FEN B MLER ENST TÜSÜ
BAZI HIV LAÇLARININ ETKEN MADDELER
N VOLTAMETR K
YÖNTEMLERLE BEL RLENMES
Esra ÖZGEN
YÜKSEK L SANS TEZ
MYA ANAB M DALI
YARBAKIR Ocak - 2018
I
Dicle Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsüne ba olarak Kimya Anabilim Dal nda yüksek lisansa ba lad m ilk günden itibaren bilgi ve deneyimlerinden yararland m, tez çal malar süresince bana bütün imkânlar sa layan, sadece kimya alan nda de il her alanda bir
eyler ö rendi im ve deste ini her zaman hissetti im, de erli hocam Prof. Dr. Berrin YADANO ULLARIN’a sonsuz te ekkürlerimi sunar m.
Tez çal malar m süresince gerek laboratuvar çal malar mda gerekse tez haz rlama amalar nda bilgi ve tecrübelerini benden esirgemeyen, gece gündüz demeden çal malar ma fayda sa layan ve bana gerçek bir karde gibi davranan çok de erli hocam Doç. Dr. Remziye GÜZEL’e te ekkürlerimi sunar m.
Bütün e itim dönemlerimde ve tezimi haz rlama a amas nda, maddi ve manevi deste iyle her zaman yan mda olan de erli ablam Yrd. Doç. Dr. C.Gülbin ESK YECEK’e, hayat n her döneminde maddi ve manevi destekleriyle beni yaln z b rakmayan can m annem Leman ESK YECEK’e, de erli ablam Dt. Berivan ALP’e, sevgili e im Mehmet ÖZGEN’e ve can m ve birtanecik o lum Aras ÖZGEN’e sonsuz sevgilerimi ve te ekkürlerimi sunar m.
II NDEK LER TE EKKÜR ... I NDEK LER ... II ÖZET ... IV ABSTRACT ... V ZELGE L STES ... VI EK L L STES ... VII KISALTMA VE S MGELER ... IX 1. ... 1
1.1. Çal mas Yap lacak HIV laç Etken Maddeler Hakk nda Genel Bilgiler ... 2
1.1.1. Lamivudine ... 2
1.1.2. Zidovudine ... 3
1.2. Voltametri ... 3
1.2.1. Voltametrinin Çal ma Prensibi ... 5
1.2.1.1. Çal ma Elektrotu (WE) ... 5
- Civa Elektrot ... 5
- Platin Elektrot ... 6
- Alt n Elektrot ... 6
- Cams Karbon Elektrot ... 6
1.2.1.2. Referans Elektrodu (RE) ... 7
1.2.1.3. Kar (Yard mc ) Elektrot (CE) ... 7
1.3. Voltametrik Analizi Etkileyen Parametreler ... 8
1.3.1. Destek Elektrolitin Seçimi ... 8
1.3.2. pH Ayar ... 8
1.3.3. cakl k Kontrolü ... 8
1.3.4. Oksijenin Uzakla lmas ... 8
1.4. Voltametrik Yöntemler ... 9
1.4.1. Difarensiyel Puls Voltametrisi ... 9
1.4.2. Kare Dalga Voltametrisi (SWW) ... 10
1.4.3. Dönü ümlü Voltametri (CV) ... 11
III
1.4.4.3. Adsorptif S rma Voltametrisi (ASV) ... 14
2. ÖNCEK ÇALI MALAR ... 15
3. MATERYAL ve METOT ... 21
3.1. Materyal ... 21
3.1.1 Kullan lan Kimyasal Maddeler ... 21
3.1.2. Kullan lan Cihaz ve Malzemeler ... 21
3.1.3. Kullan lan Teknik ve Elektrotlar ... 22
3.2. Metot ... 22
3.2.1. Alt n Elektrodun Temizlenmesi ... 22
3.2.2. Stok Çözeltiler………... 23
3.2.3. Farmasötik Örnekler... 23
3.2.4. Ticari Örneklerin Analizi... 23
3.2.5. Uygulanan Yöntem ... 24
4. BULGULAR VE TARTI MA ... 25
4.1. Lami ve Zido’nun Çözünürlü ünün Tespiti ... 25
4.2. Lamivudine ve Zidovudine Elektrokimyasal Davran ... 25
4.3. Destek elektrolit ve pH Etkisi ... 26
4.4. Frekans Etkisi ... 28
4.5. LAM ve Z DO’nun Adsorpsiyon Özellikleri ... 29
4.6. Analitik Deri im Aral n Belirlenmesi ve Validasyon ... 32
4.7. laçlar n Analizi ... 35
4.8. Yüzey Karakterizasyonu ... 37
5. SONUÇ VE ÖNER LER ... 39
6. KAYNAKLAR ... 43
IV ÖZET
BAZI HIV LAÇLARININ ETKEN MADDELER N VOLTAMETR K
YÖNTEMLERLE BEL RLENMES
YÜKSEK L SANS TEZ
Esra ÖZGEN
CLE ÜN VERS TES
FEN B MLER ENST TÜSÜ
MYA ANAB M DALI
2018
Bu çal mada kare dalga voltametrisi kullan larak Lamivudin ve Zidovudin’in ticari örneklerden analiz edilebilmesi için yöntem geli tirildi. Bu yöntem için destek elektrolit olarak Britton Robinson Tamponu, çal ma elektrotu olarak da Au elektrot kullan ld . Kalibrasyon grafi inin do rusal aral Lamivudin için 7x10-9 - 3x10-8 M, Zidovudin için 5x10-9- 1x10-8 M olarak belirlendi. Lamivudin için LOQ 3,1 x 10-9 M ve Zidovudin için LOQ 1,2 x 10-9 M olarak tespit edildi. Voltametrik yöntemin validasyonu ve uygulanabilirli i ba ms z validasyon örnekleri analiz edilerek test edildi. Önerilen voltametrik metod tablet örnekleri için ba ar sonuç verdi.
V ABSTRACT
DETERMINATION OF THE ACTIVE SUBSTANCES OF SOME HIV DRUGS, BY VOLTAMETRIC METHODS
MASTER THESIS Esra ÖZGEN
DEPARTMENT OF FIELD CHEMISTRY INSTUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES
UNIVERSITY OF DICLE 2018
In this study, a method was developed by using the square wave voltammeter in order to analyse the Lamivudine and Zidovudine from the commercial samples. We used Britton Robinson Buffer as the supporting electrolyte and Au electrode as the working electrode for this method. Concentration range of the calibration graph was identified as 7x10-9 - 3x10-8 M for the Lamivudine, and 5x10-9 - 1x10-8 M for the Zidovudine. For the Lamivudine it was verified as LOQ 3,1 x 10-9 M and for the Zidovudine LOQ 1,2 x 10-9 M was found out. The validation and applicability of the voltammetric method was tested by analyzing the independent validation samples. The recommended method showed successful results for the sample of tablets.
VI
ZELGE L STES
Çizelge No Sayfa
Çizelge 4.1. Regresyon analizi ve istatiksel veriler 35
Çizelge 4.2. Geli tirilen voltametrik yöntemle tabletlerde elde edilen sonuçlar 36 Çizelge 4.3. Geli tirilen metotla gün-içi ve günler-aras deney sonuçlar 37
Çizelge 5.1. LAM ve Z DO ile yap lan elektrokimyasal çal malar 40
VII
ekil No Sayfa
ekil 1.1. Lamivudine ilac n aç k formülü (yap ) 2
ekil 1.2. Zidovudine ilac n aç k formülü (yap ) 3
ekil 1.3. a) Giderek artan bir do ru ak m potansiyeline sabit genlikli pulslar n
uygulanmas
b) Diferansiyel puls polarografisinde elde edilen ak m-potansiyel e risi
10
ekil 1.4. Kare dalga voltametri grafi i 11
ekil 1.5. Dönü ümlü voltametri grafi i 11
ekil 3.1. GAMRY INSTRUMENTS REFERENCE 3000 Potentiostat /
Galvanostat / ZRA
22
ekil 4.1. 10-4 M LAM ve Z DO bile iklerinin 0,1 M BRT tamponunda alt n
elektrotta al nan dönü ümlü voltamogramlar (Tarama h : 50 mV/s, Ag/AgCl)
26
ekil 4.2. Fosfat tamponu [(1: pH 5,5), (2: pH 6,3), (3: pH 7,2) ve (4: pH 8,1)] ve
asetat tamponu [(5: pH 3,5), (6: pH 4,6 ve (7: pH 5,7)] ortam nda
LAM ve Z DO’nun kare dalga voltamogramlar 27
ekil 4.3. BR tamponu (pH 1-11) ortam nda LAM ve Z DO’nun kare dalga
voltamogramlar (Tarama h : 50 mV/s, Ag/AgCl) 28
ekil 4.4. LAM (A) ve Z DO’nun pik ak n pH ile de imi 28
ekil 4.5. LAM (A) ve Z DO (B)'nun pik ak mlar n frekansla de imi 29
ekil 4.6. LAM (A) ve Z DO (B) bile iklerin 10-4 M CV voltammogramlar ndan
elde edilen log pik ak -log tarama h n karekökü grafi i 30
ekil 4.7. LAM ve Z DO’nun tarama h na kar pik ak 31
ekil 4.8. 10-4 M LAM ve Z DO bile iklerinin 0,1 M BR tamponunda (pH 7,02)
alt n elektrotta farkl tarama h zlar nda al nan dönü ümlü voltammogramlar (Tarama h : 50-500 mV/s, Ag/AgCl )
32
ekil 4.9. LAM ve Z DO'nun farkl konsantrasyonlarda pH 7,02 BR tamponunda
al nan kare dalga voltamogramlar
VIII
ekil 4.10. LAM ve Z DO’nun farkl konsantrasyonlarda al nan kare dalga
voltamogramlar . LAM ve Z DO'nun kalibrasyon grafi i A:LAM , B:Z DO
34
ekil 4.11. LAM ve Z DO'nun kalibrasyon grafi i A:LAM , B:Z DO 34
IX F : Faraday sabiti
C : Konsantrasyon (madde deri imi) E : Uygulanan potansiyel Ep : Pik potansiyeli DE : Biriktirme potansiyeli Dt : Biriktirme süresi t : Zaman r : Kolerasyon katsay
E1 : Puls uygulamas ndan önceki I1 ak n ölçüldü ü potansiyel E2 : Puls uygulamas ndan sonraki I2 ak n ölçüldü ü potansiyel D : Difüzyon katsay , cm2/s p : Yo unluk Au : Alt n Pt : Platin u : Ses h mV : Milivolt WE : Çal ma elektrodu RE : Referans elektrodu SHE : Standart hidrojen elektrotu CE : Kar (yard mc ) elektrot I : Ak m
LOD : Gözlenebilme s LOQ : Tayin alt s
BRT : Britton-Robinson Tamponu LAM : Lamivudin
DO : Zidovudine
DPV : Diferansiyel puls voltametrisi CV : Dönü ümlü voltametri
X SWV : Kare dalga voltametrisi
AdSV : Adsorptif s rma voltametrisi ASV : Anodik s rma voltametrisi KSV : Katodik s rma voltametrisi UV : Ultraviyole
FDA : Amerika Birle ik Devletleri G da ve laç idaresi MS : Kütle spektrofotometrisi
HPLC : Yüksek performansl s kromotografisi TEM : letim elektron mikroskopu
I : Net ak m
XRD : X nlar k m cihaz PGE : Kalem grafit elektrodu
1 1. G
Analitik kimya, ay rma te his ve bir madde numunesindeki bile enlerin ba l
miktarlar n tayiniyle ilgilidir. Kalitatif analiz numunedeki türlerin kimyasal olarak
belirlenmesiyle u ra r. Kantitatif analiz bir veya daha fazla türün ya da analitin ba l miktar say sal olarak belirler. Bir kantitatif analiz yap lmadan önce kalitatif bir bilgi gerekir. Ay rma basama genellikle hem kalitatif hem de kantitatif bir analizin gerekli
bir k sm r (Göver 2011).
