)

 Seçilen solventlerin mikrodalga ışımasını absorplaması (polar solventler)

 Herşey ekstrakte edilir

 temizleme basamağı gereklidir

Basınclı Sıvı Ekstraksiyonu  Filtrasyon gerektirmemesi  Hızlı olması (10-40 dakika)  Düşük solvent tüketimi (20-50 mL)  Yüksek maliyet

 Matrikse bağımlı olması

Taksanların saflaştırılmasıyla ilgili yapılan çalışmalarda bir çok ekstraksiyon yöntemi uygulanmıştir. Yapılan çalışmalarda taksus bitkisindeki taksanlar süperkritik akışkan ekstraksiyon yöntemiyle paklitakselin ve bakkatin III de denenmiştir. Bu çalışmalarda bakkatin III %0,65 verimle elde edilmiştir [96].

(37)

1.1.6 Taksanlarin Analizinde Kullanilan Kromatografik Yöntemler

1.1.6.1 HPLC (Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi)

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi kısaca HPLC olarak adlandırılır. Yüksek performans; yüksek resolüsyonu (ayrımı) ifade eder. Mobil fazın yüksek basınçla ilerlemesi sağlandığı için de Yüksek basınçlı Sıvı Kromatografi olarak da adlandırılır. Sıvı kromatografisi yönteminin özel bir uygulaması olan yüksek performanslı sıvı kromatografisi yönteminde, durgun faz olarak kullanılan parçacık boyutlarının önemli ölçüde küçültülmesi sonucu, hareketli faz ile etkileşen durgun faz yüzey alanı büyür ve böylece kolonun etkinliği arttırılmış olur. Çok sıkı olarak doldurulmuş kolondan hareketli fazın belirli bir hızla geçebilmesi için bir basınç uygulanması gerekir. Bu yüksek verimdeki kolonların ve oldukça yüksek basınçların kullanıldığı HPLC, element türlendirilmesinde en yaygın biçimde uygulanan kromatografi türüdür [97], [98]. Özellikle diğer kromatografik tekniklere uygun olmayan bileşiklerin ayrılması ve analizi için uygundur. Çevre sıcaklığında termal olarak kararsız bileşikleri ve yüksek polarlıktaki bileşikleri herhangi bir türevlendirme olmaksızın ayırabilir ve analiz edebilir [99]. Taksanların ve taksan türevlerinin tespiti ve saflaştırılmasında en çok kullanılan kromotografik yöntem HPLC’dır. Yüksek hızda gerçekleştirilen ayırmaların yapıldığı sıvı kromatografi sistemlerine, yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) denir. Bu yöntemle analitik, yarıpreparatif ya da preperatif amaçlı olarak kullanılır. Kromatografik prosesler, durgun ve hareketli fazlar arasında kütle transferini kapsayan ayırma teknikleri olarak tanımlanırlar. HPLC; bir karışımdaki bileşenlerin ayrılmasında sıvı hareketli fazı kullanır. Bu bileşenler ilk olarak çözücüde çözünürleştirilirler ve daha sonra yüksek basınç altında kromatografi kolonundan geçmeye zorlanırlar. Ters faz; Apolar, polar, iyonlaşabilen veya iyonik bileşenler için kullanılabilir. Kolon apolar özellik gösterirken (C18, C8, C3, phenyl) hareketli faz polar özellik gösterir. Normal faz HPLC’de sabit faz olarak silikajel gibi ve polar dolgu maddesi, hareketli faz olarak çözücü sistemi uygulanır. Polar özellikteki maddeleri tutarak apolar bileşenlerin ayrımı gerçekleşir. HPLC’de iki çeşit elüent sistem vardır. İzokratik sistemde çözücü bileşimi hep sabittir. Basit ayrımlar için idealdir. Kalite kontrol departmanlarında sıklıkla tercih edilir. Gradient sistemde Hareketli faz bileşimi zamanla değişim gösterir. Kompleks karışımların ayrımı için idealdir. Bilinmeyen karışımlarda metod geliştirmek için tercih edilir. HPLC günümüzde analitik kimya, biyokimya, biyoteknoloji, farmakoloji, bitki

(38)

kimyası, tarım ve kimya mühendisliğini içeren alanlarda ayırma ve analiz için kullanılmaktadır. Çevre sıcaklığında termal olarak kararsız olan bileşiklerle, yüksek polariteye sahip bileşikler herhangi bir türevlendirme olmaksızın ayrılabilirler [100]. Taksanların tanımlanması ve saflaştırılması için en çok kullanılan yöntem HPLC’dir. Genellikle fenil, siyano veya oktadesil bağlı kolonlarda metanol, asetonitril, diklorometan, su çözücü karışımlarının gradient veya izokratik elüsyonla uygulandığı ters faz HPLC, özellikle taksol, sefalomannin, bakatin III ve 10-deasetilbakatin III türevlerinin ayrılmasında başarılı olmuştur.

1.1.7 Taksanların Elde Edilmesiyle İlgili Önceki Çalışmalar

1988’de Guénard ve ark. yaptıkları çalışmalar sonucunda klasik çözücü ekstraksiyonu ile Taxus baccata L.’nin iğne yapraklarında bulunan 10-deasetilbakatin III miktarını % 0.1 oranına olduğunu tespit edip, 1 kg yapraktan 1 g 10-deasetilbakatin III izole etmeyi başarmışlardır [101].

1993’de Heaton ve ark. süperkritik karbondioksit ekstraksiyonunu kullanarak Taxus

baccata L.’nin iğne yapraklarını, 15-105 dakika zaman aralıklarında 400 atm basınç %

10 metanolle, 50o C sıcaklıkta ekstrakte etmişlerdir. Yaptıkları çalışmalar sonucunda, klasik çözücü ekstraksiyonu ile 800 mg/kg oranında elde edilen taksisin, süperkritik karbondioksit ekstraksiyonu ile yukarıda belirtilen şartlarda 666 mg/kg oranında elde edilmiştir. Aynı çalışmanın devamı olarak Taksisin I ve Taksisin II bileşiklerinin süperkritik akışkan kromatografisi ile ayırımı gerçekleştirilmiştir. Analiz sonucunda polar nitril paket kolon ile daha iyi ayırım yapıldığı tespit edilmiştir [102].

1995’de Suffness ve ark. Taxus brevifolia’nın dal kısımlarını kullanarak klasik çözücü ekstraksiyonu ile % 0.014 oranında paklitaksel izole etmeyi başarmışlardır [103].

1997’de Mattina ve ark. Mikrodalga ekstraksiyon sistemini kullanarak, paklitaksel, ve 10-deasetilbakatin III’ü sefalomanin saflaştırma çalışmalar yapmışlardır. Bu çalışmada çözücü sistemi olarak metanol kullanılmış her üç molekül için % 90 oranında verim elde etmişlerdir. Çözücü olarak %95’lik etanol kullanıldığı zaman paklitaksel ve 10-deasetilbakatin III için % 85 ve sefalomanin için %90 oranında, kloroformun çözücü olarak kullanıldığı deneylerde ise paklitaksel ve sefalomanin için % 40 ve 10-deasetilbakatin III için % 60 oranında verim elde etmişlerdir. Yapılan çalışmalar sonucunda mikrodalga ekstraksiyon ile yapılan deneyler sonucu elde edilen verim değerlerinin klasik çözücü ekstraksiyonu ile elde edilen değerlere yakın olduğu ve bu

(39)

metodun taksanların saflaştırılması için yapılan ekstraksiyon deneyleri için uygun bir yöntem olduğu tespit edilmiştir [104].