Analitik kimyagerler, çe itli inorganik ve organik maddelerin kantitatif olarak tespiti için voltametrik teknikler kullan rlar. norganik, fiziksel ve biyolojik alanda çal ma yapan kimyagerler, çe itli ortamlardaki oksidasyon ve indirgeme süreçleri, yüzeylerde adsorpsiyon i lemleri, elektron transfer ve reaksiyon mekanizmalar , elektron transfer i lemlerinin kineti i ve ta nmas , tür seçimi gibi temel amaçlar için ve çözünmü türlerin termodinamik özellikleri için voltametrik teknikleri tercih ederler.
Voltametri, potansiyelin uygulanmas ndan kaynaklanan ak m ölçümünü ifade eder. Yaln zca iki elektrodu kullanan potansiyometrik ölçümlerin aksine, voltametrik ölçümler üç elektrodlu bir elektrokimyasal hücre kullanmaktad r. Potentiostat aleti ile birlikte üç elektrodun (çal ma, yard mc ve referans) kullan lmas , potansiyel
fonksiyonlar n do ru bir ekilde uygulanmas na ve olu an ak n ölçülmesine izin
verir.
Voltametrik (elektrokimyasal) yöntemler ayr ca farmasötik bile iklerin tayin
edilmesine de uygulan r ve HPLC ile birle tirildi inde de karma k kar mlar n analizi
için etkili araçlar olmay ba ar rlar.
Elektrokimyasal teknikler yüzey de iklikleri için etkili araçlar olabildi i için
çok çözeltiden türün fizikal adsorbe edilmesi, elektropolimerize olmas veya belirli kontrol potansiyeli ile elektrot yüzeyine kovalent olarak ba lanabildi i durumlarda basit deneyler yap labilir. Bu deneylerde baz ilaçlar n özellikleri elektrokimyasal olarak
ara labilir (Kounaves 1997).
Bu çal mada kullan lacak olan baz HIV ilaçlar n etken maddelerinin fiziksel,
kimyasal ve farmakolojik özellikleri ile literatür ara rma sonuçlar ile maddelerin
Esra ÖZGEN
2
1.1. Çal mas Yap lacak HIV laç Etken Maddeler Hakk nda Genel Bilgiler
da elektrokimyasal davran lar incelenen HIV ilaçlar n, aç k formülleri,
tam ve k salt lm adlar ve baz özellikleri verilmi tir. 1.1.1. Lamivudine
Lamivudine (3TC, Epivir), vücudun HIV miktar azaltan bir antiviral ilaç (nam
aidsmap Lamivudine 2017) olup, insan ba kl k yetmezlik virüsü enfeksiyonunu
tedavi etmek için di er ilaçlarla birlikte kullan r (MedlinePlus Lamivudine 2017).
Lamivudine gibi anti-HIV ilaçlar, ba kl k sistemine verilen zarar yava lat r veya
önler ve AIDS'e ba hastal klar geli tirme riskini azalt r. Lamivudine, hepatit B
virüsüne kar da aktiftir (nam aidsmap Lamivudine 2017) ( ekil 1.1).
ekil 1.1. Lamivudine ilac n aç k formülü (yap )
1996 y nda Lamivudine, Avrupa'da di er anti-HIV ilaçlar yla birlikte
kullan ld nda HIV için ruhsatland lm r. BioChem Pharma taraf ndan ke fedildi ve
Glaxo Smith Kline taraf ndan Epivir ticari ad alt nda imal edildi. Lamivudine'in birçok jenerik versiyonu mevcuttur (nam aidsmap Lamivudine 2017).
Lamivudine, GlaxoSmithKline'dan Combivir ticari ismi ile bilinen bir hapta zidovudin ile birlikte formüle edilmi tir. Her Combivir hap nda 150 mg Lamivudine ve 300 mg Zidovudine bulunur. Bu ortak formülasyonun genel versiyonlar da mevcuttur (nam aidsmap Lamivudine 2017).
3 1.1.2. Zidovudine
Zidovudine, HIV enfeksiyonunu kontrol etmeye yard mc olmak için di er HIV ilaçlar yla birlikte kullan r ve ayr ca, ba kl k sisteminizin daha iyi çal abilmesi için
vücudunuzdaki HIV miktar azaltmaya yard mc olur (WebMD 2017) ( ekil 1.2).
ekil 1.2. Zidovudine ilac n aç k formülü (yap )
Zidovudine, GlaxoSmithKline taraf ndan Retrovir markas alt nda üretilmektedir. Retrovir, 1987'de Amerika Birle ik Devletleri G da ve laç daresi (FDA) taraf ndan onaylanm olan HIV enfeksiyonunu tedavi eden ilk ilaçt r. Zidovudine, GlaxoSmithKline'dan Combivir ticari ismi ile bilinen bir hapta lamivudin ile kombine edilebilir (nam aidsmap Zidovudine 2017).
1.2. Voltametri
Voltametri, bir elektrotdaki ak n, elektroda uygulanan gerilimin bir
fonksiyonu olarak ölçüldü ü bir elektrokimyasal tekniktir. Voltametri’nin en yayg n uygulamas analitik amaçlar içindir. Voltametri, elektroaktif olan herhangi bir kimyasal türe, oksitlenmek veya indirgemek için yap labilir (Basic of Voltammetry and Polarography 2017).
Voltametri, potansiyel bir tarama uygulan rken elektro-aktif bile ikler içeren bir
solüsyona bat lm bir elektrot üzerinden akan elektronun ölçülmesine dayanan
analitik bir tekniktir. Bu elektroda çal ma elektrodu denir ve birkaç malzeme ile yap labilir (Protti 2001).
Esra ÖZGEN
4
Voltametri, ara rma amaçl çok yönlü bir tekniktir, elektrokimyasal
reaksiyonlar n çe itli yönlerini, yani elektron al veri inin reaktifler ve ürünler aras nda
yer ald reaksiyonlar ara rmam za izin verir. Bu reaksiyonlar için, çözelti ortam na
dald lan bir elektrot üzerinde uygulanan potansiyelin ak m ba ml yöneten
yasalar incelemek mümkündür. Genellikle bu yasalar t pk redoks reaksiyonlar ve içinde bulundu u ortam gibi çok karma kt r (Protti 2001).
Voltametride, uygulanan potansiyelin etkisi ve redoks ak n davran ,
bilinen birkaç kanunla aç klanmaktad r (Kounaves 1997).
Voltametrik tekniklerin kullan , çe itli elektrokimyasal olaylarla ilgili
yasalar n anla lmas n temelini olu turur ve a daki gibi birçok teknolojik alanlarda
büyük önem ta r:
Korozyona dayan kl malzemelerin ara lmas (korozyon, bir dizi
elektrokimyasal tepkimenin bir sonucudur),
Kimya endüstrisi için yeni elektrodik i lemlerin ara lmas (Örne in;
milyonlarca ton alüminyum, klor, soda, elektrokimyasal reaksiyonlarla üretilmektedir),
zla büyük miktarda enerji depolayan yeni tip piller üretilmesi (Protti 2001).
Tarihsel olarak, voltametri olarak adland rd z elektrokimya dal 1922'de Çek
Cumhuriyeti kimyageri Jaroslav Heyrovsky taraf ndan polarografinin ke finden
geli tirilmi ve 1959 y nda Heyrovsky’e kimya nobel ödülünü kazand rm r
(Kounaves 1997).
lk voltametrik yöntemlerde baz zorluklarla kar la lm , bu da onlar rutin analitik kullan m için ideal olmamaktad r. Bununla birlikte, 1960'larda ve 1970'lerde
voltametrinin tüm alanlar nda duyarl artt ran ve analitik yöntemlerin repertuar
geni leten (teori, metodoloji ve enstrümantasyon) önemli ilerlemeler yap lm r
(Kounaves 1997).
Bütün voltametrik tekniklerin ortak özelli i, bir elektroda bir potansiyel (E)
uygulanmas ve olu an ak n (i) elektrokimyasal hücre boyunca akmas n
izlenmesidir. Birçok durumda, uygulanan potansiyel de ir ya da ak m bir süre (t)
5
boyunca izlenir. Böylece, tüm voltametrik teknikler, E, i ve t'nin bir fonksiyonu olarak tan mlanabilir (Kounaves 1997).
Çe itli voltametrik tekniklerin analitik avantajlar , hem inorganik hem de
organik türler için çok geni , kullan lineer konsantrasyon aral ile mükemmel
hassasiyet içerir (Kounaves 1997).
1.2.1. Voltametrinin Çal ma Prensibi
Voltametrik deneyin yap ld elektrokimyasal hücre, bir çal ma elektrodu
(WE), bir referans elektrot (RE) ve bir kar (yard mc , CE) elektrottan olu ur. Genel olarak bir elektrot, bir yükün aktar labilece i veya etkilerinin hissedilebilece i bir ara yüz sa lar. Bir maddenin bir çal ma elektronunun yüzeyinde, uygulanan potansiyelde indirgenmesi veya oksitlenmesi, yeni maddenin elektrot yüzeyine toplu ta nmas ve bir ak m üretilmesi ile sonuçlan r. lk bak ta çe itli voltametrik teknikler çok farkl görünse de, temel prensipleri ve uygulamalar ayn elektrokimyasal teoriden kaynaklanmaktad r (Kounaves 1997).
1.2.1.1. Çal ma Elektrotu (WE)
Genel amaçl çal ma için tasarlanm çal ma elektrotlar genellikle geni bir potansiyel üzerinde elektrokimyasal olarak inert olan bir metalden yap r.
En çok kullan lan metaller; civa, platin, alt n ve çe itli karbon formlar r.
Kat metaller tipik olarak teflon, cam veya epoksi'den imal edilen kimyasal
olarak inert bir muhafaza ile çevrilmi diskler haline getirilir. S olan civa ise
çözeltiyle temas halinde küresel bir damlac k olarak kullan r (Kounaves 1997). - Civa Elektrot
Damlayan civa elektrotunun sorunlar (metalik civan n dü ük pozitif
potansiyelde bile kolayca yükseltgenebilmesi, damlama süresinin ayarlanmas n
zorlu u, civa buhar n toksit olmas gibi) ortadan kald rmak için 1940’l y llar n
sonunda ba lat lan ve günümüze kadar süren kat metal elektrot çal malar voltametriye
geni bir uygulama alan sa lam r (Baycan 2006, Adams ve ark. 1958, Skoog ve ark.
1996). Kat elektrotlar di er elektrotlara göre daha geni anodik çal ma alan sa larken, baz sorunlara da sebep olabilir. Deney s ras nda elektrot yüzeyine adsorplanm ya da birikmi safs zl klardan dolay kat elektrotlar son derece düzensiz davran gösterirler
Esra ÖZGEN
6
ve bu sebeple elde edilen sonuçlar n tekrarlanabilirli i azal r. Olu an bu sorunu gidermek için kat elektrotlar n yüzeyleri yap lacak her ölçümden önce temizlenmelidir.
Yani ön i lem yap lmal r. Ön i lem her metal için kendine has olmaktad r (Wang ve
ark 1985, Baycan 2006). Kat elektrotlar n kullan ld voltametri, özelikle indirgenme
olaylar na oranla daha az incelenmi olan yükseltgenme tepkimelerindeki rolü fizyolojik
aç dan önemli olan pek çok bile in farmakolojik etki mekanizmalar n
aç klanmas nda da ba ar yla kullan lmaktad r (Lane ve ark. 1976, Baycan 2006). Kat elektrotlar n sözü geçen olumsuzluklar ndan ötürü civa elektrot pozitif potansiyelde tercih edilmektedir.
- Platin Elektrot
Platin elektrot pahal olmas na ra men çal ma elektrotlar aras nda en yayg n
kullan lan elektrottur. Elektrokimyasal aç dan inert olmas aç ndan kolayca i lenmi
bir metal olman n avantaj na sahiptir. Sulu çözücü sistemlerinde pozitif potansiyellerle
çal rken platin çal ma elektrodu iyi bir seçimken negatif potansiyellerde hidronyum
iyonunun azalt lmas ndan dolay iyi bir seçim olmayabilir (Kounaves 1997). - Alt n Elektrot
Alt n elektrot platin elektrot gibi ayn çizgide çal abilecek ekilde dizayn edilmi tir. Alt n platinden daha ucuzdur ama platin elektrokimyasal olarak alt ndan daha inerttir.
Bir alt n elektrot yüzeyi orta derecede pozitif potansiyellerde oksidasyona maruz kal r ve bu nedenle platin kadar yararl olmaz (Kounaves 1997).
- Cams Karbon Elektrot
Cams karbon elektrodun materyali, 1962 y nda ilk defa Yamada ve Sato taraf ndan geli tirilmi tir. nert bir gaz içerisinde fenol formaldehit reçinesinin lmas sonucu cams karbon elektrodunun materyali elde edilir. Cams karbon, di er karbon yap lar ndan farkl fiziksel özellikler ta r. Yüzeyindeki daha ufak gözeneklerinden dolay di er karbon türlerine göre daha çok kullan r. Cams karbon elektrotlarda di er karbon elektrotlarda da oldu u gibi aktivasyonu sa lamak ve tekrar edilebilirlik
sonuçlar olu turmak için baz ön i lemler geli tirilmi tir. Bu i lemler; parlatma
(Rusling 1984, Thorton 1985), kimyasal ve elektrokimyasal i lemler (Taylor ve 1. G
7
Humpffay 1973) radyofrekans (Evans ve Kuwana 1977), dü ük bas nç alt nda s cakl k uygulamas (Stutts ve ark. 1983) vakum s cakl k uygulamas (Fagan Fogan ve ark.
1985) lazer ile uyar lma (Hershenhort ve ark. 1984) ve metal oksit filmlerinin
elekrot yüzeyinde kaplanmas (Cox ve ark. 1988) olarak s fland labilir. Standart bir
aktivasyon i lemi henüz saptanamam r. Bunun nedeni aktivasyon i lemi kullan lan
çözeltiye ve incelenecek maddeye ba olarak de mektedir (Shearer ve ark. 1972,
Özkan ve ark. 2000). Elektron transferi aç ndan aktivasyon i leminin amac (Hu 1985)
yüzeydeki fonksiyonel gruplar n olu turulmas ve yüzey alan n geni letilmesi, yüzey
kirliliklerinin uzakla lmas ve mikropartikül olu umunu sa lamaktad r. Yüzeyde
olu an fonksiyonel gruplar oksidasyon derecesine göre de mektedir. öyle ki; az
oksitlenme olursa hidroksil, kuvvetli oksitlenme olursa karboksil veya kinolik yap lar olu abilir (Baycan 2006).
1.2.1.2. Referans Elektrodu (RE)
Bir voltametri deneyinde çal ma elektrodunun potansiyeli baz standartlara göre kontrol edilir, o da standart referans elektrottur. Potansiyeller basit ekleme veya ç karma ile düzeltilerek SHE’ye kar rapor edilir. En çok kullan lan kalomel ve Ag/AgCI elektrotlar r.
Sulu sistemlerde çal mak için Ag/AgCI referans oldukça popülerdir. Bu
referans elektrot için yar indirgenme reaksiyonu a daki gibidir (Kounaves 1997).
AgCl(s) + e- = Ag(s) + Cl- 1.2.1.3. Kar (Yard mc ) Elektrot (CE)
ki elektrotlu sistemlerde polarlanamayan elektrot yani referans elektrot üzerinden ak m geçti i için yüksek ak mlarda polarlan r. Ayr ca, çözelti direnci yüksek ise bu direnci yenmek için gerekli olan potansiyel (IR) önemli olan bir düzeye ç kar. te bu iki sorundan dolay çal ma elektrodunun polarizasyon potansiyeli hatal okunabilir. Hatal okuma sonucu ak m-potansiyel ( = f(E)) e rileri yat kla r ve bu da piklerin kaybolmas na neden olur. Olu an bu sorunun sistemde giderilmesi için üçüncü
bir elektrotun varl na ihtiyaç duyulur. Ak m çal ma elektrotu ile yard mc elektrot
aras na uygulanan ve de eri zamanla de tirilen potansiyele kar , çal ma elektrotu ile
Esra ÖZGEN
8
kullan lan elektrotlar n soy metal olmalar gerekir. Bundan dolay Pt, grafit ya da tungsten tel çubuklar kullan r (Baycan 2006).
1.3. Voltametrik Analizi Etkileyen Parametreler 1.3.1. Destek Elektrolitin Seçimi
Destek elektrolit olabildi ince saf olmal r. Safs zl k varsa, bunlar n deri imi
analiz deri iminin % 1’ini geçmemelidir (Baycan 2006). Destek elektrolit ve çözücü elektrotla reaksiyona girmemelidir. Bu elektroliti ve çözücüyü seçerken, kullan lacak
analite kar inert olmal r. Ayr ca elektriksel iletkenlik, çözme gücü, vizkozite,
dielektrik sabiti, kolay bulunabilmesi, ucuzlu u ve kolay safla labilir olma gibi
özellikleri de önem arz eder (Çorbac lu 2013).
1.3.2. pH Ayar
Birçok organik molekülün redoks tepkimelerinde proton görev al r. Bundan
dolay ak m-potansiyel ili kileri pH’a ba olur. Bu ba ml n olu turaca
hatalardan kurtulmak için çözeltilerin tamponlanmas gerekir (Baycan 2006). Seçilen
tampon çal ma potansiyel aral daraltmamal r (Çorbac lu 2013).
1.3.3. S cakl k Kontrolü
Tüm voltametrik s r ak m e itliklerinde difüzyon katsay (D) oldu unda
cakl k, ak n iddetini de tirir. S cakl ktaki 1 santigrat derecelik de im, difüzyon
katsay yakla k % 1-2 oran nda de tirir. Bundan dolay çal malar termostatik
ko ullarda yap lmal ve s cakl k 0,5 santigrat derece aral nda sabit tutulmal r
(Baycan 2006).
1.3.4. Oksijenin Uzakla lmas
Geni bir aral kta indirgenme dalgalar olu turmas ve güçlü bir yükseltgen olmas ndan dolay , oksijen voltametrik çal malarda baz sorunlara neden olur. Bunlar;
O2’nin indirgenmesi ek bir faradaik ak m yarat r.
O2’nin indirgenmesine ili kin dalgalar, geni bir potansiyel aral
kaplad ndan, analit dalgalar yla giri im yapar.
Kimi analitler oksijenle tepkime verebilir. Mesela a r metal iyonlar varl nda
metal oksitleri olu ur veya anodik s rma voltametrisinde toplanan metalin
9
yükseltgenmesine neden olur. Bu sak ncalar nedeniyle çal maya ba lamadan önce,
çözünmü oksijenin çözeltiden N2, He, CO2 gibi inert bit gaz geçirilir ve çözünmü
oksijenin ortamdan uzakla lmas sa lan r. Bu inert gaz n geçirilme süresi 2-30 dk
kadard r. Oksijene ait olan bu dalgalar ortamdan tamamen kaybolana kadar i leme
devam edilir. Bazik çözelti ile çal yorsa oksijen sodyum sülfit ile de giderilebilir
(Çorbac lu 2013).
1.4. Voltametrik Yöntemler
1.4.1. Difarensiyel Puls Voltametrisi
Organik ve inorganik türlerin eser miktar n ölçülmesinde son derece kullan
bir tekniktir. Difarensiyel puls voltametrisinde do rusal bir potansiyel art na göre
ayarlanm sabit büyüklükte pulslar (de/dt), çal ma elektrotuna belli bir süre uygulan r. Bu süre içinde iki kez ak m ölçülür. Birincisi, puls uygulanmadan önce tam pulsun
ba lad anda potansiyelde bir art olmadan, ikincisi ise, pulsun bitmesine yak n bir
bölgede ölçülür. Bu iki ak m aras ndaki fark, puls olarak verilir ve böylece uygulanan
potansiyele kar bu ak m farklar n grafi e geçirilmesiyle difarensiyel puls
voltametrisi elde edilmi olur (Çorbac lu 2013, Wang 2000).