1998’de Verpoorte ve ark. Taksus hücre kültürlerini kullanarak taksan elde edilmesinde, HPLC analizleri için farklı tiplerde katı faz ekstraksiyon (SPE) tekniklerini kullanmışlar ve paklitaksel ile 10-deasetilbakatin III’ü analiz etmişlerdir. SPE ile yapılan çalışmalar sonucunda farklı SPE modelleri kullanıldığında 10-deasetilbakatin III için % 45-105 ve paklitaksel için %65-105 aralığında değişim gerçekleştiği belirtilmiştir. Yapılan çalışmalar sonucunda taksanların geri kazanımı için 50 µm partikül boyutunda, 60 A poroziteye sahip C-8 ve C-18 kartuşların en iyi performansı gösterdikleri belirtilmiştir [105]. Cao ve ark. yüksek hızda akım kromatografi metodunu kullanarak 10-deasetilbakatin III’ün ayrılmasını ve saflaştırılmasını gerçekleştirmişlerdir. Ekstraktın kompleks bir karışım içerisinde olmasından dolayı iki aşamalı bir ayırma işlemi gerçekleştirilmiştir. İlk olarak dört farklı çözücü karışımı ile n-hekzan-etil asetat-etanol-su (2:5:2:5 v/v), ikinci olarak yine dört farklı çözücü karışımı ile n-hekzan-kloroform-metanol-su (5:25:35:20 v/v) çözücü sistemlerini kullanarak 2 ml/dk akış hızında 254 nm’de, analizler gerçekleştirmiş ve bu metodun taksanların ayrılması için uygun bir metot olduğu belirtilmiştir [106].

1999’da Kawamura ve ark. Taxus cuspidata’nın kabuk kısımlarını hızlandırılmış çözücü ekstraksiyonu metodunu kullanarak 10.13 MPa basınç ve değişken sıcaklık aralığında 15 dakika boyunca ekstrakte etmişlerdir. Farklı sıcaklıklarda gerçekleştirdikleri deneyler sonucunda bu metot ile verim 160o C sıcaklığa kadar artış gösterdiği daha sonra bu sıcaklıktan 200 o C sıcaklığa kadar çıkıldığında verimde azalma olduğunu

tespit etmişlerdir. Hızlandırılmış çözücü ekstraksiyonunda metanol, etanol, izopropil alkol, asetonitril, etil asetat, diklorometan, benzen, aseton ve su çözücü olarak kullanılmış ve paklitakselin saflaştırılması için en iyi çözücünün metanol olduğu tespit edilmiştir. Klasik çözücü ile ekstraksiyon metodunda ekstraksiyon süresinin uzun olması nedeniyle yüksek sıcaklıklarda çalışılmasından kaçınılırken, hızlandırılmış çözücü ekstraksiyonunda bu sürenin kısa olması ve yüksek sıcaklıklarda çalışılabilmesi, ayrıca bitkiden ekstrakte edilen paklitaksel miktarında klasik ekstraksiyon metoduna göre 50 kat ve ısıtılmış su ekstraksiyonuna göre 5 kat daha iyi sonuç vermesi metodun avantajları arasında gösterilmiştir [107]. Saicic ve ark. etanol, diklorometan ve etilasetatın çözücü olarak kullanıldığı klasik çözücü ekstraksiyonu metodu ile Taxus baccata’nın yapraklarından 265 mg/kg oranında 10-deasetilbakatin III izole etmişlerdir

Referanslar

Benzer Belgeler

• Beslut fattat på enheten om tid och resurs för funktionen?. • Mål och mått klara

Bu eksikliğin bir parça da olsa giderilmesi amacıyla 24 Mart 2014 tarihinde ikincisini düzenlediğimiz ve çok olumlu geri bildirimler aldığımız Vaginal Histerektomi kursumuzdan

Bu değişkenlerden bazıları kendi aralarında yüksek ilişkiye (korelasyona) sahipken, diğer tüm değişkenlerle daha düşük ilişki içerisinde olabilir. Birbirleri ile

mikroorganizmalar tarafından tamamen okside edilemeyip çeşitli organik bileşikler oluşturulur. Fermentasyondan ayrılabilmesi amacı ile bu olay, tamamlanmamış

Kolon çalışmasında çözeltideki metal iyonunun adsorplanmasında etkili olan çözeltinin pH sı, çözeltideki matriks iyonları ve konsantrasyonları, çözeltinin kolondan geçiş

Bir Türk dili olarak Çuvaşçanın art zamanlı sesbilgisi ve biçimbilgisinde olduğu gibi, Altay dil ailesinin bağımsız bir üyesi olarak Çuvaşçanın diğer

Yumuşak Çekirdekli Meyveler Elma Yetiştiriciliği Bahçe Tesisi Armut Anaçları Tohum(Generatif) Anaçlar Pyrus comminus çöğürü Ahlat Alıç Klon (Vegetatif) Anaçlar Quince A

sic Nemesis longum, sic Delia nomen habebunt, altera cura recens, altera primus amor.. Quid vos