DPV, elektroanalitik yöntemler aras ndan en çok kullan lan r. DPV’nin normal
puls voltametrisinden üstün yanlar da vard r. Birincisi, her bir analitin analitik pikleri rahatl kla birbirlerinden ayr labildi i için tek bir voltamogramda birden çok analitin
belirlenebilmesini sa lamaktad r. kincisi ise diferansiyel ak mla çal lmas ve böylece
voltametrik bir pikin elde edilmesiyle analitik duyarl n 5.0×10-8 M’dan 1.0×10-8 M’a
Esra ÖZGEN
10
ekil 1.3. a) Giderek artan bir do ru ak m potansiyeline sabit genlikli pulslar n uygulanmas
b) Diferansiyel puls polarografisinde elde edilen ak m-potansiyel e risi 1.4.2. Kare Dalga Voltametrisi (SWW)
Kare dalga voltametrisinde DPV’de oldu u gibi her bir puls döngüsünde iki defa ak m ölçülür. DPV’den fark ise geri yönde de puls uygulan r. leri yönde uygulanan pulsun biti i ile geri yönde uygulanan pulsun biti inde ak m ölçülür ve net ak m, iki ak m aras ndaki fark olur. Hesaplanan net ak m hem ileri hem de geri yönde uygulanan
pulsun ak ndan daha büyük olacakt r. Bunun nedeni ise ileri yönde uygulanan pulsun
ak (+), geri yönde uygulanan pulsun ak ise (-)’tir. Elde edilen voltammogram yar
pik potansiyeline göre simetrik ak elektroaktif türün deri imi ile do rusal de en bir
grafiktir (Çorbac lu 2013, Wang 2000, Bard 2001).
SWW’nin en büyük üstünlü ü oldukça h zl bir teknik olmas r. H n
yüksek olmas rutin analizlerde zaman tasarrufunun yan nda çal ma elektrotu olarak
damlayan civa elektrot kullan ld nda bir tek damlada ölçüm yap labilirken, ak n
yüksek olmas daha yüksek duyarl a ve daha dü ük alt tayin s na sahip tayin
yöntemlerinin geli tirilmesine olanak sa lamaktad r (Çorbac lu 2013, Ta demir
2001) ( ekil 1.4). 1. G
11 ekil 1.4. Kare dalga voltametri grafi i 1.4.3. Dönü ümlü Voltametri (CV)
Bu yöntemde potansiyel, üçgensel potansiyel döngüsü E1’den E2’ye ileri ve E2’den E1’e geriye do ru do rusal olarak taran rken olu an ak m ölçülür ( ekil 1.5).
er, E2 potansiyeline ula ktan sonra ayn tarama h yla ilk tarama yönüne ters yönde
tarama yap rsa metodun ad dönü ümlü voltametri ad al r. Ters taramada potansiyel
E1’de sonuç verebilece i gibi ba ka bir E3 potansiyeline de götürülebilir. E er ileri taramada indirgenme olmu sa ters taramada yükseltgenme olur.
ekil 1.5. Dönü ümlü voltametri grafi i
CV’de tarama h de tirilerek pik yüksekliklerinin tarama h ile
de mesinden adsorpsiyon, difüzyon ve elektron aktar m reaksiyonuna e lik eden
kimyasal reaksiyon olaylar n varl ve do al yap belirlenebilir. Genelde CV’de
katodik ve anodik yöndeki tarama h zlar e it al r. Sadece h zl homojen kimyasal
tepkimelerde anodik ve katodik tarama h zlar farkl al nabilir (Çorbac lu 2013, Wang
2000) .
Kimyasal ve elektrokimyasal reaksiyonlar n her biri farkl reaksiyon h zlar na ve
tersinirliklerine sahiptir. Bunlar voltamogramlara yans r. Potansiyel aral , tarama h
Esra ÖZGEN
12
elektrot reaksiyonunda dönü ümlü voltamogram al rsa ve voltamogramlar uygun bir
ekilde analiz edilirse elektrot reaksiyonlar ile ilgili bilgi edinilebilir (Turan 2008, Izutsu 2002).
1.4.4. S rma Voltametrisi
rma voltametrisi yöntemleri, eser element analizleri ve tür analizleri için en
etkili elektrokimyasal tekniklerdir. Duyarl n ve seçicili in yüksek olmas n
temelinde yatan neden ise analitin, tayin edilmeden önce biriktirilmesi ve hem
biriktirmenin hem de tayinin kontrol edilebilir elektrokimyasal süreçler olmas r.
Al lm polarografik çal man n aksine, s rma voltametrisi ile elde edilen tayinler,
genel olarak 10-3 ile 10-5 mol/L aras nda daha duyarl r ve bu nedenle de tayin
rlar , 10-9 ile 10-11 mol/L seviyesindedir ve kimi durumlarda 10-12 mol/L seviyesine
ula r. Buna göre s rma yöntemleri, en hassas aletli analiz yöntemlerinden biridir; ayn
zamanda elde edilen ölçüm de erlerinin do rulu u aç ndan da di er eser element
analiz tekniklerinden üstün özelliklere sahiptir. Kab n de tirilmesine gerek kalmadan
hem biriktirmenin hem de tayinin ayn elektrotta gerçekle mesi nedeniyle kontaminasyon veya buharla ma sebebiyle olu acak sistematik hatalar n görülme
olas oldukça dü ük bir seviyede tutulabilir. S rma ifadesi, tayin esnas nda biriken
ürünün çal an elektrottan ayr lmas ifade eder. Bu süreç, voltametrik olarak ya da
kronopotansiyometrik olarak yap labilecek olup s rma voltametrisi ve s rma
kronopotansiyometrisi olarak ifade edilir. Birikme her zaman sabit potansiyelde (Eacc, biriktirme potansiyeli), dura an civa damlas , civa film, grafit veya metal elektrotunda ve kontrollü bir süre içerisinde (tacc, biriktirme süresi) gerçekle ir. Analit; metal olarak, eser miktarda çözünebilir civa bile imi olarak ya da kompleks bile imi olarak elektrolitik olarak tortula r. Biriken analit türlerinin, çal an elektrottan ayr lmas , di er
bir de le as l tayin ad , yükseltgenme ve indirgenme sürecine dayal r. Analitin,
amalgam olarak civa damlas ya da civa film elektrotunda birikti i al lm durumlarda,
tayin birikme sürecinin tersidir, bu nedenle de süreç invers voltametri olarak ifade edilir (Gençda 2013, Henze 2003).
13
1.4.4.1. Anodik S rma Voltametrisi (ASV)
Baz metaller çal ma elektrodu ile bir amalgam olu turur ve baz anyonlar
bununla çözünmez tuzlar olu turur. S rma voltametresi bu özelliklere dayanmaktad r.
Teknik iki ana a amay izlemektedir:
Analitin elektrot üzerine önceden konsantrasyonu
Kümülatif bile in elektrot üzerine çözeltiye do ru ard k olarak s yr lmas
rma, ola an tekniklerle yap lan bir tarama s ras nda (do rusal veya diferansiyel darbeli veya kare dalga tarama) gerçekle ir. Normal çal ma elektrodu damlama (veya film) civa ve en s k kullan lan teknik elektroda bir negatif potansiyelin
uyguland ve katyonlar n civa içine metalik atomlar halinde bo alt ld anlam na
gelen anodik s rma yöntemidir (Protti 2001).
Ard ndan potansiyelin anodik taranmas s ras nda metal atomlar tekrar oksitlenir. Potansiyelin taranmas s ras nda, ak m ölçülür ve çizilir, sonuçta ortaya ç kan voltamogram, zirve eklinde bir grafiktir. Bu zirvenin konumu ve iddeti analitin türüne
ve konsantrasyonuna ba r (Protti 2001).
ASV, iz metal tayini için en yayg n kullan lan ve trilyonda bir aral kta pratik bir
tespit s vard r. Bu dü ük alg lama limiti, nispeten pahal olmayan enstrümantasyonu
kullanarak dört ila alt eser metal tespit etme kabiliyeti ile birle tirilir (Kounaves 1997). Numune solüsyonundaki metal iyonlar , yeterli bir negatif potansiyelin uygulanmas yla belirli bir süre boyunca bir civa elektroduna konsantre edilir. Bu birle tirilmi metaller daha sonra uygulanan potensiyeli pozitif yönde tarayarak civadan
yr r (oksitlenir). Ortaya ç kan tepe ak mlar ip, örnek çözeltideki her bir metalin
konsantrasyonu ile orant r ve her metal için spesifik olan tepe potansiyelinin
pozisyonu Ep'dir. Civa elektrot kullan , ASV'nin çal ma aral SCE'ye göre
yakla k 0 ila -1.2 V aras nda s rlar. nce Hg filmlerin veya Hg mikroelektrodlar n
kare dalga voltametri gibi at m teknikleriyle birlikte kullan lmas , ASV'nin saptama limitlerini önemli ölçüde dü ürebilir (Kounaves 1997).
Numunede birden fazla metal iyonu oldu unda, ASV sinyali bazen Zn-Cu gibi intermetalik bile iklerin olu mas yla karma kla abilir. Bu, ilgilenilen metaller için
Esra ÖZGEN
14
zaman ayarlayarak veya çökelme potansiyelini de tirerek önlenebilir (Kounaves
1997).
1.4.4.2. Katodik S rma Voltametri (KSV)
KSV, cival iyonla çözünmeyen tuzlar olu turan maddeleri belirlemek için kullan labilir. Bu tür maddeleri içeren bir çözeltide civa elektroduna nispeten pozitif bir potansiyelin uygulanmas civa elektrodunun yüzeyinde çözünmeyen bir filmin olu umuyla sonuçlan r. Negatif yönde gerilim bir tarama daha sonra çökelmi filmi çözeltiye indirgeyebilir ( eritte b rakacakt r). Bu yöntem halojenürler, selenit ve sülfür
gibi inorganik anyonlar ve MoO4-2 ve VO5-3 gibi oksidasyonlar belirlemek için
kullan lm r. Buna ek olarak, nükleik asit bazlar gibi birçok organik bile ik de
çözünmez civa tuzlar olu turur ve CSV taraf ndan belirlenebilir (Kounaves 1997). Civa üzerindeki anyonlar n analizi ters bir ekilde gerçekle ir: ilk civa kendini oksitleyip anyon ile çözünmeyen bir tuz olu turur ve sonra katodik bir tarama uygulayarak civa kendisini dü ürür ve anyon çözeltiye geri gelir (Protti 2001).
1.4.4.3. Adsorptif S rma Voltametrisi (ASV)
AdSV, anodik ve katodik s rma yöntemlerine oldukça benzer. Birincil fark,
analitin ön konsantrasyon ad n, elektrot yüzeyinde adsorpsiyon veya elektroliz
yoluyla birikim yerine, kimyasal olarak modifiye edilmi elektrotlardaki spesifik reaksiyonlarla gerçekle tirilmesidir. Birçok organik tür (heme, klorpromazin, kodein ve kokain gibi), AdSV'yi kullanarak mikromolar ve nanomolar konsantrasyon seviyelerinde belirlenmi tir; norganik türler de tespit edilmi tir. Adsorbe edilen türleri konsantrasyona orant olarak amplitüd ile pik eklinde bir voltametrik tepki vermek üzere negatif veya pozitif yönde DPV veya SWV gibi bir voltametrik teknik kullanarak nicelle tirilir (Kounaves 1997).
15 2. ÖNCEK ÇALI MALAR
Devunuri ve ark. (2016) yapt klar çal mada, çe itli deri imlerdeki Emptrisitabin ve Lamivudin isimli iki ilac n sulu çözeltileri için yo unluk ( ) ve ses h (u) verileri
ölçülmü tür. Ara rmac lar, sonsuz seyrelti belirgin moleküler genle ebilirlik (E ),
sonsuz seyreltmede (V ) belirgin molar hacim verilerinden hesaplanm ve ilaçlar n
yap ve k lma kabiliyeti deneysel ko ullarda analiz edilmi tir. laçlar oda
cakl nda 48 saat boyunca vakum desikatörlerde P2O5 üzerinde kurutulduktan sonra
kullan lm r. Sulu solüsyonun haz rlanmas için, taze dam lm , gazdan ar nd lm
su kullan lm ve sulu solüsyonlar, oda s cakl nda 0.01 ila 0.25 mol.kg-1 aras nda bir
deri im kütle esas na göre haz rlanm ve atmosferik nemin emilmesini en aza
indirgemek için hava geçirmez elerde tutulmu tur.
Leonardo ve ark. (2010) Zidovudine (AZT), antiretroviral etkili i nedeniyle HIV
hastalar n tedavisinde yayg n olarak kullan lm lard r. laçlarda AZT'nin belirlenmesi
için, voltametri kullan larak alternatif bir analitik metodoloji geli tirilmi tir. AZT’nin as civa elektrod (HMDE)’da indirgenmesi pH 8.0'da -0.96 V'da yer almaktad r.
Tarama h (20 mV/s), genlik (50 mV), destek elektrolitin niteli i (fosfat tamponu) gibi
elektroanalitik parametrelerin etkisi ve voltametrik sinyal üzerindeki pH (8.0)’ optimize edilmi ve bu optimum ko ullar alt nda, AZT zirve ak m deri imi 0.25’den 1.25 mg/L
(1 ila 5 uM)’e kadar do rusal olarak de irken, s ras yla 0.0025 ve 0.025 mg/L’nin
belirleme s rlar ve % 0.95'lik bir göreceli standart sapmas ile % 99.88 oran nda
iyile me elde edilmi tir.
Prasad ve Singh (2017) yapm olduklar çal mada, gerçek örneklerde, anti-HIV ilaçlar ‘Lamivudin ve Zidovudini’ alg lamak için moleküler bask polimer bazl çekirdek-kabuk (kat ve oyuk) kur un kalem grafit elektrodun imalat için yeni, basit ve kolay bir yöntemi tan mlam lard r. Bunun için, bir bask polimer içi bo çekirdek
kabuklar n yan s ra modifiye edilmi kat lar elde etmek için vinillenmi silis
nanosferlerin yüzeyinde geli tirilmi tir. Çal mada, hem modifiye edilmi hem de içi
bo çekirdek kabuklar n ba lanma ve elektrod kineti i aç ndan analit difüzyonu
aç ndan ilgili elektrodikler s ras yla, dönü ümlü voltametri ve diferansiyel puls anodik rma voltametrisi yöntemleri ile bir ferrosiyanür deneyi kullan larak
Esra ÖZGEN
16
prob/analit moleküllerinin tek tarafl difüzyonunu geli tirirken, içi bo çekirdek kabuklar moleküler bo luklara kar iki tarafl difüzyonlar ndan dolay nispeten daha iyi
oldu unu bulduklar ifade etmi lerdir. Seçilen elektroaktif hedeflerin dolayl olarak
tespit edilmesi için, bask içi bo çekirdek-kabuk modifiye elektrot kullan larak
lamivudin ve zidovudin için belirleme s s ras yla 2.23 ve 1.26 (sulu örnekler), 2.45
ve 1.88 (kan serumu) ve 2.52 ve 1.77 ng/mL (farmasötikler) bulunmu tur.
Farias ve ark. (2012), mikromolar konsantrasyon seviyesinin alt nda Lamivudin
belirlemek için s rma yöntemi belirlemi lerdir. Bu yöntem yüzeydeki türlerin
ölçümünde do rusal dönü ümlü taramal voltametri tekni i kullan larak ince film civa
elektrotta lamivudin’in kontrollü adsorptif birikine dayal r. Optimum deneysel
ko ullar; 2x10-3 mol/L NaOH çözeltisi (destek elektrolit), biriktirme potansiyeli -0.40
V, tarama h 100 mV/s olarak belirlenmi tir. Lamivudin cevab 0.01-0.14 ppm deri im
aral nda do rusald r. 4 dk’l k biriktirme zaman nda, tayin s 0.13 ppb (5.7x10-10
mol/L) olarak bulunmu tur. Lamivudin’i ölçmek için daha uygun yöntemler; didanozin,
asiklovir, nevirapin, efavirenz ve zidovudin varl nda ara lm r. Metodun faydas
ATP yada DNA ile birlikte lamivudin varl göstermi tir.
Sing ve ark. (2010) çal malar nda, Lamivudin’in (anti-retro viral ilaç)
elektrokimyasal davran damlayan civa elektrotta ara rm lard r. Bile ik, iyi
belirlenmi geri dönü ümsüz bir dalga sergilemi tir. ndirgenme id’nin h1/2’ye kar do rusal çizimlerinden difüzyon kontrollü olarak belirlenmi tir. ndirgenme mekanizmas ve konsantrasyon etkisi, pH, farkl tamponlar ve s cakl k parametreleri ile incelenmi tir. E im de erleri pikin geri dönü ümsüz oldu unu göstermi ; bu nedenle kinetik parametreler (Kofh, n) Meites- srail ve Gavr-Bhargava’n n yöntemi kullan larak
de erlendirilmi tir. Termodinamik parametreler ( Hp, Hv, G, S) 15 ve 40 oC
aras nda belirlenmi tir.
Lamivudin (3TC olarak da bilinir), varsay lan aktif metabolit lamivudin trifosfatta hücre içi fosforilasyona u rayan bir dideoksinükleozid analo udur. Lamivudin trifosfat viral ters transkriptaz rekabet yoluyla inhibe ederek HIV
yinelenmesini önler. Lamivudin, antiretroviral aktivitesi nedeniyle HIV hastalar n
tedavisinde yayg n olarak kullan lmaktad r. Farmasötiklerde Lamivudin’in saptanmas için voltametri kullan larak analitik bir metodoloji geli tirilmi tir. Lamivudin, damlayan 2. ÖNCEK ÇALI MALAR
17
civa elektrotta (HMDE) -1.6 V vs Ag/AgCl potansiyelde pH 2’de indirgenmi tir.
Tarama h (20mV/s), amplitüd (50mV), destek elektrolitin niteli i (Clark-Lubs) ve pH
(2.0) gibi elektroanalitik parametrelerin voltametrik sinyal üzerindeki etkisi optimize edilmi tir. Bu optimize edilmi ko ullar alt nda, yöntem farmasötik formülasyonlar
kullan larak do rulanm r. Lamivudin pik ak , 1.15 ila 10.40 mg/L konsantrasyon
aral nda tayin ve belirleme s rlar s ras yla 0.46 ve 1.0 mg/L ve % 1.10’luk göreceli
standart sapma ile % 95.15’lik geri kazan m lineer olarak de mi tir (Leandro ve ark.
2013).
Abdel-Gawad ve ark. (2013) çal malar nda, Lamivudin ve Dothiepin Hidroklorürün belirlenmesi için basit ve do ru bir potansiyometrik titrasyon metodu geli tirmi tir. Bu amaçla, iki bromoimid, bromosüksinimid (NBS) ve N-bromoftalimid (NBP) asidik ortamda iki ilac n belirlenmesi için titrant olarak
kullan lm r ve platin indikatör kullan larak dönüm noktas belirlenmi tir. Metod, saf
ve farmasötik preparatlardaki iki örne in belirlenmesi için ba ar bir ekilde
uygulanm r. Bu örneklerdeki lamivudin ve dothiepin hidroklorür için s ras yla
ortalama geri kazan m % 99.67-100.10 ve % 99.55-100.33 ve göreceli standart sapmalar (RSD) % 0.16-0.38 ve % 0.29-0.58 olarak belirlenmi tir.
Zidovudin (ZDV), HIV virüsü enfeksiyonunun tedavisi için onaylanm bir ilaçt r. Bu ilac n tespiti ve belirlenmesi istenmeyen yan etkileri nedeniyle insan serumunda çok önemlidir. Yeni bir ZDV sensörü, cams karbon elektrot üzerinde immobilize çok duvarl karbon nanotüp (MWCNTs) ve gümü nanofilm (Ag-NF)’den olu an nanokompozit temelinde imal edilmi tir. Modifiye elektrotlar; taramal elektron
mikroskopu (SEM), enerji da X- spektroskopisi (EDS), X- k
(XRD), dönü ümlü voltametri (CV) ve do rusal tarama voltametrisi (LSV) teknikleriyle karakterize edilmi tir. Sonuçlar; elektro-birikimli gümü ün nanofilm yap ya sahip oldu unu ve dahas ileri elektrokimyasal çal malar haz rlanan nanokompozitin yüksek elektrokatalitik etkinli e sahip oldu unu ve sensörlerde kullan m için uygun oldu unu göstermi tir. Optimum artlar alt nda amperometrik teknik, ZDV’nin 0.1 ila 400 ppm
konsantrasyon aral nda 0.04 ppm belirleme s ve iyi hassasiyetle tespiti için
kullan lm r. Haz rlanan sensör ZDV için do ru ve h zl tepki vermi ve gerçek
Esra ÖZGEN
18
Do an ve ark. (2005), Lamivudin, insan immün yetmezlik virüsü-tip 1 (HIV-1) ve Hepatit B virüsü (HBV)’ne kar aktiviteye sahip bir sentetik nükleosid analo udur. Bu çal man n amac , serum ve farmasötik formülasyonlarda LAM’ damlayan civa elektrot (HMDE) kullanarak elektrokimyasal yöntemlerle belirlemek olmu tur. Bu elektrot üzerinde LAM, pik potansiyeli Ep -1.26 V (vs. Ag/AgCl/3 M KCl) civar nda
geri-dönü ümsüz indirgenmeye u ram r. ndirgenme LAM sinyalleri dönü ümlü
voltametri, diferansiyel puls voltametri ve kare dalga voltametri teknikleriyle ölçülmü tür. pH 4.5’de asetat tamponunda LAM’ n belirlenmesi için DPV ve OSW
teknikleri (her iki yöntem içinde destek elektrolit ortam nda 4x10-6 ila 1x10-4 M
konsantrasyon aral nda) önerilmi tir. Do rusal cevap, her iki teknik için pH 4.5’de
serum örneklerinde 2x10-6 ila 2x10-4 M konsantrasyon aral nda asetat tamponunda
elde edilmi tir. Tüm ortamlarda yöntemlerin yinelenebilirlik ve tekrarlanabilirli i
belirlenmi tir. Serumda standart ekleme yöntemi kullan lm r. Hassasiyet ve do ruluk
tüm ortamlarda kontrol edilmi tir. Serumda endojen maddelerden hiçbir elektroaktif
giri ime rastlanmam r. Yüksek dozlar ve LAM’ n k sa yar -ömrünün yan etkileri
aç ndan h zl ve basit bir tespit yöntemi bu çal mada tan mlanm r.
Ji ve ark. (2010), insan plazmas nda lamivudinin belirlenmesi için h zl , hassas ve seçici bir metodu hidrofilik etkile im kromatografisi-MS/MS kullanarak geli tirmi lerdir. Bu metod, örnek haz rlama prosedürü olarak asetonitril ile protein
çöktürme i lemine kat lm r. Lamivudin ve famotidin (iç standart) bir Luna hidrofilik
etkile im kromatografi kolununda, asetonitril/10 mM amonyum format (95:5, v/v) mobil faz ile ve elektrosprey iyonizasyo kütle spektrometresi kullan larak analiz
edilmi tir. Standart e risi 50-3000 ng/mL konsatrasyon aral nda (r2: 0.9985) lineer
bulunmu tur. Belirleme alt s 50 mL plazma örne inde 50 mg/mL’dir. Gün içi ve
günler aras için varyasyon katsay ve göreceli hata, dört kalite kontrol seviyesinde
ras yla 2.1-7.5 ve % 4-3.3’tür. Lamivudin ve famotidin için mutlak ve göreceli matris
etkilerinin pratikte olmad tespit edilmi . Mevcut yöntem erkek sa kl gönüllülere
oral yoldan lamivudin (100 mg/tablet) verilerek, lamivudinin farmakokinetik
çal mas na ba ar yla uygulanm r.
Kumar ve ark. (2013), seçici ve hassas yüksek performansl s
kromatografisi-tandem kütle spektrometresi yöntemini insan plazmas nda e zamanl olarak zidovodin (ZDV), lamivudin (3 TC) ve nevirapin (NPV) belirlenmesi için geli tirmi lerdir. Kat 2. ÖNCEK ÇALI MALAR
19
faz ektraksiyonundan sonra analitler ve ISTD’lar enjeksiyon hacmi 3 µL ve çal ma
süresi 3 dk seçilerek Peerless Basic C18 kolununda çal lm r. zokratik mobil faz %
0.1 formik asit su:metanol (15:85, v/v) pozitif kütle spektrometresi tespiti ile
kullan lm r. Yöntem, ZDV ve 3TC için 5-1500 ng/mL konsantrasyon aral nda ve
NPV için 10-3000 ng/mL konsantrasyon aral nda do rulanm r. Gün içi ve günler
aras , kesinlik ve do ruluktan olu an 4 validasyon parametresi s ras yla % 1.6-10.1 ve % 93.8-110.8 bulunmu tur.
Dube ve Vyas (2009) çal malar nda lamivudin ve silymarin’i e zamanl belirlemek için yeni, basit, h zl ve hassas spektrofotometrik yöntem geli tirmi lerdir. Metod, 270.9 ve 326.4 nm iki analitik boyu kullan larak e zamanl denklemin olu umu ve çözülmesi bulunmu tur. Her iki ilaç da bu yöntem için, Beer kanununa göre istenilen
konsantrasyon aral ndad r. Önerilen yöntemin do rulu u ve tekrarlanabilirli i geri
kazan m çal malar yla istatiksel olarak do rulanm r. Yöntem h zl , hassas ve do ru
bulunmu tur ve ilaçlar n rutin tahmini için laboratuarda kolayl kla uygulanabilece i belirtilmi tir.
Reddy ve ark. (2012) yapt klar çal mada, ticari dozda zidovudinin belirlenmesi için basit, hassas ve ekonomik bir spektrofotometrik yöntem geli tirmi lerdir. Yöntem, kloroform içinde h zl ekstrakte edilebilen mavi renkli zidovudin kompleksin olu umuna dayanmaktad r. Ekstrakte edilebilen iyon çifti kompleksinin maksimum absorbans kör reaktife kar 590 nm maksimum absorbans gösterdi i dalga boyunda ölçülmü tür. statiksel analizler zidovudinin toplu ilaç ve onun tablet dozaj formunda
belirlenmesi için önerilen metodun tekrarlanabilir ve seçici oldu unu kan tlam r.
D’Avolio ve ark. (2011), HIV + hastalar için periferik kan mononükleer hücrelerinde (PBMC'ler) PBMC'lerdeki 14 antiretroviral ilac n, tek kütle spektrometresi
bulgusu ile birle tirilmi s kromatografi ile e zamanl tespiti için analitik bir
yöntemin geli tirilmesini ve geçerlili ini aç klamaktad rlar. PBMC'ler, Ficoll yo unluk
gradyanl santrifüjleme ve hücre say ile izole edilmekte ve ba l ortalama hacim, bir
Coulter® cihaz ile gerçekle tirilmektedir. Ara rmac lar, kromatografik ayr lmalar ,
mobil faz A olarak su (% 0.05 formik asit) ve mobil faz B olarak asetonitril (% 0.05
formik asit) olarak kar ile bir gradyan program kullan larak gerçekle tirmi ler ve
Esra ÖZGEN
20
(tipranavir için 1-320 ng/mL) aras nda de en konsantrasyonlarda ve 1/X a rl kl
ikinci dereceden bir regresyon modeline uyarlanm ekilde kullan larak
olu turmu lard r. Analit tayini elektrosprey iyonizasyon-tek kuadrupol kütle spektrometresi ile seçilen iyon kay t (SIR) alg lama modu kullan larak
gerçekle tirilmi tir. Ara rmada uygulanan yöntem, % 2.6-14.8 aral nda intra/gün içi
standart sapma aral nda ve % -7.85 ile + % 9.7 nominal de erler aras ndaki yüzde
de im katsay (CV %) ile do rulanm ve de erlendirilen her ilaç konsantrasyonu
ng/mL cinsinden ifade edilmi ve her bir hasta orta korpuskol hacmi ve hücre say
kullan larak optimize edilmi tir. Sonuç olarak ara rmac lar, antiretroviral hücre içi
farmakokineti ini daha güvenilir bir ekilde anlayabilmek için bireysel MCV ile birlikte bir LC-MS sistemi kullanarak PBMC'de PI'lar, NNRTI'ler ve RGV'nin rutin olarak belirlenmesi için niceliksel bir deneyi tamamen do rulam lard r.
21 3. MATERYAL ve METOT
3.1. Materyal
3.1.1 Kullan lan Kimyasal Maddeler
Bu çal mada kullan lan kimyasal maddeler a da sunulmu tur:
- Asetik asit (CH3COOH) ve temin edildi i firma merck ve safl % 99,50
- Borik asit (H3BO3) ve temin edildi i firma merck ve safl % 99,50 - Fosforik asit (H3PO4) ve temin edildi i firma merck ve safl % 85
- Sodyum hidroksit (NaOH ) ve temin edildi i firma merck (yüksek safl kta) olarak belirlenmi tir.
3.1.1. Kullan lan Cihazlar
Deneysel çal malar için kullan lan dönü ümlü voltametri, diferansiyel puls ve kare dalga yöntemlerinin tüm deneyleri, GAMRY INSTRUMENTS Reference 3000 Potentiostat / Galvanostat / ZRA cihaz nda gerçekle tirilmi tir ( ekil 3.1).
Bioanalytical Systems (BAS) Model Cell Stand C3 hücre stand kullan lm r. Bu
cihazda Gamry Framework, Echem Analyst, PHE200 Physical Electrochemistry System
(Diferansiyel Puls Voltametri, Karedalga Voltametri) gibi yaz mlar kullan lm r.
Çal mada BAS Model MF–2072 Au (1.6 mm dia) çal ma elektrodu, platin tel (Pt) yard mc elektrot, sulu ortamlarda referans elektrot olarak Ag/AgCl (BAS model MF
2052) (BAS model MF 2062) referans elektrot olarak kullan lm r. Pozitif
potansiyellerde gerçekle en yükseltgenme olaylar n incelenmesi gerekti inde elektrot
çal ma penceresinin buna izin vermesi, ba ka bir deyi le elektrot malzemesinin anodik çözünmesinin daha pozitif potansiyelde olmas gerekir. Alt n elektrot bu özelli e sahip oldu undan kullan lmas tercih edilmi tir.
Ortam n pH’n ölçmek için Ecosan (hand-held series) Marka pH metre
kullan lm r. Çal ma elektrotlatlar n temizli i, ULTRASONIC CLEANER
VGT-1860QTD model sonikatörde yap lm r. Kullan lan saf su Protech MP MINIPURE
Esra ÖZGEN
22
ekil 3.1. GAMRY INSTRUMENTS REFERENCE 3000 Potentiostat / Galvanostat / ZRA 3.1.3. Kullan lan Teknik ve Elektrotlar
Bu çal mada Kare dalga voltametrisi (SWW), Dönü ümlü voltametrisi (CV) ve
Diferansiyel puls voltametrisi (DPV) teknikleri kullan lm r.
Elektrokimyasal ölçümler üçlü elektrot sistemiyle yap lm r. Kar t elektrot olarak platin tel, referans elektro olarak Ag/Ag+ elektrodu ve çal ma elektrodu olarak da Alt n (Au) elektrotlar kullan lm r.
3.2. Metot
3.2.1. Alt n Elektrodun Temizlenmesi
Elektrokimyasal çal malara ba lamadan önce çal ma elektrodunun temizlenmesi ve elektrot yüzeyinin parlat p, düzgünle tirilmesi gerekir. Bunun için
alt n elektrot önce z mpara kâ tlar ile temizlenmi tir. Z mpara kâ olarak 4000’lik
Buehler z mpara kâ tlar kullan lm r. Sonra elektrot saf su ile y kanm ve alümina
tozlar ile i leme tâbi tutulmu tur. Deneylerde 3 farkl boyutta alümina tozu
kullan lm r. Bunlar, s ras yla 1,0 µm, 0,3 µm ve 0,05 µm tanecik boyutlar na sahiptir.
Her alümina tozu ile temizleme ve parlatma i leminden sonra farkl boyuttaki toz
tanecikleri birbirine kar mas n diye elektrot yüzeyi saf su ile y kanm r. En son 0,05
µm tanecik boyutuna sahip alümina tozu kullan ld ktan sonra elektrot önce saf suda 10 dakika sonikasyon i lemine ve daha sonra da asetonitril ve izopropil alkolün 1:1
23
oran ndaki kar nda tekrar sonikasyon i lemine tâbi tutulmu tur. Bu parlatma ve
temizleme i lemleri ile daha önce modifiye edilmi elektrot yüzeyindeki moleküller
yüzeyden uzakla lmaktad r. Ayr ca yüzeye adsorbe olmu organik ve inorganik
kirlilikler giderilerek modifikasyon için temiz ve parlak yüzeyler elde edilmektedir.
Bunun yan ra tek tabaka olu umuna uygun düzgün yüzeyler elde edilmektedir.
Çal ma elektrotlar n yeterince temizlenip temizlenmedi ini ve sulu ortam referans
elektrotlar n ölçümlerinin ne derece do ru oldu unu kontrol etmek üzere; sulu
ortamda 1 mM Hekzasiyanoferrat (III) çözeltisi ile negatif tarama yap larak yüzey
testleri yap lm r. Bu i lem elektrot kalibrasyonu olarak adland r ve çal mada
belirli aral klarla tekrarlanm r. 3.2.2. Stok Çözeltiler
LAM (10-3 M) ve Z DO (10-3 M) stok çözeltileri metanol içinde haz rland .
LAM ve Z DO için kalibrasyon çözeltileri 5,7x10-9 – 9,12x10-8 M konsantrasyon
aral nda BR tamponunda (pH 7,02) seyreltilerek haz rlanm r.
BR tamponu 2,29 mL asetik asit, 2,69 mL % 85’lik fosforik asit ve 2,472 g borik
asit kar p su ile hacmi litreye tamamlanm r. 5M NaOH ile pH 1,81-11,98
aras nda ayarlanm r.
3.2.3. Farmasötik Örnekler
2 farmasötik örnek Glaxo SmithKline Pharm. Ind., stanbul / Türkiye taraf ndan üretilen Zeffix (100 mg tablet) ve Retrovir (250 mg tablet) analiz edilmi tir.
3.2.4. Ticari Örneklerin Analizi
Tablet analizi için 10’ar tablet (Zeffix ve Retrovir tablet) do ru bir ekilde
tart ld ktan sonra toz haline getirilmi ve kar lm r. 1 tablete e de er iletkenlik 0,1
M BR tamponunda (pH: 7,02) 100 mL’lik balona al narak 20 dk sonike edilmi ve 100
mL’ye tamamlanm r. Daha sonra 0,45 µm’lik membran fitreden süzülmü tür.
Süzüntü içindeki LAM ve Z DO 25 mL’lik balonlara al narak seyreltilmi tir. Tablet örneklerini içeren nihai çözeltilerin bir k sm , LAM ve Z DO’nun voltammogramlar
Esra ÖZGEN
24 3.2.5. Uygulanan Yöntem
Öncelikle çal lan ilaç etken maddelerin (LAM ve Z DO) çözünürlü ü
ara ld ve seçilen çözücülerde günlük 1x10-3 mol L-1’lik stok çözeltileri haz rland . Britton-Robinson tamponu, asetat tamponu ve fosfat tamponu çözeltisi gibi destek elektrolit çözeltileri haz rlanarak, tampon çözeltilerin pH ayarlamalar yap ld . Haz rlanan destek elektrolit çözeltilerinde yükseltgenme özelli i; kare dalga
voltametrisi ve dönü ümlü voltametri teknikleri ile incelendi. Pik ak na kar pH
etkisi ara ld ve bulunan deneysel sonuçlara göre, çal ma ortam belirlendi. Seçilen
çal ma ortam nda; her iki bile en için pik ak n tarama h yla de imi dönü ümlü
voltametri tekni i ile incelendi. Elde edilen CV sonuçlar na göre, tarama h n
karekökü ile pik ak ( 1/2-ip); tarama h ile pik ak n logaritmik (log –log ip
de im grafikleri çizilerek, bu grafiklerin e imlerinden ak m türü belirlendi. Akabinde
kare dalga voltametrisi tekni i ile örneklerin konsantrasyon-pik ak de imi
incelendi. Elde edilen sonuçlara göre kalibrasyon grafi i çizilerek, do rusall n
gözlendi i deri im aral belirlendi. Konsantrasyon aral nda deneyler üç kez
tekaraland . Bu tekrarlardan elde edilen sonuçlara göre; standart sapma de eri (SS)
hesapland . Bu de er uygun e itliklerde kullan larak, belirme s ve kantitatif tayin
alt s tespit edildi. Yöntemin geçerlili i için; LAM ve Z DO içeren ticari
tabletlerden LAM ve Z DO’nun geri kazan m çal mas yap ld . Ek olarak, bir tabletteki LAM ve Z DO miktar belirlendi.
25 4. BULGULAR ve TARTI MA
4.1. LAM ve Z DO’nun Çözünürlü ünün Tespiti
LAM ve Z DO’nun, deiyonize su, asetonitril ve metanol gibi de ik
çözücülerdeki çözünürlü ü ara ld . LAM ve Z DO metanolde kolayca çözündü.
Metanolde stok çözeltileri haz rlanan LAM ve Z DO farkl pH’lara BR tamponu
kullan larak seyreltildi. Haz rlanan de ik deri imlerde ve de ik destek elektrolitleri
içerisindeki LAM ve Z DO çözeltilerinde % 10 metanol oran sürekli sabit tutulmu tur. 4.2. Lamivudine ve Zidovudine Elektrokimyasal Davran
10-5 M Lamivudine (LAM ) ve Zidovudine (Z DO) elektrokimyasal davran
0.1 M BR tamponunda alt n elektrot kullan larak dönü ümlü voltametri tekni i ile
sa lanm r. LAM için -0.6/+0.7 V, Z DO için +0.1/+1.5 V potansiyel aral nda 50
mV/s sabit tarama h nda sulu ortamda CV tekni i kullan larak yüzey taranm r. Sulu
ortam olarak farkl pH’larda (pH: 1-11) haz rlanm ve BR Tamponu tercih edilmi tir.
ekil 4.1’de her iki maddenin de voltammogramlar n geri-dönü ümlü oldu u
Esra ÖZGEN
26
ekil 4.1. 10-4 M LAM ve Z DO bile iklerinin 0,1 M BR tamponunda (pH 7,02) alt n elektrotta al nan dönü ümlü voltammogramlar (Tarama h : 50 mV/s, Ag/AgCl )
LAM ’nin dönü ümlü voltametrik davran 0,1 M BR tamponunda (pH 7,02)
incelendi inde +0,25 V’da LAM ’nin yükseltgenmesine, -0,08 V’da ise LAM ’nin
indirgenmesine ait pik gözlendi ( ekil 4.1 A). Ayn ekilde Z DO’nun 0,1 M BR
tamponundaki voltametrik davran incelendi inde benzer pikler elde edildi. Bu
ortamda anodik pik +1,32 V’da, katodik pik ise +0,72 V’da gözlendi. Anodik pikler yayvan oldu undan diferansiyel puls voltametrisinde katodik pikler kullan ld . LAM ’nin yap daki C=O grubu üzerinden, Z DO’nun ise N N grubu üzerinden elektrokimyasal olarak indirgendi i literatür çal malar na dayan larak dü ünülmektedir.
4.3. Destek Elektrolit ve pH Etkisi
Elektrokimyasal reaksiyonlarda elektroaktif olan maddenin elektrot yüzeyine
ta ma sistemleri aras nda engellenmesi en kolay olan göç olay r. Bunun için çal lan
ortama kolayca iyonla an bir tuz (elektrolit), elektrokimyasal özellikleri incelenen maddeninkinden çok daha yüksek konsantrasyonlarda ilave edilir. Bu tuza ya da bu tuzu içeren çözeltiye "destek elektrolit" ad verilmektedir. Destek elektrolitinin deri imi
incelenen maddenin deri iminden 100 kat daha fazla olmal r. Miktar tayini
çal malar nda analizi yap lacak maddeleri kolayca çözebilen, uygun pH aral sa layan ve oldukça dü ük ak m veren çözeltiler destek elektroliti olarak seçilir. Bu çal mada destek elektrolit olarak farkl tamponlar tercih edilmi tir.
LAM ve Z DO nun elektrokimyasal davran için optimum ko ullar ara ld .
laçlar için tekrarlanabilir pik ak elde etmek üzere destek elektrolit olarak
Britton-Robinson tamponu, fosfat tamponu ve asetat tamponu çal ld . Farkl pH’lardaki fosfat
27
tamponu sodyum di-hidrojen fosfat (NaH2PO4.H2O) ve di-sodyum hidrojen fosfat
(Na2HPO4.2H2O) çözeltileri kullan larak (pH: 5,5-8,1) haz rland . Asetat tamponu için l M asetik asit çözeltisi haz rlanm ve 5M NaOH ile istenen pH de erlerine
ayarlanm r. Bu tamponla pH: 3,5-5,7 aral nda çal ld .
Fosfat tamponu ve asetat tamponu kullan larak LAM ve Z DO’nun kare dalga voltametrisi al nd ( ekil 4.2). Voltamogram incelendi inde; fosfat tamponuna ait olan 1-4 deki voltamogram ile asetat tamponuna ait 5-7 voltamogramlarda LAM ve Z DO nun yan nda destek elektrolitden ileri gelen üçüncü bir pike rastland . Bu nedenle bu
tamponlar n kullan ndan vazgeçildi.
Tekrarlanabilir ve en yüksek ak m BR tamponunda elde edildi. Farkl pH lar n
(1-11 aras nda) pik ak na etkisi BR tamponuyla test edildi ( ekil 4.3 ve 4.4). pH n n
de imiyle pik ak art göstermi olup, pH 7 den sonra toplam pik ak mlar yakla k
olarak sabit kalm r. LAM ve Z DO için en yüksek pik ak BR tamponunda
yakla k pH 7 civar nda elde edilmi tir. Bu nedenle bu elektrolit çal ma süresince kullan ld .
ekil 4.2. Fosfat tamponu [(1: pH 5,5), (2: pH 6,3), (3: pH 7,2) ve (4: pH 8,1)] ve asetat tamponu
[(5: pH 3,5), (6: pH 4,6 ve (7: pH 5,7)] ortam nda LAM ve Z DO’nun kare dalga voltamogramlar
Esra ÖZGEN
28
ekil 4.3. BR tamponu (pH 1-11) ortam nda LAM ve Z DO’nun kare dalga voltamogramlar
ekil 4.4. LAM ve Z DO’nun pik ak n pH ile de imi 4.4. Frekans Etkisi
LAM ve Z DO’nun belirlenmesi ve miktar tayini için kare dalga voltametri
tekni i kullan lm r. Frekans n pik ak na etkisini incelemek için, frekans 5 ile 100
aras nda de tirilmi tir. Frekans n pik ak üzerine etkisi incelendi inde, ekil 4.5’ten
de görüldü ü gibi hem LAM hem de Z DO için 50 Hz’e kadar ak m de erleri artmaktad r. 50 Hz’den sonra ise ak m hemen hemen ayn kalmaktad r. Buna dayanarak optimum frekans olarak her iki madde içinde 50 Hz olarak seçilmi tir.
29
ekil 4.5. LAM (A) ve Z DO (B)’nun pik ak mlar n frekansla de imi 4.5. LAM ve Z DO’nun Adsorpsiyon Özellikleri
Elektokimyasal olaylarda elektrot reaksiyonu incelenirken yüzeyde adsorpsiyon
olay n olup olmad kontrol edilmelidir. Adsorpsiyon olay elektrot yüzeyinde
meydana gelen reaksiyonlar etkilemektedir. Elektrot yüzeyinde adsorpsiyon olmas durumunda difüzyon e itlikleri ile ifade etti imiz elektrokimyasal e itliklerden sapmalar
meydana gelir. Bir molekülün elektrot yüzeyine adsorpland gösteren
elektrokimyasal metotlardan biri dönü ümlü voltametridir. Elektrot yüzeyine kuvvetli bir ekilde adsorplanan moleküle ait voltammogramda, adsorplanan moleküle ait difüzyon pikinden daha negatif ya da daha pozitif potansiyellerde farkl bir pik daha gözlenir. Bu pik adsorpsiyon piki olarak atfedilir. ekil 4.1’de verilen CV voltammogramlar incelendi inde iki voltammogramda da kuvvetli adsorpsiyon
gösteren ön veya arka pike rastlanmam r. Bu sonuç maddelerin elektrot yüzeyine
kuvvetli ekilde adsorbe olmad göstermektedir. Adsorpsiyonun zay f olmas
durumunda adsorpsiyon piki difüzyon piki ile üst üste çak r. Zay f adsorpsiyon
özelliklerini göstermek için log Ip – log grafikleri çizilerek bu grafiklerin e imi hesapland . Ürün veya reaktant elektrot yüzeyine zay f bir ekilde adsorbe olmu ise dönü ümlü voltametri tekni i ile elde edilen voltammogramlardan elde edilen pik
ak n iddeti tarama h n karekökü ile do ru orant olarak de mez ve bu
de imden elde edilen e im 0,5’den büyük olur (Bard 2001).
ncelenen moleküllerin alt n yüzeyine zay f bir ekilde adsorbe olup olmad
Esra ÖZGEN
30
zlar nda (50 - 500 mV) belirlenen potansiyel aral nda taranm r. Tarama h n
kareköküne logaritmas na kar k pik ak n logaritmik de eri grafi e geçirilmi tir
ekil 4.6). Bu grafiklerin e imleri Randles-Sevcik e itli ine uygun olarak 0,5’in
alt nda bulunmu tur. Dolay yla bu bile iklerin alt n yüzeyinde zay f adsorpsiyon
etkilerinin bulunmad sonucuna var lm r.
ekil 4.7’de LAM ve Z DO’nun katodik pik ak mlar n tarama h na kar
grafikleri verilmi tir. Bu grafiklerin do rusal olmas bu bile iklerin içerisinde bulunan fonksiyonel gruplar n difüzyon kontrollü ve tersinir olarak indirgendi i göstermektedir.
Ayr ca toplam pik potansiyel de erlerinin tarama h ile çok az de mesi bu
bile iklerin elektron aktar m h n yüksek oldu unu yani tersinir oldu unu
göstermektedir. 10-4 M LAM ve Z DO nun pH 7 BR tamponunda farkl tarama
zlar nda al nan dönü ümlü voltamogramlar ekil 4.8’de verilmi tir. Tarama h
art kça pik ak mlar n artt , pik potansiyellerininde kayd gözlenmi tir.
ekil 4.6. LAM (A) ve Z DO (B) bile iklerin 10-4 M CV voltammogramlar ndan elde
edilen log pik ak -log tarama h n karekökü grafi i
31
Esra ÖZGEN
32
ekil 4.8. 10-4 M LAM ve Z DO bile iklerinin 0,1 M BR tamponunda (pH 7,02) alt n elektrotta farkl tarama h zlar nda al nan dönü ümlü voltammogramlar (Tarama h : 50-500 mV/s, Ag/AgCl )
4.6. Analitik Deri im Aral n Belirlenmesi ve Validasyon
LAM ve Z DO için konsantrasyon deneyleri pH 7,02 BR tamponunda, 50 Hz
frekansta ve pulse size 30 mV ko ulunda çal lm r. ekil 4.9A’da LAM ’nin farkl
konsantrasyonlarda -122 mV potansiyelde kare dalga voltamogram verilmi tir. Z DO için farkl konsantrasyonlarda potansiyele kar çizilen ak m grafi inde ise pik 660 mV
da gözlenmi tir ( ekil 4.9B). LAM ve Z DO kar içeren çözeltide ise pik
potansiyellerinin pozitife kayd gözlenmi tir. 4. BULGULAR ve TARTI MA
33
ekil 4.9. LAM ve Z DO'nun farkl konsantrasyonlarda pH 7,02 BR tamponunda al nan kare dalga
voltamogramlar A:LAM , B:Z DO
LAM ve Z DO içeren kar m pH 7,02 BRT çözeltisinde her bir deri im için
ayn çözelti içinde Kare-dalga voltametri tekni i ile 3’er tekrar yap larak voltamogramlar al nd . Bu prosedür yapay ve ticari örnekler için tekrarland .
Kalibrasyon grafi i a da tabloda (Çizelge 4.1) verilen regresyon analizini kullanarak
LAM için yakla k -140 mV ve Z DO için yakla k 710 mV potansiyelde hesapland . LAM ve Z DO için kalibrasyon grafi indeki en küçük deri imlerden biri seçilerek 5 ayr çözeltisi haz rland ve bu çözeltilerden 3’er voltamogram al nd . Burada elde edilen birbirine yak n 8 ak m de eri seçildi. Bu de erlerden yararlan larak standart sapma,
LOD ve LOQ hesapland . Analitik deri im aral belirlemek için, LAM ’nin 7x10-9
-3x10-8 M ve Z DO’nun 5x10-9-1x10-8 M deri im aral nda, pH 7,02 BR tampon
çözeltisinde kare dalga voltametrisi tekni i ile al nan voltamogramlar ndan elde edilen
konsantrasyon (C) ve ak m (I) de erlerine göre do rusall n gözlendi i kalibrasyon
grafi i çizildi ( ekil 4.11). LAM için LOD 5,4x10-9 ve LOQ 3,1x10-9, Z DO için LOD
3,4x10-9 ve LOQ 1,2x10-9 ve regresyon katsay LAM için 0,9922 ve Z DO için
0,9996 bulundu. Kalibrasyon denklemi ve istatiksel veriler Çizelge 4.1’de özetlenmi tir. Örnekler LAM ve Z DO kalibrasyon denklemi kullan larak analiz edildi.
Esra ÖZGEN
34
ekil 4.10. LAM ve Z DO’nun farkl konsantrasyonlarda al nan kare dalga voltamogramlar .
LAM ve Z DO'nun kalibrasyon grafi i A:LAM , B:Z DO
ekil 4.11. LAM ve Z DO'nun kalibrasyon grafi i A:LAM , B:Z DO
Kalibrasyon denklemi ve istatiksel veriler Çizelge 4.1’de özetlenmi tir. Örnekler LAM ve Z DO kalibrasyon denklemi kullan larak analiz edilmi tir.
35 Çizelge 4.1. Regresyon analizi ve istatiksel veriler
Örnek m n LOD LOQ R
LAM 0,66 0,83 5,4x10-9 3,1x10-9 0,9922
DO 1,72 11,07 3,4x10-9 1,2x10-9 0,9996
m: Do rusal regresyon denkleminin e imi n: Do rusal regresyon denkleminin kesilmesi LOD: Deteksiyon limiti
LOQ: Belirleme s
4.7. laçlar n Analizi
LAM ve Z DO’nun tablet tayini için kare-dalga voltametri yöntemi
kullan lm r. LAM ve Z DO etken maddelerini içeren Zeffix ve Retrovir tabletlerinin
kar ndan elde edilen 5 ayr çözeltide LAM ve Z DO’nun miktar belirlemek için
her bir çözeltiden 3’er voltamogram al nd ve elde edilen ak m de erlerinden 1 tabletteki LAM ve Z DO miktar hesapland .
Analiz sonuçlar Çizelge 4.2’de verilmi tir. Sonuçlardan LAM ve Z DO’nun analizi için uygulanan yöntemin iyi oldu u aç kt r.
Esra ÖZGEN
36
Çizelge 4.2. Geli tirilen voltametrik yöntemle tabletlerde elde edilen sonuçlar Ticari Örnekler
Örnek No 100mg/tablet (LAM ) 250mg/tablet (Z DO)
1 100,5 251,2
2 107,8 250,4
3 103,3 253,1
4 102,4 250,6
5 105,6 249,8
Geri Kazan m % Geri Kazan m %
1 100,5 100,5 2 107,8 100,2 3 103,3 101,2 4 102,4 100,2 5 105,6 99,9 Ortalama 103,9 251 SS 2,8 1,2 RSS 2,3 0,74 SH 1,2 1,1
Tablet tayinine ek olarak, önerilen elektrokimyasal yöntemin hassasiyeti ve do rulu u gün-içi ve günler-aras deneyler analiz edilerek do ruland . Gün-içi ve günler-aras deneyleri için; 3 farkl konsantrasyonda gün-içinde 6 kez ve günler-aras 6 farkl gün ölçüm yap ld . Analiz edilen bile enlerin ortalama geri kazan m de erleri ve göreceli standart sapmalar (RSD) hesapland . Sonuçlar Çizelge 4.3’de özetlenmi tir. Çizelge 4.3’de önerilen elektrokimyasal metodun analiz edilen bile enler için arzu edilen sonuçlar verdi i gözlendi.
